KR20220163285A - Il-33단백질 저해용 화합물의 스크리닝 방법 및 상기 화합물을 포함하는 알러지성 질환 치료용 약학조성물 - Google Patents

Il-33단백질 저해용 화합물의 스크리닝 방법 및 상기 화합물을 포함하는 알러지성 질환 치료용 약학조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 IL-33 단백질에 결합하여 IL-33을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 스크리닝을 통해 선별된 화합물을 포함하는 IL-33 단백질 저해용 조성물 및 이를 포함하는 알러지성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 IL-33 단백질에 결합하는 화합물 프레그먼트를 스크리닝하는 방법을 이용하여 선별한 IL-33에 결합하는 화합물 프레그먼트는 IL-33단백질에 보다 특이적이고 강하게 결합하여 IL-33 단백질을 저해하므로 천식, 아토피 등 알러지성 질환을 치료 또는 예방하는 데 효과적이다.

Description

IL-33단백질 저해용 화합물의 스크리닝 방법 및 상기 화합물을 포함하는 알러지성 질환 치료용 약학조성물{Screening Method of compound for IL-33 inhibiting and the Pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 인간 IL-33 단백질에 결합하여 IL-33을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 스크리닝을 통해 선별된 화합물을 포함하는 알러지성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는High-Throughput Screening(HTS)을 통하여 천식 및 아토피 등의 알러지성 질환의 초기단계의 사이토카인인 IL-33과 결합하는 화합물을 발굴하고, 그 기본 구조를 기반으로 알러지성 질환의 예방/치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. IL-33에 대해 높은 결합력을 가지는 화합물은 IL-33을 억제하고 이를 통해 아토피 등 알러지성 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
아토피성 피부염, 천식 및 알레르기성 비염과 같은 알레르기성 면역 질환은 삶의 질을 감소시키는 만성 질환이다. 특히 이 질병은 유년기 및 청소년기에 높은 발병률을 보이며, 이 시기의 치료가 적절하지 않을 시에 성인이 된 이후에도 이들 질병의 치료를 위해 더욱 많은 사회적 비용이 발생하게 된다. 알레르기 질환은 재발률이 높기 때문에 그 질환을 조기에 차단하여 알레르기 질환의 진행을 억제하는 것이 중요하다. 이러한 알레르기 질환의 발달은 면역체계와 관련이 있다.
인터루킨-33(Interleukin-33, IL-33)은 염증성 상태에서 역할을 하는 인터루킨-1 패밀리에 속하는 사이토카인이다. IL-33은 상피 세포나 혈관 내피 세포의 핵 내에서 항상 발현되고 있으며, 감염이나 물리적, 화학적 스트레스에 의한 조직 손상에 의한 세포 파괴와 함께 방출되어 면역계에 경고를 주는 알라민(alarmin) 역할을 한다. 또한 IL-33의 발현은 리포 다당류 등의 자극에 의해 상승되고, 분비되는 메커니즘도 있다고 생각되고 있다. 세포 밖으로 방출된 IL-33은 세포 상에 발현하는 IL-33 수용체에 결합하여 세포 내 신호를 활성화할 수 있다. IL-33 수용체는 다양한 면역 세포나 상피 세포 등에서 발현되어, IL-33 유도성 세포 내 신호 전달이 발생한다. IL-33은 IL-33 수용체를 발현하는 면역 체계 세포 중 Th2 세포, 비만세포, 호산구, 호염기구, NK(natural killer) T 세포나 2형 선천성 림프구(group 2 innate lymphocyte) 등의 면역 세포 표면에 존재하는 수용체 ST2와 결합해 작동하며, IL-33 과 결합한 ST2는 악세사리 수용체 IL-1RAcP과 이종 삼량체(heterotrimer)를 형성한 뒤 하위 신호전달 경로(downstream signaling pathway)로 MAPK 및 NF-κB 경로를 활성화시킨다. 이들의 활성화는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등)의 생산을 유도함으로써 알레르기성 염증(천식, 아토피성 피부염, 화분증, 아나필락시스 등)을 유도하는 것으로 생각되고 있다(Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p1203). 또한 IL-33 수용체를 발현하는 면역 체계 세포 중 비만세포(mast cell)와 대식세포는 IL-33 자극에 의해 IL-1β, IL6 및 TNF(tumor necrosis factor)-α의 생산이 유도되고, 이것이 자가 항체 유도 관절염의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다(Damo Xu et al., Journal of Immunology, 2010, Vol. 184, p2620). 또한, 인간에서는 IL-33의 발현 증가가 각종 염증성 질환(류마티스 관절염, 천식, 전신성 경화증, 간 섬유증, 폐 섬유증 등의 섬유증, 건선, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 강직성 척추염 등)에 연관되어 있는 것으로 인정되고 있으며, IL-33이 각종 질병의 발병·유지에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 다양한 질환에 IL-33가 관여된다는 것이 알려져 있기 때문에 IL-33의 작용제와 길항제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
본 발명자들은 IL-33 단백질의 수용체 결합 부위에서 시스테인 단일 공유결합을 형성할 수 있도록 처리한 후 IL-33에 결합하는 화합물을 선별하고 본 발명을 완성하게 되었다.
미국특허 US 7897615 B2(2011.03.01) 미국특허 US 8202876 B2(2012.06.19)
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 IL-33단백질에 결합하여 IL-33단백질의 활성을 억제함으로써 알러지성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결 과제는 인간 IL-33 단백질의 수용체 결합 부위에 시스테인 잔기가 도입된 IL-33 단백질 변이체, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하고, IL-33 단백질 변이체를 제작하기 위한 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결 과제는 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 IL-33 저해용 화합물을 포함하는 알러지성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결 과제는 상기 화합물을 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, 알러지성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제(medicament)를 제조하기 위한 상기 IL-33 단백질 저해용 화합물의 용도(use)를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 a) IL-33 단백질의 수용체 결합 부위에 시스테인 잔기를 도입하여 IL-33 단백질 변이체를 제작하는 단계; b) 후보 화합물과 시스테인 잔기가 도입된 IL-33 단백질 변이체를 반응시키는 단계; 및 c) 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체 간에 시스테인 공유결합 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, IL-33단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 IL-33 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-33 단백질의 226번 위치의 아스파라긴(Asn) 잔기, 228번 위치의 발린(Val) 잔기, 267번 위치의 류신(Leu) 잔기 및 269번 위치의 글루탐산(Glu) 잔기 중 어느 하나를 시스테인(Cys)으로 치환한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체 간에 시스테인 공유결합 형성을 확인하는 단계(c단계)는 나노-시차 주사 형광 측정(이후, Nano-DSF) 실험을 통해 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 Tm 값과 IL-33 단백질 변이체의 Tm 값을 확인하여 상기 Tm 값의 차이가 3 내지 6인 경우에 상기 후보 화합물을 유효 화합물로 선별하는 것일 수 있다. 또는 LC-MS/MS 실험을 이용하여 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 분자량과 IL-33 단백질 변이체의 분자량을 확인하여 분자량의 비율(반응도)이 0.1 내지 1.7인 경우에 상기 화합물을 유효 화합물로 선별할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 선별된 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 10]을 IL-33 단백질 저해용 화합물로 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 선별된 IL-33 저해용 화합물을 포함하는 알러지성 질환의 치료/예방용 약학 조성물을 제공한다.
Figure pat00001
[화학식 1]
Figure pat00002
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
[화학식5]
Figure pat00006
[화학식6]
Figure pat00007
[화학식 7]
Figure pat00008
[화학식 8]
Figure pat00009
[화학식 9]
Figure pat00010
[화학식 10]
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 IL-33 단백질 변이체, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 따른 IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법을 이용하여 선별한 IL-33에 결합하는 화합물은 IL-33단백질에 특이적으로 결합하여 IL-33 단백질을 저해하므로 천식, 아토피 등 알러지성 질환을 치료 또는 예방하는 데 효과적이다. 또한, 다른 사이토카인 단백질에도 상기 스크리닝 방법을 적용하여 사이토카인 유발 질병의 치료 및 예방에 효과가 있는 화합물을 발굴할 수 있어 유용하다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 IL-33 단백질 내 수용체 결합 부위와 시스테인 삽입 부위를 나타낸 그림이다(A: 흰색은 IL-33 표면모델, 파란색은 ST2의 표면모델, B: IL-33과 ST2 복합체의 카툰 모델, C: IL-33의 수용체 결합부위에서 선택된 4종류 변이의 위치).
도 2는 IL-33 Cys K/O N226C(도 2A)와 IL-33 Cys K/O E269C(도 2B)의 단백질의 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 결과 및 그 SDS-PAGE결과를 나타낸 것이다.
도 3은 시스테인 공유결합을 유도하기 위한 환원제 제거를 위해 진행하는 버퍼 교환 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 nano-DSF 실험을 통한 스크리닝 결과 선별된 화합물의 △Tm를 나타낸 것이다.
도 5는 IL-33 Cys K/O E269C단백질과 반응성을 나타내는 nano-DSF 실험을 통해 선별한 유효 화합물 1(29-H07 화합물(Plate No.-Well No.))의 1H NMR 분석 결과이다.
도 6은 wt IL-33 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 2(G-8화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
도 7은 유효 화합물 3(H-1 화합물)과 유효 화합물 2(G-8 화합물)을 사용한 nano-DSF측정결과를 확인한 것이다.
도 8은 IL-33 Cys K/O 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 4(13-H04 화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
도 9은 IL-33 Cys K/O 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 5(36-B04 화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
도 10은 IL-33 Cys K/O 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 6(31-D06 화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
도 11은 IL-33 Cys K/O 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 7(39-G03 화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
도 12은 IL-33 Cys K/O 단백질과 반응성을 나타내는 유효 화합물 8(21-H04 화합물)의 1H NMR 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 어떤 구성요소를 '포함' 한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에는Nano-DSF실험, LC-MS/MS 실험을 유효 화합물을 선별하는 데 사용할 수 있다. 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체를 반응시킨 다음 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 Tm 값과, IL-33 단백질 변이체의 Tm 값을 확인하여 유효 화합물을 선별할 수 있다.
또한, 복합체의 분자량과 IL-33 단백질 변이체의 분자량을 확인하여 유효 화합물을 선별할 수 있다. 시스테인을 포함하고 있어 화합물과 결합할 것으로 판단되는 펩타이드를 타겟 펩타이드(NILFKLSCT)라고 명명하고, 타겟 펩타이드를 제외한 단백질 효소분해로 생성된 IL-33 Cys K/O E269C 펩타이드 시료들 중 반복실험에서 낮은 편차 (CV<30%)로 검출안정도가 높은 펩타이드(E.AKTDPGVFIGVKD.N)를 선택해서 참고 펩타이드라고 명명한다. 정성된 화합물이 결합된 타겟 펩타이드와 참고 펩타이드의 액체크로마토그래피 및 질량분석기로 검출된 강도(area)를 구하고, 아래의 식을 바탕으로 반응도를 계산한다.
[반응도] = [화합물과 결합한 타겟 펩타이드의 질량분석 강도]/[참고 펩타이드의 질량분석 강도]
상기 반응도 식으로부터의 비를 산출하여 화합물별 산출된 비를 높은 순으로 나열하여 비가 가장 높은 순서대로 타켓 펩타이드에 가장 반응도가 높은 화합물로 선별한다.
본 발명에 있어서 용어 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)의 “변이체”는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 스플라이스 변이체, 번역 후 수정된 버전, 입체구조 (conformation), 이소형 및 종 상동체 (species homolog), 특히 세포에 의해 천연적으로 발현되는 것을 모두 포함한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포괄한다. 아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산이 삽입된 것을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열에서 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입된다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 된 아미노 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다.
본 발명에 있어서 용어 "발현 벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미하고, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법 (electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다
본 발명에서 상기 "예방"이란, 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 알러지성 질환에 의해 기인된 증상을 차단하거나, 진행을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "치료"란, 목적하는 질병의 완화 및 개선을 위해 수행되는 일련의 활동을 의미한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투 여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자 일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골 수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경 구 투하가 바람직하다. 본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개 골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 상기 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하 게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기 간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1 일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
이하 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. IL-33의 단일 시스테인 삽입 부위 선정 및 단백질 변이체 제작
1-1. IL-33의 단일 시스테인 삽입 부위 선정
스크리닝 방법은 목적 단백질(IL-33)의 수용체 결합 장소 주변에 단일 시스테인(Cysteine)을 삽입하고 그 부근에서 화합물의 공유결합을 유도함으로써 여러 화합물 중에서 특히 잘 결합하는 화합물을 LC-MS/MS로 선별하는 방법으로, 상용의 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리(Cysteine focused covalent fragments library(CYS-3200, ENAMINE Co. Ltd.))를 활용하여 진행하였다. 본 발명의 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리에서plate ID는 1131275-R-01부터 1131275-R-40까지 분류되어 있고 각 플레이트의 1번 lane과 12번 lane은 비어 있어 각 플레이트당 80개의 샘플이 존재한다(A2~H11).
단일 시스테인의 삽입을 위하여 human IL-33(PDB ID: 4KC3)의 복합체 구조 내의 IL-33의 구조를 사용하여 검토하였다(도 1). 변이체의 위치 선정에 있어서 구조 내의 수용체 결합 부위를 찾아내고(도 1A 및 도 1B), 그 이종 이량체의 구조내에서 수용체 단백질인 ST2가 결합하고 있는 부위에 위치한 IL-33의 4가지 잔기(N226, V228, L267 또는 E269)를 선택하여 시스테인을 도입하기로 결정하였다(도 1C).
1-2. 클로닝에 사용되는 단백질 변이체의 제작
시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리의 활용을 위하여 IL-33 단백질의 구조상 단일 시스테인을 삽입한 변이체를 제작하였다. 먼저 단일 시스테인 단백질의 제작을 진행하기 위하여 단백질 구조 내의 공유결합을 형성하고 있는 시스테인을 제외한 나머지 시스테인에 녹아웃(Cysteine knock-out, 이후 Cys K/O로 표기)을 실시하였다. IL-33 내에 이황화 공유결합은 존재하지 않으므로 존재하는 4개의 시스테인 중 2개를 알라닌(Alanine)으로 치환하고(C227A, C232A) 나머지 2 개를 세린(Serine)으로 치환하도록(C208S, C259S) 클로닝을 진행하였다. 이 때 사용된 각각의 프라이머는 표 1에 기재하였다.
상기 Cys K/O의 유전자를 사용하여 4종류의 단일 시스테인 변이체, IL-33 Cys K/O N226C, IL-33 Cys K/O V228C, IL-33 Cys K/O L267C 및 IL-33 Cys K/O E269C를 제작하였고, 이 때 표2에 기재된 프라이머를 사용하였다. 인간 야생형 IL-33 단백질 및 DNA 서열과, IL-33 단백질의 시스테인을 녹아웃시킨 단백질 및 DNA 서열, 제작된 변이체 서열은 모두 서열목록으로 첨부하였다.
IL-33 시스테인 녹아웃에 사용된 프라이머
Name Sequences (5’→ 3’)
C208S_for GAG CTC CAT AAG TCT GAA AAA CCA CTG
C208S_rev CAG TGG TTT TTC AGA CTT ATG GAG CTC
C227A_C232A_for ATG CAC TCC AAC GCG GTT TCA TTT GAA GCG AAG ACT GAT CC
C227A_C232A_rev GG ATC AGT CTT CGC TTC AAA TGA AAC CGC GTT GGA GTG CAT
C259S_for C TCT TCT GAG AAT TTG TCT ACT GAA AAT ATC TTG T
C259S_rev A CAA GAT ATT TTC AGT AGA CAA ATT CTC AGA AGA G
IL-33 Cys K/O의 단일 시스테인 변이체 제작에 사용된 프라이머
Name Sequences (5’→ 3’)
L267C_for GAA AAT ATC TTG TTT AAG TGC TCT GAA ACT TGA GTC G
L267C_rev GTC GAC TCA AGT TTC AGA GCA CTT AAA CAA GAT A
N226C_for CAT AAT ATG CAC TCC TGC GCG GTT TCA TTT GAA
N226C_rev TTC AAA TGA AAC CGC GCA GGA GTG CAT ATT ATG
V228C_for ATG CAC TCC AAC GCG TGC TCA TTT GAA T
V228C_rev CTT GCA TTC AAA TGA GCA CGC GTT GGA GT
E269C_for TTG TTT AAG CTC TCT TGC ACT TGA GTC GAC
E269C_rev CTC GTC GAC TCA AGT GCA AGA GAG CTT
서열 목록
서열번호 1 human IL-33 protein sequence
서열번호 2 human IL-33 DNA sequence
서열번호3 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) protein sequence
서열번호 4 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) DNA sequence
서열번호 5 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) N226C protein sequence
서열번호 6 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) N226C DNA sequence
서열번호 7 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) V228C protein sequence
서열번호 8 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) V228C DNA sequence
서열번호 9 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) L267C protein sequence
서열번호 10 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) L267C DNA sequence
서열번호 11 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) E269C protein sequence
서열번호 12 IL-33 Cysteine knock-out(K/O) E269C DNA sequence
서열번호 13 C208S_for
서열번호 14 C208S_rev
서열번호 15 C227A_C232A_for
서열번호 16 C227A_C232A_rev
서열번호 17 C259S_for
서열번호 18 C259S_rev
서열번호 19 L267C_for
서열번호 20 L267C_rev
서열번호 21 N226C_for
서열번호 22 N226C_rev
서열번호 23 V228C_for
서열번호 24 V228C_rev
서열번호 25 E269C_for
서열번호 26 E269C_rev
실시예 2. IL-33 단백질 변이체 수득
2-1. 형질전환 대장균 세포의 배양 및 파쇄
상기 제작된 wt IL-33, IL-33 C259A, IL-33 Cys K/O N226C, IL-33 Cys K/O V228C, IL-33 Cys K/O L267C 및 IL-33 Cys K/O E269C의 유전자를 사용하여 미리 형질 전환시킨 대장균 균주를 100μg/ml의 암피실린이 함유된 20 ml의 LB배지에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 이 중 1/100 volume이 되도록 7.5ml의 배양액을 2L의 삼각 플라스크에 멸균된 750mL의 LB배지 4개에 각각 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때까지 배양하였다. 600nm에서의 흡광도가 0.4-0.6 정도가 되었을 때, 18℃에서 16시간 동안 0.5mM IPTG를 사용하여 단백질 과발현을 유도한 이후, 원심분리기를 이용하여 8,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다. 0.1M Tris-HCl pH7.4, 0.3M NaCl, 1mM β-Mercaptoethanol, 0.1% TritonX-100, 0.1mM PMSF 조성의 용해 버퍼에 세포 침전물을 현탁 시킨 후, 융해된 세포를 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher, USA)를 이용하여 40% pulse intensity, pulse on/off=3/9 secs로, pulse on time 15분 동안 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 용액을 원심분리기로 18,000rpm에서 30분간 원심분리한 후, 그 상청액을 이용해 정제를 진행하였다.
2-2. IL-33 Cys K/O 단백질 변이체의 정제
상기 실시예 3에서 얻은 상청액을 0.8μm사이즈의 시린지 필터(Sartorius, Co.)를 사용하여 세포 잔해를 제거하고 필터를 통과한 용액은 IMAC(HisPurTM cobalt resin, Thermo Fisher Scientific Korea Ltd.)를 사용하여 정제하였다. 먼저, 필터를 통과한 용액을HisPurTM Cobalt Resin이 들어있는 칼럼(Thermo Scientific™, USA)에 결합시키고, 그 후, pH7.4의 20 mM Sodium-phosphate buffer, 300 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol을 포함하는 200ml의 버퍼용액으로 세척하였다. 비특이적 결합을 제거하기 위한 추가 세척은 상기의 조성에30mM 이미다졸이 포함된 100ml의 버퍼로 실시히였다. 단백질의 용출은 상기의 버퍼 조성에 250mM 이미다졸이 포함된 50mL과 500mM 이미다졸이 포함된 버퍼 50ml이 사용되었다. SDS-PAGE를 통하여 10His-TEV protease site-IL33 단백질 부분을 확인하여 용출액을 수득하였다. IL-33 Cys K/O 단백질의 변이체들 모두 동일한 방법으로 실시하였다.
수득한 용액을 가지고 투석을 진행하였다. 투석 버퍼로 pH7.4의 20 mM Tris-HCl buffer, 500 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol을 사용하고, 이때, TEV 단백질분해효소를 사용하여 단백질의 N말단에 붙어있는 His-Tag을 제거하였다. 다음으로 2-Mercaptoethanol의 농도를 낮추기 위해 두 번째 투석을 진행하였다. 두 번째 투석 버퍼는 pH 6.8의 20mM Sodium-phosphate buffer, 300mM NaCl, 1mM 2-Mercaptoethanol을 이용했다. 제거된 His-tag 단편과 TEV단백질분해효소는 두번째 HisPurTM Cobalt Resin컬럼의 결합을 통해 분리했다. pH 6.8 20 mM Sodium-phosphate, 100 mM NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol을 포함하는 버퍼를 사용하여 겔 투과 크로마토그래피(HiLoad 16/60 Superdex75, GE healthcare)법으로 분자량에 따라 분리 및 정제하였다(도 2). IL-33 Cys K/O V228C과 IL-33 Cys K/O L267C의 경우에는 단백질의 가용성이 좋지 않아서 반응을 위한 충분한 단백질 양이 나오지 않아 IL-33 Cys K/O N226C 및 IL-33 Cys K/O E269C를 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
실시예 3. 스크리닝을 위한 준비
3-1. 단백질의 버퍼 교환 (LC-MS/MS 분석 위한 버퍼 교환)
정제된 IL-33 Cys K/O N226C와 IL-33 Cys K/O E269C의 단백질을 가지고 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 기반의 약물선별(Cys focused fragment based drug discovery(Cys-FBDD))의 일환으로 LC-MS/MS실험을 진행하기 위해 환원제를 제거한 조건으로 진행할 필요가 있어 버퍼 교환을 진행하였다(도 3). 1차 버퍼교환으로 PD MiniTrap G-25(GE Healthcare, Cat. NO.28918007) 컬럼을 사용하여 5mM TCE가 포함된 버퍼로 버퍼교환을 진행하였다. 버퍼의 조성은 pH 7.4 20mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 5mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)의 성분으로 구성된다. 5mM TCEP는 단백질 최종 버퍼 내의 5 mM 2-Mercaptoethanol을 제거하기 위한 목적으로 사용하였다. 2차 버퍼교환에서는 환원제(TCEP)를 완전히 제거할 목적으로 PD MidiTrap G-25(GE Healthcare, Cat. NO.28918008) 컬럼을 사용하여, pH 7.4 20mM Tris-HCl, 100mM NaCl의 조건인 버퍼를 사용하여 교환을 진행하였다. 3차 버퍼교환을 통하여, 2차에서 제거되지 못한 환원제(TCEP)를 완전히 제거하기 위하여, PD 10 column(GE Healthcare, Cat. NO.17085101)을 사용하여 2차와 동일하게 버퍼교환을 진행하였다.
3차에 걸친 버퍼 교환을 통해 환원제를 완전히 제거한 상태의 단백질로 화합물과의 반응을 진행하였으며 환원제의 제거여부는 LC-MS/MS를 통하여 확인되었다.
3-2. 후보 화합물과 IL-33 Cys K/O 단백질의 반응
IL-33 Cys K/O E269C 단백질 변이체와 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리를 활용하여 스크리닝을 진행하였다. 단백질 내의 단일 시스테인과 화합물의 공유결합 형성을 위해 환원제가 제거된 버퍼(pH 7.4 20mM TrisHCl, 100mM NaCl)에서 단백질: 화합물의 비율을 1:6(nano-DSF) 또는 1:5(LC-MS/MS)로 섞어 반응을 시작하였다. Nano-DSF 실험에서는 단백질의 최종농도 10μM, 화합물 농도 60μM이 되도록 조절하고 50μM의 TCEP를 버퍼에 추가하였고, LC-MS/MS실험에서는 단백질의 최종농도 20μM, 화합물 농도 100μM이 되도록 조절하였으며 환원제가 없는 조건에서 반응을 시작하였다. 4℃에서 24시간의 반응을 통해 화합물을 반응시켰다. LC-MS/MS 실험을 위해서는 상기 샘플에 요오드아세트아마이드(Iodoacetamide(IAA))를 화합물과 동일한 농도인 100μM의 최종 농도로 섞고, 반응되지 않은 단백질은 IAA와의 반응(25℃, 4시간)을 통하여 화합물과의 추가 반응을 중지시켰다.
실시예 4. IL-33 단백질에 결합하는 화합물의 선별
4-1. 유효 화합물 1의 선별
4-1-1. Nano-DSF 실험을 통한 스크리닝
ENAMINE 사의 3200종의 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리의 화합물에서 방향족 구조의 개수(>1), 소수성 지수(<3), 분자량(>220) 등의 성분으로 분류하여 1,171종으로 분류하고, Docking study(FLARE software)의 결과값인 LF rank score(<-2.8)를 기준으로 1,011종의 화합물을 분류한 다음, 1,011종의 선택된 화합물에 대해서 스크리닝을 진행하였다.
Nano-DSF실험을 진행하기 위하여 PROMETHEUS (NanoTemper Technologies GmbH, Germany) 장비를 사용하여 상기 실시예 3-2에 기재된 방법에 따라 샘플을 준비하여 진행하였다. 각각의 반응물의 전체 부피를 30μl로 설정하여 duplicate의 실험을 진행하는 것으로 스크리닝을 진행했다. 준비된 샘플은 PROMETHEUS 전용 모세관(Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries, Cat.No.: PR-C002)을 사용하여 각각의 반응물을 셋팅하여 측정하였다. 20 내지80℃의 온도범위에서 1℃/min의 속도로 측정하였고, 결과값은 녹는 온도(melting temperature, Tm)로 나타나며, 단백질 단독의 Tm-control을 기준으로 화합물과 결합한 복합체의 Tm-complex 사이의 값의 차이를 △Tm(△Tm= Tm-complex-Tm-control)으로 정하여 각 데이터를 비교하였으며, △Tm>3℃이상의 값을 나타내는 화합물을 후보 화합물로 선별하였고(도 4), 화합물의 각 구조는 표 4에 나타내었다. 표 4에서 숫자와 알파벳 숫자는 Library plate No_well No을 나타낸다.
nano-DSF 실험을 통한 후보 화합물
Position ΔTm
(℃)		 Formula Structure
1131275-R_7_H3 4.16 O=C(NCC1=COC(C2=CC=CS2)=N1)C=C
Figure pat00011
1131275-R_19_F8 4.38 O=C(C=C)N(C1)CCC2=C1SC(C3=CC=CC=C3)=N2
Figure pat00012
1131275-R_39_B3 4.7 O=S(C1=CC2=C(N(C(CCl)=O)CC2)C=C1)(N3CCCCC3)=O
Figure pat00013
1131275-R_40_A6 4.18 OC1=CC=C(C2=CSC(NC(C=C)=O)=N2)C=C1
Figure pat00014
1131275-R_21_D10 3 O=C(CN1C(C=C)=O)NC2=C1C=CC(C(F)(F)F)=C2
Figure pat00015
1131275-R_31_D7 3.35 O=C(CCl)C1CCCC2=C1C=CC(S(N(C)C)(=O)=O)=C2
Figure pat00016
1131275-R_3_E7 5.41 CC(C)(C)C1=NN(C(NC(C=C)=O)=C1)C2=NC=CC=N2
Figure pat00017
1131275-R_22_D4 3.72 O=C(C=C)NC1=CC=NC2=C1C(OC)=CC(OC)=C2
Figure pat00018
1131275-R_29_H7 3.82 CN(C(CCl)=O)CC(C=C1)=CC2=C1C=C(OC)C=C2
Figure pat00019
1131275-R_21_F10 3.36 O=C(N1CC[N+](CC2=CN3C=CC=CC3=N2)CC1)C=C
Figure pat00020
1131275-R_1_H3 3.04 O=C(CN(C1C2=CC=CC=C2)C(C=C)=O)N1C
Figure pat00021
1131275-R_35_H5 5.48 [O-][N+](C1=CC=C(N2CCN(C(CCl)=O)CC2)C=C1)=O
Figure pat00022
1131275-R_39_E10 3.97 O=C(C=C)N1CC(CCC1)CC2=NN=C3N2C=CC=C3
Figure pat00023
1131275-R_38_B5 3.01 ClCC(N1CCN(C(C2OC3=C(C=CC=C3)OC2)=O)CC1)=O
Figure pat00024
1131275-R_01_A2 2.99 O=C(NC(C=C)=O)NC12C[C@H](C3)C[C@H](C[C@H]3C2)C1
Figure pat00025
4-1-2. 1 H NMR 분석
상기 15가지의 화합물에 대한 특이적 결합구조를 특정하기 위하여, 시스테인을 제거한 IL-33 Cys K/O 단백질을 사용하여 추가적인 1H NMR분석을 통한 결합실험을 실시하였다. 0.1mM의 화합물에 대하여, 20μM의 단백질 존재하는 조건과 단백질이 존재하지 않는 조건에서의 1H NMR 분석을 통하여 결합여부를 스크리닝하였고, 그 결과15가지의 화합물 중 1가지의 화합물(유효 화합물1])에 대하여만 특이적이 반응성을 나타내었다 (도 5).
Figure pat00026
[유효 화합물1]
4-2. 유효 화합물 2의 선별
4-2-1. LC-MS/MS 실험을 통한 스크리닝(IL-33 Cys K/O N226C 및 E269C)
ENAMINE 사의 3200종의 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리의 화합물에서 방향족 구조의 개수(>1), 소수성 지수(<3), 분자량(>220) 등의 성분으로 분류하여 1,171종으로 분류하고, Docking study (FLARE software)의 결과값인 LF rank score(<-2.8)를 기준으로 1,011종의 화합물을 분류하고, 1,011종의 선택된 화합물에 대해서 스크리닝을 진행하였다. 상기 실시예 3-2에 기재된 내용으로 샘플을 준비하여 LC-MS/MS 분석을 실시하였다. IL-33 Cys K/O N226C 와 E269C단백질을 바탕으로 각각 10개의 화합물을 한 batch로 묶어서 실험을 진행하였고, IL-33 Cys K/O N226C과의 결합 반응을 위해 120개의 화합물, 곧 12개의 그룹의 샘플을 선택하여 확인하였다. 화합물의 분류는 표 5에 나타내었다. 샘플이름으로 사용한 것은 분석 그룹의 알파벳(Analysis Group)과 그룹내의 순서 (Numbering (group_No.))를 사용하여 표시하였다(표 5).
LC-MS/MS 분석을 위한 120개 화합물 그룹
Index Plate ID Well MW LogP Ring Count LF Rank Score Numbering (group_No.) WarHead
Group		 Analysis Grouping
457 1131275-R-03 E10 221.22 1.83609 2 -5.08 A_1 A 3A
609 1131275-R-04 A10 223.21 2.50378 2 -4.292 A_2 A 3A
74 1131275-R-01 E06 227.26 1.75997 2 -3.984 A_3 A 3A
507 1131275-R-04 F03 230.26 0.788359 2 -3.578 A_4 A 3A
719 1131275-R-05 H06 233.23 2.31256 2 -5.776 A_5 A 3A
377 1131275-R-03 E05 236.65 0.177217 2 -3.131 A_6 A 3A
429 1131275-R-03 G08 239.21 2.66877 2 -3.939 A_7 A 3A
1,127 1131275-R-08 D02 241.34 0.687296 2 -4.783 A_8 A 3A
94 1131275-R-01 G07 244.31 2.49016 2 -5.992 A_9 A 3A
58 1131275-R-01 E05 247.29 0.940482 2 -3.494 A_10 A 3A
899 1131275-R-06 B08 250.26 1.99949 2 -4.949 B_1 A 3B
881 1131275-R-06 A07 253.32 1.03918 2 -5.181 B_2 A 3B
70 1131275-R-01 C06 256.27 2.61708 2 -6.808 B_3 A 3B
86 1131275-R-01 C07 259.27 2.02896 2 -5.871 B_4 A 3B
961 1131275-R-07 A02 241.28 2.50596 2 -4.119 B_5 A 3B
723 1131275-R-05 B07 265.28 1.08318 2 -5.361 B_6 A 3B
605 1131275-R-04 G09 271.21 2.06647 2 -5.91 B_7 A 3B
957 1131275-R-06 G11 274.35 1.16123 2 -6.784 B_8 A 3B
349 1131275-R-03 G03 277.31 2.2586 2 -5.833 B_9 A 3B
861 1131275-R-06 G05 280.34 0.540295 2 -4.671 B_10 A 3B
571 1131275-R-04 F07 289.76 2.98015 2 -4.353 C_1 A 3C
619 1131275-R-04 F10 292.33 2.96309 3 -3.405 C_2 A 3C
849 1131275-R-06 A05 296.24 1.48268 2 -4.911 C_3 A 3C
204 1131275-R-02 F04 221.68 2.66753 2 -2.905 C_4 A 3C
503 1131275-R-04 D03 223.65 2.00877 2 -3.199 C_5 A 3C
56 1131275-R-01 D05 228.24 0.550033 2 -3.193 C_6 A 3C
697 1131275-R-05 E05 231.29 2.99119 2 -3.344 C_7 A 3C
991 1131275-R-07 H03 234.27 1.49944 2 -5.177 C_8 A 3C
851 1131275-R-06 B05 237.27 0.999635 2 -3.294 C_9 A 3C
581 1131275-R-04 C08 241.24 2.22281 2 -3.901 C_10 A 3C
10 1131275-R-01 E02 244.28 0.832435 2 -3.299 D_1 A 3D
383 1131275-R-03 H05 247.28 2.12638 2 -3.323 D_2 A 3D
611 1131275-R-04 B10 250.35 2.72051 2 -4.758 D_3 A 3D
206 1131275-R-02 G04 253.69 2.98881 2 -4.398 D_4 A 3D
387 1131275-R-03 B06 256.29 1.85915 3 -3.464 D_5 A 3D
713 1131275-R-05 E06 259.3 2.5256 2 -3.613 D_6 A 3D
339 1131275-R-03 B03 262.3 1.30922 2 -3.024 D_7 A 3D
879 1131275-R-06 H06 265.25 2.75278 2 -4.965 D_8 A 3D
497 1131275-R-04 A03 270.32 2.15527 3 -3.227 D_9 A 3D
629 1131275-R-04 C11 273.25 1.5749 2 -4.825 D_10 A 3D
845 1131275-R-06 G04 276.3 0.933349 2 -3.409 E_1 A 3E
785 1131275-R-05 A11 279.3 1.54414 2 -4.961 E_2 A 3E
607 1131275-R-04 H09 252.25 2.12621 2 -5.399 E_3 A 3E
531 1131275-R-04 B05 221.22 1.60739 2 -4.132 E_4 A 3E
437 1131275-R-03 C09 225.62 2.19453 2 -3.625 E_5 A 3E
174 1131275-R-02 G02 230.26 0.826423 2 -3.268 E_6 A 3E
501 1131275-R-04 C03 234.27 2.63405 2 -5.214 E_7 A 3E
419 1131275-R-03 B08 237.68 2.89808 2 -3.608 E_8 A 3E
403 1131275-R-03 B07 241.27 1.91255 3 -3.842 E_9 A 3E
84 1131275-R-01 B07 244.33 2.32821 2 -3.816 E_10 A 3E
871 1131275-R-06 D06 248.28 -0.525056 2 -3.064 F_1 A 3F
371 1131275-R-03 B05 251.3 0.614854 2 -3.732 F_2 A 3F
359 1131275-R-03 D04 255.31 2.03515 2 -3.618 F_3 A 3F
379 1131275-R-03 F05 259.26 1.70398 2 -3.237 F_4 A 3F
385 1131275-R-03 A06 263.33 2.61529 2 -5.908 F_5 A 3F
815 1131275-R-06 H02 271.23 2.41154 2 -4.009 F_6 A 3F
561 1131275-R-04 A07 275.34 2.04868 2 -3.453 F_7 A 3F
102 1131275-R-01 C08 280.74 2.30476 2 -3.693 F_8 A 3F
685 1131275-R-05 G04 295.35 0.339457 2 -3.51 F_9 A 3F
943 1131275-R-06 H10 230.26 1.55838 2 -3.226 F_10 A 3F
130 1131275-R-01 A10 228.24 1.07345 2 -3.358 G_1 A 3G
563 1131275-R-04 B07 232.27 1.8034 2 -3.245 G_2 A 3G
210 1131275-R-02 A05 235.7 2.88468 2 -3.154 G_3 A 3G
549 1131275-R-04 C06 239.31 2.6295 3 -3.484 G_4 A 3G
673 1131275-R-05 A04 243.21 1.38443 2 -3.682 G_5 A 3G
983 1131275-R-07 D03 246.24 2.05008 2 -5.599 G_6 A 3G
925 1131275-R-06 G09 250.35 2.87806 2 -4.925 G_7 A 3G
327 1131275-R-03 D02 254.25 2.64521 2 -5.218 G_8 A 3G
88 1131275-R-01 D07 259.27 2.26262 2 -5.798 G_9 A 3G
553 1131275-R-04 E06 265.73 2.39185 2 -3.264 G_10 A 3G
409 1131275-R-03 E07 271.31 2.82854 2 -3.309 H_1 A 3H
395 1131275-R-03 F06 276.33 1.73598 2 -3.539 H_2 A 3H
401 1131275-R-03 A07 280.74 2.16774 2 -3.553 H_3 A 3H
543 1131275-R-04 H05 296.34 0.535355 2 -4.339 H_4 A 3H
833 1131275-R-06 A04 228.24 1.96723 2 -3.412 H_5 A 3H
625 1131275-R-04 A11 235.25 2.28066 2 -4.668 H_6 A 3H
158 1131275-R-01 G11 238.28 2.48956 2 -3.673 H_7 A 3H
547 1131275-R-04 B06 241.28 1.82649 2 -3.291 H_8 A 3H
913 1131275-R-06 A09 245.25 2.39533 2 -5.869 H_9 A 3H
703 1131275-R-05 H05 251.3 0.70654 2 -3.528 H_10 A 3H
443 1131275-R-03 F09 251.3 0.31703 2 -2.967 I_1 A 3I
397 1131275-R-03 G06 254.28 1.95901 2 -4.001 I_2 A 3I
985 1131275-R-07 E03 266.28 2.2106 2 -4.247 I_3 A 3I
921 1131275-R-06 E09 260.28 2.08463 2 -3.196 I_4 A 3I
953 1131275-R-06 E11 273.34 -1.02094 2 -3.258 I_5 A 3I
140 1131275-R-01 F10 278.32 2.12297 2 -5.43 I_6 A 3I
943 1131275-R-06 H10 230.26 1.55838 2 -3.226 I_7 A 3I
705 1131275-R-05 A06 235.25 1.32713 2 -3.628 I_8 A 3I
551 1131275-R-04 D06 241.28 2.77515 2 -3.424 I_9 A 3I
134 1131275-R-01 C10 245.31 2.15571 2 -3.708 I_10 A 3I
975 1131275-R-07 H02 228.24 1.18327 2 -2.9 J_1 A 3J
943 1131275-R-06 H10 230.26 1.55838 2 -3.226 J_2 A 3J
218 1131275-R-02 E05 235.7 2.88468 2 -3.157 J_3 A 3J
569 1131275-R-04 E07 241.28 2.13509 2 -3.783 J_4 A 3J
797 1131275-R-05 G11 245.31 2.66438 2 -3 J_5 A 3J
905 1131275-R-06 E08 251.25 1.7622 2 -4.617 J_6 A 3J
903 1131275-R-06 D08 256.3 1.7577 2 -3.001 J_7 A 3J
665 1131275-R-05 E03 261.31 1.40144 2 -3.046 J_8 A 3J
347 1131275-R-03 F03 281.31 1.70268 3 -3.939 J_9 A 3J
615 1131275-R-04 D10 294.3 2.42944 3 -3.885 J_10 A 3J
IL-33의 반응성의 종결을 위해 투입한 IAA와의 반응량 대비 IL-33와 화합물의 결합량에 대한 비율에서 큰 값을 보이는 화합물이 H-1(Plate ID: 1131275-R-03_E07)(표 5의 H그룹 1번 화합물, 이후 “H-1 화합물”로 명명)으로 확인되었다. H-1 화합물로 인해 H그룹이 전체적으로 높은 랭크 레벨을 가진 것을 고려해 보면, IL-33 Cys K/O N226C 과 E269C의 단백질에서 공통적으로 G-8(Plate ID: 1131275-R-03_D02)(표 5의 G그룹의 8번 화합물, 이후 “G-8 화합물”로 명명)의 화합물의 반응성도 크게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 상위 10개의 화합물에 대한 반응성을 wt IL-33단백질을 사용하여 1H NMR을 통해 확인하였고, 그 중 G-8 화합물이 큰 반응성을 나타내 유효 화합물 2로 선별하였다(도 6).
IL-33와 반응한 IAA의 비율을 기준으로 한 상대적 비율에 따른 화합물의 반응 순위
IL-33 Cys K/O N226C IL-33 Cys K/O E269C
Sample name Intensity IL33_drug
/IL33_IAA		 Rank Sample name Intensity IL33_drug
/IL33_IAA		 Rank
IL33_Group3H_1 3.79E+08 23.71 1 IL33_Group3H_1 5.08E+07 11.02 1
IL33_Group3H_5 4.92E+07 3.08 2 IL33_Group3H_5 5.71E+06 1.24 2
IL33_Group3H_8 1.41E+07 0.88 3 IL33_Group3H_10 3.49E+06 0.76 3
IL33_Group3G_8 2.56E+08 0.80 4 IL33_Group3F_5 7.71E+08 0.47 4
IL33_Group3F_5 2.24E+08 0.55 5 IL33_Group3C_9 2.83E+07 0.4 5
IL33_Group3C_9 2.16E+08 0.53 6 IL33_Group3G_8 4.28E+07 0.36 6
IL33_Group3D_6 1.60E+08 0.41 7 IL33_Group3H_8 1.66E+06 0.36 6
IL33_Group3C_2 1.24E+08 0.30 8 IL33_Group3D_7 3.44E+07 0.23 8
IL33_Group3E_7 1.32E+08 0.26 9 IL33_Group3C_2 6.00E+06 0.09 9
IL33_Group3H_6 2.50E+06 0.16 10 IL33_Group3C_4 6.55E+06 0.09 9
IL33_Group3D_9 5.34E+07 0.14 11 IL33_Group3B_1 1.62E+07 0.08 11
IL33_Group3B_1 5.42E+07 0.11 12 IL33_Group3E_7 2.60E+06 0.08 11
IL33_Group3E_5 5.72E+07 0.11 12 IL33_Group3D_3 8.30E+06 0.05 13
IL33_Group3J_10 4.78E+07 0.09 14 IL33_Group3E_5 1.64E+06 0.05 13
IL33_Group3D_3 2.57E+07 0.07 15 IL33_Group3G_4 5.73E+06 0.05 13
IL33_Group3G_3 2.32E+07 0.07 15 IL33_Group3J_10 1.42E+07 0.05 13
IL33_Group3C_4 2.46E+07 0.05 17 IL33_Group3C_6 2.51E+06 0.04 17
IL33_Group3F_1 1.80E+07 0.04 18 IL33_Group3D_9 6.55E+06 0.04 17
IL33_Group3I_1 1.90E+07 0.04 18 IL33_Group3F_1 7.33E+07 0.04 17
IL33_Group3G_5 9.35E+06 0.03 20 IL33_Group3J_9 9.12E+06 0.03 20
IL33_Group3J_3 1.39E+07 0.03 20
IL33_Group3J_9 1.39E+07 0.03 20
IL33_Group3B_9 1.10E+07 0.02 23 IL33_Group3I_8 2.09E+06 0.02 21
IL33_Group3E_10 8.07E+06 0.02 23 IL33_Group3A_6 2.45E+06 0.01 22
IL33_Group3I_7 9.11E+06 0.02 23 IL33_Group3B_9 2.43E+06 0.01 22
IL33_Group3A_6 7.60E+06 0.01 26 IL33_Group3F_7 2.30E+06 0.01 22
IL33_Group3E_3 5.31E+06 0.01 26 IL33_Group3G_5 1.57E+06 0.01 22
IL33_Group3F_7 3.77E+06 0.01 26 IL33_Group3G_10 1.64E+08 0.01 22
IL33_Group3J_7 4.97E+06 0.01 26 IL33_Group3I_1 1.46E+06 0.01 22
IL33_Group3B_4 2.28E+06 0.005 30 IL33_Group3J_8 2.23E+06 0.01 22
IL33_Group3J_8 2.60E+06 0.005 30
Figure pat00027
[유효 화합물2]
4-3. 유효 화합물 3 내지 8의 선별
4-3-1. LC-MS/MS 실험을 통한 스크리닝(IL-33 Cys K/O E269C)
ENAMINE 사의 3200종의 시스테인에 공유결합하는 프레그먼트 라이브러리의 화합물에서 상기 실시예 4-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 1,011종의 화합물을 분류했다. 1,011종의 선택된 화합물에 대해서 warhead 기준으로 아크릴아미드와 클로로아크릴아미드의 warhead를 분류하니 699개와 312개로 나뉘어졌다. 각각, 분자량이 3 Dalton이상 차이가 나도록, 아크릴아미드 그룹에서 10개씩의 화합물로 28개의 그룹을 선택하고, 클로로아크릴아미드 그룹에서 10개씩의 화합물로 22개의 그룹을 선택하여 총 50개의 그룹으로 나뉜 화합물의 혼합물로 스크리닝을 진행하였다. IL-33 Cys K/O E269C단백질을 바탕으로 각각 10개의 화합물을 한 batch로 묶어서 실험을 진행하였다. 그 결과, IL-33 Cys K/O E269C 단백질과 결합하고 있는 화합물을 결합 순위에 따라 표 7및 표 8에 나타내었다. 표 7에서 Binding index는 표준 펩타이드 (E.AKTDPGVFIGVKD.N) 대비 화합물이 결합한 펩타이드 피크 세기를 나타낸 값으로 화합물의 결합 강도와 비례한다.
LS-MS/MS로 분석한 IL-33 Cys K/O E269C 단백질과 결합하고 있는 화합물의 결합 순위
Rank. Name M.W. Binding index
(Complex peak / Ref.(E.AKTDPGVFIGVKD.N)
1 3H-IL33-03-E07(H1) 271.1430 1.5908
2 12A-IL33-15-C10 244.1576 0.7961
3 8C-IL33-36-B04 237.0936 0.7050
4 19A-IL33-07-E04 265.0773 0.4662
5 1A-IL33-40-G08 389.0025 0.4379
6 5A-IL33-17-F03 286.1230 0.4181
7 11A-IL33-21-A05 255.1372 0.3991
8 22A-IL33-13-H04 292.0882 0.3839
9 8A-IL33-01-B09 258.1038 0.3831
10 7C-IL33-31-D07 280.0881 0.3702
11 1A-IL33-04-A05 248.0961 0.3643
12 8C-IL33-39-F04 302.0536 0.3454
13 4A-IL33-40-G10 321.2052 0.3319
14 7A-IL33-01-A03 285.0783 0.3293
15 10A-IL33-06-E04 271.1321 0.2981
16 7C-IL33-31-D06 238.0412 0.2923
17 3A-IL33-19-F06 268.1324 0.2755
18 9C-IL33-39-G03 302.0536 0.2659
19 23A-IL33-07-F02 254.1168 0.2449
20 1C-IL33-38-A11 318.0241 0.2403
21 20A-IL33-05-C04 251.0616 0.2352
22 8A-IL33-08-C11 285.1226 0.2254
23 24A-IL33-21-D10 270.0616 0.2208
24 14C-IL33-25-G07 266.0725 0.2135
25 3A-IL33-14-H03 256.0800 0.2083
26 26A-IL33-03-E06 253.0982 0.1984
27 22C-IL33-32-E07 271.0337 0.1798
28 19C-IL33-25-H09 284.0631 0.1770
29 17C-IL33-39-A04 272.0289 0.1687
30 17A-IL33-17-A06 283.1321 0.1590
31 5C-IL33-26-F10 280.0881 0.1498
32 21A-IL33-17-F06 251.1270 0.1453
33 7A-IL33-21-H04 266.0725 0.1426
34 8C-IL33-36-F09 279.0677 0.1395
35 8A-IL33-19-B11 315.1617 0.1393
36 1C-IL33-34-E05 255.0677 0.1361
37 7A-IL33-16-B05 250.0776 0.1335
38 3A-IL33-11-F04 253.1215 0.1283
39 8A-IL33-40-C04 250.1140 0.1227
40 3C-IL33-39-E03 305.9899 0.1156
LS-MS/MS로 분석한 IL-33 Cys K/O E269C 단백질과 결합하고 있는 화합물의 구조 정보
Name Rank. Structure M.W. Formula Binding index
(Complex peak / Ref.(E.AKTDPGVFIGVKD.N)
3H-IL33-03-E07(H1) 1
Figure pat00028
 271.1430 C14H17N5O 1.5908
12A-IL33-15-C10 2
Figure pat00029
 244.1576 C15H20N2O 0.7961
8C-IL33-36-B04 3
Figure pat00030
 237.0936 C11H16ClN3OS 0.7050
19A-IL33-07-E04 4
Figure pat00031
 265.0773 C13H15NO3S 0.4662
1A-IL33-40-G08 5
Figure pat00032
 389.0025 C16H12IN3O 0.4379
5A-IL33-17-F03 6
Figure pat00033
 286.1230 C15H15FN4O 0.4181
11A-IL33-21-A05 7
Figure pat00034
 255.1372 C15H17N3O 0.3991
22A-IL33-13-H04 8
Figure pat00035
 292.0882 C14H16N2O3S 0.3839
8A-IL33-01-B09 9
Figure pat00036
 258.1038 C11H18N2O3S 0.3831
7C-IL33-31-D07 10
Figure pat00037
 280.0881 C13H17ClN2O3S 0.3702
1A-IL33-04-A05 11
Figure pat00038
 248.0961 C13H13FN2O2 0.3643
8C-IL33-39-F04 12
Figure pat00039
 302.0536 C12H13ClF2N2O3S 0.3454
4A-IL33-40-G10 13
Figure pat00040
 321.2052 C17H27N3O3 0.3319
7A-IL33-01-A03 14
Figure pat00041
 285.0783 C11H15N3O4S 0.3293
10A-IL33-06-E04 15
Figure pat00042
 271.1321 C15H17N3O2 0.2981
7C-IL33-31-D06 16
Figure pat00043
 238.0412 C10H11ClN2O3S 0.2923
3A-IL33-19-F06 17
Figure pat00044
 268.1324 C15H16N4O 0.2755
9C-IL33-39-G03 18
Figure pat00045
 302.0536 C12H13ClF2N2O3S 0.2659
23A-IL33-07-F02 19
Figure pat00046
 254.1168 C14H14N4O 0.2449
1C-IL33-38-A11 20
Figure pat00047
 318.0241 C12H13Cl2FN2O3S 0.2403
20A-IL33-05-C04 21
Figure pat00048
 251.0616 C12H13NO3S 0.2352
8A-IL33-08-C11 22
Figure pat00049
 285.1226 C14H15N5O2 0.2254
24A-IL33-21-D10 23
Figure pat00050
 270.0616 C12H9F3N2O2 0.2208
14C-IL33-25-G07 24
Figure pat00051
 266.0725 C12H15ClN2O3S 0.2135
3A-IL33-14-H03 25
Figure pat00052
 256.0800 C11H16N2O3S 0.2083
26A-IL33-03-E06 26
Figure pat00053
 253.0982 C12H16ClN3O 0.1984
22C-IL33-32-E07 27
Figure pat00054
 271.0337 C11H14ClNO3S2 0.1798
19C-IL33-25-H09 28
Figure pat00055
 284.0631 C12H14ClFN2O3S 0.1770
17C-IL33-39-A04 29
Figure pat00056
 272.0289 C10H13ClN2O3S2 0.1687
17A-IL33-17-A06 30
Figure pat00057
 283.1321 C16H17N3O2 0.1590
5C-IL33-26-F10 31
Figure pat00058
 280.0881 C13H17ClN2O3S 0.1498
21A-IL33-17-F06 32
Figure pat00059
 251.1270 C12H17N3O3 0.1453
7A-IL33-21-H04 33
Figure pat00060
 266.0725 C12H14N2O3S 0.1426
8C-IL33-36-F09 34
Figure pat00061
 279.0677 C12H14ClN3O3S 0.1395
8A-IL33-19-B11 35
Figure pat00062
 315.1617 C14H25N3O3S 0.1393
1C-IL33-34-E05 36
Figure pat00063
 255.0677 C10H14ClN3O3S 0.1361
7A-IL33-16-B05 37
Figure pat00064
 250.0776 C12H14N2O2S 0.1335
3A-IL33-11-F04 38
Figure pat00065
 253.1215 C15H15N3O 0.1283
8A-IL33-40-C04 39
Figure pat00066
 250.1140 C13H18N2OS 0.1227
3C-IL33-39-E03 40
Figure pat00067
 305.9899 C10H12Cl2N2O3S2 0.1156
IL-33 Cys K/O E269C 단백질을 사용한 스크리닝에서 LC-MS/MS분석을 통하여 반응성이 강하게 나타난 구조는 1131275-R-03_E07(H-1) 화합물이였다. 이는 전 단계의 스크리닝의 결과와 유사한 결과로1131275-R-03_E07(H-1) 화합물의 반응성을 확인하기 위하여 nano-DSF 측정을 실시했다(도 7). H-1 화합물을 사용하여 nano-DSF실험을 측정한 결과, H-1화합물 경우에 4 ℃이상의 Tm값의 차이를 보이며 강한 반응성을 나타내 유효 화합물 3으로 선별하였다.
Figure pat00068
[유효 화합물 3]
4-3-1. 1 H NMR 분석
상기 표 8에 나타난40종의 화합물에 대한 특이적 결합구조를 특정하기 위하여IL-33 Cys K/O 단백질을 사용하여 추가적인 1H NMR분석을 통한 결합실험을 실시하였다. 0.1mM의 화합물에 대하여 20μM의 단백질이 존재하는 조건과 존재하지 않는 조건에서의 1H NMR 분석을 통하여 결합 여부를 스크리닝하였다. 그 결과, 40종의 화합물 가운데 6가지의 화합물에 대하여 특이적인 반응성을 나타내었다. 그 중 하나는 상기 유효 화합물 2로 선별된 G-8화합물(Plate ID: 1131275-R-03_D02)의 구조이고, 나머지는 스크리닝 ID가 22A-IL33-13-H04(plate ID: 1131275-R-13_H04), 36-B04 (plate ID: 1131275-R-36_B04), 31-D06 (plate ID: 1131275-R-31-D06), 39-G03 (plate ID: 1131275-R-39-G03), 21-H04 (plate ID: 1131275-R-21-H04) 인 화합물로 유효 화합물 4 내지 8로 선별하였다(도 8 내지 도 12).
Figure pat00069
[유효 화합물 4]
Figure pat00070
[유효 화합물 5]
Figure pat00071
[유효 화합물 6]
Figure pat00072
[유효 화합물 7]
Figure pat00073
[유효 화합물 8]
4-4. 유효 화합물 9 및 10의 선별
상기 실시예 4-1-1 및 4-2-1의 스크리닝 방법을 사용하여 공통의 hit compounds를 비교하여 유효화합물로 선별하였다. 두 가지 스크리닝을 통하여 공통으로 hit 된 화합물이 3가지가 있었다.
그 중 첫 번째가 유효 화합물 3으로 선택된 H-1(Plate ID: 1131275-R-03_E07) 화합물이고, 다른 두 가지 화합물은 31-D07(plate ID: 1131275-R-31-D07) 및 21-D10(plate ID: 1131275-R-21-D10) 화합물로, 이 화합물을 각각 유효 화합물 9 및 10으로 선별하였다.
Figure pat00074
[유효 화합물 9]
Figure pat00075
[유효 화합물 10]
상기 스크리닝 과정을 통해 IL-33에 결합하는 10 가지 유효화합물을 선별하였다.
유효 화합물1: 29-H07 (Plate ID: 1131275-R-29_H07)
유효 화합물 2: G-8 (Plate ID: 1131275-R-03_D02)
유효 화합물 3: H-1 (Plate ID: 1131275-R-03_E07)
유효 화합물 4: 22A-IL33-13-H04 (plate ID: 1131275-R-13_H04)
유효 화합물 5: 36-B04 (plate ID: 1131275-R-36_B04)
유효 화합물 6: 31-D06 (plate ID: 1131275-R-31-D06)
유효 화합물 7: 39-G03 (plate ID: 1131275-R-39-G03)
유효 화합물 8: 21-H04 (plate ID: 1131275-R-21-H04)
유효 화합물 9: 31-D07 (plate ID: 1131275-R-31-D07)
유효 화합물 10: 21-D10 (plate ID: 1131275-R-21-D10)
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<210> 2 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtgtgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac tgtgtttcat ttgaatgcaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtgta ctgaaaatat cttgtttaag ctctctgaaa ct 462 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) protein sequence <400> 3 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ala Val 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 <210> 4 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) DNA sequence <400> 4 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac gcggtttcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtcta ctgaaaatat cttgtttaag ctctctgaaa ct 462 <210> 5 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) N226C protein sequence <400> 5 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Cys Ala Val 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 <210> 6 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) N226C DNA sequence <400> 6 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactcctgc gcggtttcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtcta ctgaaaatat cttgtttaag ctctctgaaa ct 462 <210> 7 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) V228C protein sequence <400> 7 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ala Cys 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 <210> 8 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) V228C DNA sequence <400> 8 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac gcgtgctcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtcta ctgaaaatat cttgtttaag ctctctgaaa ct 462 <210> 9 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) L267C protein sequence <400> 9 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ala Val 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Cys Ser Glu Thr 145 150 <210> 10 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) L267C DNA sequence <400> 10 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac gcggtttcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtcta ctgaaaatat cttgtttaag tgctctgaaa ct 462 <210> 11 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) E269C protein sequence <400> 11 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ala Val 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Cys Thr 145 150 <210> 12 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-33 4Cysteine knock-out(K/O) E269C DNA sequence <400> 12 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac gcggtttcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtcta ctgaaaatat cttgtttaag ctctcttgca ct 462 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C208S_for primer <400> 13 gagctccata agtctgaaaa accactg 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C208S_rev primer <400> 14 cagtggtttt tcagacttat ggagctc 27 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C227A_C232A_for primer <400> 15 atgcactcca acgcggtttc atttgaagcg aagactgatc c 41 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C227A_C232A_rev primer <400> 16 ggatcagtct tcgcttcaaa tgaaaccgcg ttggagtgca t 41 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C259S_for primer <400> 17 ctcttctgag aatttgtcta ctgaaaatat cttgt 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C259S_rev primer <400> 18 acaagatatt ttcagtagac aaattctcag aagag 35 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L267C_for primer <400> 19 gaaaatatct tgtttaagtg ctctgaaact tgagtcg 37 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L267C_rev primer <400> 20 gtcgactcaa gtttcagagc acttaaacaa gata 34 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N226C_for primer <400> 21 cataatatgc actcctgcgc ggtttcattt gaa 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N226C_rev primer <400> 22 ttcaaatgaa accgcgcagg agtgcatatt atg 33 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V228C_for primer <400> 23 atgcactcca acgcgtgctc atttgaat 28 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V228C_rev primer <400> 24 cttgcattca aatgagcacg cgttggagt 29 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E269C_for primer <400> 25 ttgtttaagc tctcttgcac ttgagtcgac 30 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E269C_rev primer <400> 26 ctcgtcgact caagtgcaag agagctt 27

Claims (16)

  1. a) IL-33 단백질의 수용체 결합 부위에 시스테인 잔기를 도입하여 IL-33 단백질 변이체를 제작하는 단계;
    b) 후보 화합물과 시스테인 잔기가 도입된 IL-33 단백질 변이체를 반응시키는 단계; 및
    c) 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체 간에 시스테인 공유결합 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 IL-33 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-33 단백질의 226번 위치의 아스파라긴(Asn) 잔기, 228번 위치의 발린(Val) 잔기, 267번 위치의 류신(Leu) 잔기 및 269번 위치의 글루탐산(Glu) 잔기 중 어느 하나를 시스테인(Cys)으로 치환한 것을 특징으로 하는 IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 IL-33 단백질 변이체는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 Tm 값과 IL-33 단백질 변이체의 Tm 값의 차이를 측정하는 것인, IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 Tm 값과 IL-33 단백질 변이체의 Tm 값의 차이가 3 내지 6인 경우에 상기 후보 화합물을 유효 화합물로 선별하는 것을 특징으로 하는 IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 분자량과 IL-33 단백질 변이체의 분자량을 확인하는 것인, IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 후보 화합물과 IL-33 단백질 변이체가 결합한 복합체의 분자량과 IL-33 단백질 변이체의 분자량 비율이 0.1 내지 1.7인 경우에 상기 후보 화합물을 유효 화합물로 선별하는 것을 특징으로 하는 IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 IL-33단백질에 결합하는 화합물은 하기 화학식 1 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 것인, IL-33 단백질 저해용 화합물을 스크리닝하는 방법.
    Figure pat00076

    [화학식 1]
    Figure pat00077

    [화학식 2]
    Figure pat00078

    [화학식 3]
    Figure pat00079

    [화학식 4]
    Figure pat00080

    [화학식5]
    Figure pat00081

    [화학식6]
    Figure pat00082

    [화학식 7]
    Figure pat00083

    [화학식 8]
    Figure pat00084

    [화학식 9]
    Figure pat00085

    [화학식 10]
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-33 단백질의 226번 위치의 아스파라긴(Asn) 잔기, 228번 위치의 발린(Val) 잔기, 267번 위치의 류신(Leu) 잔기 및 269번 위치의 글루탐산(Glu) 잔기 중 어느 하나를 시스테인(Cys)으로 치환한 것을 특징으로 하는 IL-33 단백질 변이체.
  10. 제 9항의 IL-33 단백질 변이체를 코딩하는 핵산.
  11. 제 10항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제 11항의 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체.
  13. 제 9항의 IL-33 단백질 변이체를 제작하기 위한 서열번호 19및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍으로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍.
  14. 하기 화학식 1 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 알러지성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
    Figure pat00086

    [화학식 1]
    Figure pat00087

    [화학식 2]
    Figure pat00088

    [화학식 3]
    Figure pat00089

    [화학식 4]
    Figure pat00090

    [화학식5]
    Figure pat00091

    [화학식6]
    Figure pat00092

    [화학식 7]
    Figure pat00093

    [화학식 8]
    Figure pat00094

    [화학식 9]
    Figure pat00095

    [화학식 10]
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 알러지성 질환은 천식, 아토피성 피부염, 두드러기 비염 또는 알러지성 비염　질환인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  16. 하기 화학식 1 내지 10 으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나와, 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    Figure pat00096

    [화학식 1]
    Figure pat00097

    [화학식 2]
    Figure pat00098

    [화학식 3]
    Figure pat00099

    [화학식 4]
    Figure pat00100

    [화학식5]
    Figure pat00101

    [화학식6]
    Figure pat00102

    [화학식 7]
    Figure pat00103

    [화학식 8]
    Figure pat00104

    [화학식 9]
    Figure pat00105

    [화학식 10]
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