CN102816205A - β抑制蛋白1、其片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体，它们的编码核酸、重组载体、宿主细胞，以及包含它们的药物组合物。本发明还涉及制备本发明β抑制蛋白1或其片段或变异体的方法。另一方面，本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体在治疗或预防PPARγ介导的疾病中的应用，以及β抑制蛋白1或其片段或变异体在制备治疗或预防PPARγ介导的疾病的药物中的应用，所述疾病具体是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。本发明还涉及一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法。

Description

β抑制蛋白1、其片段及其应用

技术领域

本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体，它们的编码核酸、重组载体、宿主细胞，以及包含它们的药物组合物。本发明还涉及制备本发明β抑制蛋白1或其片段或变异体的方法。另一方面，本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体在治疗或预防PPARγ介导的疾病中的应用，以及β抑制蛋白1或其片段或变异体在制备治疗或预防PPARγ介导的疾病的药物中的应用，所述疾病具体是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。本发明还涉及一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法。 

背景技术

肥胖症的发病率的不断增加是一个严重的世界性问题。在美国，只有约三分之一的成年人被认为是正常的体重，并且可以观察到类似的趋势正在全球范围内蔓延。肥胖被认为是胰岛素抵抗，2型糖尿病和心血管疾病的主要危险因素。据统计，2009年全世界约有2.85亿人患有糖尿病，而到了2030年这一数字预计将增加至4.35亿。 

脂肪组织的异常积累，脂肪组织中的巨噬细胞浸润和炎症反应是肥胖的主要病理特征。此外，许多研究表明，脂肪组织控制体脂平衡，从而调节全身葡萄糖和脂质代谢平衡。肥胖引起的炎症反应被认为是一个潜在的机制将肥胖与相关疾病如胰岛素抵抗，心血管疾病，2型糖尿病和其他免疫系统疾病联系起来。然而，肥胖发生的细胞和分子机制是非常复杂，目前的研究还没有完全揭示清楚。 

脂肪组织是一个重要的代谢器官，对整个人体胰岛素敏感性和能量平衡至关重要。脂肪细胞的发育对人类疾病有许多影响。目前最大的一类健康问题与肥胖相关，其中大部分是由过多的脂肪细胞堆积引起的。脂肪细胞的发育生成 是一个多步骤的过程，大量标志性基因的表达调控着脂肪细胞的生成。在脂肪细胞生成的过程中，成纤维细胞样的前体脂肪细胞分化成包涵脂滴和具有胰岛素敏感性的脂肪细胞。这一过程发生在几个阶段，并且涉及到一系列的转录因子级联反应，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)被认为是脂肪细胞发育生成的重要决定因素。 

在肥胖的小鼠模型和人类患者中，白色脂肪组织是巨噬细胞浸润的一个重要目标，而这一浸润会导致体质指数(BMI)比例上升和脂肪细胞的肥大。在脂肪组织中的这一群巨噬细胞可能会提高“低水平”慢性炎症与肥胖的发生。巨噬细胞在脂肪组织中积累也确实增加了循环系统中一些炎症细胞因子的浓度。而炎症分子可能正是分子水平联系脂肪组织和整体代谢，心血管，肝脏方面的肥胖并发症的‘链接'。特别是，激活的巨噬细胞会增加肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和抗胰岛素蛋白的水平进而直接造成脂肪堆积导致的胰岛素敏感性的变化。 

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)作为一个有转录调控功能的核受体，是调控脂肪细胞分化和巨噬细胞的功能的关键分子。PPARγ与9顺式维甲酸(9-cis-RA)受体(RXR)可以形成二聚化的复合体，结合在PPARγ反应元件上，招募各种不同的辅助因子介导下游基因的转录调控。PPARγ的激活可以介导一系列PPARγ的下游靶基因，包括脂肪细胞的蛋白质、脂肪酸转运蛋白、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶等基因的表达(1,2)。这些脂肪细胞的特异性基因的表达导致游离的脂肪酸进入脂肪细胞和其他组织(3)。在活化的巨噬细胞中，激活的PPARγ可以通过调节免疫反应基因的转录来抑制炎症反应(4)。通过这些方式，PPARγ调控着脂肪细胞和巨噬细胞功能，有助于实现整个人体能量平衡，并已成为研究肥胖和糖尿病的中心焦点。 

传统上，β抑制蛋白分为β抑制蛋白1和β抑制蛋白2，它们是G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路中重要的负调控因子，可以介导G蛋白偶联受体的脱敏和内吞。最近的研究表明，β抑制蛋白除了对GPCR的那些经典功能之外，还可以结合不同的信号通路分子，作为一个多功能的蛋白质复合物(5-8)行使功能。 

我们最近的研究发现，主要定位于细胞质中的β抑制蛋白2，在胰岛素刺 激下，可以作为一个不可缺少的支架，链接Akt和Src以及胰岛素受体(IR)，介导胰岛素信号通路中的信号复合物(IR/Akt/β-抑制蛋白2/Src)的形成，而这一复合物对胰岛素信号的传递以及胰岛素代谢功能的行使起了至关重要的作用。并且β抑制蛋白2的敲除增加了胰岛素的抵抗(9)。而β抑制蛋白1和β抑制蛋白2显示不同的亚细胞定位。刺激后，β抑制蛋白1可以转运到细胞核，调节基因转录(10)。 

发明内容

在本发明中，我们发现在细胞核内，β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用负调控PPARγ的转录活性，从而抑制PPARγ下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。在动物中敲除β抑制蛋白1会影响PPARγ介导的脂代谢相关基因和炎症反应相关基因的表达，进而促进饮食引起的肥胖症的发生；而在动物体内过表达β抑制蛋白1可以抑制脂肪细胞生成和巨噬细胞的侵入，进而防止食物引发的肥胖症以及改善葡萄糖耐受和整体胰岛素的敏感性。同时，不结合PPARγ的β抑制蛋白1的突变体不能抑制PPARγ介导的脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，因而无法防止发生饮食诱导的肥胖。另外，本发明还令人惊讶地发现了一系列短肽TS1、TS3、βarr2M、T18、T16、T14、T11和MD6，TS1由β抑制蛋白1上与PPARγ结合结构域结合的20个氨基酸(氨基酸残基246-265)组成，TS3由β抑制蛋白1上TS1内的12个氨基酸(氨基酸残基253-264)组成，βarr2M为β抑制蛋白2的Q256、L257、Q259、Q262和S264氨基酸残基用β抑制蛋白1的M255、E256、A258、T261和A263替代产生的突变体，T18由β抑制蛋白1上TS 1内的18个氨基酸(氨基酸残基248-265)组成，T16由β抑制蛋白1上TS 1内的16个氨基酸(氨基酸残基250-265)组成，T14由β抑制蛋白1上TS 1内的14个氨基酸(氨基酸残基252-265)组成，T11由β抑制蛋白1上TS1内的11个氨基酸(氨基酸残基255-265)组成，MD6由β抑制蛋白1上TS1内的6个氨基酸(氨基酸残基255-260)组成。这些短肽与PPARγ的相互作用能够负调控PPARγ的转录活性，从而抑制PPARγ下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。这种短肽 的发现使得在产业上能够更方便地制备并且在临床上能够更方便地使用这种治疗/预防性肽或其编码核酸、重组载体或宿主细胞，并且能更有效地实现与PPARγ的相互作用。 

基于以上发现，本发明提供一种分离多肽。在一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO：3或由其组成。在另一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO：13或由其组成。在另一优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO：1或由其组成。在另一优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO：10或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO：67-71中任一项所述序列或由其组成。在优选实施方式中，本发明提供一种多肽，其包含与SEQ ID NO：3的序列相同性为约99.8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的氨基酸序列，所述多肽中与SEQ ID NO：3的253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基。例如，本发明提供一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：10或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽能够与PPARγ特异性结合，优选抑制PPARγ的活性。在一个实施方式中，本发明多肽可以包含或不包含本领域已知的标签或信号肽，例如HA标签或Flag标签或TAT标签。本发明多肽还包括β抑制蛋白1或其片段、衍生物和类似物。本发明多肽的长度可以是6个氨基酸残基、9个氨基酸残基、12个氨基酸残基、15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、30个氨基酸残基、50个氨基酸残基、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或更 多个氨基酸残基，或其间任何范围。 

在一个实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO：14所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO：5所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO：7所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO：12所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO：73-77中任一项所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在另一个实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO：14所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO：5所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO：7所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO：12所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO：73-77中任一项所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO：14所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO：5所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO：7所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO：12所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO：73-77中任一项所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。 

在一个实施方式中，本发明多肽包含由SEQ ID NO：1、10、13、67-71中任一项所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的氨基酸序列，或由其组成的多肽。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生 的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽能够与PPARγ特异性结合，优选抑制PPARγ的活性。 

在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码本发明所述的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQID NO：3、10或13的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：67-71中任一项的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO：3的序列相同性为约99.8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的氨基酸序列的多肽，所述多肽中与SEQ ID NO：3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO：3的255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基；例如，所述多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：10或由其组成。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含与SEQ ID NO：7的序列相同性为约99.8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的核苷酸序列。例如，本发明提供一种核酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：12。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其在严谨条件下与SEQ ID NO：7或12杂交，且与SEQ ID NO：7或12的互补性为约99.8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%。 

在一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含SEQ ID NO：14或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ ID NO：5或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含SEQ ID NO：7或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ ID NO：12或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ ID NO：73-77中任一项或由其组成。在一个实施方式中，本发明核酸可以包含或不包含本领域已知的标签或信号肽的编码序列，例如HA标签或Flag标签或TAT标签的编码序列。本发明核酸的长度可以是18个、27个、36个、45个、60个、90个、150个、300个、450个、600个、750个、900个、1050个、1200个、1350个或更多个核苷酸残基，或其间任何范围。 

在一个实施方式中，本发明提供一种重组载体，其包含本发明的核酸。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在原核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在真核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在大肠杆菌中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在酵母中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在动物细胞中表达的载体，例如杆状病毒载体。更优选地，本发明提供的重组载体可以包含适合在高等动物细胞，例如鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞、羊细胞或人细胞中表达的载体，例如腺病毒载体。具体说，本发明提供的重组载体可以包含腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、HIV病毒载体或pShuttle-CMV载体。 

在一个实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的重组载体，所述重组载体可以整合或不整合到所述宿主细胞的基因组内。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是原核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是真核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。在另一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是酵母细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是昆虫细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞；具体可以是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞、鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞或人细胞。在一个优选实施方式中， 本发明提供的宿主细胞是人细胞系，例如HEK293细胞系。 

另一方面，本发明还提供一种制备本发明多肽的方法，其依次包括以下步骤： 

i)培养本发明宿主细胞， 

ii)诱导其表达， 

iii)收获表达产物，和 

iv)任选地，纯化表达产物。 

在一个实施方式中，本发明方法还包括用本发明重组载体转化或转导宿主细胞的步骤。在另一个实施方式中，本发明方法还包括将本发明核酸可操作地连接到载体中的步骤。 

另一方面，本发明还提供一种在对象中治疗或预防PPARγ介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明多肽给予对象。本发明还提供一种在对象中治疗或预防PPARγ介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明核酸给予对象。本发明还提供一种在对象中治疗或预防PPARγ介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明重组载体给予对象。 

另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明多肽以及药学上可接受的运载体或赋形剂。另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明核酸以及药学上可接受的运载体或赋形剂。另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明重组载体以及药学上可接受的运载体或赋形剂。本发明的药物组合物可用于预防或治疗PPARγ介导的疾病。 

另一方面，本发明还提供本发明多肽、核酸或重组载体在制备用于治疗或预防PPARγ介导的疾病的药物中的应用。又一方面，本发明还提供β抑制蛋白1、其编码核酸或重组载体在制备用于治疗或预防PPARγ介导的疾病的药物中的应用。 

具体说，本发明所述的PPARγ介导的疾病可以是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症，例如II型胰岛素抵抗性糖尿病。 

本发明提供一种在体外或体内抑制PPARγ活性的方法，所述方法包括应用本发明所述的多肽、核酸或重组载体。 

本发明还提供一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法，所述方法包括待筛药物与PPARγ相接触和测定PPARγ活性的步骤，如果接触后PPARγ活性降低则将该待筛药物鉴定为治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物。 

此外，文发明还提供一种筛选特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤：i)构建表达全长的PPARγ或PPARδ与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPARγ和PPARδ质粒；ii)构建全长的RXRα与另一转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRα质粒；iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件；iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞；v)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达；vi)以PPARδ与RXRα的相互作用作为对照，筛选特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物。在一个实施方式中，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。在一个实施方式中，步骤ii)和iii)中所述转录调控因子是Gal4。在一个实施方式中，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。在一个实施方式中，步骤iv)中所述细胞为293细胞。 

附图说明

图1.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD)18周的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体重变化(每组n=10)。 

图2.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD)14周的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体重增加值(每组n=10)。 

图3.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD)14周的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体长值(每组n=10)。 

图4.喂食RD或HFD的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血液中甘油三酯(TG)(左)和游离脂肪酸(NEFA)(右)的含量(每组n=10)。 

图5.喂食RD或HFD 14周后，核磁共振分析的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko 小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的瘦体重和脂肪含量(每组n=10)。 

图6.喂食RD或HFD的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的白色脂肪组织的H＆E染色石蜡包埋切片的显微照片(图例，200微米)。 

图7.喂食RD或HFD的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的白色脂肪组织的脂肪细胞直径。 

图8.在葡萄糖耐受试验(GTT)(左)和胰岛素耐受试验(ITT)(右)中，正常饲料喂养时βarr1-tg小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。 

图9.在葡萄糖耐受试验(GTT)(左)和胰岛素耐受试验(ITT)(右)中，正常饲料喂养时βarr1-ko小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的的血糖水平的时程变化。 

图10.在RD和HFD处理14周之后，βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血糖水平。 

图11.在RD和HFD处理14周之后，βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血液胰岛素水平。 

图12.在葡萄糖耐受试验(GTT)中，高脂饮食饲养的βarr1-tg小鼠(Tg)和野生型小鼠(WT)的血糖水平(左)和血液胰岛素水平(右)的时程变化。 

图13.在胰岛素耐受试验(ITT)中，高脂饮食饲养的βarr1-tg小鼠(Tg)和野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。 

图14.在葡萄糖耐受试验(GTT)中，高脂饮食饲养的βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血糖水平(左)和血液胰岛素水平(右)的时程变化。 

图15.在胰岛素耐受试验(ITT)中，高脂饮食饲养的βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。 

图16.在高胰岛素-正糖钳夹实验中，在基础状态(A)和钳夹状态(B)时正常饮食或高脂饮食处理的βarr1-ko小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的肝糖输出水平；以及KO小鼠与WT小鼠在正常饮食和高脂饮食处理后整体葡萄糖清除率(GDR)(C)和葡萄糖输注率(GIR)(D)的变化。 

图17.喂食HFD的βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)白色脂肪组织的石蜡切片，用抗F4/80抗体做免疫组化(图例，200微米)。 

图18.ELISA法测定喂食RD或HFD的βarr1-tg(Tg)小鼠、βarr1-ko(KO)小 鼠和野生型小鼠(WT)的血清中炎症细胞因子TNF-α(左)、IL-6(中)和MCP-1(右)的分泌水平(每组n=10)。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值±平均标准误，*表示P<0.05。 

图19.在βarr1-tg小鼠(Tg)、βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的MEF在向脂肪细胞分化第4天，用RT–qPCR检测细胞中多种基因的mRNA水平。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值±平均标准误。 

图20.RT–qPCR检测βarr1-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的原代培养巨噬细胞中几种炎症因子的mRNA水平(LPS：内毒素；Ro：罗格列酮)。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值±平均标准误。 

图21.用输入DNA的百分比表示的PPARγ、RXRα和NCoR在Nos2和CD36基因启动子上的结合。数据显示为平均值±平均标准误，*表示P<0.05。 

图22.在C57BL/6小鼠白色脂肪组织(WAT)细胞裂解液中用抗β抑制蛋白1和抗RXRα的抗体进行的免疫沉淀后，用PPARγ、RXRα和βarr的抗体杂交获得的Western印迹图。 

图23.在β抑制蛋白1转基因小鼠(βarr1-tg，Tg)、β抑制蛋白1基因敲除小鼠(βarr1-ko，KO)和野生型小鼠(WT)白色脂肪组织(WAT)细胞裂解液中用抗PPARγ抗体进行免疫沉淀后，用RXRα和PPARγ的抗体杂交获得的Western印迹图。 

图24.在共表达Flag标签的PPARγ或RXRα和HA标签的β抑制蛋白1或β抑制蛋白2的HEK293T细胞裂解液中免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示沉淀的复合体中的PPARγ、RXRα和β抑制蛋白。 

图25.通过体外拉下实验显示的β抑制蛋白1和β抑制蛋白2与PPARγ和PPARδ的相互作用。 

图26PPARγ不同部分的图示(上)，以及通过拉下实验显示的β抑制蛋白1和β抑制蛋白2与PPARγ不同部分的相互作用(下)。 

图27.一系列β抑制蛋白1的截短突变体的图示(上)，以及使用这些β抑制蛋白1的截短突变体与PPARγ的免疫共沉淀实验结果。 

图28.PPARγ与β抑制蛋白1、β抑制蛋白2及其突变体的相互作用。在共表达Flag标签的PPARγ和HA标签的β抑制蛋白1或β抑制蛋白2的HEK293T 细胞裂解液中用抗Flag的抗体做免疫沉淀。PPARγ和β抑制蛋白通过免疫印迹显示。β抑制蛋白1相互作用发生的核心位置与β抑制蛋白2对应的位置显示在图上方。 

图29.从mRNA水平上看，βarr1、βarr2M、βarr2或βarr1M的表达对LPS刺激后罗格列酮对Nos2、IL-6、TNF-α和CD36的转录抑制作用的影响。 

图30.PPARγ、RXRα和NCoR在Nos2和CD36基因启动子上的结合。使用抗PPARγ，抗RXRα或抗NCoR的抗体做染色质免疫沉淀，分析过表达β抑制蛋白1，β抑制蛋白2或它们突变体的原代培养的巨噬细胞。沉淀得到的DNA用RT–qPCR检测，结果用输入DNA的百分比表示，并显示为平均值±平均标准误，*表示P<0.05。 

图31.核磁共振分析注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠经高脂饮食处理后的脂肪含量(左)和体重(右)的变化(每组n=6)。 

图32.对注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(每组n=6)后，白色脂肪组织和肝脏的H&E染色照片，以及白色脂肪组织石蜡切片后用抗F4/80抗体得到的免疫组化照片(图例，200微米)。 

图33.对注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(每组n=6)后，脂肪细胞的直径变化。 

图34.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，肝脏的甘油三酯含量(表示为每克肝组织重量所含的甘油三酯的量)(左)和脂肪组织中巨噬细胞浸润(ATM)比例(由多张图片中F4/80染色阳性细胞与总细胞数的比值表示)(右)(每组n=6)。数据显示为平均值±平均标准误，*表示P<0.05。 

图35.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中甘油三酯(左)、游离脂肪酸(中)及总胆固醇(右)的含量。 

图36.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中瘦素(左)和脂连蛋白(右)的含量。 

图37.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中炎症因子TNF-α(左)、IL-6(中)和MCP-1(右)的分泌水平。 

图38.RT-qPCR检测注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠(每组n=6)白色脂肪组织中多种蛋白的mRNA水平。数据与相应的对照小鼠比较，并显示为平均值 ±平均标准误，*表示P<0.05。 

图39.注射β抑制蛋白1、βarr1M、β抑制蛋白2、βarr2M对血糖和胰岛素水平的影响。 

图40.通过GTT实验(1.5克每公斤体重)和ITT实验(1.5单位每公斤体重)测定，注射β抑制蛋白1、βarr1M、β抑制蛋白2、βarr2M对血糖水平的影响。 

图41.在HEK293T细胞中共表达Flag标签的PPARγ和HA标签的β抑制蛋白1，在细胞裂解液中加入不同浓度的人工合成短肽TS1和TS3处理后免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示的沉淀复合体中的PPARγ和β抑制蛋白1。 

图42.TS1和TS2在荧光素报告基因实验中对PPARγ转录活性的影响。 

图43.在共表达Flag标签的PPARγ和HA标签的β抑制蛋白1的HEK293T细胞中加入不同浓度的TS1或TS2处理后，在细胞裂解液中免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示的沉淀复合体中的PPARγ和β抑制蛋白1。 

图44.通过[³⁵S]RXRα的放射性自显影表明，TS1和TS2对PPARγ和RXRα结合的影响。 

图45.用编码TS1或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，细胞内脂肪含量的变化。 

图46.用编码TS1或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，PPARγ/RXRα复合物在DNA上的结合。 

图47.用编码TS1或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，脂肪细胞分化基因的表达。 

图48.LPS刺激后罗格列酮的处理引起过表达TS1或TS2的原代培养的巨噬细胞中Nos2和CD36表达水平的变化。 

图49.Fabp4启动子驱动的编码核定位序列(NLS)和TS1或TS2的重复序列的融合蛋白的腺病毒载体的结构(左图)和转染后βarr1、TS1和TS2的mRNA表达水平(右图)。 

图50.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS 1和TS2和空载体对照的小鼠的体重。 

图51.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后， 表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠的脂肪量。 

图52.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS 1和TS2和空载体对照的小鼠的脂肪细胞大小。 

图53.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠的白色脂肪组织和肝脏的H&E染色照片，以及白色脂肪组织石蜡切片后用抗F4/80抗体得到的免疫组化照片。 

图54.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠肝脏中的甘油三酯水平。 

图55.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠脂肪组织中巨噬细胞的浸润(ATM)比例。 

图56.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠血清中TNF-α、IL-6和MCP-1的水平。 

图57.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠血清中甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NEFA)及总胆固醇的含量。 

图58.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠血清中的瘦素水平。 

图59.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠血清中PPARγ及其下游基因和脂肪细胞免疫反应基因的表达水平。 

图60.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TS1和TS2和空载体对照的小鼠血液中胰岛素(上)和葡萄糖的水平(下)。 

图61.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，通过GTT实验(中)和ITT实验(右)测定表达TS 1和TS2和空载体对照的小鼠的血糖水平的时程变化。 

图62.通过光学表面等离子共振（SPR）实验检测多肽TS1对PPARγ-LBD与RXRα-LBD相互作用的影响。将PPARγ-LBD与多肽TS1或TS2室温孵育后注射通过标记有RXRα-LBD的芯片表面，未与多肽孵育过的为对照。 

图63.筛选与PPARγ-LBD结合的不同多肽（图A），以及不同浓度MD6对 PPARγ-LBD与RXRα-LBD相互作用的影响（图B）。以HA多肽为对照，通过光学表面等离子共振（SPR）实验分析不同多肽与PPARγ-LBD结合的性质。不同的多肽序列排列在图A的右边。 

图64.用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat-TS1或Tat-MD6孵育培养细胞后，细胞内脂肪含量的变化。 

图65.用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat-TS1或Tat-MD6孵育培养细胞后，PPARγ（A），RXRα（B）和NCoR（C）在DNA上的结合，D显示用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat-TS1或Tat-MD6孵育培养细胞后，细胞中脂肪细胞分化基因的表达。 

具体实施方式

I.定义 

如本文所用，术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。 

如本文所用，术语“分离”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离的。 

如本文所用，术语“疾病”和“病症”可互换使用，它们均反映损害正常功能、通常通过体征和症状表现、并引起人或动物的寿命或生活质量降低的人或动物体或其部分之一的异常状态。本文所用术语“PPARγ相关的疾病或病症”指有关PPARγ的任何疾病状态，包括但不限于代谢紊乱导致的疾病，炎症或癌症，例如糖尿病、肥胖症等（11，12）。 

如本文所用，术语“β抑制蛋白”是G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路中重要的负调控因子，分为β抑制蛋白1(其氨基酸序列为SEQ ID NO：3)和β抑制蛋白2(其氨基酸序列为SEQ ID NO：4)。根据BlastP的计算，这两种蛋白质的氨基酸序列相似性为88%，且集中在蛋白质的氮端结构域上。 

如本文所用，提到多肽时，术语“片段”指基本上保持与本发明天然β抑制 蛋白1相同的生物学功能或活性(例如与PPARγ相互作用)的肽，例如天然β抑制蛋白1的一部分。所述片段优选包含SEQ ID NO：1、3、10、13或67-71中任一项，例如，包含与SEQ ID NO：3全长相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基。本发明优选的多肽选自：（1）SEQ ID NO:3的长6-409个，优选6-70、6-60、6-50、6-40或6-30个氨基酸残基的片段，所述片段含有SEQ ID NO：1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列；（2）在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO：3的生物学活性的由（1）衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在SEQ ID NO：71中，优选不出现在SEQ ID NO：1、13、67-70中。 

如本文所用，提到核酸时，术语“片段”指其翻译产物基本上保持与本发明天然β抑制蛋白1相同的生物学功能或活性(例如与PPARγ相互作用)的核酸，例如天然β抑制蛋白1编码核酸的一部分。所述片段的翻译产物优选包含SEQ ID NO：1、3，10、13或67-71中任一项，例如，包含与SEQ ID NO：3全长相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与 SEQ ID NO：3的氨基酸255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO：3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基。所述片段的翻译产物优选自：（1）SEQID NO:3的长6-409个，优选6-70、6-60、6-50、6-40或6-30个氨基酸残基的片段，所述片段含有SEQ ID NO：1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列；（2）在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO：3的生物学活性的由（1）衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在SEQ ID NO：71中，优选不出现在SEQ ID NO：1、13、67-70中。 

本文所用术语“变异体”可以是天然β抑制蛋白1或其编码核酸的功能性类似物、衍生物、突变体、遗传变异体、简并变异体、在严谨条件下杂交的变异体等，还包括通过本领域已知方法获得的本发明多肽或核酸的变化形式。 

本文所用术语“衍生物”可以是基本上保持与本发明天然β抑制蛋白1相同的生物学功能或活性(例如与PPARγ相互作用)的天然β抑制蛋白1的衍生蛋白，其中(i)一个或多个保守或非保守性氨基酸残基被取代(优选保守性取代)，(ii)一个或多个氨基酸残基缺失(优选保守性缺失)；或(iv)在原有氨基酸序列内或序列外添加一个或多个氨基酸残基(优选保守性添加)。优选的，发生改变的氨基酸残基数目有至多10个、较佳地至多8个、更佳地至多5个、最佳地至多3个，最佳地至多1个。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(也称为碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(也称为酸性氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(也称为非极性氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(也称为芳族氨基酸，例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的 蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如HA或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。 

本文所用术语“类似物”可以是基本上保持与本发明天然β抑制蛋白1相同的生物学功能或活性(例如与PPARγ相互作用)的肽的类似物，例如天然β抑制蛋白1的类似物，例如，它可包含与SEQ ID NO：3的序列相同性为约99.8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的氨基酸序列。这些类似物与天然β抑制蛋白1的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导的遗传变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。这种类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。 

本文所用术语“核酸”可以指DNA或RNA。DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码区序列可以是SEQ ID NO：5、12、14或73-77中任一项所示的编码序列的简并变异体。此处所用的“简并变异体”指与参比核酸编码相同氨基酸序列、但核酸序列不同于参比核酸的核酸变异体。例如，本发明核酸的“简并变异体”可以指编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：5所示编码序列有差别的核酸序列；或可以指编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：14所示编码序列有差别的核酸序列。 

如本文所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型的相互间至少60%同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选的，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间有至少65%、更优的至少70%、且甚至更优选的至少80%或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术 人员所公知。严谨条件的一个优选，非限制性实例为：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，0℃；或(2)杂交时加有变性剂，50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的核酸编码的蛋白与本发明蛋白有相同的生物学功能和活性。 

本文所用的术语“表达载体”和“载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件，在本发明中适用的载体包括但不限于：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、HIV病毒载体或pShuttle-CMV载体。本文所用术语“重组表达载体”和“重组载体”指包含目标核酸的表达载体。例如本发明的重组表达载体包含以适于核酸在宿主细胞中表达形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞而选择的条件序列，其与表达的核酸可操作的连接。在重组表达载体中，“可操作的连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。此外，“重组表达载体”优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。 

II.筛选小分子化合物的方法 

在另一实施方式中，文发明还提供一种筛选特异影响PPAR γ和RXRα相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤：i)构建表达全长的PPARγ或PPARδ与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPARγ和PPARδ质粒；ii)构建全长的RXRα与另一转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRα质粒；iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件；iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞；v)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达；vi)以PPARδ与RXRα的相互作用作为对照，筛选特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物。在一个实施方式中，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。在一个实施方式中，步骤ii)和iii)中所述的转录调控因子是Gal4。在一个实施方式中，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。在一个实施方式中，步骤iv)中所述细胞为293细胞。 

III.本发明多肽及其制备方法 

本发明中的多肽和核酸优选以分离的形式提供，更优选地被纯化至均质。本发明的多肽并不仅限于上述列举的多肽及其片段、类似物和衍生物。修饰(通常不改变一级结构)形式还包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。 

本发明核酸也包括变异体，其编码与本发明有相同氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此核酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。 

编码本发明多肽的全长核酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸 序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 

一旦获得了有关的核酸，就可以用重组法来大批量地获得有关多肽。这通常是将核酸可操作地连接到载体中，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关多肽。 

此外，还可用人工合成的方法来合成有关多肽，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段、衍生物或类似物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。 

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的重组载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞，特别是草地贪夜蛾细胞、鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞或人细胞；优选人细胞。 

通过常规的重组DNA技术，本发明的核酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤： 

(1)用编码本发明多肽的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞； 

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 

用重组载体转化宿主细胞可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。如此处所用，术语“转化”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸或载体形式的核酸导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、 DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移、病毒介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。宿主细胞是真核细胞时，也常常使用病毒载体来转移核酸，常用的病毒载体如上所述。 

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。 

在一个实施方式中，通过培养包含本发明重组载体的HEM293细胞生产本发明多肽，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的目的多肽。 

IV．药物组合物和给药方法 

在其它实施方式中，描述了包含有效量的本发明多肽和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。这些组合物适用于兽医或人类给药。 

本发明药物组合物可以是给予患者的任何组合物形式。例如，该组合物可以是固体、液体或气体(气雾剂)形式。一般的给药途径包括但不限于：口服、局部、胃肠道外、舌下、直肠、阴道、眼部、肿瘤内和鼻内。胃肠道外给药包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸内注射或输注。在一个方面，胃肠道外给予该组合物。在又一方面，静脉内给予所述药物组合物。在又一方面，口服给予所述药物组合物。 

可配制药物组合物，使得在给予患者该组合物后其有效成分，即本发明多肽可被生物利用。药物组合物可采取单一或多剂量单位的形式，例如，片剂可以是单剂量单位，气雾剂的容器可容纳一个或多个多个剂量单位。 

用于制备该药物组合物的材料在其用量下应无毒。本领域普通技术人员将明白该药物组合物中活性成分的最佳剂量取决于各种因素。相关因素包括但不限于：动物类型(如人)、本发明多肽的具体形式、给药方式和具体的组成。 

药学上可接受的载体可为颗粒状，因此该组合物可以是，例如片剂或粉末形式。载体是液体时，该组合物可以是，例如口服糖浆或注射液。此外，载体可以是气态或微粒，以提供用于(例如)吸入给药的气雾剂组合物。 

当口服给药时，该组合物优选固体或液体形式，半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式也包括在本文所考虑的固体或液体形式中。 

作为口服给药的固体组合物，可将该组合物制成粉剂、颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、糯米纸囊剂等。这种固体组合物一般含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可存在一种或多种以下物质：粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精、崩解剂如藻酸、藻酸钠、原始凝胶(Primogel)、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精、调味剂如薄荷、甲基水杨酸或橙味剂；以及着色剂。 

当组合物是胶囊，如明胶胶囊形式时，除上述类型的材料外，它还可含有液态载体如聚乙二醇、环式糊精或脂肪油。 

该组合物可以是液体形式，如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮剂。液体可用于口服给药或注射递送。当口服给药时，组合物可含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和味道增强剂中的一种或多种。注射给药的组合物中，也可包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。 

无论是溶液、悬浮液或其它类似形式的液体组合物也可包含一种或多种以下物质：无菌稀释剂如注射用水，盐溶液，优选生理盐水、林格溶液、等渗氯化钠，可用作溶剂或悬浮介质的不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、环式糊精、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液，以及调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。可将胃肠道外组合物包装在 由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示范性辅佐剂。注射组合物优选无菌。 

在治疗或预防具体疾病或病症中本发明多肽的有效量取决于疾病或病症的性质，可用标准临床技术测定有效量。此外，可任选地进行体外或体内试验以帮助鉴定最佳剂量范围。用于组合物的准确剂量也取决于给药途径，和疾病或失调的严重性，应根据医生的判断和各个患者的情况来决定。 

该组合物含有治疗有效量的本发明多肽，以获得合适剂量。该治疗有效量一般至少约为该组合物重量的0.01%。当口服给药时，该治疗有效量可约为该组合物重量的0.1%-80%。在一个方面，口服组合物可含有约占该组合物重量4%-50%的本发明多肽。在又一方面，制备本发明组合物，以使胃肠道外单位剂量含有约0.01重量%-2重量%的本发明多肽。 

该药物组合物可含有每千克体重约0.01-1000mg的本发明多肽。在一个方面，该药物组合物可包含约每千克体重0.1-100mg的本发明多肽。在一个方面，该药物组合物可包含约每千克体重1-100mg的本发明多肽。在另一方面，给药量约为0.1-25mg/kg体重的本发明多肽。在另一方面，给药量约为1-10mg/kg体重的本发明多肽。 

在治疗方案中，每天给予该药物组合物的剂量可以是约0.01-1000mg本发明多肽/kg体重，优选0.1-100mg本发明多肽/kg体重，更优选1-10mg本发明多肽/kg体重，最优选2-5mg本发明多肽/kg体重。 

本发明多肽或药物组合物可通过任何方便的途径，例如通过输液或推注给药，通过上皮或粘膜层(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。可以全身或局部给药。已知各种递送系统，如包裹在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，它们可用于给予本发明多肽或药物组合物。在某些实施方式中，将一种以上的本发明多肽或药物组合物给予患者。 

例如也可通过使用吸入器或喷雾器，与促气雾剂一起配制，或通过碳氟化合物或合成肺部表面活性剂灌注进行肺部给药。 

在又一实施方式中，本发明多肽或组合物可以控释系统递送，例如但不限于：使用泵或各种聚合材料。在又一实施方式中，可将控释系统置于本发明多肽或组合物的靶(如脑)的附近，因而仅需要全身给药剂量的一部分(参见例如Goodson，《控 释的医学应用》(Medical Applications of Controlled Release)，同上，第2卷，第115-138页(1984))。可用Langer综述(Science 249:1527-1533(1990))中讨论的其它控释系统。 

药学上可接受的载体可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体氧化硅、尿素等。此外，可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方式中，当给予患者时，本发明多肽或组合物和药学上可接受的载体无菌。当静脉内给予本发明多肽时，水是示范性载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油的水溶液也可用作液体载体，尤其是注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物也可含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。 

本发明组合物可采取溶液，悬液，乳液，片剂，丸剂，微型片剂，胶囊，含有液体、粉剂、缓释剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮剂的胶囊形式或其它适合使用的形式。其它合适的药物载体的其它例子见E.W.Martin的《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。 

在一个实施方式中，根据常规方法将本发明多肽配成适合静脉内给予动物，尤其是人的药物组合物。用于静脉内给药的载体一般是无菌等渗缓冲水溶液。需要时，该组合物也可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选地包含局部麻醉剂如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，在标明活性物质用量的密封容器如安瓿或药囊中以单位剂型单独或混合形式，例如，作为冻干粉末或无水浓缩物提供。当通过输注给予本发明多肽时，可用，例如含有药物级无菌水或盐水的输液瓶配药。当通过注射给予本发明多肽时，可提供装有注射用无菌水或盐水的安瓿，以便在给药前混合这些成分。 

该组合物可用于局部给药，此时载体可以是溶液、乳液、软膏或凝胶基质形式。如果用于透皮给药，该组合物可以是透皮贴剂或离子电渗装置形式。局部剂型可包含浓度约为0.05%-50%w/v(每单位体积组合物中的重量)，另一方面为0.1%-10%w/v的本发明多肽。这可通过，例如但不限于：手术期间局部输注；局部施用，如术后与创伤敷料联用；注射；导管方式；栓剂方式；或植入方式(植入物为多孔性、非 多孔性或明胶材料，包括膜如硅塑(sialastic)膜或纤维)来实现。 

该组合物可用于直肠给药，其形式为，例如在直肠中融化并释放本发明多肽的栓剂。 

该组合物可包含改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，该组合物可包含在活性成分周围形成包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料一般是惰性的，可选自例如：糖、虫胶和其它肠溶包衣物质。或者，可将活性成分包装在明胶胶囊中。 

该组合物可由气态剂量单位组成，例如，可以是气雾剂形式。术语气雾剂用来指各种系统，从胶体性质系统到由密封包装组成的系统。可通过液化气或压缩气体或通过适合地分散活性成分的泵系统进行递送。 

无论是固体、液体或气体形式，本发明药物组合物均可包括用于治疗纤维化病的其它药物。 

V.本发明多肽的用途 

本发明人通过实验证明，本发明多肽通过与PPARγ的相互作用负调控PPARγ的转录活性，从而抑制PPARγ下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。因此，本发明多肽可用于防止或逆转PPARγ介导的炎症、肥胖症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合征等疾病。 

因此，本发明包括本发明多肽、其编码核酸或含有其编码核酸的重组载体在制备抑制PPARγ活性用的组合物中的应用。该组合物可以是本文所述的药物组合物。本发明也包括本发明多肽、其编码核酸或含有其编码核酸的重组载体在预防或治疗PPARγ介导的疾病中的应用。 

以下通过实施例来证明本发明多肽的这种用途。本领域技术人员应理解，以下提供的实施例仅为说明目的，不以任何方式限制本发明的保护范围。 

实施例 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。 

1.实验材料 

1.1哺乳动物细胞株 

HEK293：人胚胎肾细胞系，上皮细胞。购自ATCC并用MEM培养液培养。HEK293用磷酸钙方法转染。3T3-L1：小鼠成纤维细胞系，购自ATCC并用DMEM培养液培养。3T3-L1用脂质体转染或病毒感染。MEF：小鼠成纤维细胞。本文中使用的缺失内源β-抑制蛋白的MEF以及其对照野生型细胞由美国杜克大学医学中心Robert J.Lefkowitz教授惠赠。MEF用脂质体转染或病毒感染。 

1.2质粒 

PAdEasy-1：33.4kb长的质粒，包含大部分5型腺病毒基因组(除了E1和E3)，能感染并在含有E1基因组成分的细胞如HEK293中复制。pcDNA3-HA，pcDNA3-FLAG：真核表达载体，用于分别表达HA，FLAG融合蛋白。pShuttle-CMV：真核表达载体，用于构建腺病毒载体。包含CMV启动子和多克隆位点，用来克隆目的基因片段。 

1.3酶等主要试剂 

限制性内切酶、T4DNA连接酶为中国上海的英杰公司(Invitrogen)产品；质粒抽提试剂盒购自中国上海的凯杰公司(Qiagen)；MEM、DMEM培养液以及胎牛血清购自中国上海的吉布科公司(Gibco BRL)。脂质体转染胺试剂(LipofectAMINE2000)为中国上海的英杰公司产品。蛋白A琼脂糖4快流(Protein A Sepharose 4Fast Flow)(17-5280-04)及蛋白G琼脂糖4快流(Protein G epharose4 Fast Flow)(17-0618-02)、放射性同位素[³⁵S]甲硫氨酸为中国上海的珀金埃尔默公司(PerkinElmer)产品。胰岛素购自中国上海的西格玛公司(Sigma)。 

1.4抗体 

肌动蛋白兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号A-2066。 

β-抑制蛋白兔源多抗(A1CT)由美国杜克大学的R.J.Lefkowitz教授惠赠。 

FLAG鼠源单抗(M2)为中国上海的西格玛公司产品，目录号F3165。 

FLAG兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号F7425。 

HA鼠源单抗(12CA5)为中国上海的罗氏公司(Roche)产品，目录号1666606。 

HA兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号H-6908。 

Sp1兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号S-8909。 

肌动蛋白兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号A-2066。 

β-抑制蛋白兔源多抗（A1CT）由美国杜克大学的R.J.Lefkowitz教授惠赠。 

PPARγ兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz)产品，目录号sc-7196。 

PPARγ鼠源单抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-7273。 

RXRα兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-553。 

RXRα鼠源单抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-46659。 

NCoR兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-8994。 

SMRT兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-20778。 

SRC-1鼠源单抗为美国马萨诸塞州贝尔福德的密理博公司(Millipore)产品，目录号05-522。 

FLAG鼠源单抗（M2）为中国上海的西格玛公司产品，目录号F3165。 

FLAG兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号F7425。 

HA鼠源单抗(12CA5)为中国上海的罗氏(Roche)产品，目录号1666606。 

HA兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号H-6908。 

Sp1兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号S-8909。 

1.5小鼠品系和饲养条件 

C57BL/6小鼠、db/db2型糖尿病模型小鼠购于上海斯莱克实验动物公司(SLAC)。β-抑制蛋白1和2缺失和野生型小鼠由美国杜克大学的R.J.Lefkowitz教授惠赠。β-抑制蛋白1过表达和野生型小鼠由本实验室做成并与C57BL/6回交九代以上(如Shi等，2007)(13)。动物的饲养和操作均按照中科院上海生命科学院实验动物委员会的条例进行。所有其他小鼠从中国科学院上海实验动物中心提供。所有动物均在无病原体的环境下饲养，饲养和实验方法符合国家实验动物护理和使用健康指南。正常小鼠喂养普通饲料(Formulab 5008，Labdiet5053)，高脂小鼠喂养高脂饲料(55%脂肪卡路里)(Harlan-Teklad 93075)，并自由获得水和食物。 

2.实验方法 

2.1细胞转染和质粒 

野生型和β-抑制蛋白缺失的鼠胚胎成纤维细胞系(MEFs)由美国杜克大学医学中心Robert J.Lefkowitz博士赠与，瞬转采用脂质体转染法。每盘DNA转染总量通过补加表达β-gal的载体质粒(表达)保持一致。全长人的PPARγ1、PPARδcDNA都构建到pcDNA3(中国上海的英杰公司)载体中，并在其N端加上HA或FLAG序列。全长人的β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白2和缺失突变体的构建见引文(14)。所有的序列都经过测序确证。 

2.2实时定量RT-PCR 

总RNA按照中国上海的英杰公司使用指南用TRIzol试剂提取。逆转录采用寡聚(dT)和超转录II(superscript II)系统。实时定量PCR反应在中国上海的司查塔基公司(Stratagene)的Mx3000p中完成。β-肌动蛋白的mRNA水平被用来归一化实验样品。所用引物为： 

2.3免疫沉淀和免疫印迹 

小鼠处死后，组织被快速取出并储存在液氮中。组织裂解液由匀浆获得并由Bradford法测定蛋白浓度。对于免疫沉淀细胞裂解液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，10%甘油，0.1%曲通X-100)加入相应的抗体，4°C孵育过夜后，加入蛋白A或蛋白G凝胶珠，4°C继续孵育2小时。结合在蛋白A或蛋白G凝胶珠上的蛋白经SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，20%甘油，4%SDS，2%巯基乙醇，0.2%溴酚蓝)洗脱并50°C处理20分钟后通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹的方法检测相应的蛋白。对于免疫印迹，蛋白条带通过IRDye800CW偶联二抗激发远红外荧光，由奥德赛(Odyssey)远红外图象系统取得，随后在丝昂图像(Scion Image)软件(美国新英格兰地区林肯市的LCB公司(Li-Cor Bioscience，Lincoln，NE，USA))上进行定量分析。 

小鼠处死后，组织被快速取出并储存在液氮中。组织裂解液由匀浆获得并由Bradford法测定蛋白浓度。组织和细胞的裂解与免疫沉淀和免疫印记参照(15)。对于免疫沉淀，细胞裂解液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，10%甘油，0.1%曲通X-100)加入相应的抗体，4°C孵育过夜后，加入蛋白质A或蛋白质G凝胶珠，4°C继续孵育2小时。结合在蛋白质A或蛋白质G凝胶珠上的蛋白经SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，20%甘油，4%SDS，2%巯基乙醇，0.2%溴酚蓝)洗脱并50°C处理20分钟后通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹的方法检测相应的蛋白。对于免疫印迹，蛋白条带通过IRDye800CW偶联二抗激发远红外荧光，由奥德赛远红外图象系统取得，随后在丝昂图像软件上进行定量全细胞蛋白提取物和核提取物的制备方法参照(16)。对于二次免疫沉淀，方法与之前的一样，在第一次免疫沉淀后用含0.3mg/ml Flag短肽的溶液洗脱30分钟，在洗脱后的溶液中用不同的抗体分别做第二次免疫沉淀(17)。 

2.4染色质免疫共沉淀 

染色质免疫共沉淀实验方法参照(4,13)。5×10⁶原代培养的巨噬细胞或分化的小鼠成纤维细胞用于细胞实验。在巨噬细胞的实验中，细胞用0.1μM的罗格列酮(rosiglitazone，Rosi)处理1小时并在之前用1μg/ml内毒素(LPS)处理1小时，之后 用1%的甲醛交联10分钟。在小鼠成纤维细胞实验中，细胞诱导分化4天后再进行染色质免疫共沉淀实验。实时荧光定量PCR检测实验结果。引物序列如下表： 

二次染色质免疫共沉淀的实验方法参照了(18)。第一步免疫沉淀沉淀下来的复合体用1倍体积的re-ChIP溶液(0.5mM二硫苏糖醇，1%Triton X-100，2mM EDTA，150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8.1)和1倍体积的Immunopure Gentle Ag/Ab洗脱溶液(皮尔斯公司(Pierce))分别各洗脱15分钟。洗脱下的溶液用ChIP稀释溶液(1mM EDTA，20mM TrisHCl，pH 8.1，50mM NaCl，1%曲通X-100)稀释20倍之后做第二次的染色质免疫沉淀。5-10μl用于PCR实验分析re-ChIP的实验结果。 

2.5小鼠胰岛素耐受及葡萄糖耐受实验 

在葡萄糖耐受实验中，小鼠饥饿6小时后通过腹腔注射的方法给予葡萄糖(剂量见正文)刺激，在相应的时间点通过尾尖取血用罗氏(Roche)Accu-chek血糖仪测定血糖，用大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒(LCB公司)测定胰岛素水平。在胰岛素耐受实验中，小鼠直接经腹腔注射的方法给予胰岛素(剂量见正文)刺激，在相应的时间点通过尾尖取血用罗氏Accu-chek血糖仪测定血糖。 

2.6腺病毒的构建和注射 

目的基因片段克隆组装到pShuttle-CMV真核表达载体，通过原核细胞重组系统与pAdEasy-1发生重组，并线形化后在HEK293细胞中产生病毒。CsCl密度梯度纯化的病毒以1×10¹⁰病毒颗粒/100微升生理盐水的量通过尾静脉注射。 

2.7高胰岛素－正常葡萄糖钳夹 

小鼠颈动脉置管，断尾，取尾静脉血测空腹血糖。输注[³H]葡萄糖首剂5μCi（20Ci/ml，651Gbq/mmol，入量0.25ml），随后以0.02μCi/分钟输注（20Ci/ml），持续至2小时。分别在90分钟和115分钟时取尾静脉血各100μl，并测基础血糖和血清胰岛素，总入量约0.3ml。输注胰岛素200mU/mL，胰岛素输注率：起始3分钟，注入首剂100mU/kg·min，随后以2.5mU/kg·min持续输注，以0.025kg计算，2小时总输入量约0.02ml。输注胰岛素同时，以0.1μCi/min输注（20Ci/ml）[³H]葡萄糖，2小时总输入量约0.6ml。输注胰岛素3分钟后，开始输注20％葡萄糖溶液，起始10mg/kg·min，每10分钟取尾静脉测血糖，调节葡萄糖输注率，以维持血糖水平6mmol/L（以平均在30mg/kg·min计算，总输入量0.45ml），80、85、90、100、110、120分钟取尾静脉血各50μl。具体步骤参照(19,20)。 

2.8体外拉下(pull down)实验 

[³⁵S]甲硫氨酸标记的β-抑制蛋白2用TNT转录/翻译试剂盒按照厂商提供方法合成。HEK293内源表达的胰岛素受体用特异性抗体免疫沉淀，和[³⁵S]甲硫氨酸标记的β-抑制蛋白2在结合缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、0.5mg/mL牛血清蛋白、1%曲通X-100、5mM EDTA、10%甘油和蛋白 酶抑制剂)中共孵育。结合琼脂糖凝胶的β-抑制蛋白2用SDS聚丙烯酰胺电泳分离，放射自显影检测。 

[³⁵S]甲硫氨酸标记的PPARγ、PPARδ和RXRα用TNT转录/翻译试剂盒按照厂商提供方法合成。HEK293T细胞中表达带HA标签的β抑制蛋白1或β抑制蛋白2，用抗HA的抗体将其免疫沉淀下来。10μl凝胶珠包含约1μg纯化的β抑制蛋白s和5μl[³⁵S]标记的PPARγ或[³⁵S]PPARδ在100μl结合缓冲液（50mM HEPES[pH 7.5]，150mM NaCl，0.5mg/ml BSA，1%曲通X-100，5mMEDTA，10%甘油和蛋白酶抑制剂）中在4°C共孵育3小时。对于竞争实验，带Flag标签的PPARγ被结合在凝胶珠上并与重组表达的β抑制蛋白1、β抑制蛋白2、βarr1M或βarr2M以及[³⁵S]标记的RXRα共孵育。用结合缓冲液洗过后蛋白复合体通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影显示[³⁵S]标记的RXRα。 

2.9巨噬细胞的制备和活化 

如前所述(Wang等，2006)，骨髓细胞接种于10厘米细菌培养塑料板，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，添加50ng/ml重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(肽技术公司(Peprotech))。第7天，1×106/毫升贴壁细胞收集在24孔板中进行各种实验。 

2.10免疫组化和H&E染色。 

小鼠脂肪组织用4%的多聚甲醛固定过夜。石蜡包埋，切片。H&E染色参照标准步骤。脂肪组织中巨噬细胞的浸润通过抗F4/80的抗体做免疫组化显示，并定量(21)。 

2.11光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR) 

我们通过BIAcore T100仪器利用SPR技术检测TS1和TS2与PPAR γ-LBD或RXRα-LBD的结合情况。在实验中所使用的蛋白（15mg/mL）溶在溶解缓冲液中（10mM醋酸钠，pH5.0）并按说明书用EDC（N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）和NHS（N-hydroxysuccinimide）固定在CM5的感应芯片上。用上样缓冲液（10mM HEPES,150mM氯化钠,3mM EDTA,和0.005%(v/v)surfactant P20）持续调整流过芯片1到2小时做出基线。 之后，TS1用上样缓冲液梯度稀释。将样品注入，流速为30毫升/分钟，之后再用上样缓冲液洗脱。在研究样品对PPARγ-LBD/RXRα-LBD复合物形成的影响时，纯化的RXRα-LBD蛋白标记在CM5芯片上。PPARγ-LBD与RXRα-LBD的结合通过BIAcoreT100仪器的相对单位（RU）读值直接反应。在研究TS1或TS2的作用时，TS1或TS2先与PPARγ-LBD(0.2毫克/毫升)混合在室温孵育2小时，之后再注入仪器，以30毫升/分钟的流速流过标记有RXRα-LBD的感应芯片。 

2.12.数据统计 

所有数据均表示为平均值±均值标准误。多组数据比较采用ANOVA的方法，并通过Bonferroni进行均值检验。两组独立数据之间的比较采用学生t检验(Student’s t test)并在学生t检验之后做方差分析。P值小于0.05表示显著性差异。 

实施例1.β抑制蛋白1抑制小鼠高脂饮食诱发的肥胖 

β抑制蛋白1(βarr1)和β抑制蛋白2(βarr2)是细胞胞浆中的一种介导信号转导和蛋白相互作用的蛋白。我们实验室以前的工作证明了β抑制蛋白2在胰岛素信号通路中扮演着重要的角色，影响了动物整体的胰岛素敏感性。为了进一步研究β抑制蛋白1在代谢系统中的生理功能，我们首先对β抑制蛋白1转基因小鼠(βarr1-tg，Tg)，β抑制蛋白1基因敲除小鼠(βarr1-ko，KO)和它们的同窝野生型对照小鼠(WT)进行高脂饮食(HFD)处理，建立食物诱导的肥胖小鼠模型。βarr1-tg小鼠发育正常且所有小鼠体长相似。βarr1-tg小鼠虽然在断奶后4周时的身体总重量没有差别，但高脂喂养开始后，βarr1-tg小鼠比野生型小鼠体重增长的慢(图1)。经过14周HFD饲养，这种体重差异更加明显，βarr1-tg小鼠体重33.6±1.3克(n=10)，而其野生型对照体重36.9±0.9克(n=10)，P<0.05。βarr1-ko小鼠经过14周HFD的饲养，体重约增加了21.6±0.7克，而其野生型小鼠体重增加了17.3±0.8克。这种体重增加的差异在喂正常饲料的βarr1-tg和βarr1-ko小鼠中也能观察到，尽管程度较轻(图2)。然而，这些不同基因型的小鼠高脂饮食处理前后在身体长度上并没有显著差异(图3)。值得注意的是，喂高脂的βarr1-tg小鼠的体重增加量与喂正常饲料的小鼠的体重增加量 没有明显差异。这些结果表明，过表达的β抑制蛋白1可以减缓肥胖的发展。 

肥胖小鼠会显示血脂含量的异常(22)。我们监测了分别喂食高脂和正常饲料的βarr1-tg、βarr1-ko和野生型小鼠血中甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(NEFA)的水平。如图4所示，与野生型小鼠相比，βarr1-tg的小鼠喂食高脂后显示了明显低的甘油三酯和游离脂肪酸水平，而βarr1-ko小鼠血脂水平有显著提高。 

接着，我们利用核磁共振光谱(NMR)确定了小鼠的体脂含量和瘦体重。正如图5A和B显示，经过14周HFD饲养，βarr1-tg小鼠、βarr1-ko小鼠和野生型小鼠的瘦体重相差无几；但βarr1-tg小鼠的脂肪量为13.8±2.3g，野生型小鼠的脂肪量为24.1±2.5g，βarr1-ko小鼠的脂肪量为27.4±3.3g，(n=10，P<0.05)。 

进一步，我们对分别喂食高脂或正常饲料的βarr1-tg、βarr1-ko或野生型小鼠性腺旁的白色脂肪组织作H&E染色(图6)，结果显示，喂食高脂野生型小鼠脂肪细胞的大小显着增加(平均直径：63.5±3.8μm)。而在βarr1-tg小鼠中，这种饮食诱导的脂肪细胞肥大并不明显(平均直径：45.4±4.1μm)，但βarr1-ko小鼠则显示了比野生型更明显的脂肪细胞增大(平均直径：75.1±4.5μm)(图7)。 

总之，β抑制蛋白1基因敲除使小鼠更容易发生饮食诱发的肥胖；相反的是，过表达β抑制蛋白1的小鼠则可以降低它们饮食诱发的肥胖。 

实施例2.β抑制蛋白1在小鼠中抑制肥胖引起的炎症和胰岛素抵抗 

肥胖会导致胰岛素抵抗和非胰岛素依赖型糖尿病(23-25)。饮食引起的肥胖小鼠显示较低的整体胰岛素敏感性和不正常的葡萄糖代谢(22,26)。正如我们以前的报道，我们没有发现任何证据表明β抑制蛋白1影响整体胰岛素敏感性(9)。正常饲料喂养时βarr1-tg、βarr1-ko小鼠与野生型小鼠的葡萄糖耐受试验(GTT)和胰岛素耐受试验(ITT)均无明显变化(图8和图9)。然而，在HFD处理14周之后，βarr1-tg小鼠与野生型小鼠相比血糖和胰岛素水平明显较低，而βarr1-KO小鼠具有较高的血糖和胰岛素水平(图10和图11)。这一结果表明，高脂饮食处理后在葡萄糖动态平衡缺陷的情况下，βarr1-KO小鼠对胰岛素有更高的需求，而βarr1-tg的小鼠能抵抗的肥胖相关的胰岛素抵抗的发展。 

我们还进一步对高脂处理的βarr1-tg，βarr1-ko小鼠与野生型小鼠进行了 GTT和ITT实验。在野生型小鼠中按1.5克每公斤体重腹腔注射葡萄糖可诱发血糖水平迅速上升，2小时后逐步恢复正常。相比之下，βarr1-tg小鼠表现出较低的血糖水平(图12)，表明在这些高脂处理的转基因小鼠的葡萄糖代谢有明显改善，在GTT实验过程中胰岛素分泌反应也较低，可见在βarr1-tg小鼠胰岛素的敏感性有明显改善(图12)。在ITT实验中这一结果被进一步证实了，在野生型小鼠和βarr1-tg小鼠中按1.5单位每公斤体重腹腔注射胰岛素均可诱发血糖水平随时间降低并逐步恢复正常。然而，相比野生型小鼠，小鼠自身降低血糖和胰岛素的降糖效果在βarr1-tg小鼠中更明显(图13)。这些结果表明，相对于它们的野生型小鼠，高脂处理βarr1-tg小鼠改善了胰岛素的敏感性。用高脂处理的βarr1-ko小鼠在GTT(1.5克每公斤体重)和ITT(1.5U每公斤体重)实验中显示了比野生型小鼠较差的胰岛素敏感性(图14和图15)。总结这些分析表明了，β抑制蛋白1缺失会易于导致肥胖诱导的胰岛素敏感性受损，而提高β抑制蛋白1的蛋白质表达水平可改善高脂饮食的肥胖小鼠的整体胰岛素敏感性。 

为了进一步研究β抑制蛋白1在肥胖引起的胰岛素抵抗和葡萄糖代谢紊乱中的作用，我们做了高胰岛素-正糖钳夹实验。实验结果显示，在基础状态和钳夹状态时高脂饮食处理的βarr1-ko小鼠与WT小鼠的肝糖输出均没有显著差异(图16A，B)。但是βarr1-ko小鼠在高脂饮食处理后与野生型对照小鼠相比，整体的葡萄糖清除率(GDR)和葡萄糖输注率(GIR)均显著降低(图16C，D)。这显示了，高脂饮食处理更显著的降低了βarr1-ko小鼠的胰岛素敏感性。 

巨噬细胞浸润到脂肪组织是肥胖的主要病理特征之一。我们用F4/80的抗体作免疫组化检测脂肪组织中巨噬细胞(ATM)的浸润。如图17所示，喂食高脂的βarr1-tg小鼠与野生型小鼠相比，脂肪组织中巨噬细胞的浸润减少了70％，而在βarr1-ko小鼠的脂肪组织中巨噬细胞的浸润则更加明显。ATM产生炎症因子，并促进了肥胖有关的异常免疫反应。 

我们进一步测量了喂食高脂或正常饲料的βarr1-tg，βarr1-ko和野生型小鼠血清中炎症因子的水平。虽然正常饲料喂养时βarr1-tg，βarr1-ko小鼠与野生型小鼠相比血清中IL-6、TNF-α和MCP-1的水平没有明显差异，但是βarr1-ko小鼠在用高脂饲料喂养时三个炎症细胞因子水平明显高于野生型小鼠，而βarr1-tg小鼠的这些细胞因子的水平则低于野生型小鼠(图18)。这些结果表明， 过表达β抑制蛋白1可以抑制与高脂饮食诱导的肥胖相关的免疫反应。 

总之，β抑制蛋白1基因敲除会促进肥胖引起的炎症和胰岛素抵抗，而过表达β抑制蛋白1可防止肥胖引起的炎症和胰岛素抵抗。 

实施例3.β抑制蛋白1对PPARγ及其下游脂肪细胞分化指标基因的影响 

我们通过检测PPARγ、脂肪酸结合蛋白4(Fabp4、aP2)、脂肪酸转运蛋白(CD36)、脂肪酸合成酶(Fasn)和脂蛋白脂酶(Lpl)这些脂肪细胞分化的指标基因的表达来评估βarr1-tg、βarr1-ko和野生型的MEF细胞向脂肪细胞分化的能力。在分化后的野生型MEF细胞中，我们通过RT-PCR观察到了这些指标基因的显著表达。此外，如图19所示，我们观察到分化第4天的βarr1-ko的MEF细胞表达更多的PPARγ、Fabp4、CD36、Fasn和LPL。有趣的是，相对于野生型的MEF细胞，这些基因在βarr1-tg的MEF细胞中，mRNA水平明显降低。相反，我们发现，无论是β抑制蛋白1基因敲除，还是β抑制蛋白1过表达对脂肪酸氧化的限速酶，包括Acadm和Acox1的表达都无显著影响。有趣的是，只有PPARγ的下游基因的表达水平受到显著影响，而PPARδ的下游基因并不受影响。这提示β抑制蛋白1特异调控PPARγ及其下游基因。 

实施例4.β抑制蛋白1对PPARγ依赖性炎症反应基因的转录的影响 

以前的报道显示了PPARγ可以在巨噬细胞中通过抑制炎症反应基因的表达抑制炎症反应(27)。为了研究β抑制蛋白1对PPARγ在巨噬细胞中功能的潜在调控作用，我们从野生型或βarr1-ko小鼠中分离和培养原代的巨噬细胞。我们检测了在内毒素(LPS)和一个PPARγ的配体罗格列酮(rosiglitazone)共同作用下诱导型一氧化氮合酶(iNOS，Nos2)的基因表达水平。如图20所示，在野生型和βarr1-ko的巨噬细胞中，内毒素处理显著提高了Nos2的表达。有趣的是，仅在野生型巨噬细胞中，罗格列酮的处理可使Nos2的表达降低，而在βarr1-ko的巨噬细胞中则没有这种现象，在其他免疫反应基因上也能观察到类似的变化，其中包括IL-6和TNF-α。但是，我们看到在罗格列酮处理后，脂肪形成相关基因CD36的表达显著增强(图20)，这表明PPARγ调控免疫反应基因和脂肪分化基因的复杂和不同。 

我们使用抗PPARγ、抗RXRα或抗NCoR的抗体进行了染色质免疫沉淀(ChIP)实验，用RT–qPCR检测沉淀得到的DNA，以直接分析原代培养的巨噬细胞中β抑制蛋白1对PPARγ转录活性的调控。如图33所示，在野生型和βarr1-ko巨噬细胞中，内毒素刺激导致了NCoR在Nos2基因的启动子结合下降。在野生型的巨噬细胞中，罗格列酮处理可以提高LPS刺激下NCoR在Nos2基因启动子区的结合。与此相反，在βarr1-ko的巨噬细胞中，罗格列酮不影响NCoR在Nos2的启动子上的结合。RXRα在Nos2基因的启动子区的结合很低，而且不受LPS或罗格列酮处理的影响。LPS刺激并不影响PPARγ，RXRα和NCoR在CD36基因启动子的结合。另一方面，与野生型相比，在βarr1-ko巨噬细胞中，罗格列酮处理加强了和RXRα和PPARγ的结合而减少NCoR的结合。这些结果支持了之前的研究，脂肪细胞分化基因CD36和巨噬细胞炎症基因Nos2的表达是由不同的PPARγ转录调控复合体调控的，即Nos2的表达被PPARγ/NCoR抑制性复合体抑制，而CD36基因的表达则被PPARγ/RXRα激活性的复合体激活(4)。此外，这些结果也表明，β抑制蛋白1抑制PPARγ/RXRα复合体并增强了PPARγ/NCoR复合体的形成。 

实施例5.β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用 

最近的研究显示，βarr1在细胞质和细胞核中均有重要功能。细胞核中的βarr1与染色质重塑复合体相互作用并通过表观遗传途径介导基因转录调控(10)。PPARγ是脂肪细胞分化过程中最重要的转录调控因子。为了进一步探讨β抑制蛋白1/PPARγ复合物潜在的生物功能，我们用过表达人源β抑制蛋白1的小鼠(βarr1-tg)和β抑制蛋白1敲除小鼠(βarr1-ko)，及其野生型小鼠(WT)的脂肪组织进行了研究。在野生型小鼠脂肪组织中，用抗β抑制蛋白1的抗体免疫共沉淀，可见内源性β抑制蛋白1和PPARγ有明显的相互作用(图22，2)。在用抗RXRα抗体共沉淀的复合物中PPARγ与RXRα的相互作用明显(图22，4)，但是在用抗β抑制蛋白抗体免疫共沉淀的复合物中只能检测到PPARγ而不能检测到RXRα(图22，2)。βarr1过表达，基因敲除以及野生型的小鼠脂肪组织中PPARγ和RXRα表现出类似的表达水平(图23)。在用抗PPARγ的抗体免疫共沉淀的复合物中可检测到明显的PPARγ/RXRα异源二聚体(图23，1和3)。有 趣的是，在βarr1基因敲除小鼠的脂肪组织中免疫共沉淀的复合物中可检测到更多的PPARγ/RXRα异源二聚体(图23，2和1)。相反，在过表达βarr1小鼠的脂肪组织中PPARγ和RXRα的相互作用显著降低(图23，4和3)。这些结果强烈地表明，β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用抑制PPARγ/RXRα异源二聚体的形成。 

接下来，我们研究了在HEK293细胞中表达的Flag标签的PPARγ或RXRα与HA标签的β抑制蛋白1或β抑制蛋白2的相互作用。Flag标签的PPARγ可以与HA标签的β抑制蛋白1免疫共沉淀但没有与HA标签的β抑制蛋白2没有免疫共沉淀(图24，5和2)。Flag标签的RXRα不能与HA标签的β抑制蛋白1或β抑制蛋白2免疫共沉淀(图24，3和6)。我们还进一步研究了是否所有PPAR的亚型与β抑制蛋白1都存在相互作用。在体外拉下实验也进一步证实，β抑制蛋白2与PPARγ并无直接的相互作用(图25)。这些结果表明，β抑制蛋白1与PPARγ存在特异性的相互作用。 

实施例6.β抑制蛋白1的片段与PPARγ的相互作用 

首先通过免疫沉淀实验用一系列PPARγ的截短突变体研究了β抑制蛋白1在PPARγ上的结合区域。我们发现，β抑制蛋白1结合在PPARγ的配体结合结构域(PPARγ-LBD)(图26)。而PPARγ-LBD被报道是PPARγ的配体结合以及PPARγ/RXR异源二聚体的形成的关键区域。 

为了确定β抑制蛋白1与PPARγ相互作用的所依赖的氨基酸序列，我们使用了一系列β抑制蛋白1的截短突变体做了免疫共沉淀实验，结果发现，β抑制蛋白1的246-265氨基酸(TS1，SEQ ID NO：1)对β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用至关重要(图27)。与β抑制蛋白2的这一区域(247-266氨基酸，TS2，SEQ ID NO：2)相比，β抑制蛋白1只含有5个不同的氨基酸(图28)。由于PPARγ只能与β抑制蛋白1相互作用，而不与β抑制蛋白2相互作用，我们互换了β抑制蛋白1和β抑制蛋白2的这一段氨基酸序列并检测了互换后的突变体与PPARγ的相互作用。如图28所示，将β抑制蛋白1的5个氨基酸残基用β抑制蛋白2的对应的5个氨基酸替代所产生的突变体(βarr1M，氨基酸序列为SEQ ID NO：9，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：11)失去了与PPARγ的结合(6和2)。 但是，与野生型的β抑制蛋白2不同，将β抑制蛋白2的5个氨基酸残基用β抑制蛋白1的对应的5个氨基酸替代产生的突变体(βarr2M，氨基酸序列为SEQID NO：10，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：12)却能够与PPARγ结合(8和4)。总之，这些结果表明，β抑制蛋白1的氨基酸残基M255、E256、A258、T261和A263对它与PPARγ的作用至关重要。 

实施例7.β抑制蛋白1介导PPARγ依赖的炎症反应基因的转录抑制 

我们研究了β抑制蛋白1/PPARγ复合体的相互作用对PPARγ在巨噬细胞中调节炎症反应功能的影响。我们发现βarr1和βarr2M的表达，而不是βarr2或βarr1M的表达，可以提高在LPS刺激后罗格列酮对Nos2、IL-6和TNF-α的转录抑制作用(图29)。另一方面，βarr1和βarr2M过表达，而不是βarr2或βarr1M过表达，可以抑制罗格列酮刺激的CD36的表达。 

同样，染色质免疫沉淀(ChIP)实验表明，野生型原代培养的巨噬细胞中过表达βarr1和βarr2M可以提高NCoR在Nos2、TNF和IL-6的启动子区域的结合，但在CD36的启动子区则没有这样的现象(图30)。这些结果表明，在巨噬细胞的炎症反应过程中，β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用抑制了PPARγ/RXRα的功能，而促进了PPARγ/NCoR的功能。 

实施例8.注射β抑制蛋白1或其片段减轻饮食诱导的肥胖 

鉴于β抑制蛋白1与PPARγ存在明显的相互作用，而且直接抑制PPARγ的转录活性，并抑制脂肪形成和免疫反应。我们假设，在小鼠体内过表达野生型β抑制蛋白1可能改善脂肪形成、巨噬细胞浸润和肥胖。为了验证这一假说，我们用表达β抑制蛋白1、β抑制蛋白2、βarr1M或βarr2M的腺病毒注射小鼠并对小鼠进行高脂喂养。 

注射了表达β抑制蛋白1或βarr2M重组腺病毒的小鼠与对照小鼠相比，身体脂肪量和体重增加量都减少了(图31)。我们发现，在这些小鼠中，饮食引起的脂肪细胞肥大，脂肪肝和巨噬细胞浸润明显减少(分别参见图32、图33和图34)。肝脏甘油三酯、血清甘油三酯、游离脂肪酸及瘦素水平也显着减少(图35和图36)。与这些结果一致的是，在对照小鼠中，HFD处理导致TNF-α、IL-6 和MCP-1分泌升高。而在接受了β抑制蛋白1或βarr2M腺病毒的小鼠中，这些炎症因子的分泌并没有明显升高(图37)。我们发现，与对照组小鼠相比，PPARγ的下游基因与脂肪细胞中的免疫反应基因，在分别接受了β抑制蛋白1或βarr2M腺病毒的小鼠的脂肪组织中的表达显著降低(图38)。 

实施例9.注射β抑制蛋白1或其片段改善血糖和胰岛素耐受 

注射β抑制蛋白1或βarr2M表达腺病毒也可以改善血糖和胰岛素耐受，如GTT实验结果显示(1.5克每公斤体重)和ITT(1.5单位每公斤体重)(图39和图40)。相反，我们观察到注射β抑制蛋白2或βarr1M表达的腺病毒对肥胖症的进展无明显影响。总的来说，这些数据清楚地表明，β抑制蛋白1可以通过它与PPARγ的结合在体内抑制肥胖的发展。此外，增加β抑制蛋白1表达或模拟β抑制蛋白1与PPARγ的结合可以减轻肥胖及肥胖相关的胰岛素抵抗。两者合计，这些结果显示β抑制蛋白1有潜在的预防和治疗肥胖的作用。 

实施例10.β抑制蛋白1的片段在体外对PPARγ活性的影响 

鉴于β抑制蛋白1对脂肪细胞分化和肥胖的抑制作用取决于β抑制蛋白1与PPARγ的结合，我们进一步假设表达一个由β抑制蛋白1246-265位氨基酸组成小肽，可能与β抑制蛋白1类似的抑制脂肪细胞分化和肥胖。因此，我们首先比较了在β抑制蛋白1这个区域的不同长短的两段小肽TS1(由天然β抑制蛋白1的246-265号氨基酸SEQ ID NO：1组成)和TS3(由天然β抑制蛋白1的253-264号氨基酸SEQ ID NO：13组成)对β抑制蛋白1和PPARγ相互作用的影响（图41）。结果显示较长的TS1对PPARγ和β抑制蛋白1的相互作用有明显的抑制作用，而较短的TS3也有竞争β抑制蛋白1抑制PPARγ和β抑制蛋白1的相互作用的功能，但作用较弱。因此我们用TS1进行进一步的实验。我们检测了TS 1是否可以抑制PPARγ的活性(图42)。同时，还对包括β抑制蛋白2在同一区域的氨基酸序列的小肽TS2(SEQ ID NO：2)进行了检测并作为对照。如图所示，合成的TS1竞争β抑制蛋白1与PPARγ结合(图43)，并影响了PPARγ/RXRα复合物的形成(图44)，而TS2没有这种作用。接下来，我们用编码TS1或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞。感染TS1慢病毒的细 胞明显地降低了细胞内的脂肪含量(图45)，减少了PPARγ/RXRα复合物在DNA上的结合(图46)和脂肪细胞分化基因的表达(图47)，这表明TS1而不是TS2可以降低PPARγ的活性和脂肪细胞的形成。LPS刺激后罗格列酮的处理使得过表达TS1的原代培养的巨噬细胞Nos2表达下降(图48)，这表明只有TS1增强PPARγ的介导的免疫反应基因的转录抑制。 

实施例11.β抑制蛋白1的片段对小鼠的影响 

为了进一步探讨TS1在小鼠体内潜在的预防作用，Fabp4启动子驱动的编码核定位序列(NLS)和TS1或TS2的重复序列的融合蛋白的腺病毒载体(图50)，通过静脉注射入野生型小鼠体内，以高脂饮食处理小鼠。与对照小鼠或表达TS2的小鼠相比，表达TS1的小鼠显示较低的体重(图51)和脂肪量(图52)，较小的脂肪细胞(图53)，较少的脂肪肝(图54和图55)和巨噬细胞浸润(图56)，较低的TNF-α，IL-6和MCP-1的分泌(图57)，较低的甘油三酯，游离脂肪酸(图58)和血清瘦素水平(图59)。我们发现，与对照组小鼠相比，PPARγ的下游基因与脂肪细胞中的免疫反应基因，在接受了TS1腺病毒的小鼠的脂肪组织中的表达显著降低(图60)。此外，GTT和ITT实验显示，表达TS1的小鼠没有明显的葡萄糖耐受及胰岛素耐受，(图61)。这些结果清楚地表明，TS1抑制PPARγ的转录活性，并防止脂肪细胞形成和巨噬细胞的免疫反应，从而防止了肥胖的发展。 

实施例12.β抑制蛋白1的片段与PPARγ-LBD的相互作用 

我们进一步用光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术的仪器BIAcore T100检测短肽TS1与PPARγ-LBD结合的特异性和动力学过程。实验结果清楚的显示TS1可与PPARγ-LBD相互作用(图62A)，与RXRα-LBD没有相互作用(图62B)。而TS2与PPARγ-LBD没有相互作用，可作为阴性对照(图62C)。 

据报道，PPARγ与RXRα会形成异源二聚体结合在特异的反应原件上调控下游基因的转录。因此，我们进一步用SPR技术实验检测了TS1对PPARγ/RXRα异源二聚体形成的影响。PPARγ-LBD与RXRα-LBD之间的结合由图62D验证，而TS1的加入可显著降低PPARγ-LBD与RXRα-LBD的结合(图62E)，而TS2 没有这样的作用(图62F)。 

实施例13.有Tat标签的β抑制蛋白1的片段与PPARγ-LBD的相互作用 

为了下一步的转染实验，我们在TS1多肽前加上了HIV-1的Tat标签(SEQ ID NO：66)，之前的报道（28）.显示HIV-1的Tat标签可以介导短肽或蛋白在没有转染试剂的介导下直接进入细胞或组织中。在SPR实验中，我们发现添加了HIV-1的Tat标签的TS1短肽可以与PPARγ-LBD相互作用(图63A)。同时，为了寻找与TS1更能相近序列更短的多肽，我们用SPR实验测试了多个比TS1更短的多肽，出于之后细胞实验考虑，我们在这些多肽上都添加了HIV-1的Tat标签。这些短肽分别为T18(SEQ ID NO：67；其编码序列为SEQ ID NO：73)、T16(SEQ ID NO：68；其编码序列为SEQ ID NO：74、T14(SEQ ID NO：69；其编码序列为SEQ ID NO：75)、T11(SEQ ID NO：70；其编码序列为SEQID NO：76)和MD6(SEQ ID NO：71；其编码序列为SEQ ID NO：77)。实验结果显示添加了HIV-1Tat标签的一个6个氨基酸的多肽MD6（MEEADD，SEQ ID NO：71；其编码序列为SEQ ID NO：77）与TS1相比可以和PPARγ-LBD有更强的结合作用，并且Tat-MD6也可以降低PPARγ-LBD与RXRα-LBD的结合(图63A和B)。 

实施例14.β抑制蛋白1的片段TS1和MD6对MEF细胞分化的影响 

我们将合成的Tat-TS1和Tat-MD6添加在野生型的MEF细胞中，并诱导这些细胞向脂肪细胞分化。8天后油红-O染色结果显示，添加了Tat-TS1和Tat-MD6的细胞分化成的脂肪细胞更少，细胞内的脂质积累更少(图64)。 

实施例15.β抑制蛋白1的片段TS1和MD6对PPARγ、RXRα和NCoR的启动子区域结合的影响 

为了进一步检测在细胞3T3-L1前体脂肪细胞细胞系内Tat-TS1和Tat-MD6对PPARγ、RXRα和NCoR在脂肪分化相关基因启动子区域结合的影响，我们做了染色质免疫共沉淀的实验。结果显示，Tat-TS1和Tat-MD6的添加可显著降低PPARγ和RXRα在脂肪分化相关基因启动子区域的结合(图65A和B)，而 NCoR在这些启动子区域的结合则被升高(图65C)。添加Tat-TS1和Tat-MD6的细胞中，这些PPARγ调控的脂肪细胞分化相关基因的mRNA转录水平也显著降低(图65D)。以上这些实验结果显示Tat-TS1和Tat-MD6可以结合PPARγ并抑制PPARγ的功能。这为我们肥胖症的治疗也提供了一个可能的策略。在小鼠的在体实验中我们也发现了，喂食的Tat-TS1和Tat-MD6多肽可转导进入小鼠脂肪细胞内，并对小鼠高脂饮食诱导的肥胖的产生有一定的抑制作用。 

实施例16：特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物的筛选 

哺乳动物双杂交实验。我们构建了表达全长的PPARγ或PPARδ与VP 16转录激活结构域的融合蛋白，产生了VP16-PPARγ和VP16-PPARδ质粒。我们也构建了全长的RXRα与Gal4DNA结合结构域的融合蛋白，产生了Gal4-RXRα质粒。另外的辅助质粒为带有Gal4结合元件的荧光素酶报告基因。我们将质粒转染进293细胞，并在转染后48小时检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。PPARγ或PPARδ与RXRα相互作用可形成具有转录激活活性的蛋白复合物并结合在Gal4结合元件上激活荧光素酶的表达。因此荧光素酶活性便反应了PPARγ或PPARδ与RXRα相互作用的强弱。通过对转染后的细胞添加小分子化合物刺激，刺激后检测荧光素酶活性，我们筛选检测了大量化合物对PPARγ和RXRα相互作用的影响。以PPARδ与RXRα的相互作用作为对照，我们筛选了特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物。 

讨论 

β抑制蛋白1和β抑制蛋白2是在各组织中广泛分布并大量表达的信号分子，其在神经和免疫系统中的重要功能最近得到了广泛的研究(13,29-31)。这些研究结果表明，β抑制蛋白基因缺陷小鼠表现正常，但是，在各种病理或刺激的条件下，这些小鼠就显示出与相关疾病关联的表型。这说明β抑制蛋白与许多复杂疾病的易感性是密切联系的。我们目前的工作，与以往的研究结合在一起(9,32,33)，建立了一个严格的独特的β抑制蛋白1和β抑制蛋白2的调节方式，来协调整个个体的代谢反应和能量平衡。任一β抑制蛋白基因亚型的缺乏都会导致代谢相关疾病，包括肥胖症，胰岛素抵抗和糖尿病。而通过直接引入β抑 制蛋白1或其片段，或者通过基因载体的形式引入β抑制蛋白1或其片段均可能预防或治疗这类代谢相关疾病。 

β抑制蛋白的功能主要通过结合不同的蛋白分子，在调节各种信号通路中起关键作用。我们以前的研究表明，在细胞核中，β抑制蛋白1通过与P300(10)的相互作用调节组蛋白的修饰和基因转录。而在我们目前的研究中，我们发现β抑制蛋白1与核受体PPARγ有相互作用并可以负调控PPARγ在细胞核的转录活性。因此，我们的研究，不仅拓展了β抑制蛋白1在细胞核内的功能，而且还提供了新的证据表明，β抑制蛋白1除了可以调控其经典的细胞膜上的GPCR和其他受体也能在细胞核中调控核受体。我们现在还不清楚β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用或分离是否受到其他信号的调控。值得注意的是，我们的初步结果表明，在GLP–1的刺激下，β抑制蛋白1和PPARγ的相互作用可以增强(数据未显示)。因此这暗示了我们β抑制蛋白1可以作为一种多功能的调节分子，影响胰岛素分泌，胰岛素的功能以及胰岛素的敏感性，调控全身代谢反应保持适当水平。 

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一类重要的核受体，在调节血脂，细胞分化，增殖和免疫反应中起着重要作用。PPARγ是其中重要的一员。PPARγ可以通过结合其配体，与RXR形成异元二聚体，进一步招募共激活因子发挥转录活性。PPARγ的转录活性也受到NCoR的调控，PPARγ与NCoR形成抑制性复合体，抑制如Nos2、TNF-α和IL-6(4,27,34,35)等免疫反应的相关基因的表达。在我们的研究中，我们证明了β抑制蛋白1与PPARγ的相互作用，抑制了PPARγ/RXRα异元二聚体的形成，同时增强了PPARγ/NCoR抑制性复合物的形成。并且，我们发现，罗格列酮的刺激可以降低β抑制蛋白1/PPARγ的相互作用，但并不影响PPARγ/RXRα异元二聚体的形成，表明了PPARγ复合体的抑制功能可能由β抑制蛋白1与PPARγ相互作用的分离而转变为激活功能。因此β抑制蛋白1可能作为一个双向开关调解PPARγ的转录激活和转录抑制功能。 

参考文献 

1.Chandra,V.,等Nature,350-356(2008). 

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Claims (22)

1.一种用于调节PPARγ活性以预防或治疗PPARγ相关的疾病或病症的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：71所示氨基酸序列。

2.如权1所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1、3、10、13和67-70中任一项所示的氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求1-2中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含与SEQID NO：3的序列相同性为约99.8%以下的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽中与SEQ ID NO：3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽为如SEQ ID NO：1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列。

6.一种分离的多肽，所述多肽选自：

（1）如SEQ ID NO：1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列的多肽；

（2）在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO：3的生物学活性的由（1）衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在SEQ ID NO：71中。

7.一种核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的多肽。

8.一种重组载体，其包含权利要求7所述的核酸。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的重组载体。

10.一种制备权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，其包括以下步骤：

i)培养权利要求9所述的宿主细胞，

ii)诱导其表达，

iii)收获表达产物，和

iv)任选地，纯化表达产物。

11.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。

12.权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体在制备用于治疗或预防PPARγ相关的疾病或病症的药物中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病或病症括肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。

14.一种抑制PPARγ活性的方法，所述方法包括应用权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体。

15.权利要求1-5中任一项所述的多肽、权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的重组载体在制备抑制PPARγ活性的组合物中的应用。

16.一种降低罗格列酮引起的脂肪细胞分化和生成的方法，所述方法包括应用权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体。

17.权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体在制备降低罗格列酮引起的脂肪分化和生成的组合物中的应用。

18.一种筛选特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤：

i)构建表达全长的PPARγ或PPARδ与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPARγ和PPARδ质粒；

ii)构建全长的RXRα与另一转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRα质粒；

iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件；

iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞；

v)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达；

vi)以PPARδ与RXRα的相互作用作为对照，筛选特异影响PPARγ和RXRα相互作用的小分子化合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤ii)和iii)中所述的转录调控因子是Gal4。

21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。

22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤iv)中所述细胞为293细胞。

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