KR20170098046A - 중간엽 줄기세포 또는 xcl1을 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는, XCL1 단백질 또는 이의 유도체를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 근육질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 중간엽 줄기세포 또는 XCL1 단백질은 근육세포 또는 근육아세포 사멸을 저해하는 효과가 있으므로 근육질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, XCL1 단백질을 포함하는 세포사멸 저해제는 세포 사멸 연구에 활용할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 또는 XCL1을 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of muscular disease containing mesenchymal stem cells or XCL1}
본 발명은 중간엽 줄기세포 또는, XCL1 단백질 또는 이의 유도체를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 근육질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 스트로마 기원의 세포로 자기 재생(self-renewal)의 특징을 가지고 있으며 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 등으로 분화할 수 있어 세포 치료요법에 적합한 세포로 주목받고 있다. 현재 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수(bone marrow)를 들 수 있다. 그러나, 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고, 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통을 수반하는 것이 보통이다. 또한, 골수 이식을 위해서는 조직적합항원 비교를 통해 항원 표현형이 일치하여 이식편대 숙주반응을 보이지 않는 공여자를 찾아야 한다는 문제점이 있다. 탯줄은 골수와는 달리 분만과정에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 최근에는, 탯줄, 태반, 제대혈 등에 많은 양의 줄기세포가 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 탯줄로부터 분리·배양한 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비되는 인자가 근육세포 사멸을 억제한다고 보고된 바는 없다.
XCL1(chemokine (C motif) ligand 1)은 케모카인(chemokine) 서브패밀리 구성원중 하나이다. 케모카인은 염증 및 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 세포 사멸과의 관계에 대해서는 알려진 바가 없다.
한편, 근육은 우리 몸을 지탱하고 생명현상을 유지하는 필수 조직이다. 근육은 근육아세포(myoblast)가 분화하여 다핵의 근관세포(multinucleated myotube)를 형성하고 근육세포(myocyte)를 만들며 근육아세포와 근육세포의 사멸은 여러가지 질병의 원인이 되고 있다. 또한, 유전자 돌연변이나 (muscular myopathy) 여러 원인을 통한 만성염증, 자가면역질환을 통한 근육소실 혹은 말초신경의 퇴화를 통하여 신경근접합부(neuromuscular junction)의 근육세포가 소실되는 질환들이 보고되고 있으며 현재까지 근본적인 치료제가 없는 상황이다. 현재 급성 및 만성 세균성 염증 질환, 낭포성 섬유증 및 패혈증 등의 염증 관련 질환에 있어 중간엽 줄기세포의 효능이 입증되어 그 활용성이 주목받고 있으나, 근육질환과의 관계에 대해서는 그 효과가 전무한 상태이다. 이처럼 근육세포사멸에 기인한 근육질환을 효과적으로 치료하고 내성을 유발하지 않는 새로운 치료법에 관한 필요성이 절실하다.
한편, 제브라피쉬(zebrafish)는 열대성 어류의 한 종류로 실험 동물모델로 널리 이용되고 있다. 제브라피쉬는 척추동물로 쥐, 랫트와 같은 동물모델을 대체할 수 있음은 물론 이들 동물에 비해 발생 시간이 짧으며 배아가 투명하여 관찰이 용이하다는 장점이 있다.
특히, 미세 주입(microinjection) 기술을 이용한 재조합 단백질들을 제브라피쉬에 직접 주입 시킬 수 있으므로, 이들 단백질의 생리적 기능을 관찰 및 규명하는 연구에 유용하다. 그럼에도 현재까지 XCL1 단백질을 대상으로 제작된 제브라피쉬 및 연구 결과에 대한 보고는 없다.
또한, 대용량의 치료 물질을 스크리닝하기 위해서는 동물 사육 및 관리비와 분석 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 동물들 보다는 경제적, 시간적 효용성이 좋은 제브라피쉬가 훨씬 편리하다. 따라서 생체 내 기능을 모사할 수 있으며 대용량 스케일의 스크리닝이 가능한 질환 동물 모델 제작 및 스크리닝 방법은 개발할 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 중간엽 줄기세포가 근육세포사멸을 저해하는 효과가 있음을 확인하였고, 중간엽 줄기세포에서 분비되는 수용성 인자인 XCL1 단백질을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 근육질환 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 세포사멸 저해제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 근육질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 XCL1 단백질 또는 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체가 도입된 제브라피쉬를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 단백질 또는 이의 유도체를 포함하는 세포사멸 저해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) XCL1을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현을 증가시키는 경우, 상기 시험물질은 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) XCL1에 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성을 증가시키면 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
또한, 본 발명은 XCL1 단백질 또는 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체가 도입된 제브라피쉬(zebrafish)를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 근육질환 예방 또는 치료를 위한, XCL1 병용투여용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 제14항의 제브라피쉬에 XCL1 병용투여용 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 제브라피쉬 근육세포의 발생정도를 관찰하는 단계.
본 발명의 중간엽 줄기세포 또는 XCL1 단백질은 근육세포 또는 근육아세포 사멸을 저해하는 효과가 있으므로 근육질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, XCL1 단백질을 포함하는 세포사멸 저해제는 세포 사멸 연구에 활용할 수 있다.
도 1은 중간엽 줄기세포와 사멸 근육아세포의 공동배양 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 중간엽 줄기세포와 근육아세포의 공동배양 결과를 나타낸 도이다(WJ-MSC: 탯줄 유래 중간엽 줄기세포).
도 3은 중간엽 줄기세포와 공동배양한 근육아세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 4는 농도 의존적으로 처리한 XCL1 단백질과 공동배양한 근육아세포의 세포모양을 나타낸 도이다.
도 5는 농도 의존적으로 처리한 XCL1 단백질과 공동배양한 근육아세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 시간 의존적으로 처리한 XCL1 단백질과 공동배양한 근육아세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 7은 PAN 저해제와 XCL1 단백질의 세포사멸 저해 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 세포사멸유도 인자 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 마우스 해마신경세포의 형태를 나타낸 도이다.
도 9는 세포사멸유도 인자 및 XCL1 단백질 처리 후 마우스 해마신경세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 10은 소포체 스트레스 유도체 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 랫드 슈반세포의 형태를 나타낸 도이다.
도 11은 소포체 스트레스 유도체 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 랫드 슈반세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 12는 로바스타틴(Lovastatin) 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 마우스 근관세포의 형태를 나타낸 도이다.
도 13은 로바스타틴(Lovastatin) 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 마우스 근육아세포 및 근관세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 14는 로바스타틴(Lovastatin) 처리 후 XCL1 단백질을 처리한 마우스 근육아세포에서 MHC를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 15는 XCL1 합성을 저해하는 siRNA를 처리한 중간엽 줄기세포와 공동배양한 근육아세포의 형태를 나타낸 도이다.
도 16은 XCL1 합성을 저해하는 siRNA를 처리한 중간엽 줄기세포와 공동배양한 근육아세포에서 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 도이다.
도 17은 인간 XCL1 발현 제브라피쉬 모델을 제조하기 위한 미세 주입 모식도이다.
도 18은 인간 XCL1 발현 제브라피쉬 모델이 태어난 후 3일차의 표현형을 나타낸 도이다.
도 19는 근육질환 증상을 모사하는 제브라피쉬에 XCL1 단백질을 주입한 후 제브라피쉬를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 제브라피쉬의 근육세포 활성화 정도를 관찰하기 위해 선정한 몸통의 특정 지역을 나타낸 도이다.
도 21은 제브라피쉬의 근육세포 활성화 정도를 공초점현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 제브라피쉬의 배아에 XCL1 단백질을 0, 30, 50μg/mL로 처리한 후 정상 배아와 비정상 배아를 관찰하여 수치화한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1)을 포함하며, XCL1은 중간엽 줄기세포에서 분비되는 수용성 인자로서, 케모카인(chemokine) 서브패밀리 구성원중 하나이다(NCBI GenBank Accession number: NP_002986).
본 발명의 XCL1 단백질은 서열목록 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다.
본 발명의 조성물은 XCL1 단백질 자체 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 포함한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 소망하는 약리학적 효과, 즉 근육질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 상기 XCL1 단백질의 염을 나타낸다. 이러한 염은 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드 및 하이드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 형성된다. 용어, "약학적으로 허용 가능한 수화물"은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 XCL1 단백질의 수화물을 나타낸다. 용어, "약학적으로 허용 가능한 용매화물"은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 XCL1 단백질의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체의 약학적 유효량을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체에서 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 2의 서열로 이루어진다.
상기 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 담체에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다.
한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 XCL1 유전자는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 한편, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다.
또한, 상기 삽입 서열들은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
본 발명의 아데노바이러스 유전자 담체는 "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"과 "프로모터-XCL1 유전자-폴리 A 서열"이 연결된 구조를 갖으며, 상기 "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된 것이고, 상기 "프로모터-XCL1 유전자-폴리 A 서열"은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다. 또한, "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열-IRES-XCL1 유전자-폴리 A 서열"처럼 목적 뉴클레오타이드와 XCL1 유전자가 IRES(internal ribosome entry site)에 의해 연결된 바이시스트론(bicistronic) 발현 시스템에 의해서도 발현될 수 있다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 담체를 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, XCL1 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). XCL1 유전자, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 담체로 이용한다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 담체로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 담체로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(XCL1 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945(1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 담체로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, XCL1 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
ⅴ. 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine (Gibco BRL)이 있다. XCL1 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 XCL1 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서, 유전자 담체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구 세포를 말한다. 본 발명에서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은 상태로 조성물 중에 함유된다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간의 배낭(embryonic yolk sac), 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있으나, 바람직하게는 탯줄에서 유래한다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 인간으로부터 유래하지만, 태아 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수도 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
상기 중간엽 줄기세포의 분리방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 인간의 배낭(embryonic yolk sac), 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등으로부터 분리되고 정제될 수 있으며 분리된 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh,1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 상기 중간엽 줄기세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "근육질환"은 근육 소모 관련 질환 또는 근육 손상으로 인한 질환을 모두 포함한다. 용어 "근육 소모 관련 질환"은 근육량의 점진적 손실 등의 증상을 수반하는 질환 또는 상태를 의미한다. 상기 근육 소모는 유전적 소인; 고혈압, 내당능장애, 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성경화증 및 심혈관 질환과 같은 연령-관련 질환; 암, 자가면역질환, 감염성 질환, AIDS, 만성 염증질환, 관절염, 영양실조, 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 구루병, 만성 하부 척추통증, 말초신경손상, 중추신경손상 및 화학적 손상과 같은 질환 등의 만성 질환; 장기 고정과 같은 상태, 골절 또는 외상과 같은 무력감과 같은 상태, 수술 후 침상 요양; 및 노화과정에 따른 골격 근육량 및 강도의 진행성 감소 등의 다양한 원인에 기인할 수 있다. 근육 소모 관련 질환은 약화된 신체 상태를 유발하게 되어 건강상태의 악화 또는 무능한 신체 수행력의 건강 상태를 야기할 수 있다. 용어 “근육 손상”은 임의의 근조직의 손상으로, 근육 손상은 사고, 운동 부상, 내분비선 장애, 질환, 창상 또는 외과 수술로 인한, 근조직에 대한 육체적 트라우마로부터 발생할 수 있다.
상기 근육질환은 염좌(sprain), 좌상(strain), 경련, 건염, 근육암, 근염(myositis), 횡문근융해증, 근위축증(muscular atrophy), 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화증, 근무력증(myasthenia), 디스트로핀병증(dystrophinopathy), 근육병증(myopathy) 및 근감소증(sacopenia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며, 바람직하게는 근육세포 또는 근육아세포의 사멸에 의해 발생하는 질환을 포함한다. 상기 근위축증은 근육의 양이 부분적으로 줄거나 완전히 소실되는 현상을 보이며, 외상에 따른 탈신경에 의한 골격근 위축, 안정 와상이나 관절 고정 등에 의한 부동으로 발생하는 골격근 위축 (폐용성 골격근 위축(muscle disuse atrophy))으로 나뉘고, 폐용성 골격근 위축은 고령화 사회에서는 보다 증가 추세이다. 골격근 위축은 각종 질병들에 의한 근육으로의 혈액 공급 감소, 또는 그에 따른 움직임과 운동 부족(immobilization), 지속적인 체중 감소, 영양 불량 상태 (malnutrition or starvation), 근육에 연접한 탈신경(denervation), 암, 에이즈, 울혈심부전 (congestive heart failure), 만성 폐쇄폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 신부전 (renal failure), 심각한 화상 (severe burns) 등에 의해 나타난다. 상기 근감소증은 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다. 본 발명의 조성물은 근육세포 또는 근육아세포의 사멸을 저해함으로써 근육질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 가지고, 근육은 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 유래 XCL는 근육세포 또는 근육아세포 사멸을 저해하여 세포 보호 기능을 함을 특징으로 한다.
또한 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 병변이 발생한 부위에 직접 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(Suspensions), 침제 (Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pills)등으로 제조할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 주입되는 중간엽 줄기세포의 양은 104-1010cells/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 105-109 cells/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5x107cells/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 주입되는 XCL1은 0.0001ng-500mg/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001mg-200mg/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 근육질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 근육질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1)은 자연적으로 생성되고 중간엽 줄기세포로부터 유래된 것일 수 있으며, 자연적으로 생성된 XCL1은 보통 동물과 연관된 XCL1의 야생형 아미노산 서열을 갖는 XCL1을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 자연적으로 생성된 XLC1은 자연적으로 생성된 XCL1의 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 대립 변이체, 다형성 변이체 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 XCL1은 근육질환 예방 또는 치료 효과를 달성하는 생물활성을 가진 한 당 분야의 알려진 방법으로 재조합된 단백질, 이들의 유사체, 유도체, 돌연변이체들을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 돌연변이는 자연계에서 발견되는 돌연변이 또는 XCL1을 코딩하는 핵산 서열에 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 삽입한 효과를 갖거나 갖지 않는 인공적 돌연변이일 수 있다.
상기 돌연변이는 단백질 발현에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 자연계의 XCL1 단백질의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 XCL1 단백질은 단편, 결실, 절두 등에 의한 폴리펩티드 변이체로 이루어진 것을 포함하며, 자연계의 XCL1 단백질로부터 아미노산 잔기가 제거된 단편일 수 있다. 이러한 단편, 결실, 절두 등은 생성된 폴리펩티드의 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않는다. 구체적 양태에서, XCL1 의 단백질 도메인의 맵핑에 의해 또는 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 단부 둘다로부터의 절두를 통해 XCL1의 활성화 도메인을 도출해 낼 수 있으며, 이러한 절두된 폴리펩티드는 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않거나 활성의 증가를 나타낼 수 있다.
상기 재조합된 단백질에서 "재조합"은, 세포와 관련하여 사용될 때, 전형적으로 세포가 외래 핵산 서열의 도입에 의해 변형되었거나 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래됨을 나타낸다. 예를 들어, 재조합 세포는 천연(native) (비-재조합) 형태의 세포 내에서는 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 재조합 세포는 (천연 형태의 세포에서 발견되는) 천연 유전자를 포함할 수 있지만, 그러나 이러한 유전자는 변형되어 세포 내로 재도입된 것이다. 재조합 세포는, 세포로부터의 핵산의 제거 없이, 변형된 세포에 내재하는 핵산을 포함할 수 있으며 그러한 변형은 유전자 치환, 부위-특이적 돌연변이, 및 당업자에게 공지된 관련 기술에 의해 얻어지는 것들을 포함한다. 재조합 DNA 기술은, 시험관 내에서 재조합 DNA를 생산하고, 그러한 재조합 DNA를 발현 또는 전파될 수 있는 세포 내로 전달하여 재조합 폴리펩티드를 생산하는 기술을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 "재조합", "재조합하는", 및 "재조합된"은 일반적으로, 둘 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 가닥들 또는 단편들을 조립 또는 조합하여 새로운 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 생성하는 것을 지칭한다. 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 때때로 키메라로 지칭된다. 핵산 또는 폴리펩티드는, 인공적이거나 또는 엔지니어링된 경우에, "재조합" 핵산 또는 폴리펩티드이다.
재조합 XCL1은, 예를 들면, 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이로부터 유래된 VWF 패밀리의 임의의 멤버, 및 그의 생물학적 활성 유도체를 포함한다. 활성을 갖는 돌연변이 및 변이형 XCL1 단백질이 XCL1 단백질의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로 포함된다.
상기 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체에서 상기 "유도체"란 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1)의 구조 일부를 다른 원자단, 치환기 등으로 치환하여 얻어지는 것 또는 다른 생물학적 물질과 결합 또는 융합된 하나 이상의 XLC1 폴리펩티드를 포함한다. 또한 당업계에 공지되어 있는 단백질의 개량 방법에 의해 개량된 단백질을 포함한다.
상기 다른 생물학적 물질과 결합된 하나 이상의 XLC1 폴리펩티드는 항체, 항체의 절편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인(cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등이 융합된 XCL1 융합 단백질일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 결합된 폴리펩티드를 분리 또는 확인하는 데 유용한 다양한 작은 펩티드, 다른 단백질, 화학적 수단(당 업계에는 "tag"로 알려짐)을 제한 없이 포함한다.
상기 생물학적 물질은 XCL1 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있으며, 당 업계에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.
구체적으로, XCL1과 융합될 수 있는 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적상, 친화성 크로마토그래피를 위한 적절한 매트릭스, 예컨대 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지가 사용된다. 다수의 그러한 매트릭스는 파마시아 지에스티 (Pharmacia GST) 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너와 유용한 큐엘에이익스프레스(QLAexpress)TM 시스템 (카이아진, Qiagen)과 같이 "키트" 형태로 이용가능하다. 또 다른 예로서, 융합 도메인은 XCL1 단백질의 검출을 촉진하도록 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 특정 항체가 이용가능한 일반적으로 길이가 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"뿐만 아니라 다양한 형광 단백질 (예를 들어, GFP)도 포함한다. 특정 모노클로날 항체가 쉽사리 이용가능한 주지의 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 융합 도메인은 적절한 프로테아제로 하여금 융합 단백질을 부분적으로 소화하도록 해주고 그리하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시키게 해주는 프로테아제 절단 부위, 예컨대 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 이어서 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의하여 융합 도메인으로부터 단리시킬 수 있다. 또한 상기 도메인은 예컨대 폴리아르기닌-태그(Arg-tag), Strep-태그(Strep-tag), S-태그(S-tag), 칼모듈린-결합 펩티드(calmodulin-binding peptide), 셀룰로오스-결합 도메인(cellulose-binding domain), SBP-태그(SBP-tag), 키틴-결합 도메인(chitin-binding domain), 글루타티온 S-트랜스퍼라제-태그(glutathione S-transferase-tag), 말토오스-결합 단백질(maltose-binding protein), NusA, TrxA, DsbA, protein A, protein G, 인간 알부민(human albumin) 등을 더 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, XCL1 단백질은 생체내에서 XCL1 단백질을 안정화시키는 도메인 ("스태빌라이저" 도메인)과 융합될 수 있다. "안정화시키는"이란 혈청 반감기 증가가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 클리어런스 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다. 이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (소망에 따라, 추가의 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인을 포함한다. 융합체는 이종 펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단에서 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 카르복시 말단에서 융합되도록 구축될 수 있다.
발명의 일부 실시양태에서, XCL1 아미노산 서열은 그의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 다량체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이량체이다. 본원에 기재된 결합제의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적 활성을 나타내거나, 그의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 변이는 결실, 삽입, 반전, 반복 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.
또한 XCL1 단백질, 폴리펩티드, 그의 유도체, 유사체 및 변이체는 통상적으로 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티(moiety)를 함유하도록 변형될 수 있다. 유도체화 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 개선시키거나 또는 달리 조절할 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 단백질, 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법에서부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열의 구축 및 이들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것까지의 범위에 이른다. 일부 실시양태에서, 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 재조합 기술을 사용하여 단리 또는 합성함으로써 DNA 서열을 구축한다. 임의로, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 이 서열에 돌연변이를 일으킴으로써, 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로, 관심 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택함으로써 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정의 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 이들을 라이게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
어셈블리 (합성, 부위-지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함)되면, 특정한 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내에 삽입되고, 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적당한 어셈블리는 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열분석, 제한 효소 맵핑 및/또는 발현에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에 있어서 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 펩티드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 링커 펩티드에 의할 수 있다.
본 발명의 XCL1은 치료 효과의 증진을 위하여 생물활성 화합물과 추가로 결합되어 존재할 수 있다. 용어 "생물활성 화합물"은 상기 질병을 갖는 포유류에 적용되었을 때 질병을 변형하는 화합물을 말한다. 생물 활성 화합물은 길항(antagonistic) 또는 작용물질(agonistic) 특성들을 포함할 수 있고, 또는 단백질성 생물활성 화합물 또는 비-단백질성 생물활성 화합물일 수 있다. 그러한 단백질성 생물활성 화합물은 예를 들어, 표준 DNA 클로닝 기술들, 유전자 융합 폴리펩타이드들을 생성하는 것에 의한 본 발명의 결합 도메인과 공유결합으로 부착될 수 있고, 이어서 그들의 표준 발현 및 정제될 수 있다. 그러한 비-단백질 생물 활성 화합물들은 화학적 수단에 의해, 예를 들어, 여기서 기술한 것과 같이, 결합 도메인의 N- 또는 C-말단에 펩타이드 링커를 통하여 결합(coupled)되는 시스테인을 가지고 말레이미드 링커를 통해 시스테인 티올에 커플링하는 것에 의해, 예를 들어, 본 발명의 결합 도메인에 공유 결합적으로 부착될 수 있다. 단백질성 생물활성 화합물의 예시들은 뚜렷한 타겟 특이성 (예: 그것을 결합하는 것에 의해 성장 인자를 중화하는 것), 사이토카인 (예: 인터루킨), 성장 인자들 (예: 인간 성장 호르몬), 항체 및 그들의 단편들(fragments)m, 호르몬들(예: GLP-1) 및 어떤 가능한 단백질성 약물을 포함한다. 비-단백질성 생물활성 화합물들의 예시들은, 톡신(예: ImmunoGen으로부터 DM1), 소 분자 표적화 GPCRs, 항생물질들 및 어떤 가능한 비-단백질성 약물을 포함한다.
용어 "결합 도메인"은 단백질 스캐폴드(c)로써 동일한 "폴드(fold)" (3-차원의 배열)을 나타내는 단백질 도메인을 포함하고, 미리 정해진 특성(predetermined property)을 가진다. 그러한 결합 도메인은 이 기술에 알려진 합리적인, 또는 가장 흔하게, 조합화학적 단백질 엔지니어링 기술들에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 미리 정해진 특성을 포함하는 결합 도메인은 (a)아래에서 더 정의된 것처럼 단백질 스캐폴드로써 동일한 폴드를 제공하는 것; 그리고 (b) 상기 다양한 컬렉션 스크리닝 및/또는 상기 미리 정해진 특성을 포함하는 적어도 하나의 단백질 도메인을 얻기 위한 상기 다양한 컬렉션으로부터 선택;의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 단백질 도메인들의 다양한 컬렉션은 스크리닝 및/또는 사용된 선택 시스템에 따른 여러 가지 방법들에 의해 제공될 수 있고, 및 파지 디스플레이 또는 리보좀 디스플레이 같은, 이 기술에 숙련된 당업자에게 잘 알려진 방법들의 사용을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다. 또한 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 반복 단백질 또는 디자인된 반복 단백질이다.
상기에서 설명한 바와 같이 여기에서 제시된 단백질들 또는 도메인들을 결합하는 어떤 재조합 XCL1은, 예를 들면, 이중-특이성 결합제, 생물활성 화합물, 라벨링 모이어티(예, 플루오레세인 또는 방사성 추적자 같은 형광성 라벨), 단백질 정제를 가능하게 하는 모이어티(예. His- 또는 strep-태그 같은 소형 펩타이드 태그), 상승된 치료적 효능을 위한 효과기 기능들을 제공하는 모이어티(예. 항체의존세포매개세포독성을 제공하는 항체의 Fc부분, 녹농균 엑소톡신 A (ETA)와 같은 독성 단백질 모이어티 또는, 메이탄시노이드 또는 DNA 알킬화제들과 같은 소형 분자 독성 작용제들) 또는 향상된 약물동태학을 제공하는 모이어티를 생성하기 위해 다른 타겟에 결합하는 모이어티를 포함하는 하나 또는 더 추가적인 모이어티들과 공유결합하게 되어있을 수 있다. 향상된 약물동태학은 인지된 치료상의 필요에 따라 평가될 수 있다. 종종 아마도 복용 후에 혈청 안에서 단백질이 이용가능하게 남아있는 시간을 증가시키는 것에 의해, 생물학적 이용 가능성을 향상시키거나 및/또는 복용 간격 시간을 증가하는 것이 바람직하다. 몇몇의 예시들에서, 시간에 걸쳐 단백질의 혈청 농도의 지속성을 향상시키는 것이 바람직하다.(예, 투여 직후 농도 와 다음 투여 직전 농도 사이의 단백질의 혈청 농도 차이를 감소).
상기 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체는 근육세포 또는 근육아세포 사멸을 저해하는 효과가 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 근육질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포는 XCL1 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 혹은 이종(xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러 가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 의약품 (KFDA가 고시한 생물학적 제재 등의 품목허가 심사고시(2008-78호) 제 2조)를 의미한다.
또한, 본 발명은 XCL1(chemokine (C motif) ligand 1) 단백질 또는 이의 유도체를 포함하는 세포사멸 저해제(apoptosis inhibitor)를 제공한다.
본 발명의 용어 "세포사멸 저해제(apoptosis inhibitor)"에서 세포사멸(apoptosis)란 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로 세포의 괴사나 병적인 죽음과 구별되는 개념이다. 또한, 저해제(inhibitor)란 화학 반응이나 생리작용을 억제하는 작용을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명의 XCL1 단백질은 XCL1 단백질 뿐만 아니라 이의 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 "변이체"란 XCL1 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). XCL1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명에 따른 XCL1 단백질 또는 이의 유도체를 이용하면 세포사멸을 저해할 수 있는 특징이 있으므로, 세포사멸의 연구 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) XCL1을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현을 증가시키는 경우, 상기 시험물질은 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) XCL1에 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성을 증가시키면 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 XCL1을 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 본 발명의 XCL1의 발현량 또는 활성에 영향을 미치는지 또는 근육에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.
본 발명에서 시험물질은 다양한 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 시험물질은 화학물질, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(영국), Comgenex(미국), Brandon Associates(미국), Microsource(미국) 및 Sigma-Aldrich(미국)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(미국) 및 MycoSearch(미국)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
XCL1을 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시킨 다음, 시험물질이 처리된 세포에서 XCL1의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, XCL1의 발현을 증가시키는 경우, 시험물질이 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정될 수 있다.
상술한 뉴클레오타이드 서열의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 상술한 프라이머 세트는 이용되는 XCL1-인코딩 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열이다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 뉴클레오타이드 서열의 발현량 변화를 측정한다.
또한, XCL1 발현량의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, XCL1 발현량의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azidine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 XCL1의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 XCL1 단백질 또는 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체가 도입된 제브라피쉬(zebrafish)를 제공한다.
상기 제브라피쉬에는 XCL1 단백질 또는 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체가 도입될 수 있다. 상기 도입은 공지된 방법에 따라 진행할 수 있는데, 예를 들면 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법 (particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated genetransfer), 바이러스 감염법(viralinfection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존(trnasposon) 등을 포함하며, 바람직하게는 미세주입법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 근육질환 예방 또는 치료를 위한, XCL1 병용투여용 후보물질의 스크리닝 방법:을 제공한다. (a) 제14항의 제브라피쉬에 XCL1 병용투여용 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 제브라피쉬 근육세포의 발생정도를 관찰하는 단계.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 근육아세포 사멸 억제 효과 확인
1.1 영양분 고갈을 통한 근육아세포 사멸의 유도
근육아세포 사멸을 유도하기 위해서, C2C12 마우스 근육아세포(skeletal muscle myoblast)를 무혈청 배지에서 12, 24시간 동안 배양하여 세포사멸을 유도하였다.
1.2 인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 근육아세포 사멸 억제 효과 확인
인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 근육아세포 사멸 억제 효과를 확인하기 위해서, 상기 1.1에서 얻은 사멸된 근육아세포와 출산 후 버려지는 탯줄(umbilical cord)에서 분리한 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(Wharton's Jelly-mesenchymal stem cell; WJ-MSC)를 공동배양챔버를 이용하여 공동배양하였고 그 모식도를 도 1에, 배양 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 중 인간 탯줄 중간엽 줄기세포를 공동배양하지 않은 군을 사용하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 무혈청 배지에서 12, 24시간 배양한 결과 근육아세포의 사멸이 확인되었으며, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포와 공동배양시 세포사멸이 감소되었음을 확인하였다.
또한, 인간 탯줄 줄기세포의 세포사멸 억제 효과를 수치화하기 위하여 상기 시료에서 당분야에 공지된 웨스턴 블롯팅 방법으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 검출하여 그 결과와 이를 수치화한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포를 처리하는 경우 세포사멸에 의한 85kDa 절편의 검출이 확연히 감소함을 확인하였다.
따라서, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포가 영양분 고갈에 의한 근육아세포의 사멸을 억제함을 알 수 있다. 또한 이러한 근육아세포사멸 억제 효과가 공동배양에 의해 나타났고, 공동배양챔버의 구멍은 세포가 이동할 수 없는 크기이므로 인간 탯줄 중간엽 줄기세포가 분비한 수용성 인자가 근육아세포사멸을 저해함을 유추할 수 있다.
실시예 2: 수용성 인자 XCL1 재조합 단백질의 근육아세포 사멸 억제 효과 확인
2.1 XCL1 단백질의 농도 의존적 근육아세포 사멸 억제 효과 확인
각 실험군의 공동배양챔버에서 배지를 수득한 뒤, 배지에서 antibody array를 수행하였다. antibody array를 수행한 결과, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 수용성 인자로 XCL1을 동정하고 이를 유력한 후보로 선정하였다.
XCL1의 근육아세포 사멸 억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 1.1과 같은 방법으로 근육아세포의 사멸을 유도하였다. 사멸된 근육아세포에 XCL1 재조합 단백질(R&D Systems, Catalog Number: 695-LT/CF)을 0, 10, 50ng/mL로 각각 12시간 동안 처리한 후 세포모양을 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 도중 XCL1을 처리하지 않은 군을 사용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, XCL1 재조합 단백질이 농도 의존적으로 근육아세포의 사멸을 억제함을 확인하였다.
XCL1 재조합 단백질의 세포사멸 억제 효과를 추가적으로 확인하기 위하여 상기 시료에서 당분야에서 통상적으로 사용하는 웨스턴 블롯팅 방법으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 검출한 결과와 이를 수치화한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 웨스턴 블롯팅에 나타낸 바와 같이, XCL1의 처리에 의해 세포사멸에 의한 85kDa 절편이 확연히 감소함을 확인하였다. 또한 이러한 세포사멸 억제 효과는 XCL1의 농도에 의존적으로 나타남을 확인하였다.
2.2 XCL1 단백질의 시간 의존적 근육아세포 사멸 억제 효과 확인
XCL1 재조합 단백질의 처리 시간에 따른 세포사멸 억제 효과를 확인하기 위하여, XCL1 재조합 단백질을 50ng/mL로 3, 6, 12시간 동안 처리하였다. 상기 시료에서 당분야에서 사용하는 통상의 웨스턴 블롯팅 방법으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 검출한 결과와 이를 수치화한 그래프를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 XCL1 재조합 단백질은 시간 의존적으로 세포사멸 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포 또는 XCL1은 근육아세포의 사멸을 농도와 시간 의존적으로 효과적으로 억제함으로써 근육세포 사멸로 인해 발생하는 근육질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
2.3 PAN 저해제(PAN inhibitor)와 XCL1 단백질의 세포사멸 억제 효과 비교
영양분의 고갈에 의한 세포사멸, 즉 caspase-3에 의해 매개되는 세포사멸의 저해제로 알려진 PAN 저해제와 XCL1의 근육아세포 사멸 억제 효과를 비교하기 위해 영양분의 고갈로 인해 상기 1.1과 같이 근육아세포의 사멸을 유도하였고, 상기 세포에서 PAN 저해제를 5, 10, 20, 50 μM로, XCL1 단백질을 0.5, 1, 2, 5 nM로 각각 처리하였다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 도중 PAN 저해제 또는 XCL1 단백질을 처리하지 않은 군을 사용하였다. PARP 절단을 웨스턴 블롯팅 방법으로 확인한 결과와 이를 수치화 한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 영양분의 고갈에 의한 세포사멸의 저해제로 잘 알려진 PAN 저해제를 처리한 경우에 비해, 본 발명의 XCL1 단백질을 처리한 경우 근육아세포 사멸이 유의적으로 덜 진행되었으므로, PAN 저해제보다 XCL1 단백질의 세포 보호 효과가 더 뛰어남을 확인하였다. 또한, PAN 저해제의 50μM 처리 효과가 XCL1 단백질의 1nM 처리 효과와 유사하게 관찰됨을 확인하였다.
실시예 3: XCL1 단백질의 세포사멸 억제 효과의 특성 확인
XCL1은 근육아세포인 C2C12의 세포사멸을 억제시키는 효과를 나타내며 이에 따라 다른 세포에도 이러한 효과가 적용되는지 확인하기 위하여, 마우스 해마신경세포인 HT22와 랫드 슈반세포, S16을 이용하였다. 알츠하이머 질병 모델에서 세포사멸유도 인자로 알려진 아밀로이드 베타 (Amyloid-ß)와 단백질분해효소 억제제인 MG132를 마우스 해마신경세포 HT22에 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 세포사멸을 유도 후, XCL1 단백질을 처리한 결과를 도 8에 나타내었다.
또한, 상기 시료에서 당분야의 통상의 웨스턴 블롯팅 방법으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단을 검출한 결과와 이를 수치화한 결과를 도 9에 나타내었다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 중 아밀로이드 베타와 MG132, 그리고 XCL1 단백질을 처리하지 않은 군을 사용하였다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 형태와 웨스턴 블롯팅 결과를 통하여 마우스 해마신경세포에서는 세포사멸의 뚜렷한 억제 효과가 나타나지 않았음을 확인하였다.
또한, 랫드 슈반세포 S16 세포에서도 상기와 같이 세포 특이성을 확인하기 위하여 소포체 스트레스(Endoplasmic Reticulum stress) 유도체인 Tapsigargin을 12시간 동안 처리하였을 때, XCL1에 의한 세포사멸 억제 효과가 나타나는지 확인하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 중 Tapsigargin과 XCL1 단백질을 처리하지 않은 군을 사용하였다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 랫드 슈반세포에서도 비슷한 결과로, XCL1에 의한 세포사멸 억제 효과를 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, XCL1 단백질은 근육아세포에 대해 특이적으로 세포사멸 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 콜레스테롤 합성 억제제인 Lovastatin을 이용하여 XCL1 단백질이 다른 세포사멸 유도제에 의해 야기되는 근육아세포의 세포사멸을 억제하는 효과가 있는지 확인하였다. 당분야에서 Lovastatin은 근육아세포의 위축을 유도한다고 알려져 있으며, C2C12 마우스 근육아세포와 7일 동안 분화 유도시킨 C2C12 마우스 근관세포 (myotube)에 Lovastatin을 0.1, 0.5, 1, 2ng/mL로 농도 의존적 처리하였다. 상기 시료에 XCL1 단백질(50ng/mL)을 처리 또는 처리하지 않고 배양하여 PARP 절단에 의해 XCL1 단백질의 사멸 억제 효과를 확인하고, 이를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, Lovastatin에 의해 유도된 PARP 절단은 XCL1 단백질에 의해 완벽히 저해됨을 확인하였다. 따라서, XCL1 단백질은 영양 고갈로 인한 근육아세포의 사멸 뿐만 아니라 다른 원인에 의한 근육아세포의 사멸에 대한 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 7일 동안 분화 유도시킨 마우스 근육아세포 C2C12에 1, 2, 5, 10μM로 농도 의존적 Lovastatin을 처리하여 근육근관(Myotube)의 손실을 확인하였으며, 이에 XCL1의 처리 후, 상기 시료에서 당분야의 통상의 웨스턴 블롯팅 방법으로 Myosin Heavy Chain인 MHC를 확인한 결과 및 이를 수치화한 결과를 도 14에 나타내었다. 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양 중 Lovastatin과 XCL1을 처리하지 않은 군을 사용하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, XCL1의 세포사멸 억제 효과는 근육아세포 및 근육근관세포에 특이적인 효과를 나타냄을 유추할 수 있다.
실시예 4: siRNA를 통한 XCL1 합성의 저해가 인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 세포사멸 억제효과를 상실시킴을 확인
siRNA를 이용해 XCL1 단백질의 합성을 저해하면 인간 탯줄 줄기세포의 세포사멸 억제효과가 상실되는지 확인하기 위하여, 영양분 고갈에 의해 유도된 사멸 근육아세포에 XCL1 단백질의 합성을 저해할 수 있는 siRNA인 XCL1-siRNA1 및 XCL1-siRNA2를 전처리한 인간 탯줄 중간엽 줄기세포를 공동배양하였으며, 근육아세포의 사멸 여부를 상기 실시예와 같은 방법에 의하여 확인하였다. 이때 양성 대조군으로는 무혈청 배지에서 배양한 C2C12세포와 인간 탯줄 줄기세포를 공동배양한 군을, 음성 대조군으로는 XCL1 단백질의 합성을 저해하지 않는 control siRNA(CTRL-siRNA)를 인간 탯줄 중간엽 줄기세포에 처리하고 무혈청 배지에서 키운 C2C12 세포와 공동배양한 군을 사용하였으며, 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, XCL1-siRNA1 및 XCL1-siRNA2를 처리한 경우, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포의 근육아세포 사멸 억제 효과가 상실된 것을 확인하였다. 따라서, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포가 세포사멸 억제효과를 갖도록 하는 유효성분은 XCL1 단백질임을 확실히 하였다.
실시예 5: 인간 XCL1 발현 제브라피쉬 모델 제조 및 인간 XCL1 단백질이 도입된 후 3일 지난 제브라피쉬의 발생 정도 관찰
5.1 제브라피쉬의 사육 및 발생배의 준비
야생형(wild type) 제브라피쉬들을 조건[온도: 28-28.5℃, 명암: 오전 9시에서 오후 8시까지 점등 그 외 시간 소등, 먹이: 브라인 슈림프(brine shrimp)]하에서 사육하였다. 발생배는 교미를 시키기 전날 제브라피쉬 암컷과 수컷을 각각 칸막이로 나눠둔 뒤 다음 날 아침에 밝게 해주면서 암컷과 수컷 사이의 칸막이를 없애 교미를 시켰다. 교미를 통해 얻은 제브라피쉬의 알을 아가 젤(agar gel)로 만든 틀에 옮겼다.
5.2 인간 XCL1 발현 제브라피쉬 모델 제조 및 인간 XCL1 단백질이 도입된 후 3일 지난 제브라피쉬의 발생 정도 관찰
인간 XCL1 발현 제브라피쉬 모델을 제조하기 위해서 재조합 XCL1 단백질을 제브라피쉬가 수정된지 12시간 후에 미세 주입하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이 제브라피쉬를 아가로스 젤로 만든 틀에 옮겨 단백질을 미세주입기 (micromanipulator, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, USA)에 장착된 마이크로피펫으로 미세주입 하였다.
상기와 같이 제조한 제브라피쉬 모델의 표현형 (phenotype)을 태어난지 3일 후에 관찰하였고 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, XCL1 단백질을 미세주입하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 인간 XCL1 단백질이 도입된 제브라피쉬의 경우 전반적으로 별다른 이상 없이 정상적으로 발생함을 확인하였다.
실시예 6: 인간 XCL1이 도입된 제브라피쉬의 원위근육계 조사
인간 XCL1 단백질의 도입이 제브라피쉬에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해서 근육질환 증상을 모사하는 제브라피쉬에 인간 XCL1 단백질을 주입 한 후, 제브라피쉬를 관찰하고 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이 제브라피쉬의 전체적인 움직임 정도 및 발생정도가 완화됨을 관찰하였다.
또한, 제브라피쉬의 배아를 이용해 근육세포의 발생정도를 확인하기 위해 이를 확인할 수 있는 라미닌(Laminin)과 MHC을 마커로 결정하고 형광 염색을 실시하였다. 이 후 근육세포의 활성화 정도를 관찰하기 위해 도 20과 같이 몸통의 특정 지역을 선정하였고, 공초점현미경(confocal microscope)을 통해 근육세포를 관찰하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다. 추가적으로, 제브라피쉬의 배아에 XCL1 단백질을 0, 30, 50μg/mL로 처리한 후 정상 배아와 비정상 배아를 관찰하여 수치화한 결과를 도 22에 나타내었다.
도 21 및 도 22에 나타낸 바와 같이, XCL1 단백질을 주사하지 않은 근육질환 모델의 제브라피쉬는 두 마커 모두 비정상적인 발현을 보인 반면, 인간 XCL1 단백질이 도입된 제브라피쉬의 경우 두 마커 모두 정상적으로 발현됨을 관찰하였다. 또한 제브라피쉬의 근육 질환이 처리한 XCL1 단백질에 대해 농도 의존적으로 정상화됨을 확인하였다.
따라서, XCL1의 근육질환 예방 또는 치료 효능을 제브라피쉬 모델에서 확인함으로써 XCL1이 in vivo에서 작동 가능함을 확인하였다. 또한 제브라피쉬를 근육 질환 모델로 유용하게 활용할 수 있으며 XCL1 단백질과 같은 근육 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝에 유용할 것으로 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
제제예 - 의약품의 제조
산제의 제조
중간엽 줄기세포 5x108 세포 또는 XCL1 100mg
유당 100㎎
탈 10㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
주사제의 제조
중간엽 줄기세포 5x108 세포 또는 XCL1 100mg
주사용 멸균 증류수 적량
조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
액제의 제조
중간엽 줄기세포 5x108 세포 또는 XCL1 100mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of muscular disease containing mesenchymal stem cells or XCL1 <130> 1_26P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys 20 25 30 Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr 35 40 45 Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg 50 55 60 Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val 65 70 75 80 Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln 85 90 95 Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu 100 105 110 Thr Gly <210> 2 <211> 1367 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 taagaaaaat aaaagcatca gtattgcaaa gactttccat gatcctacac ccacctcgaa 60 agccccctct caccacagga agtgcactga ccactggagg cataaaagag gtcctcaaag 120 agcccgatcc tcactctcct tgcacagctc agcaggacct cagccatgag acttctcatc 180 ctggccctcc ttggcatctg ctctctcact gcatacattg tggaaggtgt agggagtgaa 240 gtctcagata agaggacctg tgtgagcctc actacccagc gactgccggt tagcagaatc 300 aagacctaca ccatcacgga aggctccttg agagcagtaa tttttattac caaacgtggc 360 ctaaaagtct gtgctgatcc acaagccaca tgggtgagag acgtggtcag gagcatggac 420 aggaaatcca acaccagaaa taacatgatc cagaccaagc caacaggaac ccagcaatcg 480 accaatacag ctgtgactct gactggctag tagtctctgg caccctgtcc gtctccagcc 540 agccagctca tttcacttta cacgctcatg gactgagttt atactcacct tttatgaaag 600 cactgcatga ataaaattat tcctttgtat ttttactttt aaatgtcttc tgtattcact 660 tatatgttct aattaataaa ttatttatta ttaagaatag ttccctagtc tattcattat 720 atttagggaa aggtagtgta tcattgttgt ttgatttctg accttgtacc tctctttgat 780 ggtaaccata atggaagaga ttctggctag tgtctatcag aggtgaaagc tatatcaatc 840 tctcttagag tccagcttgt aatggttctt tacacatcag tcacaagtta cagctgtgac 900 aatggcaaca atttgagatg tatttcaact tgtctctata atagaattct gtttatagaa 960 taagggagaa aataatccag tcttcactgg gttcccattc tgagggtcca ctactcaaaa 1020 atttgcttca ctcaattttt ttcacctctt tgtgttttat tttggtgtcc tattaaagga 1080 ataaaatgac acaacttgtc ccttttttgt cccattagca aaaattagaa ttttggtata 1140 aagaaacttt attcaagtaa aaatcaatac cctttgaatt ggacaataat ctcactacct 1200 tattaggatt tctgtatttg ccattacgct agttatcatg catgttatgc tttactgcga 1260 ataagctttt aatgctccaa atgctgaccc atgcaatatt tcctcatgtg atcacaattt 1320 gcagtaaact tttaattaaa tgctcatctg gtaactcaac accccag 1367

Claims (15)

  1. 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 XCL1(chemokine(C motif) ligand 1)을 포함하는, 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄 유래인 것을 특징으로 하는, 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 근육질환은 근육세포 또는 근육아세포 사멸에 의해 발생하는 것인, 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 근육질환은 염좌(sprain), 좌상(strain), 경련, 건염, 근육암, 근염(myositis), 횡문근융해증, 근위축증(muscular atrophy), 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화증, 근무력증(myasthenia), 디스트로핀병증(dystrophinopathy), 근육병증(myopathy) 및 근감소증(sacopenia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. XCL1(chemokine(C motif) ligand 1) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 중간엽 줄기세포를 포함하는 근육질환 치료용 줄기세포 치료제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 XCL1(chemokine(C motif) ligand 1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 근육질환 치료용 줄기세포 치료제.
  9. XCL1(chemokine(C motif) ligand 1) 단백질 또는 이의 유도체를 포함하는 세포사멸 저해제(apoptosis inhibitor).
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 근육세포 또는 근육아세포인, 세포사멸 저해제(apoptosis inhibitor).
  11. 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) XCL1을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 발현을 증가시키는 경우, 상기 시험물질은 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
  12. 다음 단계를 포함하는 근육질환 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) XCL1에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 XCL1의 활성을 증가시키면 근육질환의 예방 또는 치료제로 판정된다.
  13. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 시험물질은 화학물질, 단백질, 펩타이드, 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. XCL1 단백질 또는 XCL1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체가 도입된 제브라피쉬(zebrafish).
  15. 다음의 단계를 포함하는 근육질환 예방 또는 치료를 위한, XCL1 병용투여용 후보물질의 스크리닝 방법:
    (a) 제14항의 제브라피쉬에 XCL1 병용투여용 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 제브라피쉬 근육세포의 발생정도를 관찰하는 단계.









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