CN107522778A - 一种调控糖脂代谢的功能性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种调控糖脂代谢的多肽，其氨基酸序列为EPSGIEPSG，其来源于AJUBA蛋白分子。所述AJUBA蛋白分子是一个全新的PPAR受体结合蛋白分子；AJUBA属于LIM蛋白家族，在C‑端含有三个串联的LIM结构域，LIM结构域由两个串联锌指组成，所述AJUBA蛋白分子能结合在PPARγ靶基因的启动子上，并能促进这些靶基因的表达，可作为PPARγ的共激活因子。所述多肽EPSGIEPSG能抑制与脂肪合成有关的关键基因的表达，并抑制脂肪细胞分化和脂肪合成，能够用于治疗糖尿病和肥胖等疾病。

Description

一种调控糖脂代谢的功能性多肽
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人源的能调控糖脂代谢的功能性多肽，所述功能性多肽具有潜在的医学临床应用价值，特别是在糖尿病，肥胖等疾病中的应用。
背景技术
肥胖问题日益被人们重视起来，研究表明肥胖与心血管疾病、II型糖尿病及肿瘤的发生高度相关，同时作为这类代谢疾病的诱因，逐渐被重视起来。脂肪细胞在维持全身能量平衡中发挥关键作用，研究脂肪组织发育以及脂肪细胞分化的分子机制，成为了解和解决这类疾病的关键。
核受体PPAR(Peroxisome-Proliferator Activated Receptors)家族对脂肪发生和调节糖代谢至关重要。目前该家族包括三个基因成员，分别命名为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ。PPAR家族成员具有明显不同的组织分布和功能。在脂肪组织的大量研究都集中到了PPARγ，这主要源于它具有明显的脂肪组织的表达特异性。PPARγ直接调控大量脂类合成相关的基因表达，在脂肪细胞分化和功能实现中占据核心地位。
PPAR家族是开发治疗糖尿病和肥胖的药物的主要靶点。目前临床应用的多为噻唑烷二酮(TZDs)类药物。该类药是PPAR受体的激动剂，结合在PPAR的配体结合域，从而激活PPAR下游控制脂肪合成相关的基因的表达。TZDs类药物被用来治疗糖尿病，但是发现该类药物具有严重的毒副作用，例如导致心衰，骨质疏松等，现在已经被禁用。因此，寻找新的，更为安全的PPAR靶标药物具有必要性。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提出了一种人源的调控糖脂代谢的多肽，其氨基酸序列为EPSGIEPSG，含有EPSG的2个重复，如图1所示。所述多肽来源于AJUBA分子。所述AJUBA是一种新的PPAR家族的转录调控因子，能够作为治疗糖尿病和肥胖等疾病的靶分子。
本发明提出的所述人源的调控糖脂代谢的多肽EPSGIEPSG，来源于AJUBA蛋白分子。所述AJUBA蛋白分子是一个全新的PPAR受体结合蛋白分子；AJUBA属于LIM蛋白家族，在C-端含有三个串联的LIM结构域，LIM结构域由两个串联锌指组成，主要介导多种蛋白的互作如Snail，14-3-3等，目前未发现其具有DNA结合活性，如图1所示。
所述特异多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为EPSGIEPSG。
其中，所述AJUBA蛋白分子能结合在PPARγ靶基因的启动子上，并能促进这些靶基因的表达，这说明AJUBA蛋白分子是PPARγ的共激活因子。
其中，所述AJUBA分子能直接结合PPARγ，在细胞内主要共同定位于细胞核中，如图2所示。
其中，所述AJUBA蛋白分子能促进脂肪细胞分化和脂肪合成。
其中，所述AJUBA蛋白分子的特异氨基酸序列(EPSGIEPSG)结合PPARγ的DNA结合区域。
其中，所述氨基酸序列EPSGIEPSG能抑制与脂肪合成有关的关键基因的表达，并抑制脂肪细胞分化和脂肪合成。
本发明首次发现了AJUBA是全新的PPARγ的共激活因子，能促进脂肪的合成，AJUBA蛋白分子的特异氨基酸序列EPSGIEPSG能够结合PPARγ的DNA结合区域，该多肽EPSGIEPSG能抑制PPARγ的功能，并抑制脂肪合成。这些发现表明该多肽EPSGIEPSG具有调控糖脂代谢的功能。
所述AJUBA蛋白分子特异结合于PPARγ的DNA结合域，AJUBA分子中的氨基酸序列EPSGIEPSG结合于PPARγ的C区域，如图3所示。
所述AJUBA蛋白分子能促进脂肪细胞成熟和合成脂肪，如图4所示。
所述AJUBA蛋白分子结合在PPARγ靶基因的启动子上，并能促进控制脂肪合成的靶基因的表达，如图5所示。
所述特异性多肽EPSGIEPSG能进入细胞，在细胞核里富集，能抑制脂肪合成基因的表达，如图6所示。
本发明所采用的技术包括如下：1)生物信息学分析预测，找到PPARγ受体的候选结合蛋白分子AJUBA；2)免疫共沉淀，免疫荧光，体内体外表达等技术确定PPARγ与AJUBA直接结合；3)分子遗传学手段干预候选分子在细胞内的表达，确定AJUBA促进PPARγ的转录活性，即对其靶基因的表达具有促进作用，并且能促进脂肪细胞的分化和脂肪的合成；4)采用截短体重组蛋白表达体系及定点氨基酸残基突变技术找到具体的特异氨基酸序列；5)人工合成该特异多肽EPSGIEPSG，确定其与PPARγ结合，对其靶基因和脂肪合成的抑制作用。
本发明还提出了所述的人源的调控糖脂代谢的AJUBA蛋白分子在制备作为PPARγ的共激活因子的药物中的应用；所述AJUBA蛋白分子结合在PPARγ靶基因的启动子上，并能促进这些靶基因的表达。
本发明还提出了所述的人源的调控糖脂代谢的AJUBA蛋白分子在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的应用。
本发明还提出了所述的人源的调控糖脂代谢的AJUBA蛋白分子在制备促进脂肪细胞分化和脂肪合成的药物中的应用。
本发明还提出了所述的多肽在制备抑制脂肪细胞分化和脂肪合成的药物中的应用。
本发明还提出了所述多肽EPSGIEPSG在制备治疗糖尿病和肥胖等疾病药物中的应用。
本发明还提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括：所述人源的调控糖脂代谢的AJUBA蛋白分子。
本发明的调控糖脂代谢的功能性多肽可以由人工合成的方式获得。
本发明的有益效果在于，本发明的多肽EPSGIEPSG来源于AJUBA蛋白分子，所述多肽能够结合PPARγ的DNA结合区域，能抑制PPARγ的功能，并抑制脂肪合成，具有调控糖脂代谢的功能。
附图说明
图1为AJUBA与PPARγ相互结合：其中，图1A图示PPARγ的分子结构，A/B是转录活性区域，C是DNA结合域，D是铰链域，E/F是配体结合域，TZDs结合于该域而激活PPARγ的转录活性；图1B图示AJUBA的分子结构；负责结合PPARγ的特异氨基酸序列EPSGIEPSG位于PreLIM区域；LIM是双锌指结构，负责AJUBA与其它蛋白质分子的相互作用。
图2为AJUBA直接结合PPARγ；其中，图2A表示免疫共沉淀实验证明AJUBA可以和PPARγ1和2结合；图2B表示在3T3-L1细胞中，内源的AJUBA和PPARγ也能相互结合；图2C表示免疫荧光实验证明内源的AJUBA和PPARγ主要共同定位于细胞核里。
图3为定位AJUBA和PPARγ相互结合的具体区域；其中，图3A，图3B表示免疫共沉淀实验证明含有EPSGIEPSG序列的区域结合PPARγ；图3C，图3D表示免疫共沉淀实验证明PPARγ的DNA结合域负责结合AJUBA。
图4为AJUBA促进脂肪合成；其中，图4A，图4B表示通过小RNA技术干扰AJUBA的表达，能抑制脂肪合成，红色代表细胞内的脂肪滴，B表示脂肪合成相关的基因；图4C，图4D表示在细胞内增加AJUBA的水平促进脂肪合成。
图5为AJUBA结合PPARγ靶基因的启动子DNA上；其中，图5A，图5B表示AJUBA促进PPARγ靶基因转录；图5C，图5D表示AJUBA结合PPARγ靶基因的启动子上，这种结合依赖于PPARγ。
图6为特异多肽EPSGIEPSG负责结合PPARγ，并能抑制脂肪合成；其中，图6A图示特异多肽序列及其失活突变体；图6B表示免疫共沉淀实验证明该特异多肽负责结合PPARγ；图6C表示该特异多肽能进入细胞，在胞质和细胞核都有分布；图6D表示该多肽能抑制脂肪合成基因的表达。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1免疫共沉淀实验：表达Myc标签的AJUBA和Flag标签的PPARγ蛋白的质粒利用Lipofactamine 2000瞬时转入293细胞中，48小时后收取细胞，制备蛋白抽提物.利用Myc抗体做免疫共沉淀，Flag抗体做Western blot检测PPARγ。实验结果如图2，3所示，AJUBA直接结合PPARγ。
实施例2实时定量RT-PCR检测脂肪合成基因的表达：收取不同分化期的3T3-L1细胞，利用TRIZOL的方法，抽提细胞内总RNA，取2微克逆转录成cDNA.根据常规的定量PCR方法，检测所选的脂肪合成的关键基因的表达水平。实验结果如图3所示，AJUBA能促进PPARγ靶基因转录。
实施例3染色质免疫共沉淀实验(ChIP)：3T3-L1细胞(未分化，和分化4天)利用4％的福尔马林液固定15分钟，甘氨酸溶液中和后，PBS溶液漂洗3次，收集细胞。超声波破碎细胞，定量，分装。利用抗体(AJUBA,PPARγ)免疫沉淀，提取沉淀的DNA，定量PCR检测靶基因启动子DNA的丰度。实验结果如图5所示，AJUBA能结合在PPARγ靶基因的启动子DNA上。
实施例4多肽ESPGIESPG处理3T3-L1细胞实验：该多肽和其突变体由公司合成，纯度>95％。5'端带有绿色荧光标记(波长488).1微克多肽利用蛋白质转染试剂盒(Thermofisher,Cat:89850)转入3T3-L1细胞，荧光显微镜观察多肽分子在细胞内的分布。24小时后收取细胞，利用实例2所述方法，检测PPARγ靶基因的表达水平。实验结果如图6所示，多肽ESPGIESPG在细胞核内富集，并能抑制脂肪合成的基因表达水平。
具体实验和其它实验，参阅发明人的公开文献：
The LIM protein Ajuba promotes adipogenesis by enhancing PPARγand p300/CBP interaction.Cell Death Differ.2016Jan；23(1):158-68.
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (10)

1.一种调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为EPSGIEPSG，含有EPSG的2个重复。
2.如权利要求1所述的调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，其来源于AJUBA蛋白分子。所述AJUBA蛋白分子属于LIM蛋白家族，在C-端含有三个串联的LIM结构域，所述LIM结构域由两个串联锌指组成。
3.如权利要求2所述的调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，所述AJUBA蛋白分子能直接结合PPARγ，在细胞内主要共同定位于细胞核中。
4.如权利要求2所述的调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，所述AJUBA蛋白分子特异结合于PPARγ的DNA结合域，AJUBA分子中的氨基酸序列EPSGIEPSG结合于PPARγ的C区域。
5.AJUBA分子如权利要求2所述的调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，所述AJUBA蛋白分子结合在PPARγ靶基因的启动子上，并能促进控制脂肪合成的靶基因的表达，能促进脂肪细胞成熟和合成脂肪。
6.如权利要求1所述的调控糖脂代谢的多肽，其特征在于，所述多肽EPSGIEPSG能进入细胞，在细胞核里富集，能抑制脂肪合成基因的表达。
7.如权利要求1所述的调控糖脂代谢的多肽在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的应用。
8.如权利要求1所述的调控糖脂代谢的多肽在制备抑制脂肪细胞分化和脂肪合成的药物中的应用。
9.如权利要求2所述的调控糖脂代谢的多肽中的AJUBA蛋白分子在制备作为PPARγ的共激活因子的药物中的应用。
10.如权利要求2所述的调控糖脂代谢的多肽中的AJUBA蛋白分子在制备促进脂肪细胞分化和脂肪合成的药物中的应用。
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