KR20210094534A - 병용 암 면역 요법 - Google Patents

병용 암 면역 요법 Download PDF

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러셀 모리슨 고들리
잭 츄-치아오 린
브라이언 스코트 개리슨
필립 잔민 리
알바 곤잘레스-준카
돈-홍 왕
다니엘 프리만슨
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Abstract

본원은 암에서 다중 면역억압 메커니즘을 동적으로 제어하고 표적화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 양태는 이들 각각이 종양의 상이한 면역억압 메커니즘을 조정하는, 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 세포뿐만 아니라 세포를 사용하여 암, 예컨대, 난소암, 유방암 또는 결장암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

병용 암 면역 요법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원는 2018년 10월 17일에 제출된 미국 가출원 번호 62/747,109; 2018년 10월 17일에 출원된 62/747,114; 및 2019년 5월 3일에 출원된 62/843,180의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전체가 참고로 본원에 원용된다. 20XX년 XX월에 생성된 상기 ASCII 사본은 XXXXXUS_sequencelisting.txt으로 명명되며 X,XXX,XXX 바이트의 크기이다.
미국에서는 매년 22,000 건 초과의 새로운 난소 암 사례와 14,000 건 초과의 사망이 발생하여 (Siegel RL, 등 (2016) CA Cancer J Clin 66(1):7-30), 6 억 달러 초과의 추정된 연간 건강관리 부담금을 안고 있다 (Dizon D MJ (2010) Gynecol Oncol 116(3)). 종래의 접근법, 예컨대, 화학요법 (예컨대, 카보플라틴/시스플라틴 및/또는 파클리탁셀)은 종종 난소암을 치유할 수 없다. 환자의 대략 70 %가 제1-라인 화학요법에서 관해를 달성하지 못하고, 관해가 있는 환자의 40-50 %는 3년 이내에 재발할 것이다.
다른 암, 예컨대, 유방암 및 결장암의 치료는 각자 85 % 및 65 %의 5-년 생존율과 연관된다. 요법는 종종 침습성 수술 및 화학요법의 조합을 포함한다.
발명의 요약
일부 실시양태에서, 본원은 암, 예컨대, 난소암, 유방암, 결장암, 폐암 및 췌장암의 표적화된 치료를 위한 병용 세포-기반 면역요법을 제공한다. 이 병용 면역요법은 종양 내 및/또는 근처 ("종양 미세환경 (TME)")에서 다인자 조정을 가능하게 하는 조작된 세포 회로에 의존한다. 병용 면역요법의 고무된 진전에도 불구하고, 암에 대한 이의 효능은 다음의 과제에 부분적으로 기인하여 제한되었다. 유의한 부작용을 유발하지 않으면서 최대의 효능을 달성하기 위해 다중 요법을 동시에 전달하는 것은 어렵다. 임상 시험에서 다중의 전신적으로-투여 및/또는 국소적으로-주사된 요법의 적절한 투약 및 시기를 결정하는 것은 또한 어렵다.
그러나, 본원에 제공된 병용 면역요법은 종양-특이적이고 효과적이나 전신 독성을 제한한다. 이 병용 면역요법은 단일 전달 비히클로부터 다중 면역조정 이펙터 분자를 종양 미세환경에 전달한다. 프로모터, 링커, 신호 펩티드 및 다중 면역조정 이펙터 분자의 순서의 최적화를 비제한적으로 포함하는, 전달 비히클의 설계는 암 요법에서 전체 기능을 개선하도록 최적화된다.
유익하게는, 본 개시내용의 세포 회로는 중간엽 줄기 세포 (MSC)에서 조작되며, 이는 종양 (전이를 포함함)을 선택적으로 호밍시킬 수 있고, 전-염증성/면역자극성 분비물 및 특정 조건 하에서 항-염증성 분비물을 생산할 수 있고, 저면역원성이다. 이들 특성은 무엇보다도, 예를 들어, 유의한 안전성 문제, 부작용 또는 거부없이 동종이계 세포 요법에 대한 이들의 사용을 가능하게 한다.
종양은 세포 외 기질, 암-연관된 간질 세포 (MSC 및 섬유모세포), 종양 맥관구조 및 면역계를 포함하는 종양 세포와 주변 간질 사이의 복잡한 상호작용이라는 것이 점점 더 인식되고 있다. TME는 환자의 선천성 및 적응성 면역계 둘 모두를 표적화하는 다중 메커니즘을 통해 항-종양 면역 반응을 억압한다. 예를 들어, 종양은 특이적 케모카인, 예컨대, CCL22를 정교화함으로써 기존 T 세포의 항-종양 활성을 억압하는 조절 T 세포를 동원 및 유도할 수 있다. 종양은 또한 T 세포 및 NK 세포의 활성을 억제하는 분자, 예컨대, 면역 체크포인트, 예컨대, PD-L1을 발현할 수 있다. 따라서, 단일 경로를 표적화하는 것은 고형 종양에 대한 강력한 효능을 달성하기에 충분하지 않을 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 이펙터 분자의 비-제한적인 예는 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드, 효소 및 종양용해성 바이러스를 포함한다. 예를 들어, MSC는 다음의 이펙터 분자 중 적어도 하나, 2 개 또는 3 개 이상을 발현 (및 전형적으로 분비)하도록 조작될 수 있다: IL-12, IL-16, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, IL-21, OX40-리간드, CD40L, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TGFβ 항체, 항-TNFR2, MIP1α (CCL3), MIP1β (CCL5), CCL21, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 항-종양 펩티드 (예컨대, 항-종양 활성을 갖는 항-미생물 펩티드, 예컨대, Gaspar, D. 등 Front Microbiol. 2013; 4: 294; Chu, H. 등 PLoS One. 2015; 10(5): e0126390, 및 website:aps.unmc.edu/AP/main.php 참고).
본원은 다음을 포함하는 조작된 세포를 제공하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00001
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
일부 양태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이다. 일부 양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 NKT 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 선천성 림프구 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)이다. 일부 양태에서, 세포는 비만 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 호산구이다. 일부 양태에서, 세포는 호염기구이다. 일부 양태에서, 세포는 단핵구이다. 일부 양태에서, 세포는 대식세포이다. 일부 양태에서, 세포는 호중구이다. 일부 양태에서, 세포는 골수성 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL)이다. 일부 양태에서, 세포는 바이러스-특이적 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 감마-델타 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 T 조절 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 B 세포이다.
일부 양태에서, 프로모터는 외인성 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 내인성 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00002
Figure pct00003
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 번역과 작동가능하게 연관된다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다. 일부 양태에서, 2A 리보솜 스키핑 태그는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: P2A, T2A, E2A 및 F2A. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단가능한 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 양태에서, 절단가능한 폴리펩티드는 퓨린(Furin) 인식 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 Gly-포함. Ser-포함, 또는 Gly-Ser 포함 폴리펩티드 서열, 예컨대, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열을 추가로 코딩한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 프로모터를 코딩하며, 여기서 프로모터는 화학식
Figure pct00004
을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제2 프로모터는 화학식
Figure pct00005
를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 폴리뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 양태에서, 프로모터 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 인간 세포는 대상체, 예컨대, 세포를 받을 대상체로부터의 단리된 세포이다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직. 일부 양태에서, 조작된 세포는 배양된 세포이다.
일부 양태에서, 조작된 MSC는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합. 일부 양태에서, 조작된 MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 NK 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 NKT 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 포함하는 세포 마커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12RB1, IL12RB2, CCL7 및 이들의 조합.
일부 양태에서, 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 구성적 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb 및 hUBIb. 일부 양태에서, 프로모터는 SFFV 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체.
일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 비-천연 신호 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시온겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12 및 IL21.
일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 및 제2 신호 펩티드는 동일하다. 일부 양태에서, 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 분비 폴리펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이다.
일부 양태에서, 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 분비 폴리펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 치료적 클래스는 상이하다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 변형된 이펙터 분자이다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 세포막 테더링 도메인을 포함하도록 변형된다. 일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포 내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 변형된 이펙터 분자는 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 변형된 이펙터 분자는 이펙터 분자와 세포막 테더링 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 발현될 때 변형된 이펙터 분자는 조작된 세포의 세포막에 테더링된다.
일부 양태에서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL7, IL21, IL18, IL15, 타입 I 인터페론 및 인터페론-감마. 일부 양태에서, IL12 사이토카인은 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-11 융합, CCL19, CXCL9 및 XCL1. 일부 양태에서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: Flt3L 및 GM-CSF. 일부 양태에서, 공동-활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 4-1BBL 및 CD40L. 일부 양태에서, 종양 미세환경 개질제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2. 일부 양태에서, TGF베타 억제제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합. 일부 양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 양태에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자는 인간-유래된 이펙터 분자이다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 인터레킨 12 (IL12), 예를 들어, 일반적으로 IL-12p70으로서 당업계에 지칭되는 이량체로서 p35 및 p40을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, IL12p70 융합 단백질은 인간 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12는 서열번호 137에 표시된 p35 서브유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12는 서열번호 137에 표시된 p40 서브유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CCL21a를 포함한다. 일부 양태에서, CCL21a는 인간 CCL21a이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL7을 포함한다. 일부 양태에서, IL7은 인간 IL7이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL21을 포함한다. 일부 양태에서, IL21은 인간 IL21이다.
일부 양태에서, 발현 카세트는 제3 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E3를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다. 예를 들어, 항-PD1은 항-PD1 항체일 수 있다. 일부 양태에서, 발현 카세트는 제4 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E4를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제4 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 XCL1을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 인터페론-베타를 포함하고 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 프로모터 및 발현 카세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 조작된 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 발현 카세트는 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식을 포함하는 추가적인 외인성 폴리뉴클레오티드 서열인 E2를 추가로 포함하며:
Figure pct00006
여기서 S는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E는 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 1 내지 20이며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 각각의 X에 대해 상응하는 신호 펩티드는 이펙터 분자와 작동가능하게 연관된다.
본원은 또한 작제물을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00007
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이고; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원은 또한 작제물을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00008
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원은 또한 작제물을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00009
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이며, 여기서 MSC는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
본원은 또한 작제물을 포함하는 조작된 MSC를 제공하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00010
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 MSC는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
본원은 또한 작제물을 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00011
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이다. 일부 양태에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 NKT 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 선천성 림프구 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)이다. 일부 양태에서, 세포는 비만 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 호산구이다. 일부 양태에서, 세포는 호염기구이다. 일부 양태에서, 세포는 단핵구이다. 일부 양태에서, 세포는 대식세포이다. 일부 양태에서, 세포는 호중구이다. 일부 양태에서, 세포는 골수성 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL)이다. 일부 양태에서, 세포는 바이러스-특이적 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 감마-델타 T 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 T 조절 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 B 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 인간 세포이다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 인간 세포는 대상체, 예컨대, 세포를 받을 대상체로부터의 단리된 세포이다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직. 일부 양태에서, 조작된 세포는 배양된 세포이다.
일부 양태에서, 조작된 MSC는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합. 일부 양태에서, 조작된 MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 T 조절 세포이다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 NK 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 NKT 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 단핵구 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 대식세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 TIL을 포함한다.
일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 조작된 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포는 각각의 이펙터 분자를 분비한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 제2 이펙터 분자의 분비에 비해 10 배 더 높은 비율로 분비된다.
일부 양태에서, 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, ADGRE2, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카드헤린 3, 카드헤린 6, CCR1, CCR4, CD117, CD123, CD131, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD244, CD30, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CD93, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, CLEC12A, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, EMB, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, FLT3, GAPT, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-1RAP, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, LAT2, 루이스 Y, LeY, LILRA2, LILRB2, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MLC1, MS4A3, MUC1, MUC16, MUC1C, MYADM, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, Ovarin, P-카드헤린, pan-Erb2, PIEZO1, PRAM1, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S Aures, SCT, SLAMF7, SLC22A16, SLC17A9, SLITRK6, SPNS3, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, VSTM1 및 WT1.
일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일부 양태에서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 양태에서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 양태에서, CAR은 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-쇄 세포 내 신호전달 도메인, CD97 세포 내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포 내 신호전달 도메인, CD2 세포 내 신호전달 도메인, ICOS 세포 내 신호전달 도메인, CD27 세포 내 신호전달 도메인, CD154 세포 내 신호전달 도메인, CD8 세포 내 신호전달 도메인, OX40 세포 내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포 내 신호전달 도메인, CD28 세포 내 신호전달 도메인, ZAP40 세포 내 신호전달 도메인, CD30 세포 내 신호전달 도메인, GITR 세포 내 신호전달 도메인, HVEM 세포 내 신호전달 도메인, DAP10 세포 내 신호전달 도메인, DAP12 세포 내 신호전달 도메인 및 MyD88 세포 내 신호전달 도메인. 일부 양태에서, CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인. 일부 양태에서, CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
본원은 또한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것을 포함하는 세포 집단을 제공한다. 일부 양태에서, 세포 집단은 조작된 세포가 풍부하다.
일부 양태에서, 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 조작된 세포가 풍부한 세포 집단은 IL12 수용체 β1 또는 이의 증가된 수준, IL12 수용체 β2 또는 이의 증가된 수준, 또는 IL12 수용체 β1 및 IL12 수용체 β2 또는 이의 증가된 수준을 발현한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL21이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CCL21이다. 일부 양태에서, 조작된 세포가 풍부한 세포 집단은 CCL21 수용체 또는 이의 증가된 수준을 발현한다. 일부 양태에서, CCL21 수용체는 CCR7이다.
본원은 또한 조작된 세포 또는 본원에 기재된 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 조작된 세포 또는 본원에 기재된 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 자극 (예컨대, 유도)하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 조작된 세포 중 임의의 것 조작된 세포 또는 본원에 기재된 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-종양 면역을 제공하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 조작된 세포 또는 본원에 기재된 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 조작된 세포 또는 본원에 기재된 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 대상체로부터 유래된다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 대상체에 관하여 동종이계이다.
일부 양태에서, 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양. 일부 양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 양태에서, 종양은 복막 공간에 위치한 종양이다.
본원은 또한 다음을 포함하는 조작된 세포를 제공하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00012
여기서 S는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E는 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, X = 2 내지 20이며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서
Figure pct00013
유닛의 제1 반복의 경우 L이 부재하며, 각각의 X에 대해 상응하는 신호 펩티드는 이펙터 분자와 작동가능하게 연관되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00014
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00015
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되며, 여기서 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진하며, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
일부 양태에서, 하나 이상의 조작된 세포는 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 발현한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL21이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CCL21이다.
본원은 또는 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00016
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되며, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00017
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되며, 여기서 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진하며, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원은 또한 하나 이상의 세포가 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉하는 조건 하에서 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수용체 또는 수용체 리간드가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 접촉된 세포는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 하나 이상의 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 발현하고, 여기서 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자의 부재 하에 배양된 세포에 비해 접촉된 세포의 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 증가시킨다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 하나 이상의 세포에서 이종적으로 발현되고, 하나 이상의 세포는 자가분비 방식으로 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 하나 이상의 추가적인 세포에서 발현되고, 하나 이상의 세포는 주변분비 방식으로 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 추가적인 세포는 영양 세포이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 세포는 배지에서 배양된다.
일부 양태에서, 하나 이상의 세포는 배지에 대한 가용성 제1 이펙터 분자, 가용성 제2 이펙터 분자, 또는 가용성 제1 및 제2 이펙터 분자의 첨가에 의해 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다. 일부 양태에서, 가용성 제1 이펙터 분자 및/또는 가용성 제2 이펙터 분자는 재조합 이펙터 분자이다.
일부 양태에서, 하나 이상의 세포는 부착 조건 하에서 배양된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 세포는 표면에 부착된다. 일부 양태에서, 부착된 세포는 하나 이상의 세포를 표면에 고정된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 노출시킴으로써 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 세포 집단은 IL12 수용체 β1 (IL12Rβ1)이 풍부하거나, IL12 수용체 β2 (IL12Rβ2)가 풍부하거나, IL12Rβ1 및 IL12Rβ2가 풍부하다. 일부 양태에서, MSC 집단은 세포 마커 CD105+, CD73+, CD90+, IL12Rβ1+ 및 IL12Rβ2+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
일부 양태에서, 세포 집단은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다: 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포 및 T 조절 세포, 및 B 세포. 일부 양태에서, 세포 집단은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 대식세포 또는 골수 유래된 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL21이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CCL21이다. 일부 양태에서, 세포 집단은 CCR7이 풍부하다.
일부 양태에서, MSC 집단은 세포 마커 CD105+, CD73+, CD90+, IL12Rβ1+, IL12Rβ2+ 및 CCR7+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
본원은 또한 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 하나 이상의 수용체 또는 수용체 리간드가 풍부한 세포 집단을 제공한다.
본원은 또한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 하나 이상의 단백질을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식으로 기재된 발현 카세트를 포함하며,
Figure pct00018
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
본원은 또한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 하나 이상의 단백질을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식으로 기재된 발현 카세트를 포함하며,
Figure pct00019
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
본원은 또한 프로모터 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며,
Figure pct00020
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
본원은 또한 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며,
Figure pct00021
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
일부 양태에서, 프로모터는 외인성 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 내인성 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00022
Figure pct00023
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다.
일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 번역과 작동가능하게 연관된다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다. 일부 양태에서, 2A 리보솜 스키핑 태그는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: P2A, T2A, E2A 및 F2A. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩한다.
일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단가능한 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 양태에서, 절단가능한 폴리펩티드는 퓨린 인식 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 Gly-포함. Ser-포함, 또는 Gly-Ser 포함 폴리펩티드 서열, 예컨대, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열을 추가로 코딩한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 프로모터를 코딩하며, 여기서 프로모터는 화학식
Figure pct00024
을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제2 프로모터는 화학식
Figure pct00025
를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되며, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 폴리뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 양태에서, 프로모터 및 제2 프로모터는 상이하다.
일부 양태에서, 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 구성적 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb 및 hUBIb. 일부 양태에서, 프로모터는 SFFV 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체.
일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 비-천연 신호 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시온겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12 및 IL21. 일부 양태에서, 제1 신호 펩티드 및 제2 신호 펩티드는 동일하다. 일부 양태에서, 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 분비 폴리펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이다. 일부 양태에서, 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 분비 폴리펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 치료적 클래스는 상이하다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 변형된 이펙터 분자이다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 세포막 테더링 도메인을 포함하도록 변형된다. 일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포 내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 변형된 이펙터 분자는 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 변형된 이펙터 분자는 이펙터 분자와 세포막 테더링 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 세포에서 발현될 때, 변형된 이펙터 분자는 세포의 세포막에 테더링된다.
일부 양태에서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL7, IL21, IL18, IL15, 타입 I 인터페론 및 인터페론-감마. 일부 양태에서, IL12 사이토카인은 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 양태에서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-11 융합, CCL19, CXCL9 및 XCL1. 일부 양태에서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: Flt3L 및 GM-CSF. 일부 양태에서, 공동-활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 4-1BBL 및 CD40L. 일부 양태에서, 종양 미세환경 개질제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2. 일부 양태에서, TGF베타 억제제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합. 일부 양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 양태에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자는 인간-유래된 이펙터 분자이다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 IL12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, IL12p70 융합 단백질은 인간 IL12p70 융합 단백질이다.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CCL21a를 포함한다. 일부 양태에서, CCL21a는 인간 CCL21a이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL7을 포함한다. 일부 양태에서, IL7은 인간 IL7이다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 IL21을 포함한다. 일부 양태에서, IL21은 인간 IL21이다.
일부 양태에서, 발현 카세트는 제3 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E3를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다.
일부 양태에서, 발현 카세트는 제4 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E4를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제4 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다.
일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 제3 이펙터 분자는 XCL1을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 인터페론-베타를 포함하고 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원은 또한 SFFV 프로모터를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 제공하며,
Figure pct00026
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원은 또한 SFFV 프로모터를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 제공하며
Figure pct00027
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되며; 여기서 프로모터는 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00028
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고; 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 의해 코딩된다: DNA, cDNA, RNA, mRNA 및 네이키드(naked) 플라스미드.
본원은 또한 본원에 기재된 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본원은 또한 본원에 기재된 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 또한 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것, 본원에 기재된 발현 벡터 중 임의의 것, 또는 본원에 기재된 약학 조성물 중 임의의 것을 포함하는 단리된 세포.
일부 양태에서, 단리된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 바이러스-특이적 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수성 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC-유래된 세포, 다능성 줄기 세포, MSC, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 및 iPSC-유래된 세포.
일부 양태에서, 단리된 세포는 MSC이다.
일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈으로 통합된다. 일부 양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 인간 세포는 대상체, 예컨대, 세포를 받을 대상체로부터의 단리된 세포이다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직. 일부 양태에서, 세포는 배양된 세포이다.
일부 양태에서, MSC는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합. 일부 양태에서, MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
일부 양태에서, 세포 마커 표현형은 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 포함하는 세포 마커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12RB1, IL12RB2, CCL7 및 이들의 조합.
일부 양태에서, 세포는 각각의 이펙터 분자를 분비한다. 일부 양태에서, 제1 이펙터 분자는 제2 이펙터 분자의 분비에 비해 10 배 더 높은 비율로 분비된다.
일부 양태에서, 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일부 양태에서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 양태에서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 양태에서, CAR은 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-쇄 세포 내 신호전달 도메인, CD97 세포 내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포 내 신호전달 도메인, CD2 세포 내 신호전달 도메인, ICOS 세포 내 신호전달 도메인, CD27 세포 내 신호전달 도메인, CD154 세포 내 신호전달 도메인, CD8 세포 내 신호전달 도메인, OX40 세포 내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포 내 신호전달 도메인, CD28 세포 내 신호전달 도메인, ZAP40 세포 내 신호전달 도메인, CD30 세포 내 신호전달 도메인, GITR 세포 내 신호전달 도메인, HVEM 세포 내 신호전달 도메인, DAP10 세포 내 신호전달 도메인, DAP12 세포 내 신호전달 도메인 및 MyD88 세포 내 신호전달 도메인. 일부 양태에서, CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인. 일부 양태에서, CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
본원은 또한 본원에 기재된 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것 또는 본원에 기재된 발현 벡터 중 임의의 것을 포함하는 바이러스를 제공한다. 일부 양태에서, 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 및 아데노바이러스. 일부 양태에서, 바이러스는 렌티바이러스이다.
본원은 또한 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00029
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며; 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00030
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 자극 (예컨대, 유도)하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00031
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극 (예컨대, 유도)하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00032
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-1L 항체 또는 항-CTLA-4 항체이다. 일부 양태에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양. 일부 양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 양태에서, 종양은 복막 공간에 위치한 종양이다.
일부 양태에서, 투여는 전신 투여, 복막 내 투여 또는 종양 내 투여를 포함한다.
일부 양태에서, 종양의 부피는 대조군에 비해 25 % 이상 감소되며, 임의로 대조군은 변형되지 않은 세포이다. 일부 양태에서, 종양의 부피는 대조군에 비해 50 % 이상 감소되며, 임의로 대조군은 변형되지 않은 세포이다. 일부 양태에서, 종양의 부피는 대조군에 비해 75 % 이상 감소되며, 임의로 대조군은 변형되지 않은 세포이다.
본원은 또한 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 각각의 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00033
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00034
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극 (예컨대, 유도)하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 다음을 포함하며: a) 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00035
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
본원은 또한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극 (예컨대, 유도)하는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하고, 여기서 작제물은 다음을 포함하며: a) SFFV 프로모터; 및 b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00036
여기서 S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고; E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고; L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고; S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고; E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며; 여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 137에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 138에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL12p70 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 142에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21은 서열번호 143에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 인간 IL21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 141에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 서열번호 140에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 139에 도시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 시스템을 포함한다: 바이러스 시스템, 트랜스포존 시스템 및 뉴클레아제 게놈 편집 시스템. 일부 양태에서, 바이러스 시스템은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 및 아데노바이러스. 일부 양태에서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 징크-핑거 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR 시스템.
일부 양태에서, 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양.
일부 양태에서, 투여는 전신 투여, 복막 내 투여 또는 종양 내 투여를 포함한다.
도 1은 CT26 모델에서 IL12p70/CCL21a를 발현하는 동계 및 동종이계 MSC를 사용한 처리를 도시한다.
도 2는 CT26 모델에서 IL12p70/CCL21a를 발현하는 동계 및 동종이계 MSC를 사용하여 이전에 처리된 CT26 종양이 있는 무종양 마우스의 재시험을 도시한다.
도 3은 복막 내 주사된 뮤린 BM-유래된 MSC (BM-MSC)가 생체 내에서 4T1 유방암 세포의 종양 부위로 호밍함을 나타내는 데이터를 도시한다. 형광 표지된 BM-MSC (치료적 세포)를 4T1 유방 종양 세포를 보유한 마우스에 주사하였다. 유방 종양 세포는 루시퍼라제 리포터를 발현한다. 왼쪽의 제1 상단 2 개의 패널은 지시된 바와 같이 주사 후 1 일차 및 7 일차에 종양을 보유한 마우스의 치료적 세포 (BM-MSC)의 이미징을 도시한다. 왼쪽의 제3 상단 패널은 주사 후 7 일차에 종양을 보유한 마우스의 종양 세포의 이미징을 도시한다. 왼쪽 하단 2 개의 패널은 지시된 바와 같이 주사 후 1 일차 및 7 일차에 종양을 보유하지 않은 정상 마우스의 치료적 세포의 이미징을 도시한다. 치료적 세포의 호밍에 대한 종양의 영향을 도시하는 도식이 제일 오른쪽에 제공된다.
도 4는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 유방암의 동소성 마우스 모델에서 유의한 종양 성장 지연을 유도하였음을 나타내는 데이터를 도시한다. 왼쪽의 차트는 마우스의 4T1 유방 종양 성장에 대한 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 8). 차트의 각각의 라인은 0 일차 및 7 일차에 대조군 MSC 성장 배지 또는 조작된 MSC의 복막 내 주사를 받은 마우스의 종양 부피를 나타낸다. 마우스는 IL-12를 발현하는 조작된 MSC 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC의 복막 내 주사를 받았다. 종양 부피는 격일로 캘리퍼 측정에 의해 결정되었다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 대조군 배지 그룹과 비교하여 *p< 0.05, **p< 0.005. 오른쪽의 도식은 처리의 타임라인 및 처리된 마우스에서 종양 부담에 대한 조합 유전자 IL-12 및 CCL21a가 발현된 조작된 MSC의 영향을 도시한다.
도 5a는 IFN-β, IFN-γ, IL-12, CCL21a 또는 이들의 조합을 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 억제함을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 5a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 5b의 왼쪽 그래프는 14 일차에 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 5b의 오른쪽 그래프는 시간 경과에 따른 각각의 처리를 받은 마우스에 대한 평균 ± SEM으로서 나타낸 종양 부피를 도시한다.
도 6a는 OX40L, TRAIL, IL15, cGAS 또는 이들의 조합을 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 6a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 6b의 왼쪽 그래프는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 6b의 오른쪽 그래프는 시간 경과에 따른 각각의 처리를 받은 마우스에 대한 평균 ± SEM으로서 나타낸 체중을 도시한다.
도 7a는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; 항-CD40 항체의 첨가는 종양 성장을 감소시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 7a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 7b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다.
도 8a는 OX40L, TRAIL, IL15, HACvPD-1 또는 이들의 조합을 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 피하 마우스 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 8a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 8b의 왼쪽 그래프는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 8b의 오른쪽 그래프는 시간 경과에 따른 각각의 처리를 받은 마우스에 대한 평균 ± SEM으로서 나타낸 체중을 도시한다.
도 9a는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; CCL21a, IL-36 감마 및 IL-7을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 그러나, 테스트된 이펙터 조합 중 일부는 독성을 야기할 수 있다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 9a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 9b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다.
도 10a-10b는 독성 및 스크리닝에 대한 GFP 용량 단계적 확대 연구로부터의 데이터를 포함한다. 도 10a는 GFP를 발현하는 조작된 MSC가 독성을 유발하지 않음을 도시한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 10a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 10b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다.
도 11a는 조작된 인간 MSC가 마우스 4T1 종양으로 호밍하지 않음을 도시한다. 도 11b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 효능은 격일로 캘리퍼 측정으로부터 종양 부피에 의해 결정되었다.
도 12는 IL-12 및 CCL21a가 종양 확장을 감소시킬 수 있음을 도시하는 데이터를 포함한다.
도 13a는 IL-12 및 CCL21을 발현하는 조작된 MSC가 유방암 (4T1 삼중 음성 유방 암종)의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하기에 충분하며, 체크포인트 억제제 (항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체)의 첨가가 효능을 증가시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었고, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었으며, 체크포인트 억제제는 별개로 주사되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 13a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 13b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다.
도 14는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 결장직장암의 마우스 모델에서 유의한 종양 성장 지연을 유도하였음을 나타내는 데이터를 도시한다. 왼쪽의 그래프는 마우스의 CT26 결장직장 종양 성장에 대한 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 8). 차트의 각각의 라인은 0 일차 및 7 일차에 대조군 MSC 성장 배지 또는 조작된 MSC의 복막 내 주사를 받은 마우스의 종양 부피를 나타낸다. 마우스는 IL-12를 발현하는 조작된 MSC 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC의 복막 내 주사를 받았다. 종양 부피는 격일로 캘리퍼 측정에 의해 결정되었다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 대조군 배지 그룹과 비교하여 *p< 0.05, **p< 0.005. 오른쪽의 도식은 처리의 타임라인 및 처리된 마우스에서 종양 부담에 대한 조합 유전자 IL-12 및 CCL21a가 발현된 조작된 MSC의 영향을 도시한다.
도 15는 조작된 MSC 세포를 투약하기 위한 최적 시간을 결정하기 위해 CT26 마우스 모델에서 종양 성장 동역학을 도시하는 그래프이다.
도 16a-16b는 결장암의 동계 마우스 모델에서 평균량 종양 성장에 대한 항-CD40 또는 항-CTLA4 항체와 조합된 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC의 영향을 나타내는 데이터를 포함한다. CT26 결장 종양을 보유하는 마우스를 7 가지 처리 중 하나로 처리하였다 (처리 그룹 당 n = 5-6). MSC-IL-12+MSC-CCL21a는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) IL-12를 발현하는 조작된 세포 및 CCL21a를 발현하는 조작된 세포를 사용한 처리를 나타낸다. 도 16b의 왼쪽 그래프는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 16b의 오른쪽 그래프는 시간 경과에 따른 각각의 처리를 받은 마우스에 대한 평균 ± SEM으로서 나타낸 종양 부피를 도시한다.
도 17a-17b는 용량-의존적 장기간 생존 연구로부터의 데이터를 포함한다. 도 17a는 개별 그룹의 종양 부피를 도시한다. 도 17b는 체중 (상단), 종양 부피 (하단) 및 생존율 (오른쪽)을 도시한다.
도 18a는 IL-12, CCL21a, 및 IL15 또는 HACvPD-1을 발현하는 조작된 MSC가 모우 모델 결장직장암에서 종양 성장을 유의하게 억제함을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 CT26 결장직장 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 18a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 18b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 18c는 종양 미세환경 내 침윤성 면역 집단의 대표적인 그래프이다. 도 18d는 전체 CD3 집단에서의 조절 T 세포 (Treg)의 백분율을 도시한다. 조작된 MSC-IL2 및 CCL21a로 처리된 종양 미세환경에서 Treg의 수의 유의한 저감이 있었다. 도 18e는 면역 침윤 백분율과 종양 중량의 상관 관계를 나타낸다. 높은 림프구 (CD3+)를 갖는 샘플은 낮은 종양 중량와 상관 관계가 있는 것으로 나타난 반면, 높은 골수성 (CD11b+) 침윤을 갖는 샘플은 더 높은 종양 부담과 상관 관계가 있었다.
도 19는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 부피를 도시한다. 효능은 격일로 캘리퍼 측정으로부터 종양 부피에 의해 결정되었다.
도 20은 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 효능은 격일로 캘리퍼 측정으로부터 종양 부피에 의해 결정되었다.
도 21a-21b는 복막 내 공간에서의 CT26-LUC (루시퍼라제) 종양 성장의 동역학을 도시한다. CT26 세포주를 0 일차에 주사하고 3 마리의 마우스를 7 일차, 10 일차, 14 일차 및 18 일차에 수확하여 종양 성장의 동역학을 결정하였다. 도 21a의 제1 행은 종양 부담을 모니터링하기 위해 IVIS 이미저로 마우스 체중 및 ROI를 측정하였다. 제2 행은 각각의 그룹에서 개별 마우스 종양의 종양 중량 및 ROI를 모니터링하였다. 제3 행은 종양 중량와 전신 ROI 또는 종양 ROI의 상관 관계를 나타낸다. 도 21b는 종양 미세환경을 보다 잘 특성화하기 위해 18 일차 그룹에서 3 마리 마우스의 면역 프로파일을 도시한다.
도 22a는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 결장직장암의 피하 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; CCL21a 및 IL-36 감마 또는 IL-7을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 CT26 결장 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 22a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 22b는 각각의 처리 그룹에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다.
도 23a-23b는 도 22a-22b로 나타낸 실험으로부터의 종양 면역 침윤 통계를 포함한다. PBS, 나이브 MSC 및 MSC-IL12+MSC-CCL21a (콤보) 그룹으로부터 3 마리의 마우스를 선택하여 면역 프로파일 종양 미세환경에 대한 유세포분석법을 실행하였다. 도 23a는 나이브 MSC를 투약한 그룹과 비교하여 콤보 그룹에서 침윤성 CD3 및 CD8 세포독성 T 집단의 유의한 증가를 도시한다. 도 23b는 나이브 MSC를 처리한 그룹과 비교하여 콤보 그룹에서 과립구 골수-유래된 억압인자 세포 (gMDSC) 및 대식세포 집단의 유의한 감소를 도시한다.
도 24a-24b는 도 22a-22b로 나타낸 실험과 관련된, 면역 백분율 및 종양 중량에 관한 데이터를 포함한다. 도 24a 및 도 24b는 더 많은 CD3+ 및 CD8+ T 세포를 갖는 샘플 (왼쪽 상단 및 중앙 그래프)이 종양 중량의 저감과 강하게 상관 관계가 있음을 도시한다. 이들 도면은 또한 대식세포, 수지상 세포 및 MDSC를 포함하는 더 적은 CD11b 골수성 세포를 갖는 샘플이 더 낮은 종양 부담을 나타냄을 도시한다 (도 24a의 하부 중앙 및 오른쪽 그래프 및 도 24b의 상부 행).
도 25a-25b는 복막 내 및 피하 결장직장암 마우스 모델에서 MSC-IL-12+CCL21a 요법으로부터의 데이터를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입된 라인의 3 개의 상이한 로트를 MSC-IL12 및 CCL21a에 대해 테스트하였다 (TLOO8-3/4, TL019-01/02 및 TL022-01/0; 각각의 TL 번호는 하나의 로트를 나타냄). 도 25a는 MSC-IL12 + MSC-CCL21a의 3 개의 로트 모두가 피하 및 복막 내 모델 둘 모두에서 종양 부담을 감소시킬 수 있음을 도시한다 (처음 5 개의 그래프는 SC 모델로부터의 것이고 마지막 3 개는 IP 모델로부터의 것임). 모든 마우스로부터의 종양을 11 일차에 수집하였다. 도 25b는 각각의 그룹으로부터의 평균량 종양 중량을 도시한다.
도 26a는 조작된 병용 처리 MSC-IL-12+MSC-CCL21a 또는 MSC-CCL21a+MSC-IFN-β가 결장직장암의 피하 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; CCL21a 및 s41BBL을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 CT26 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 26a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 26b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. MSC-IL12 + MSC-CCL21a는 나이브 MSC를 주사한 마우스와 비교하여 최상의 효능을 도시한다. 처리 효능은 또한 MSC-IFNb + MSC-CCL21a로 처리된 그룹에서 관찰되었다.
도 27a-27b는 도 26a-26b로 나타낸 실험으로부터의 추가적인 데이터를 제공한다. 도 27a-27b는 표시된 조작된 MSC로 처리된 각각의 그룹의 면역 프로파일을 도시하는 그래프이다. MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리한 후 대식세포 집단의 일관된 저감이 관찰되었다 (도 27a). 나이브 MSC에 대하여 MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리된 그룹과 비교할 때 CD3+ 집단에서 증가된 침윤 및 CD11b+ 집단에서 저감된 침윤의 일반적인 경향이 또한 관찰되었다 (도 27a 및 도 27b).
도 28a-28b는 또한 도 26a-26b로 나타낸 실험으로부터의 추가적인 데이터를 제공한다. 도 28a-28b는 면역 침윤과 종양 중량의 상관 관계를 도시한다. 낮은 대식세포 및 수지상 세포를 갖는 샘플은 더 낮은 종양 부담을 갖는다 (도 28b, 상단 중앙 및 상단 오른쪽).
도 29는 상기 결장직장암 모델로부터의 생체 내 데이터를 조합한 그래프를 도시한다 (도 22a 및 도 26a). 도 22a 및 도 26a로부터의 조합된 CT26 데이터는 다음의 3 개의 그룹을 캡처한다: 종양만 (PBS), 나이브 MSC로 처리됨, 및 MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리됨.
도 30a-30c는 또한 도 22a 및 도 26a의 조합된 데이터를 도시한다. 그래프는 유세포분석법 실험 데이터로부터 면역 침윤의 평균량 수를 도시한다. 통계적 유의성이 도 30a로부터 CD8+ T에서 관찰되며, 이는 종양 미세환경을 재분극시키고 더 많은 세포독성 T 세포 침윤을 허용하는 MSC-IL12 + MSC-CCL21a의 능력을 입증한다. 더욱이, MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리된 그룹에서 CD11b+ 골수성 집단 침윤의 감소가 있었다 (도 30b). 수집된 데이터는 수지상 세포 및 대식세포 집단이 통계적 유의성이 있음을 도시한다.
도 31은 pL17D의 벡터 맵을 도시한다.
도 32는 단독으로 또는 조합하여 상이한 이펙터 분자를 발현하도록 조작된 MSC, 및 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 CT26 종양 부담을 감소시키는데 있어 이들의 효능을 도시한다.
도 33은 단독으로 또는 조합하여 상이한 이펙터 분자를 발현하도록 조작된 MSC, 및 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 B16F10 종양 부담을 감소시키는데 있어 이들의 효능을 도시한다.
도 34는 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 인간 IL12 (p70) 및 인간 CCL21a의 발현을 위한 렌티바이러스 발현 벡터 맵을 도시한다.
도 35는 사이토카인 ELISA에 의해 사정된 바와 같이, hIL12 (도 35a) 및 hCCL21a (도 35b) 둘 모두의 생산 조작된 hMSC를 도시한다.
도 36은 IFNγ 생산에 의해 사정된 바와 같이 MSC로부터 생산된 hIL12에 의한 기능적 T 세포 조정을 입증하는 트랜스웰 검정을 도시한다.
도 37은 생물발광 이미징에 의해 사정된 IP 종양-보유 마우스 종양에서 MSC에 의한 종양으로의 호밍을 도시한다. 도 37a-d는 CT26 종양 모델 (도 37a에 도시된 이미지, 도 37b에서 이미지의 정량화 요약), 정량적 실시간 PCR (도 37c) 및 반딧불이 루시퍼라제에 대한 형광 현미경 (도 37d)에서의 호밍을 도시한다. 도 37e는 B16F10 종양 모델에서의 호밍을 도시한다 (이미지의 정량화 요약).
도 38은 CT26 IP 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래하는 IL12p70 발현 MSC를 도시한다.
도 39는 B16F10 IP 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래하는 IL12p70 발현 MSC를 도시한다.
도 40은 CT26 IP 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래하는 IL12p70/CCL21a 발현 MSC를 도시한다. 도 40a는 PBS 처리된 (원), MSC-Flag-Myc ("나이브 MSC" 사각형) 및 IL12p70/CCL21a 발현 MSC (삼각형)에 대해 BLI에 의해 사정된 바와 같이 평균 종양 부담을 도시한다. 도 40b는 PBS 처리된, MSC-Flag-Myc ("나이브 MSC") 및 IL12p70/CCL21a 발현 MSC (각자 왼쪽, 중간 및 오른쪽 패널)에 대해 BLI에 의해 사정된 바와 같이 개별 마우스의 종양 부담을 도시한다. 도 40c는 IL12p70/CCL21a 발현 MSC를 사용한 처리가 연장된 생존 (90 일 초과의 100 % 생존)을 초래한 반면, 대조군 처리된 마우스는 모두 사멸하였거나 20 일차에 안락사되었음을 도시한다.
도 41은 IL12p70 발현 MSC를 사용한 처리가 연장된 생존을 초래함을 도시한다.
도 42는 3 명의 별개의 공여자 (도 42a, 공여자 1; 도 42b, 공여자 2; 도 42c, 공여자 3)에서 상이한 MOI (95000, 9500, 950 또는 감염되지 않음)에 걸쳐 유전적으로 조작된 MSC의 상대적 성장을 도시한다.
도 43은 EGFP 발현을 구동하는 다양한 프로모터를 함유하는 작제물로 형질도입된 2 명의 상이한 공여자 (각자 상단 및 하단 열)로부터의 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주를 도시한다. 형질도입 후 25 일차에 조작된 세포의 GFP (왼쪽 패널) 및 MFI (오른쪽 패널) 백분율을 도시한다.
도 44는 EGFP 발현을 구동하는 다양한 프로모터를 함유하는 작제물로 형질도입된 2 명의 상이한 공여자로부터의 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주를 도시한다. 개별적으로 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주 (왼쪽 패널) 또는 조합된 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주로부터의 데이터 (오른쪽 패널)를 사용하여 시간 경과에 따른 (형질도입-7 일차 내지 28 일차 후) 추적된 EGFP MFI를 도시한다.
도 45는 ELISA에 의해 사정된 바와 같이 조작된 MSC에 의한 IL-12p70의 분비를 도시한다.
도 46은 ELISA에 의해 사정된 바와 같이 조작된 MSC에 의한 IL-21의 분비를 도시한다.
도 47은 ELISA에 의해 사정된 바와 같이 조작된 MSC에 의한 IL-21에 대한 분비된 IL-12p70의 비율을 도시한다.
도 48은 조작된 MSC에 의한 사이토카인 생산 및 분비를 사정하기 위해 STAT4-SEAP 리포터와 함께 HEK-293T 세포를 사용한 IL-12p70에 대한 기능적 리포터 검정의 결과를 도시한다.
도 49는 NK-92 인간 자연 살해 세포에서 포스포-STAT1 (왼쪽 패널) 및 포스포-STAT3 (오른쪽 패널)를 정량화하여 조작된 MSC에 의한 사이토카인 생산 및 분비를 사정하기 위해 세포 내 포스포-플로우를 사용하는 IL-21에 대한 기능적 리포터 검정의 결과를 도시한다.
도 50은 조작된 MSC에 의한 사이토카인 생산 및 분비를 사정하기 위해 IL21R-U2OS IL21R/IL2RG 이량체화 리포터를 사용한 IL-12에 대한 기능적 리포터 검정의 결과를 도시한다.
도 51a는 단독으로 또는 조합하여 상이한 이펙터 분자를 발현하도록 조작된 MSC, 및 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 CT26 종양 부담을 감소시키는데 있어 이들의 효능을 도시한다.
도 51b는 단독으로 또는 조합하여 상이한 이펙터 분자를 발현하도록 조작된 MSC, 및 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 B16F10 종양 부담을 감소시키는데 있어 이들의 효능을 도시한다.
도 52는 CT26 모델에서 BLI (도 52a 왼쪽 패널) 및 종양 중량 (도 52a 오른쪽 패널)에 의해 사정된 바와 같이 IL12p70-발현 MSC, IL21-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 사용한 처리의 효능을 도시한다. 도 52b는 개별 마우스의 BLI 루시퍼라제 측정을 나타낸다.
도 53은 BLI에 의해 사정된 바와 같이 더 낮은 용량의 IL12p70-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 사용한 처리의 효능을 도시한다 도 53a; 마우스의 개별 BLI 측정 - 왼쪽 패널; BLI 측정의 요약 - 오른쪽 패널). 도 53b는 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 54는 B16F10 모델에서 BLI (도 54 왼쪽 패널) 및 종양 중량 (도 54 오른쪽 패널)에 의해 사정된 바와 같이 IL12p70-발현 MSC, IL21-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 사용한 처리의 효능을 도시한다.
도 55는 B16F10 모델에서 IL12p70-발현 MSC, IL21-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 사용한 처리 후 개별 마우스의 BLI 루시퍼라제 측정을 나타낸다.
도 56은 IL12p70-발현 MSC, IL21-발현 MSC, IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합, 항-PD1, 또는 IL12p70 및 항-PD1의 조합을 받은 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 57은 종양 재시험 후 마우스의 생존 곡선을 도시한다. 도 57a는 처리되지 않은 나이브 마우스를 도시한다. 도 57b는 이전에 단독으로 IL12-발현 MSC의 처리를 받았음을 도시한다. 도 57c는 이전에 IL12-발현 MSC 및 IL21-발현 MSC의 병용 처리를 받은 마우스를 도시한다.
도 58은 CT26 종양 모델에서 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작된 mMSC를 사용한 처리의 용량-의존적 효능을 도시한다. 도 58a는 17 일차 대 7 일차에 정규화된 효능의 요약된 BLI 사정을 도시한다. 도 58b 및 도 58c는 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI 측정을 도시한다. 도 58d는 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 59는 B16F10 종양 모델에서 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작된 mMSC를 사용한 처리의 용량-의존적 효능을 도시한다. 도 59a는 17 일차 대 7 일차에 정규화된 효능의 요약된 BLI 사정을 도시한다. 도 59b 및 도 59c는 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI 측정을 도시한다. 도 59d는 더 높은 용량의 다중 투여에 대한 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI 측정을 도시한다. 도 59e는 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 60은 MC-38 종양 모델에서 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작된 mMSC를 사용한 처리의 용량-의존적 효능을 도시한다. 도 60a는 18 일차 대 9 일차에 정규화된 효능의 요약된 BLI 사정을 도시한다. 도 60b는 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI 측정을 도시한다. 도 60c는 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 61은 인간 MSC의 우선적인 호밍을 도시한다. 도 61a는 요약된 루시퍼라제 정량화를 도시한다. 도 61b는 장기에서 루시퍼라제 신호의 대표적인 이미지를 도시한다.
도 62a는 OVCAR8 모델에서 복막액 (각각의 각자 시점에 대한 왼쪽 열) 및 혈청 (각각의 각자 시점에 대한 오른쪽 열)에서의 인간 IL12 (왼쪽 패널) 및 인간 IL21 (오른쪽 패널)의 생산을 도시한다.
도 62b는 CT26 모델에서 복막액 (각각의 각자 시점에 대한 왼쪽 컬럼) 및 혈청 (각각의 각자 시점에 대한 오른쪽 컬럼)에서의 뮤린 IL12 (왼쪽 패널) 및 뮤린 IL21 (오른쪽 패널)의 일시적인 생산을 도시한다.
도 63은 CT26 모델에서 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리되거나 재조합 사이토카인 요법으로 처리된 마우스의 효능을 도시한다. 도 63a는 MSC-IL12 대 rIL12의 생존 곡선을 도시한다. 도 63b는 MSC-IL21 대 rIL21의 생존 곡선을 도시한다. 도 63c는 MSC-IL12/IL21 대 rIL12+rIL21의 생존 곡선을 도시한다. 도 63d 및 도 63e는 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리되거나 재조합 사이토카인 요법으로 처리된 마우스에 대한 종양 부담의 BLI 사정을 도시한다.
도 64는 B16F10 모델에서 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리되거나 재조합 사이토카인 요법으로 처리된 마우스의 효능을 도시한다. 도 63a는 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리되거나 재조합 사이토카인 요법으로 처리된 마우스에 대한 종양 부담의 종양 중량 사정을 도시한다. 도 64b는 처리 그룹의 생존 곡선을 도시한다.
도 65는 CT26 IP 종양 모델에서 IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하는 MSC를 이용한 처리 후 마우스의 면역 프로파일을 도시한다. 도시된 결과는 치료에 대한 반응으로 면역 침윤을 특성화하는 데 사용되는 다색 유세포분석법 분석이다. 도 65a 및 도 65b는 T-세포 서브세트 및 활성화 마커 (CD3, CD4, CD8, CD8/CD38+, CD8/IFNg+, CD8/Gzmb+, NK/Gzmb+ 및 비율 CD8:Treg-FoxP3)를 도시한다. 도 65c는 항원-제시 세포, 예컨대, 수지상 세포의 면역 프로파일을 도시한다.
상세한 설명
중간엽 줄기 세포 (MSC) (중간엽 간질 세포, 다능성 간질 세포, 골수 간질 세포 또는 다능성 중간엽 간질 세포로서 또한 지칭됨)는 중배엽으로부터 기인하는 비-조혈성 성체 줄기 세포의 세브세트이다. 이들은 자기-재생 능력 및 중배엽 계통, 예컨대, 연골세포, 골세포 및 지방세포뿐만 아니라 외배엽 세포 및 내배엽 세포로의 다중계통 분화를 보유한다. 윤리적 우려 및 기형종 형성 둘 모두가 없는 MSC는 면역 질환 및 비-면역 질환 둘 모두의 치료를 위한 세포 요법에 사용되는 주요 줄기 세포 타입이다. 이들은 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐로부터 쉽게 단리될 수 있으며 생체 외에서 성공적으로 확장될 수 있다. 모든 목적을 위해 참고로 원용된 Dominici, 등 (Cytotherapy. 2006;8(4):315-7)에 보다 자세히 논의된 바와 같이, MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함하는 세포 표면 마커 표현형에 의해 정의될 수 있다. 또한, MSC가 인간 및 동물에 외인성 및 전신적으로 전달될 때, 이들은 종양 미세환경 및 전이 영역을 포함하여 염증이 있는 손상된 조직 부위로 호밍하는 (직접적으로 이동하는) 경향이 있다. 염증-지향된 MSC 호밍은 케모카인, 접착 분자 및 기질 금속단백분해효소 (MMP)를 포함하여 몇 가지 중요한 세포 트래픽킹-관련된 분자를 포함한다.
본원은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 이펙터 분자를 생산하기 위해 세포, 예컨대, MSC를 조작하는 방법을 제공한다. 이러한 MSC는 본원에서 "조작된 MSC"로서 지칭된다. 전형적으로 조작된 핵산을 함유하는 이러한 MSC는 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 실시양태에서, MSC는 이펙터 분자, 예를 들어, 면역 반응을 자극하는 것를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하도록 조작된다.
본원은 또한 이펙터 분자를 생산하기 위해 세포, 예컨대, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포를 비제한적으로 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법을 제공한다. MSC 및 면역 세포 둘 모두를 포함하는 이들 세포는 본원에서 "조작된 세포"로서 지칭된다. 전형적으로 조작된 핵산을 함유하는 이러한 세포는 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 이펙터 분자, 예를 들어, 면역 반응을 자극하는 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하도록 조작된다.
"이펙터 분자"는 다른 분자에 결합하고 이것이 결합하는 그 분자의 생물학적 활성을 조정하는 분자 (예컨대, 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA, 또는 단백질 (폴리펩티드) 또는 펩티드)를 지칭한다. 예를 들어, 이펙터 분자는 효소적 활성, 유전자 발현 또는 세포 신호전달을 증가 또는 저감시키기 위한 리간드로서 작용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 상이한 면역조정 메커니즘을 조정 (활성화 또는 억제)한다. 분자에 직접적으로 결합하고 조정함으로써, 이펙터 분자는 또한 제2 다운스트림 분자를 간접적으로 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 분비된 분자인 반면, 다른 실시양태에서, 이펙터 분자는 세포 표면에 결합되거나 세포 내에 남아있다. 예를 들어, 이펙터 분자는 예를 들어, 면역조정 활성, 호밍 성질 또는 세포의 지속성을 향상시키기 위해 내부 세포 상태를 변형시키는 세포 내 전사 인자, 마이크로RNA 및 shRNA를 포함한다. 이펙터 분자의 비-제한적인 예는 사이토카인, 케모카인, 대사산물 수준을 조정하는 효소, 사이토카인을 조정하는 항체 또는 디코이 분자, 호밍 분자 및/또는 인테그린을 포함한다.
용어 "조정하다"는 생물학적 활성의 유지, 생물학적 활성의 (부분적인 또는 완전한) 억제 및 생물학적 활성의 (부분적인 또는 완전한) 자극/활성화를 포괄한다. 용어는 또한 생물학적 활성을 저감 또는 증가 (예컨대, 향상)시키는 것을 포괄한다. 2 개의 상이한 이펙터 분자는 하나의 이펙터 분자가 (예컨대, 항원 제시 및/또는 처리를 자극하는) 다른 이펙터 분자에 의해 조정된 종양-매개 면역억압 메커니즘과 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정할 때 (예컨대, T 세포 신호전달을 자극할 때) "상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는" 것으로 간주된다.
이펙터 분자에 의한 조정은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 직접적인 조정은 이펙터 분자가 다른 분자에 결합하고 그 분자의 활성을 조정할 때 발생한다. 간접적인 조정은 이펙터 분자가 다른 분자에 결합하고 그 분자의 활성을 조정하며, 그 조정의 결과로 (이펙터 분자가 결합되지 않은) 또 다른 분자의 활성이 조정될 때 발생한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 분자에 의한 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 10 % 이상 (예컨대, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % 또는 200 %)까지 (예컨대, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서) 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 20 % 이상, 30 % 이상, 40 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 100 % 이상까지 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 10-20 %, 10-30 %, 10-40 %, 10-50 %, 10-60 %, 10-70 %, 10-80 %, 10-90 %, 10-100 %, 10-200 %, 20-30 %, 20-40 %, 20-50 %, 20-60 %, 20-70 %, 20-80 %, 20-90 %, 20-100 %, 20-200 %, 50-60 %, 50-70 %, 50-80 %, 50-90 %, 50-100 % 또는 50-200 % 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래한다. 예를 들어, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 "증가"는 달리 이펙터 분자(들)의 부재 하에 발생할 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에 비례하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 분자에 의한 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 2 배 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50 또는 100 배)까지 (예컨대, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서) 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 3 배 이상, 5 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 50 배 또는 100 배 이상까지 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 2-60, 2-70, 2-80, 2-90 또는 2-100 배까지 면역자극 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 증가를 초래한다.
면역자극 및/또는 항-종양 면역 메커니즘의 비-제한적인 예는 T 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원, 항원 제시 및/또는 처리, 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호전달, 활성 및/또는 동원, 수지상 세포 분화 및/또는 성숙, 면역 세포 동원, 전-염증성 대식세포 신호전달, 활성 및/또는 동원, 간질 분해, 면역자극 대사산물 생산, 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 신호전달 (이는 IFN 분비 및 Th1 분극화를 증가시켜 항-종양 면역 반응을 촉진함) 및/또는 타입 I 인터페론 신호전달을 포함한다. 이펙터 분자는 전술한 면역자극 메커니즘 중 하나 이상 (하나 이상)을 자극하여, 면역자극 반응에서의 증가를 초래할 수 있다. 전술한 면역자극 및/또는 항-종양 면역 메커니즘의 변화는 예를 들어, T 세포 증식 또는 세포독성에 대한 생체 외 검정, 생체 외 항원 제시 검정, (예컨대, 특정 마커의) 발현 검정 및/또는 (예컨대, 사이토카인의) 세포 분비 검정을 사용하여 사정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 분자에 의한 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 10 % 이상 (예컨대, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % 또는 200 %)까지 (예컨대, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서) 면역억압 반응에서의 저감을 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 20 % 이상, 30 % 이상, 40 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 100 % 이상까지 면역억압 반응에서의 저감을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 10-20 %, 10-30 %, 10-40 %, 10-50 %, 10-60 %, 10-70 %, 10-80 %, 10-90 %, 10-100 %, 10-200 %, 20-30 %, 20-40 %, 20-50 %, 20-60 %, 20-70 %, 20-80 %, 20-90 %, 20-100 %, 20-200 %, 50-60 %, 50-70 %, 50-80 %, 50-90 %, 50-100 % 또는 50-200 % 면역억압 반응에서의 저감을 초래한다. 예를 들어, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서 면역억압 반응의 "저감"은 달리 이펙터 분자(들)의 부재 하에 발생할 면역억압 반응에 비례하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 분자에 의한 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 2 배 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50 또는 100 배)까지 (예컨대, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서) 면역억압 반응에서의 저감을 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 3 배 이상, 5 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 50 배 이상 또는 100 배 이상까지 면역억압 반응에서의 저감을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양-매개 면역억압 메커니즘의 조정은 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 2-60, 2-70, 2-80, 2-90 또는 2-100 배까지 면역억압 반응에서의 저감을 초래한다.
면역억압 메커니즘의 비-제한적인 예는 음성 공동자극 신호전달, 세포독성 세포 (예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포)의 전-아폽토시스 신호전달, T 조절 (Treg) 세포 신호전달, 종양 체크포인트 분자 생산/유지, 골수-유래된 억압인자 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원, 면역억압 인자/대사산물 생산 및/또는 맥관 내피 성장 인자 신호전달을 포함한다. 이펙터 분자는 전술한 면역억압 메커니즘 중 하나 이상 (하나 이상)을 억제하여, 면역억압 반응에서의 저감을 초래할 수 있다. 전술한 면역억압 메커니즘의 변화는, 예를 들어, T 세포 증식에서의 증가 및/또는 IFNγ 생산에서의 증가 (음성 공동-자극 신호전달, Treg 세포 신호전달 및/또는 MDSC); 아넥신 V/PI 유동 염색 (전-아폽토시스 신호전달); 발현, 예컨대, PDL1 발현에 대한 유동 염색 (종양 체크포인트 분자 생산/유지); ELISA, LUMINEX®, qPCR을 통한 RNA, 효소적 검정, 예컨대, IDO 트립토판 이화작용 (면역억압 인자/대사산물 생산); 및 PI3K, Akt, p38의 인산화 (VEGF 신호전달)에 대해 검정함으로써 사정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 MSC는 막-테더링된 항-CD3 및/또는 항-CD28 작용제 세포 외 도메인을 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대, MSC는 2 개 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상)의 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 각각은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 다른 실시양태에서, 세포는 세포에 의해 천연적으로 생산되지 않는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 이러한 이펙터 분자는 예를 들어, 세포에 의해 천연적으로 생산된 이펙터 분자의 기능을 보완할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 상가적으로 기능하며: 예를 들어, 2 개의 이펙터 분자의 효과는 별개로 기능하는 2 개의 이펙터 분자의 효과의 합과 동등할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이펙터 분자는 상승작용적으로 기능하며: 예를 들어, 2 개의 이펙터 분자의 효과는 2 개의 이펙터 분자의 조합된 기능보다 클 수 있다. 본 개시내용은 또한 이펙터 분자(들)와 이들이 생산되는 면역 세포 (예컨대, MSC) 사이의 상가성 및 상승작용을 포괄한다.
종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하고/하거나 종양 미세환경을 변경하는 이펙터 분자는 예를 들어, 분비된 인자 (예컨대, 면역계에 관여된 세포 외 메커니즘을 조정하는 사이토카인, 케모카인, 항체 및/또는 디코이 수용체), 억제제 (예컨대, 항체, 항체 단편, 리간드 TRAP 및/또는 작은 차단 펩티드), 세포 상태를 제어하는 세포 내 인자 (예컨대, 전-염증성 성질을 향상시키도록 세포의 상태를 조정하는 마이크로RNA 및/또는 전사 인자), 엑소좀 내로 패키징된 인자 (예컨대, 마이크로RNA, 사이토졸 인자 및/또는 세포 외 인자), 표면 전시된 인자 (예컨대, 체크포인트 억제제, TRAIL) 및/또는 대사 유전자 (예컨대, 대사산물 또는 아미노산을 생산/조정 또는 분해하는 효소)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 다음의 분자의 비-제한적인 클래스로부터 선택될 수 있다: 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드 및 효소. 이펙터 분자의 전술한 클래스의 비-제한적인 예는 표 1에 나열되어 있고 예시적인 이펙터 분자를 코딩하는 특이적 서열은 표 6에 나열되어 있다. 이펙터 분자, 예컨대, 표 1 또는 표 6에 나열된 것 또는 표 1 또는 표 6에 나열된 뮤린 이펙터 분자의 인간 등가물은 인간일 수 있다. 이펙터 분자, 예컨대, 내인성 인간 이펙터 분자 또는 기능이 변형된 및/또는 최적화된 이펙터 분자, 예컨대, 발현을 개선하도록 최적화되거나, 안정성을 개선하도록 변형되거나, 이의 신호 서열에서 변형된 코돈은 인간-유래일 수 있다 (하기 참고). 기능을 최적화하기 위한 다양한 프로그램 및 알고리즘이 당업자에게 알려져 있으며 원하는 개선, 예컨대, 특이적 종 (예컨대, 인간, 마우스, 박테리아 등)에 대한 코돈 최적화를 기반으로 선택될 수 있다.
표 1. 예시적인 이펙터 분자
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일부 실시양태에서, 세포, 예컨대, MSC는 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조작된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 2 개 이상의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 조작된 핵산은 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포, 예컨대, 조작된 MSC는 2 개 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작되며, 각각은 하나 이상 (예컨대, 1, 2 또는 3 개)의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 세포는 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있으며, 각각은 하나 이상 (예컨대, 1, 2 또는 3 개)의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작되며, 각각은 하나 이상 (예컨대, 1, 2 또는 3 개)의 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
"조작된 핵산"은 자연적으로 발생하지 않는 핵산이다. 그러나, 조작된 핵산 전체가 자연-발생하는 것은 아니지만 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 상이한 유기체로부터의 (예컨대, 상이한 종으로부터의) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 뮤린 뉴클레오티드 서열, 박테리아 뉴클레오티드 서열, 인간 뉴클레오티드 서열 및/또는 바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 핵산 분자를 이음으로써 작제되는 분자를 지칭하며, 일부 실시양태에서, 생 세포에서 복제할 수 있다. "합성 핵산"은 증폭되거나, 화학적으로 또는 다른 수단에 의해 합성되는 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나, 달리 변형되지만 자연-발생하는 핵산 분자와 염기쌍을 이룰 수 있는 것들을 포함한다. 재조합 핵산 및 합성 핵산은 또한 전술한 것 중 어느 하나의 복제로 인한 분자를 포함한다. 본 개시내용의 조작된 핵산은 단일 분자 (예컨대, 동일한 플라스미드 또는 다른 벡터에 포함됨) 또는 다중 상이한 분자 (예컨대, 다중 상이한 독립적으로-복제하는 분자)에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 핵산은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 생산될 수 있다 (예컨대, Green 및 Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press 참고). 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 작제물은 GIBSON ASSEMBLY® 클로닝 (예컨대, Gibson, D.G. 등 Nature Methods, 343-345, 2009; 및 Gibson, D.G. 등 Nature Methods, 901-903, 2010을 참고하며, 이들 각각은 본원에 참고로 원용됨)을 사용하여 생산된다. GIBSON ASSEMBLY®는 전형적으로 단일-튜브 반응에서 다음의 3 가지 효소적 활성을 사용한다: 5' 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소의 'Y 연장 활성 및 DNA 리가제 활성. 5' 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단 서열을 다시 츄잉하고 어닐링을 위한 상보적 서열을 노출시킨다. 그런 다음, 중합효소 활성은 어닐링된 영역 상의 갭에 채운다. 이어서, DNA 리가제는 닉을 밀봉하고 DNA 단편을 함께 공유적으로 연결한다. 인접한 단편의 오버랩 서열은 골든게이트 어셈블리에 사용된 것보다 훨씬 길어, 올바른 어셈블리의 더 높은 백분율을 초래한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 작제물은 IN-FUSION® 클로닝 (Clontech)을 사용하여 생산된다.
"프로모터"는 핵산 서열의 나머지의 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역을 지칭한다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자, 예컨대, RNA 중합효소 및 다른 전사 인자가 결합할 수 있는 하위-영역를 함유할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 구동하거나 전사를 구동한다. 본원에서, 프로모터는 이것이 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및 배향에 있을 때 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주되며, 이것은 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("구동")하도록 조절한다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트의 업스트림에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 핵산 서열은, 이것의 자연 환경에서 코딩된 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭하는, 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에서 위치될 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 "자연 발생"하지 않은 합성 프로모터 또는 인핸서, 예컨대, 예를 들어, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 당업계에 알려진 유전공학의 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 것들을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것에 더하여, 서열은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 4,683,202 및 미국 특허 번호 5,928,906 참고).
조작된 핵산의 프로모터는 "유도성 프로모터"일 수 있으며, 이는 신호의 존재 하에 또는 이에 의해 영향을 받거나 또는 이에 의해 접촉될 때 전사 활성을 조절 (예컨대, 개시 또는 활성화)하는 것을 특징으로 하는 프로모터를 지칭한다. 신호는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 조절하는 데 활성이 되는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉하는 내인성 또는 정상적으로 외인성 상태 (예컨대, 광), 화합물 (예컨대, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질 (예컨대, 사이토카인)일 수 있다. 전사의 활성화는 전사를 구동하기 위해 프로모터에 직접적으로 작용하는 것 또는 프로모터가 전사를 구동하는 것을 방지하는 억제인자를 불활성화시킴으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 비활성화는 전사를 방지하기 위해 프로모터에 직접적으로 작용하는 것 또는 프로모터에 그 다음 작용하는 억제인자를 활성화시킴으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다.
프로모터는 국소 종양 상태 (예컨대, 염증 또는 저산소증) 또는 그 상태 또는 신호의 존재 하에 프로모터로부터의 전사가 활성화, 비활성화, 증가 또는 저감되는 경우 신호에 "반응성"이거나 또는 "조정"된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 반응 요소를 포함한다. "반응 요소"는 프로모터로부터의 유전자 발현을 조정 (조절)하는 특이적 분자 (예컨대, 전사 인자)에 결합하는 프로모터 영역 내의 짧은 DNA 서열이다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 반응 요소는, 제한없이, 플로레틴-조율가능한 제어 요소 (PEACE), 징크-핑거 DNA-결합 도메인 (DBD), 인터페론-감마-활성화된 서열 (GAS) (Decker, T. 등 J Interferon Cytokine Res. 1997 Mar;17(3):121-34, 본원에 참고로 원용됨), 인터페론-자극된 반응 요소 (ISRE) (Han, K. J. 등 J Biol Chem. 2004 Apr 9;279(15):15652-61, 본원에 참고로 원용됨), NF-카파B 반응 요소 (Wang, V. 등 Cell Reports. 2012; 2(4): 824-839, 본원에 참고로 원용됨) 및 STAT3 반응 요소 (Zhang, D. 등 J of Biol Chem. 1996; 271: 9503-9509, 본원에 참고로 원용됨)를 포함한다. 다른 반응 요소가 본원에 포괄된다. 반응 요소는 또한 탠덤 반복체 (예컨대, 반응 요소를 코딩하는 동일한 뉴클레오티드 서열의 연속 반복체)를 함유하여 일반적으로 이의 동족 결합 분자에 대한 반응 요소의 민감도를 증가시킬 수 있다. 탠덤 반복체는 2X, 3X, 4X, 5X 등으로 표지되어 존재하는 반복체의 수를 표시할 수 있다.
반응성 프로모터 ("유도성 프로모터"로서 또한 지칭됨) (예컨대, TGF-베타 반응성 프로모터)의 비-제한적인 예는 표 2에 나열되어 있으며, 이는 프로모터 및 전사 인자의 설계뿐만 아니라 도시된 전사 인자 (TF) 및 트랜스진 전사 (T)에 대한 유도자 분자의 효과를 도시한다 (B, 결합; D, 해리; n.d., 결정되지 않음) (A, 활성화; DA, 비활성화; DR, 탈억압) (Horner, M. & Weber, W. FEBS Letters 586 (2012) 20784-2096m, 및 본원에 인용된 참고문헌 참고). 유도성 프로모터의 다른 비-제한적인 예는 표 3에 나타낸 것들을 포함한다.
표 2. 반응성 프로모터의 예.
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표 3. 예시적인 유도성 프로모터
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프로모터의 다른 비-제한적인 예는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1-알파 (EF1a) 프로모터, 신장 인자 (EFS) 프로모터, MND 프로모터 (골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 비장 초점-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, 유인원 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터를 포함한다 (표 4 참고).
표 4. 예시적인 구성적 프로모터
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일부 실시양태에서, 본 개시내용의 프로모터는 종양 미세환경 내의 신호에 의해 조정된다. 종양 미세환경은 종양 미세환경의 존재 하에 프로모터의 활성이 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 10 % 이상까지 증가 또는 저감되는 경우 프로모터를 조정하는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 20 % 이상, 30 % 이상, 40 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 100 % 이상까지 증가 또는 저감된다. 예를 들어, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 10-20 %, 10-30 %, 10-40 %, 10-50 %, 10-60 %, 10-70 %, 10-80 %, 10-90 %, 10-100 %, 10-200 %, 20-30 %, 20-40 %, 20-50 %, 20-60 %, 20-70 %, 20-80 %, 20-90 %, 20-100 %, 20-200 %, 50-60 %, 50-70 %, 50-80 %, 50-90 %, 50-100 %, 또는 50-200 %까지 증가 또는 저감된다.
일부 실시양태에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 2 배 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50 또는 100 배)까지 증가 또는 저감된다. 예를 들어, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 3 배 이상, 5 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 50 배 이상 또는 100 배 이상까지 증가 또는 저감된다. 일부 실시양태에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비해 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 2-60, 2-70, 2-80, 2-90, 또는 2-100 배까지 증가 또는 저감된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 프로모터는 저산소 상태 하에서 활성화된다. "저산소 상태"는 신체 또는 신체 영역이 조직 수준에서 적절한 산소 공급이 부족한 상태이다. 저산소 상태는 염증을 유발할 수 있다 (예컨대, 저산소 상태 하에서 염증성 사이토카인의 수준이 증가함). 일부 실시양태에서, 저산소 상태 하에서 활성화되는 프로모터는 염증성 사이토카인의 활성의 발현을 저감시켜, 저산소 상태에 의해 염증 감소를 야기하는 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 저산소 상태 하에서 활성화되는 프로모터는 저산소증 반응성 요소 (HRE)를 포함한다. "저산소증 반응성 요소 (HRE)"는 저산소증-유도성 인자 (HIF)에 반응하는 반응 요소이다. 일부 실시양태에서, HRE는 공통 모티프 NCGTG (여기서 N은 A 또는 G임)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 다중 이펙터 분자를 생산한다. 예를 들어, 세포는 2-20 개의 상이한 이펙터 분자를 생산하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-20, 17-19, 17-18, 18-20, 18-19 또는 19-20 개의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 외인성 서열은 멀티시스트론일 수 있으며, 즉, 하나보다 많은 별개의 폴리펩티드 (예컨대, 다중 이펙터 분자)가 단일 mRNA 전사체로부터 생산될 수 있다. 외인성 서열은 다양한 링커의 사용을 통해 멀티시스트론일 수 있으며, 예컨대, 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 유전자:링커:제2 유전자 5' 내지 3' 배향에서와 같이 제2 이펙터 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 2A 리보솜 스키핑 요소, 예컨대, T2A를 코딩할 수 있다. 다른 2A 리보솜 스키핑 요소는 E2A, P2A 및 F2A를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 2A 리보솜 스키핑 요소는 번역 동안 생산되는 제1 및 제2 유전자에 의해 코딩되는 별개의 폴리펩티드의 생산을 허용한다. 링커는 절단가능한 링커 폴리펩티드 서열, 예컨대, 퓨린 절단 부위 또는 TEV 절단 부위를 코딩할 수 있으며, 여기서 발현 후에 절단가능한 링커 폴리펩티드는 절단되어 제1 및 제2 유전자에 의해 코딩되는 별개의 폴리펩티드가 생성된다. 절단가능한 링커는 절단을 추가로 촉진하는 폴리펩티드 서열, 예컨대, 이러한 가요성 링커 (예컨대, Gly-Ser-Gly 서열)를 포함할 수 있다.
링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩할 수 있으므로, 제1 및 제2 유전자에 의해 코딩된 별개의 폴리펩티드가 번역 동안 생산된다. 링커는 스플라이스 수용체, 예컨대, 바이러스 스플라이스 수용체를 코딩할 수 있다.
링커는 링커의 조합, 예컨대, 2A 리보솜 스키핑을 통해 별개의 폴리펩티드를 생산한 다음 퓨린 부위를 추가로 절단하여 2A 잔기의 완전한 제거를 허용할 수 있는 퓨린-2A 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커의 조합은 퓨린 서열, 가요성 링커 및 2A 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 링커는 퓨린 -Gly-Ser-Gly-2A 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 링커는 퓨린-Gly-Ser-Gly-T2A 융합 폴리펩티드이다.
일반적으로, 멀티시스트론 시스템은 링커의 임의의 수 또는 조합을 사용하여 유전자의 임의의 수 또는 이의 일부를 발현할 수 있다 (예컨대, 외인성 서열은 각각 링커에 의해 분리된 제1, 제2 및 제3 이펙터 분자를 코딩할 수 있어, 제1, 제2 및 제3 이펙터 분자에 의해 코딩된 별개의 폴리펩티드가 생산됨).
외인성 서열은 다중 ORF로부터 유전자를 발현하기 위해 다중 프로모터를 사용할 수 있으며, 즉, 외인성 서열로부터 하나 초과의 별개의 mRNA 전사체가 생산될 수 있다. 예를 들어, 제1 프로모터는 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 제2 프로모터는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 "링커"는 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 폴리펩티드, 상기 기재된 멀티시스트론 링커, 또는 상기 기재된 추가적인 ORF에 작동가능하게 연결되는 추가적인 프로모터를 지칭할 수 있다.
본 개시내용의 조작된 세포, 예컨대, MSC는 전형적으로 다중 이펙터 분자를 생산하며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자 중 하나 이상은 종양 미세환경에서 염증성 경로를 자극하고, 이펙터 분자 중 하나 이상은 종양 미세환경에서 염증의 음성 조절자를 억제한다.
"종양 미세환경"은 주변 혈관, 면역 세포, 섬유모세포, 골수-유래된 염증 세포, 림프구, 신호전달 분자 및 세포 외 기질 (ECM)을 포함하여 종양이 존재하는 세포 환경이다 (예컨대, Pattabiraman, D.R. 및 Weinberg, R.A. Nature Reviews Drug Discovery 13, 497-512 (2014); Balkwill, F.R. 등 J Cell Sci 125, 5591-5596, 2012; 및 Li, H. 등 J Cell Biochem 101(4), 805-15, 2007 참고).
일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 호밍 분자를 생산하도록 조작된다. "호밍"은 표적 부위 (예컨대, 세포, 조직 (예컨대, 종양) 또는 장기)로의 세포의 활성 탐색 (이동)을 지칭한다. "호밍 분자"는 세포가 표적 부위를 지향하는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 호밍 분자는 세포가 표적 부위를 인식하고/하거나 이의 상호작용을 개시하는 기능을 한다. 호밍 분자의 비-제한적인 예는 CXCR1, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR4, FPR2, VEGFR, IL6R, CXCR1, CSCR7 및 PDGFR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 호밍 분자는 케모카인 수용체 (케모카인에 결합하는 세포 표면 분자)이다. 케모카인은 세포에서 지향된 화학주성을 포함할 수 있는 세포에 의해 분비된 작은 사이토카인 또는 신호전달 단백질이다. 케모카인은 다음의 4 개의 주요 서브패밀리로 구분될 수 있으며: CXC, CC, CX3C 및 XC, 이들 모두는 표적 세포의 표면에 위치한 케모카인 수용체에 선택적으로 결합함으로써 생물학적 효과를 발휘한다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포가 케모카인 구배에 따라 간질 세포-유래된 인자 1 (SDF1, C-X-C 모티프 케모카인 12, 및 CXCL12로서 또한 알려짐)-발현 세포, 조직, 또는 종양으로 호밍하도록 허용하는 케모카인 수용체인 CXCR4를 생산하도록 조작된다. 본 개시내용의 조작된 세포에 의해 생산될 수 있는 케모카인 수용체의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: CXC 케모카인 수용체 (예컨대, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 및 CXCR7), CC 케모카인 수용체 (CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11), CX3C 케모카인 수용체 (예컨대, CX3CR1, 이는 CX3CL1에 결합함), 및 XC 케모카인 수용체 (예컨대, XCR1). 일부 실시양태에서, 케모카인 수용체는 G 단백질-연결된 막관통 수용체 또는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 수퍼패밀리 (비제한적으로 TNFRSF1A, TNFRSF1B를 포함함)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CXCL8, CXCL9, 및/또는 CXCL10, 11, 또는 CXCL10 및 CXCL11을 포괄하는 융합 단백질 (T-세포 동원을 촉진함), CCL3 및/또는 CXCL5, CCL21 (Th1 동원 및 분극화)을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서 세포는 B-세포 동원을 촉진하기 위해 CXCL13을 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포는 N-포르밀화-함유 올리고펩티드 (비제한적으로 FPR2 및 FPRL1을 포함함)를 검출하는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포는 인터루킨 (비제한적으로 IL6R을 포함함)을 검출하는 수용체를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포는 다른 세포, 조직 또는 종양으로부터 분비된 성장 인자 (비제한적으로 FGFR, PDGFR, EGFR, 및 비제한적으로 VEGF-C 및 VEGF-D를 포함하는 VEGF 패밀리의 수용체를 포함함)를 검출하는 수용체를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 호밍 분자는 인테그린이다. 인테그린은 세포-세포 외 기질 (ECM) 접착을 용이하게 하는 막관통 수용체이다. 인테그린은 다음의 2 개의 서브유닛을 갖는 절대 이종이량체이다: α (알파) 및 β (베타). 인테그린의 α 서브유닛은 제한없이 다음일 수 있다: ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, IGTA7, ITGA8, ITGA9, IGTA10, IGTA11, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAV, ITGA2B, ITGAX. 인테그린의 β 서브유닛은 제한 없이 다음일 수 있다: ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7 및 ITGB8. 본 개시내용의 세포는 인테그린 α 및 β 서브유닛의 임의의 조합을 생산하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 호밍 분자는 기질 금속단백분해효소 (MMP)이다. MMP는 내피 세포벽 아래에 있는 기저막의 구성요소를 절단하는 효소이다. MMP의 비-제한적인 예는 MMP-2, MMP-9 및 MMP를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 MMP를 억제하는 분자의 억제제 (예컨대, 단백질)를 생산하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 막 타입 1 MMP (MT1-MMP) 또는 TIMP 메탈로펩티다제 억제제1 (TIMP-1)의 억제제 (예컨대, RNAi 분자)를 발현하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 호밍 분자는 예를 들어, 표적 조직의 내피 상의 셀렉틴에 결합하는 리간드이다 (예컨대, 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드 (HCELL), Dykstra 등, Stem Cells. 2016 Oct;34(10):2501-2511).
용어 "호밍 분자"는 또한 세포의 호밍을 개선/향상시키는 분자의 생산을 조절하는 전사 인자를 포괄한다.
일부 실시양태에서, 세포 호밍은 대상체에서 종양/암 세포를 국소적으로 조사함으로써 증가된다. 방사선 조직 손상은 세포 호밍뿐만 아니라 그 손상된 조직으로의 내인성 T 세포 호밍을 돕는다.
조작된 세포의 예
본원에 제공된 바와 같은 세포 (예컨대, MSC)는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 이펙터 분자는 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역자극 메커니즘을 자극하거나, 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역억압 메커니즘을 억제한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 이펙터 분자는 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역억압 메커니즘을 억제하고, 하나 이상의 이펙터 분자 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)는 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역억압 메커니즘을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 2 개 이상 (예컨대, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 이펙터 분자는 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역자극 메커니즘을 자극한다. 또 다른 실시양태에서, 2 개 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 이펙터 분자는 종양 미세환경에서 하나 이상의 면역억압 메커니즘을 억제한다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 T 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 항원 제시 및/또는 처리를 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 면역 세포 동원을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 M1 대식세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 Th1 분극화를 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 간질 분해를 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 면역자극 대사산물 생산을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 타입 I 인터페론 신호전달을 자극하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 음성 공동자극 신호전달을 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 항-종양 면역 세포의 (예컨대, TRAIL을 통해) 전-아폽토시스 신호전달을 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 T 조절 (Treg) 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 종양 체크포인트 분자를 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 골수-유래된 억압인자 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 면역억압 인자/대사산물을 분해하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 맥관 내피 성장 인자 신호전달을 억제하는 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 종양 세포를 직접적으로 사멸시키는 하나 이상의 이펙터 분자 (예컨대, 그랜자임, 퍼포린, 종양용해성 바이러스, 세포질용해성 펩티드 및 효소, 예컨대, ADCC를 유발하는 항-종양 항체)를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 분자는 다음과 같으며: T 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 항원 제시 및/또는 처리를 자극하거나, 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하거나, 면역 세포 동원을 자극하거나, 대식세포 신호전달을 자극하거나, 간질 분해를 자극하거나, 면역자극 대사산물 생산을 자극하거나, 타입 I 인터페론 신호전달을 자극하며; 하나 이상의 이펙터 분자는 음성 공동자극 신호전달을 억제하거나, 항-종양 면역 세포의 전-아폽토시스 신호전달을 억제하거나, T 조절 (Treg) 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하거나, 종양 체크포인트 분자를 억제하거나, 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 신호전달을 활성화하거나, 골수-유래된 억압인자 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하거나, 면역억압 인자/대사산물을 분해하거나, 맥관 내피 성장 인자 신호전달 억제하거나, 직접적으로 종양 세포를 사멸시킨다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드 및 CD40L로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자; 및/또는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체 및 항-IL-35 항체로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자; 및/또는 MIP1α (CCL3), MIP1β (CCL5) 및 CCL21로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자; 및/또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자; 및/또는 미생물 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β, 및 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드, 효소 및 인터페론 유전자의 자극자 (STING)로부터 선택된 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 사이토카인 또는 수용체/리간드 (예컨대, IL-12,, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드 및/또는 CD40L)를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 사이토카인 또는 수용체/리간드 (예컨대, IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드 및/또는 CD40L)를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서 사이토카인은 Treg 세포에 결합하는 것을 방지하고 우선적으로 CD8 및 NK 세포에 결합하는 항체 단편에 융합된 IL-2와 같이 세포-특이적 표적화된 결합을 유도하도록 사이토카인에 자기-결합하는 항체, 항체-단편, 또는 수용체와 함께 조작된 융합 단백질로서 생산된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 항체 (예컨대, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-VEGF, 항-TGF-β, 항-IL-10, 항-TNF-α 및/또는 항-IL-35 항체)를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 케모카인 (MIP1α(CCL3), MIP1β(CCL5) 및/또는 CCL21)을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 뉴클레오티드 (예컨대, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드)를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 펩티드 (예컨대, 항-종양 펩티드)를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 효소를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 하나 이상의 STING 활성화제를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 직접적인 항-종양 활성 (예컨대, 종양용해성 바이러스)을 갖는 하나 이상의 이펙터를 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL) 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 MIP1-α를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 MIP1-β를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 CXCL9를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 CXCL10을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 CXCL11을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 CCL21을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL36-γ, IL-18, CD40L, 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-36γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL10-11 융합, CXCL13 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL) 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-36γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-36γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 MIP1-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-36γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 MIP1-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-12를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IFN-γ를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-2를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-7을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-15를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-36γ을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 IL-18을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 CD40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 41BB-L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항-CD40 항체, 안드티-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체, 및/또는 OX40L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-α 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-β 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 TRAIL 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 STING 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 사이토신 데아미나제 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL21을 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-α 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 MIP1-β 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL9 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL10 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CXCL11 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CCL21 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-36γ, IL-18, CD40L 및/또는 41BB-L을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-12 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-γ 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-γ 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-γ 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IFN-γ 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-2 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-2 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-2 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-2 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-7 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-7 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-7 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-7 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-15 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-15 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-15 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-15 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-36-γ 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-36-γ 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-36-γ 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-36-γ 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-18 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-18 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-18 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 IL-18 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 CD40L 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 41BB-L 및 항-PD-L1 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 41BB-L 및 OX40L을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 41BB-L 및 항-CTLA4 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, MSC)는 41BB-L 및 항-CD47 항체를 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 IFN-α, IFN-β, TRAIL, STING, CD40L 및/또는 사이토신 데아미나제를 추가로 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 MIP1-α, MIP1-β, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CCL21을 추가로 생산하도록 조작된다.
분비 신호
일반적으로, 하나 이상의 이펙터 분자는 분비 또는 막 인서션을 위한 새로 합성된 단백질을 적절한 단백질 처리 경로로 지향하는 이펙터 분자의 N-말단에 있는 분비 신호 펩티드 (신호 펩티드 또는 신호 서열로서 또한 지칭됨)를 포함한다. 이펙터 분자와 작동가능하게 연관된 분비 신호 펩티드는 천연 분비 신호 펩티드 천연 분비 신호 펩티드 (예컨대, 주어진 이펙터 분자와 일반적으로 내인성으로 연관된 분비 신호 펩티드)일 수 있다. 이펙터 분자와 작동가능하게 연관된 분비 신호 펩티드는 비-천연 분비 신호 펩티드 천연 분비 신호 펩티드일 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드는 특정 환경, 예컨대, 종양 미세환경에서 개선된 발현 및 기능, 예컨대, 유지된 분비를 촉진할 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드의 비-제한적인 예는 표 5에 도시되어 있다.
표 5. 예시적인 신호 분비 펩티드
Figure pct00048
Figure pct00049
세포 타입
본 개시내용은 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 중간엽 줄기 세포 (MSC) (예컨대, 인간 MSC)를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, (이펙터 분자를 생산하도록 조작된) 조작된 세포는 또한 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포, T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포 및 T 조절 세포 (CD4+, FOXP3+, CD25+)) 및 B 세포로부터 선택될 수 있다. 그러나, MSC 공학에 대한 임의의 언급은 다른 세포 타입 (예컨대, 면역계의 세포 타입)에 또한 적용될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, MSC)는 골수로부터의 것이다 (예컨대, 이로부터 수득되거나 이로부터 유래된다). 일부 실시양태에서, 조작된 중간엽 줄기 세포는 지방 조직으로부터의 것이다 (예컨대, 이로부터 수득되거나 이로부터 유래된다). 일부 실시양태에서, 조작된 중간엽 줄기 세포는 탯줄로부터의 것이다 (예컨대, 이로부터 수득되거나 이로부터 유래된다). 일부 실시양태에서, 조작된 중간엽 줄기 세포는 다능성 줄기 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포)로부터의 것이다.
따라서, 본 개시내용은 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포 또는 T 조절 세포 (CD4+, FOXP3+, CD25+))를 제공하며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, B 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, NKT 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 선천성 림프구 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 비만 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 호산구는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 호염기구는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 호중구는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작되며, 이들 중 2 개 이상은 상이한 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정한다.
일부 실시양태에서, 이펙터 분자 중 하나 이상은 종양 미세환경에서 면역자극 메커니즘을 자극하고/하거나 종양 미세환경에서 면역억압 메커니즘을 억제한다.
일부 실시양태에서, 이펙터 분자 중 하나 이상은 (a) T 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하고/하거나, (b) 항원 제시 및/또는 처리를 자극하고/하거나, (c) 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하고/하거나, (d) 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하고/하거나, (e) 면역 세포 동원을 자극하고/하거나, (f) 전-염증성 대식세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 항-염증성 대식세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (g) 간질 분해를 자극하고/하거나, (h) 면역자극 대사산물 생산을 자극하고/하거나, (i) 타입 I 인터페론 신호전달을 자극하고/하거나, (j) 음성 공동자극 신호전달을 억제하고/하거나, (k) 항-종양 면역 세포의 전-아폽토시스 신호전달을 억제하고/하거나, (l) T 조절 (Treg) 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (m) 종양 체크포인트 분자를 억제하고/하거나, (n) 인터페론 유전자의 자극자 (STING) 신호전달을 자극하고/하거나, (o) 골수-유래된 억압인자 세포 신호전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (p) 면역억압 인자/대사산물을 분해하고/하거나, (q) 맥관 내피 성장 인자 신호전달을 억제하고/하거나, (r) 종양 세포를 직접적으로 사멸시킨다.
방법
본원은 또한 본 개시내용의 조작된 MSC (또는 다른 조작된 면역 세포)를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. MSC를 배양하는 방법이 알려져 있다. 일부 실시양태에서, MSC는 성장 배지 (예컨대, MSCGM 인간 중간엽 줄기 세포 성장 BULLETKIT™ 배지 (혈청 함유), THERAPEAK™ MSCGM-CD™ 중간엽 줄기 세포 화학적으로 한정된 배지 (무혈청) 또는 RoosterBio xeno-free MSC 배지)에서의 배양물이다. 다른 세포, 예컨대, 면역 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본원은 본원에 제공되는 바와 같은 조작된 세포를 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에 전달 또는 투여하여 생체 내에서 세포에 의해 생산된 하나 이상의 이펙터 분자를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 정맥 내, 복막 내, 기관 내, 피하, 종양 내, 경구, 항문, 비강 내 (예컨대, 전달 입자에 패키징됨) 또는 동맥 (예컨대, 내부 경동맥) 경로를 통해 투여된다. 따라서, 세포는 전신적으로 또는 국소적으로 (예컨대, TME에) 투여될 수 있다.
본원에 기재된 조작된 세포 또는 폴리뉴클레오티드는 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 수성 담체를 함유하는 조성물에 있을 수 있다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 물, 완충수, 0.9 % 식염수, 0.3 % 글리신 및 히알루론산 등이 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 패키징될 수 있거나, 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물은 생리적 조건을 근사하는데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조율 및 완충제, 긴장성 조율제, 및 습윤제 등, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 함유할 수 있다.
일부 방법은 종양 (또는 암)을 갖는 대상체 (또는 환자 집단)를 선택하고, 그 대상체를 조작된 세포로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 조작된 세포는 일부 경우에, 암, 예컨대, 난소암을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 암이 본원에 설명되어 있다. 예를 들어, 조작된 세포는 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 난소 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및/또는 자궁 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 조작된 세포, 예컨대, 조작된 세포의 제제를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 예를 들어, 세포 이외의 세포의 5 % 미만 (예컨대, 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만)을 함유하는 실질적으로 순수한 제제이다. 제제는 1x105 개의 세포/kg 내지 1x107 개의 세포/kg, 예컨대, 조작된 세포를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 조작된 세포를 생산할 수 있는 생체 내 조성물을 전달하는 단계, 예컨대, 생체 내 렌티바이러스를 전달하는 단계를 포함한다. 인간 요법에 사용되는 것으로 알려진 것들, 예컨대, PhiC31을 사용하여 게놈 슈도사이트 내로 통합된 또는 뉴클레아제, 예컨대, 징크 핑거 (ZF)를 사용하여 통합된, 바이러스 전달 시스템 (예컨대, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 시스템), 트랜스포존 (예컨대, 슬리핑 뷰티 및 피기백 트랜스포존 시스템), 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 (CRISPR), 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함하는 다른 생체 내 전달 메커니즘 및 시스템이 또한 사용될 수 있다.
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Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
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Figure pct00061
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Figure pct00063
Figure pct00064
추가적인 실시양태
구체적인 실시양태를 설명하는 열거된 단락을 아래에 제공한다:
1. 조작된 세포로서:
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00065
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
2. 단락 1의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터는 외인성 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
3. 단락 1의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터는 내인성 프로모터를 포함한다.
4. 단락 1-3 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터는, 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00066
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다.
5. 단락 4의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 번역과 작동가능하게 연관된다.
6. 단락 5의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
7. 단락 6의 조작된 세포이되, 여기서 2A 리보솜 스키핑 태그는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: P2A, T2A, E2A 및 F2A.
8. 단락 5의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
9. 단락 5의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩한다.
10. 단락 5-9 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단가능한 폴리펩티드를 코딩한다.
11. 단락 10의 조작된 세포이되, 여기서 절단가능한 폴리펩티드는 퓨린 인식 폴리펩티드 서열을 포함한다.
12. 단락 5-9 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열을 추가로 코딩한다.
13. 단락 1-5 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
14. 단락 1-3 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 프로모터를 코딩하고,
여기서 프로모터는 화학식
Figure pct00067
을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고,
여기서 제2 프로모터는 화학식
Figure pct00068
를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 폴리뉴클레오티드이다.
15. 단락 14의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하다.
16. 단락 14의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터 및 제2 프로모터는 상이하다.
17. 단락 1-16 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다.
18. 단락 1-17 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 인간 세포이다.
19. 단락 18의 조작된 세포이되, 여기서 인간 세포는 대상체로부터의 단리된 세포이다.
20. 단락 19의 조작된 세포이되, 여기서 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직.
21. 단락 1-20 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 배양된 세포이다.
22. 단락 1-21 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 MSC는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
23. 단락 22의 조작된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II, 및 이들의 조합.
24. 단락 1-21 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
25. 단락 22-24 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 유세포분석법에 의해 결정되거나 결정되었다.
26. 단락 1-21 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 T 세포를 포함한다.
27. 단락 1-21 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 NK 세포를 포함한다.
28. 단락 1-21 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 NKT 세포를 포함한다.
29. 단락 22-28 중 임의의 것의 조작된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 포함하는 세포 마커를 추가로 포함한다.
30. 단락 29의 조작된 세포이되, 여기서 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12RB1, IL12RB2, CCL7 및 이들의 조합.
31. 단락 1-30 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 구성적 프로모터를 포함한다.
32. 단락 31의 조작된 세포이되, 여기서 구성적 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb 및 hUBIb.
33. 단락 1-30 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터는 SFFV 프로모터를 포함한다.
34. 단락 1-30 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터를 포함한다.
35. 단락 34의 조작된 세포이되, 여기서 유도성 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체.
36. 단락 1-35 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함한다.
37. 단락 1-36 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호 펩티드를 포함한다.
38. 단락 37의 조작된 세포이되, 여기서 비-천연 신호 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시온겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12 및 IL21.
39. 단락 1-38 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 신호 펩티드 및 제2 신호 펩티드는 동일하다.
40. 단락 1-39 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
41. 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 분비 폴리펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이다.
42. 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
43. 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 분비 폴리펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이다.
44. 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되고, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소.
45. 단락 1-44 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되고, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소.
46. 단락 45의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 치료적 클래스는 상이하다.
47. 단락 1-46 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 변형된 이펙터 분자이다.
48. 단락 47의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 세포막 테더링 도메인을 포함하도록 변형된다.
49. 단락 48의 조작된 세포이되, 여기서 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포 내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다.
50. 단락 48의 조작된 세포이되, 여기서 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함한다.
51. 단락 50의 조작된 세포이되, 여기서 변형된 이펙터 분자는 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다.
52. 단락 48-51 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 변형된 이펙터 분자는 이펙터 분자와 세포막 테더링 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다.
53. 단락 47-52 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 변형된 이펙터 분자는 발현될 때 조작된 세포의 세포막에 테더링된다.
54. 단락 44-53 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL7, IL21, IL18, IL15, 타입 I 인터페론 및 인터페론-감마.
55. 단락 54의 조작된 세포이되, 여기서 IL12 사이토카인은 IL12p70 융합 단백질이다.
56. 단락 44-55 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-11 융합, CCL19, CXCL9 및 XCL1.
57. 단락 44-56 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: Flt3L 및 GM-CSF.
58. 단락 44-57 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 공동-활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 4-1BBL 및 CD40L.
59. 단락 34-41 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 종양 미세환경 개질제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2.
60. 단락 59의 조작된 세포이되, 여기서 TGF베타 억제제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합.
61. 단락 59의 조작된 세포이되, 여기서 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체를 포함한다.
62. 단락 59의 조작된 세포이되, 여기서 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
63. 단락 1-59 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자는 인간-유래된 이펙터 분자이다.
64. 단락 1-63 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12를 포함한다.
65. 단락 1-63 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12p70 융합 단백질을 포함한다.
66. 단락 15의 조작된 세포이되, 여기서 IL12p70 융합 단백질은 인간 IL12p70 융합 단백질이다.
67. 단락 64-66 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CCL21a를 포함한다.
68. 단락 67의 조작된 세포이되, 여기서 CCL21a는 인간 CCL21a이다.
69. 단락 64-66 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL7을 포함한다.
70. 단락 69의 조작된 세포이되, 여기서 IL7은 인간 IL7이다.
71. 단락 64-66 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL21을 포함한다.
72. 단락 71의 조작된 세포이되, 여기서 IL21은 인간 IL21이다.
73. 단락 1-72 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 발현 카세트는 제3 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E3를 추가로 포함한다.
74. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
75. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다.
76. 단락 75의 조작된 세포이되, 여기서 발현 카세트는 제4 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E4를 추가로 포함한다.
77. 단락 76의 조작된 세포이되, 여기서 제4 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다.
78. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다.
79. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
80. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다.
81. 단락 73의 조작된 세포이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 XCL1을 포함한다.
82. 단락 64의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
83. 단락 64의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다.
84. 단락 64의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다.
85. 단락 64의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
86. 단락 1-63 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 인터페론-베타를 포함하고 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
87. 단락 1-86 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
88. 단락 1-87 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
89. 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 프로모터 및 발현 카세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
90. 단락 89의 조작된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 서열을 포함한다.
91. 단락 1-90 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 조작된 세포의 게놈 내로 통합된다.
92. 단락 1-91 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
93. 단락 92의 조작된 세포이되, 여기서 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
94. 단락 1-93 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 발현 카세트는 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식을 포함하는 추가적인 외인성 폴리뉴클레오티드 서열인 E2를 추가로 포함하며:
Figure pct00069
여기서
S는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E는 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 1 내지 20이며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 각각의 X에 대해 상응하는 신호 펩티드는 이펙터 분자와 작동가능하게 연관된다.
95. 작제물을 포함하는 조작된 세포로서, 여기서 작제물은
a) SFFV 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00070
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
96. 단락 17의 조작된 세포이되, 여기서 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
97. 단락 17 또는 단락 18의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다.
98. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 인간 세포이다.
99. 단락 0의 조작된 세포이되, 여기서 인간 세포는 대상체로부터의 단리된 세포이다.
100. 단락 0의 조작된 세포이되, 여기서 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직.
101. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 배양된 세포이다.
102. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 MSC는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
103. 단락 0의 조작된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
104. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 MSC는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
105. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 T 세포를 포함한다.
106. 단락 105의 조작된 세포이되, 여기서 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, 또는 T 조절 세포이다.
107. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 NK 세포를 포함한다.
108. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 NKT 세포를 포함한다.
109. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 단핵구 세포를 포함한다.
110. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 대식세포를 포함한다.
111. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 TIL을 포함한다.
112. 단락 17-111 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 조작된 세포의 게놈 내로 통합된다.
113. 단락 17-0 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
114. 단락 0의 조작된 세포이되, 여기서 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
115. 단락 0의 조작된 세포이되, 여기서 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
116. 단락 1-115 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 세포는 각각의 이펙터 분자를 분비한다.
117. 단락 116의 조작된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 제2 이펙터 분자의 분비에 비해 10 배 더 높은 비율로 분비된다.
118. 단락 1-117 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함한다.
119. 단락 118의 조작된 세포이되, 여기서 항원 인식 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, ADGRE2, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카드헤린 3, 카드헤린 6, CCR1, CCR4, CD117, CD123, CD131, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD244, CD30, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CD93, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, CLEC12A, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, EMB, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, FLT3, GAPT, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-1RAP, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, LAT2, 루이스 Y, LeY, LILRA2, LILRB2, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MLC1, MS4A3, MUC1, MUC16, MUC1C, MYADM, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, Ovarin, P-카드헤린, pan-Erb2, PIEZO1, PRAM1, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S Aures, SCT, SLAMF7, SLC22A16, SLC17A9, SLITRK6, SPNS3, SSTR2, STEAP1, 서바이빈, TDGF1, TIM1, TROP2, VSTM1 및 WT1.
120. 단락 118 또는 단락 119의 조작된 세포이되, 여기서 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함한다.
121. 단락 120의 조작된 세포이되, 여기서 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함한다.
122. 단락 120의 조작된 세포이되, 여기서 항원-결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
123. 단락 122의 조작된 세포이되, 여기서 scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
124. 단락 123의 조작된 세포이되, 여기서 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
125. 단락 124의 조작된 세포이되, 여기서 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
126. 단락 118-125 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
127. 단락 118-125 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
128. 단락 127의 조작된 세포이되, 여기서 CAR은 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-쇄 세포 내 신호전달 도메인, CD97 세포 내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포 내 신호전달 도메인, CD2 세포 내 신호전달 도메인, ICOS 세포 내 신호전달 도메인, CD27 세포 내 신호전달 도메인, CD154 세포 내 신호전달 도메인, CD8 세포 내 신호전달 도메인, OX40 세포 내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포 내 신호전달 도메인, CD28 세포 내 신호전달 도메인, ZAP40 세포 내 신호전달 도메인, CD30 세포 내 신호전달 도메인, GITR 세포 내 신호전달 도메인, HVEM 세포 내 신호전달 도메인, DAP10 세포 내 신호전달 도메인, DAP12 세포 내 신호전달 도메인 및 MyD88 세포 내 신호전달 도메인.
129. 단락 127 또는 단락 128의 조작된 세포이되, 여기서 CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인 및 CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인.
130. 단락 127-129 중 어느 하나의 조작된 세포이되, 여기서 CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
131. 세포 집단으로서, 세포 집단은 단락 1-130 중 어느 하나의 조작된 세포 중 임의의 것을 포함한다.
132. 단락 19의 세포 집단이되, 여기서 세포 집단은 조작된 세포가 풍부하다.
133. 단락 19 또는 단락 132의 세포 집단이되, 여기서 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진한다.
134. 단락 133의 세포 집단이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다.
135. 단락 134의 세포 집단이되, 여기서 조작된 세포가 풍부한 세포 집단은 IL12 수용체 β1 또는 이의 증가된 수준, IL12 수용체 β2 또는 이의 증가된 수준, 또는 IL12 수용체 β1 및 IL12 수용체 β2 또는 이의 증가된 수준을 발현한다.
136. 단락 133-135 중 임의의 것의 세포 집단이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL21이다.
137. 단락 133-135 중 임의의 것의 세포 집단이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CCL21이다.
138. 단락 137의 세포 집단이되, 여기서 조작된 세포가 풍부한 세포 집단은 CCL21 수용체 또는 이의 증가된 수준을 발현한다.
139. 단락 138의 세포 집단이되, 여기서 CCL21 수용체는 CCR7이다.
140. 대상체의 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 방법은 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포 또는 단락 19-139 중 임의의 것의 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
141. 대상체에 항-종양 면역을 제공하는 방법으로서, 방법은 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포 또는 단락 19-139 중 임의의 것의 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
142. 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포 또는 단락 19-139 중 임의의 것의 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
143. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 방법은 단락 1-0 중 어느 하나의 조작된 세포 또는 단락 19-139 중 임의의 것의 세포 집단 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
144. 단락 140-143 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 조작된 세포는 대상체로부터 유래된다.
145. 단락 140-143 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 조작된 세포는 대상체에 관하여 동종이계이다.
146. 단락 140-145 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양.
147. 단락 140-145 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 난소 종양이다.
148. 단락 140-147 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 복막 공간에 위치한 종양이다.
149. 조작된 세포로서,
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00071
여기서
S는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E는 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
X = 2 내지 20인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서
Figure pct00072
유닛의 제1 반복의 경우 L이 부재하며, 각각의 X에 대해 상응하는 신호 펩티드는 이펙터 분자와 작동가능하게 연관되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
150. 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00073
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
151. 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00074
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진하고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
152. 단락 151의 세포 집단이되, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 발현한다.
153. 단락 151 또는 단락 152의 세포 집단이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다.
154. 단락 151-153 중 임의의 것의 세포 집단이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL21이다.
155. 단락 151-153 중 임의의 것의 세포 집단이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CCL21이다.
156. 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 작제물을 포함하고, 여기서 작제물은
a) SFFV 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00075
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
157. 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 여기서 하나 이상의 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은
a) SFFV 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00076
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자를 발현하지 않는 집단의 세포에 비해 증가된 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 촉진하고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
158. 단락 0 또는 단락 0의 세포 집단이되, 여기서 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
159. 하나 이상의 세포가 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉하는 조건 하에서 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수용체 또는 수용체 리간드가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법으로서, 여기서 접촉된 세포는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 하나 이상의 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 발현하고, 여기서 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자의 부재 하에 배양된 세포에 비해 접촉된 세포의 성장, 생존력, 또는 성장 및 생존력을 증가시킨다.
160. 단락 0의 방법이되, 여기서 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 하나 이상의 세포에서 이종적으로 발현되고, 하나 이상의 세포는 자가분비 방식으로 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다.
161. 단락 0의 방법이되, 여기서 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자는 하나 이상의 추가적인 세포에서 발현되고, 하나 이상의 세포는 주변분비 방식으로 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다.
162. 단락 0의 방법이되, 여기서 하나 이상의 추가적인 세포는 영양 세포이다.
163. 단락 0의 방법이되, 여기서 하나 이상의 세포는 배지에서 배양된다.
164. 단락 0의 방법이되, 여기서 하나 이상의 세포는 배지에 대한 가용성 제1 이펙터 분자, 가용성 제2 이펙터 분자, 또는 가용성 제1 및 제2 이펙터 분자의 첨가에 의해 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다.
165. 단락 0 또는 단락 0의 방법이되, 여기서 가용성 제1 이펙터 분자 및/또는 가용성 제2 이펙터 분자는 재조합 이펙터 분자이다.
166. 단락 0의 방법이되, 여기서 하나 이상의 세포는 부착 조건 하에서 배양된다.
167. 단락 0의 방법이되, 여기서 하나 이상의 세포는 표면에 부착된다.
168. 단락 0의 방법이되, 여기서 부착된 세포는 하나 이상의 세포를 표면에 고정된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 노출시킴으로써 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자와 접촉된다.
169. 단락 0-168 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12 또는 IL12p70 융합 단백질이다.
170. 단락 169의 방법이되, 여기서 세포 집단은 IL12 수용체 β1 (IL12Rβ1)이 풍부하거나, IL12 수용체 β2 (IL12Rβ2)가 풍부하거나, IL12Rβ1 및 IL12Rβ2가 풍부하다.
171. 단락 0의 방법이되, 여기서 MSC 집단은 세포 마커 CD105+, CD73+, CD90+, IL12Rβ1+ 및 IL12Rβ2+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
172. 단락 0의 방법이되, 여기서 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
173. 단락 0의 방법이되, 여기서 세포 집단은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다: 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포 및 T 조절 세포, 및 B 세포.
174. 단락 173의 방법이되, 여기서 세포 집단은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 대식세포 또는 골수 유래된 세포를 포함한다.
175. 단락 0-174 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL21이다.
176. 단락 0-174 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CCL21이다.
177. 단락 176의 방법이되, 여기서 세포 집단은 CCR7이 풍부하다.
178. 단락 0의 방법이되, 여기서 MSC의 집단은 세포 마커 CD105+, CD73+, CD90+, IL12Rβ1+, IL12Rβ2+ 및 CCR7+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
179. 단락 0의 방법이되, 여기서 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
180. 단락 0-0 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 하나 이상의 수용체 또는 수용체 리간드가 풍부한 세포 집단.
181. 프로모터 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열로서,
Figure pct00077
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
182. 단락 181의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터는 외인성 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
183. 단락 181의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터는 내인성 프로모터를 포함한다.
184. 단락 181-183 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터는 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00078
Figure pct00079
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다.
185. 단락 184의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 별개의 폴리펩티드로서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 번역과 작동가능하게 연관된다.
186. 단락 185의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
187. 단락 186의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 2A 리보솜 스키핑 태그는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: P2A, T2A, E2A 및 F2A.
188. 단락 185의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
189. 단락 185의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩한다.
190. 단락 185-189 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 절단가능한 폴리펩티드를 코딩한다.
191. 단락 181의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 절단가능한 폴리펩티드는 퓨린 인식 폴리펩티드 서열을 포함한다.
192. 단락 185-189 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열을 추가로 코딩한다.
193. 단락 181-185 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩한다.
194. 단락 181-183 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 프로모터를 코딩하고,
여기서 프로모터는 화학식
Figure pct00080
을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고,
여기서 제2 프로모터는 화학식
Figure pct00081
를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 폴리뉴클레오티드이다.
195. 단락 181의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하다.
196. 단락 181의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터 및 제2 프로모터는 상이하다.
197. 단락 181-196 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 구성적 프로모터를 포함한다.
198. 단락 197의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 구성적 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb 및 hUBIb.
199. 단락 181-196 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터는 SFFV 프로모터를 포함한다.
200. 단락 181-196 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터를 포함한다.
201. 단락 200의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 유도성 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체.
202. 단락 181-201 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함한다.
203. 단락 181-202 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드는 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호 펩티드를 포함한다.
204. 단락 203의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 비-천연 신호 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시온겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12 및 IL21.
205. 단락 181-204 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 신호 펩티드 및 제2 신호 펩티드는 동일하다.
206. 단락 181-205 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
207. 단락 181-206 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 분비 폴리펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이다.
208. 단락 181-206 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
209. 단락 181-208 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 분비 폴리펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이다.
210. 단락 181-208 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소.
211. 단락 181-210 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 치료적 클래스로부터 선택되며, 여기서 치료적 클래스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소.
212. 단락 211의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 치료적 클래스는 상이하다.
213. 단락 181-212 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 변형된 이펙터 분자이다.
214. 단락 213의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자는 세포막 테더링 도메인을 포함하도록 변형된다.
215. 단락 214의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포 내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다.
216. 단락 214의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함한다.
217. 단락 216의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 변형된 이펙터 분자는 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막-결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다.
218. 단락 214-217 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 변형된 이펙터 분자가 이펙터 분자와 세포막 테더링 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다.
219. 단락 213-218 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 세포에서 발현될 때 변형된 이펙터 분자는 세포의 세포막에 테더링된다.
220. 단락 210-219 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12, IL7, IL21, IL18, IL15, 타입 I 인터페론 및 인터페론-감마.
221. 단락 220의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 IL12 사이토카인은 IL12p70 융합 단백질이다.
222. 단락 210-221 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-11 융합, CCL19, CXCL9 및 XCL1.
223. 단락 210-222 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: Flt3L 및 GM-CSF.
224. 단락 210-223 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 공동-활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 4-1BBL 및 CD40L.
225. 단락 210-224 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 종양 미세환경 개질제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2.
226. 단락 225의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 TGF베타 억제제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합.
227. 단락 225의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체를 포함한다.
228. 단락 225의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
229. 단락 181-225 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자는 인간-유래된 이펙터 분자이다.
230. 단락 181-229 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12를 포함한다.
231. 단락 181-229 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 IL12p70 융합 단백질을 포함한다.
232. 단락 231의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 IL12p70 융합 단백질은 인간 IL12p70 융합 단백질이다.
233. 단락 230-232 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CCL21a를 포함한다.
234. 단락 233의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 CCL21a는 인간 CCL21a이다.
235. 단락 230-232 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL7을 포함한다.
236. 단락 235의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 IL7은 인간 IL7이다.
237. 단락 230-232 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 IL21을 포함한다.
238. 단락 237의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 IL21은 인간 IL21이다.
239. 단락 181-238 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 발현 카세트는 제3 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E3을 추가로 포함한다.
240. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
241. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다.
242. 단락 241의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 발현 카세트는 제4 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 E4를 추가로 포함한다.
243. 단락 242의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제4 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다.
244. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 아데노신 데아미나제를 포함한다.
245. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
246. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다.
247. 단락 239의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제3 이펙터 분자는 XCL1을 포함한다.
248. 단락 230의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
249. 단락 230의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함한다.
250. 단락 230의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 항-PD1을 포함한다.
251. 단락 230의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자는 CD40L을 포함한다.
252. 단락 181-229 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 인터페론-베타를 포함하고 제2 이펙터 분자는 Flt3L을 포함한다.
253. 단락 181-252 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
254. 단락 181-253 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
255. 단락 181-254 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
256. SFFV 프로모터 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열로서,
Figure pct00082
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며;
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결된다.
257. 단락 256의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
258. SFFV 프로모터 및 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열로서,
Figure pct00083
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이며;
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고;
여기서 프로모터는 폴리뉴클레오티드가 화학식
Figure pct00084
를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고;
여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
259. 단락 181-258 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 의해 코딩된다: DNA, cDNA, RNA, mRNA 및 네이키드 플라스미드.
260. 단락 181-259 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
261. 단락 260의 발현 벡터이되, 여기서 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
262. 단락 261의 발현 벡터이되, 여기서 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
263. 단락 181-259 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
264. 단락 181-259 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 단락 260-262 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 단락 263의 조성물을 포함하는 단리된 세포.
265. 단락 264의 단리된 세포이되, 여기서 단리된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 바이러스-특이적 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 자연 살해 (NK) 세포, B 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수성 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포 (ESC), ESC-유래된 세포, 다능성 줄기 세포, MSC, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 및 iPSC-유래된 세포.
266. 단락 264의 단리된 세포이되, 여기서 단리된 세포는 MSC이다.
267. 단락 264-266 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다.
268. 단락 264-267 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
269. 단락 268의 단리된 세포이되, 여기서 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
270. 단락 268의 단리된 세포이되, 여기서 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열은 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
271. 단락 264-270 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 HLA-타입화된다.
272. 단락 264-271 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 조작된 세포는 인간 세포이다.
273. 단락 272의 단리된 세포이되, 여기서 인간 세포는 대상체로부터의 단리된 세포이다.
274. 단락 273의 단리된 세포이되, 여기서 단리된 세포는 다음의 군으로 이루어진 조직으로부터 단리된다: 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직.
275. 단락 264-272 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포는 배양된 세포이다.
276. 단락 264-275 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포는 세포 마커 CD105+, CD73+ 및 CD90+를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
277. 단락 276의 단리된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커가 결여되거나 실질적으로 결여된 표현형을 추가로 포함한다: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA 클래스 II 및 이들의 조합.
278. 단락 264-275 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포는 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함한다.
279. 단락 264-278 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포 마커 표현형은 세포에서 발현된 제1 이펙터 분자, 제2 이펙터 분자, 또는 제1 및 제2 이펙터 분자에 대한 동족 수용체 또는 동족 수용체 리간드를 포함하는 세포 마커를 추가로 포함한다.
280. 단락 279의 단리된 세포이되, 여기서 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL12RB1, IL12RB2, CCL7 및 이들의 조합.
281. 단락 264-280 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포는 각각의 이펙터 분자를 분비한다.
282. 단락 281의 단리된 세포이되, 여기서 제1 이펙터 분자는 제2 이펙터 분자의 분비에 비해 10 배 더 높은 비율로 분비된다.
283. 단락 264-282 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함한다.
284. 단락 283의 단리된 세포이되, 여기서 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함한다.
285. 단락 284의 단리된 세포이되, 여기서 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (sdAb)를 포함한다.
286. 단락 284의 단리된 세포이되, 여기서 항원-결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
287. 단락 286의 단리된 세포이되, 여기서 scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
288. 단락 287의 단리된 세포이되, 여기서 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
289. 단락 288의 단리된 세포이되, 여기서 scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다.
290. 단락 283-289 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
291. 단락 283-289 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
292. 단락 291의 단리된 세포이되, 여기서 CAR은 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-쇄 세포 내 신호전달 도메인, CD97 세포 내 신호전달 도메인, CD11a-CD18 세포 내 신호전달 도메인, CD2 세포 내 신호전달 도메인, ICOS 세포 내 신호전달 도메인, CD27 세포 내 신호전달 도메인, CD154 세포 내 신호전달 도메인, CD8 세포 내 신호전달 도메인, OX40 세포 내 신호전달 도메인, 4-1BB 세포 내 신호전달 도메인, CD28 세포 내 신호전달 도메인, ZAP40 세포 내 신호전달 도메인, CD30 세포 내 신호전달 도메인, GITR 세포 내 신호전달 도메인, HVEM 세포 내 신호전달 도메인, DAP10 세포 내 신호전달 도메인, DAP12 세포 내 신호전달 도메인 및 MyD88 세포 내 신호전달 도메인.
293. 단락 291 또는 단락 292의 단리된 세포이되, 여기서 CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인 및 CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인.
294. 단락 291-293 중 어느 하나의 단리된 세포이되, 여기서 CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.
295. 단락 181-259 중 어느 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열 또는 단락 260-262 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 바이러스.
296. 단락 295의 바이러스이되, 여기서 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 및 아데노바이러스.
297. 단락 295의 바이러스이되, 여기서 바이러스는 렌티바이러스이다.
298. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 방법은 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 조작된 세포는
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00085
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
299. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 방법은 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하고, 여기서 작제물은
a) SFFV 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00086
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
300. 단락 0의 방법이되, 여기서 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
301. 단란 298-에러! 참조 출처가 발견되지 않음. 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
302. 단락 0의 방법이되, 여기서 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-1L 항체 또는 항-CTLA-4 항체이다.
303. 단락 298-302 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
304. 단락 298-303 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양.
305. 단락 298-303 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 난소 종양이다.
306. 단락 298-303 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 복막 공간에 위치한 종양이다.
307. 단락 298-306 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 투여는 전신 투여, 복막 내 투여 또는 종양 내 투여를 포함한다.
308. 단락 298-307 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양의 부피는 대조군에 비해 25 % 이상 감소되고, 임의로 여기서 대조군은 변형되지 않은 세포이다.
309. 단락 307의 방법이되, 여기서 종양의 부피는 대조군에 비해 50 % 이상 감소되고, 임의로 여기서 대조군은 변형되지 않은 세포이다.
310. 단락 309의 방법이되, 여기서 종양의 부피는 대조군에 비해 75 % 이상 감소되고, 임의로 여기서 대조군은 변형되지 않은 세포이다.
311. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 방법은 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 각각의 조작된 세포는
a) 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00087
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
312. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서, 방법은 종양의 부피를 감소시키기 위한 유효량으로, IL12 및 IL21을 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 조작된 세포는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은
a) SFFV 프로모터; 및
b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
Figure pct00088
여기서
S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
을 포함하며,
여기서 SFFV 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
여기서 조작된 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포.
313. 단락 0의 방법이되, 여기서 작제물은 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
314. 단락 311-에러! 참조 출처가 발견되지 않음. 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 조성물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 시스템을 포함한다: 바이러스 시스템, 트랜스포존 시스템 및 뉴클레아제 게놈 편집 시스템.
315. 단락 0의 방법이되, 여기서 바이러스 시스템은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 및 아데노바이러스.
316. 단락 0의 방법이되, 여기서 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 징크-핑거 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR 시스템.
317. 단락 311-316 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 종양은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 선암종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구 B-세포 백혈병 (BALL), 급성 림프모구 T-세포 백혈병 (TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수이형성증, 난소 종양, 췌장 종양, 형질 세포 골수종, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및 자궁 종양.
318. 단락 311-317 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 투여는 전신 투여, 복막 내 투여 또는 종양 내 투여를 포함한다.
실시예
실시예 1
이 실시예는 개별 및 병용 면역요법 페이로드를 갖는 MSC의 생체 외 특성화를 설명한다. 암세포에 대한 면역요법-발현 MSC의 직접적인 항-암 효과를 먼저 측정하였다. 다음으로, 일차 면역 세포 (T 세포에 초점) 및 암 세포와의 공동-배양에 대한 면역요법-발현 MSC의 영향을 측정하였다. 면역요법-발현 MSC의 면역-자극 성질은 마우스 및 인간 세포 시스템 둘 모두에서 염증성 바이오마커 패널을 기반으로 순위순으로-정렬된다. 자체적으로 또는 T 세포와 함께 암세포 사멸을 유의하게 향상시키는 면역요법-발현 MSC를 식별하고, 생체 내 테스트로 진전될 수 있는 상위 후보가 선택된다.
방법: 면역요법-발현 MSC를 표 1에 나열된 이펙터 분자를 발현하도록 조작하였으며 암 요법과 관련된 생체 외 모델을 사용하여 이들의 기능적 효과에 대해 평가하였다. 인간 난소암 세포 (예컨대, OVCAR8 및 SKOV3) 및 순환 PBMC로부터 단리된 인간 면역 세포를 hIT를 발현하는 hMSC를 테스트하는 데 사용하였다. 마우스 난소암 세포 (예컨대, ID8) 및 마우스 면역 세포를 mIT를 발현하는 mMSC를 테스트하는 데 사용하였다.
체크포인트 억제제. 세포-결합 검정은 발현된 항체의 활성을 확인하는 데 사용하였다. 항체 CTLA4 및 PD1의 표적은 둘 모두 T 세포를 음성적으로 조절하지만, T-세포 활성화의 상이한 단계에서 상향조절된다 (Boutros C, 등 (2016) Nat Rev Clin Oncol 13(8):473-486; Valsecchi ME (2015) New Engl J Med 373(13):1270-1270). CTLA4는 프라이밍 상에서 간단히 상향조절되는 반면 PD1은 T 세포 활성화의 이펙터 상에서 일관되게 발현된다 (Pardoll DM (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-264; Legat A, 등 (2013) Front Immunol 4:455). 항-CTLA4 항체는 T-세포 표면의 CTLA4에 결합하여 초기 단계에서 CTLA4가 T-세포 활성화를 정지시키는 것을 차단하고, 인간 항-PD1 항체는 PD1에 결합하여 종양 세포가 T-세포 활성을 억제하는 것을 방지한다.
T 세포를 EASYSEP™ 자기 비드 (STEMCELL Technologies)를 사용한 음성 선택에 의해 PBMC로부터 단리하였다. 단리된 T 세포를 인간 T-활성화제 CD3/28 Dynabeads (Thermo Fisher)에 의해 활성화시키고 CTLA-4 및 PD-1의 발현을 5 일에 걸쳐 모니터링하여 각각의 표면 마커에 대한 최적의 발현시기를 선택하였다. 적절한 날에, CTLA-4 또는 PD-1에 대한 항체를 발현하는 MSC로부터의 제어된 배지 또는 비-발현 MSC로부터의 대조군 제어된 배지를 활성화된 T 세포에 적용하여 이러한 항체의 직접적인 세포-표면-수용체 결합을 검증하였다. 유세포분석법과 함께 형광색소-표지된 이차 검출 항체는 결합을 확인해야 한다.
케모카인. CCL21 케모카인 기능성을 CCL21 화학주성에 반응성인 케모카인 수용체 CCR7을 발현하는 단리된 나이브 T 세포 및 세포 이동 검정을 사용하여 확인하였다. 구체적으로, CCL21-발현 또는 대조군 MSC를 트랜스-웰의 하나의 구획에 첨가한 다음, 다른 구획으로부터 단리된 나이브 T 세포에 의해 세포 이동을 사정하고, 이어서 이동된 T 세포의 수를 열거하였다 (Justus CR, 등 (2014) J Vis Exp (88)).
사이토카인. IL2, IL12 및 IL15의 활성을 측정하였다. IL2, IL12 및 IL15에 특이적인 ELISA 검정을 사용하여 MSC 상청액에서 이러한 사이토카인의 수준을 검출하였다. 기능적 생물활성 검정은 CTLL-2 세포주를 사용하여 IL2 또는 IL15-매개 증식을 사정하거나, NKG 세포주를 사용하여 MSC 상청액에 의한 IL12-매개 IFN-감마 생산을 사정하였다. LUMINEX® 기술을 사용한 다중화된 사이토카인 프로파일링 검정을 사용하여 사이토카인 발현 및 면역 세포에 대한 영향을 또한 사정할 수 있다.
STING 경로. STING 경로 활성화를 구성적 STING 돌연변이체 페이로드로 측정하였다. LUMINEX® 비드를 사용하여, STING 돌연변이체의 발현과 함께 타입 I 인터페론 (예컨대, IFN-알파2 및 IFN-베타)의 분비를 MSC에서 프로파일링하였다.
난소암 세포에 대한 면역요법-발현 MSC의 직접적인 영향. 난소암 세포 성장 및 생존력에 대한 MSC의 임의의 직접적인 영향을 생체 외에서 테스트하였다. 예를 들어, mMSC 또는 hMSC 후보를 마우스 난소암 세포주 (ID8) 또는 인간 난소암 세포주 (OVCAR8 및 SKOV3)와 함께 공동-배양하고, 암세포 세포독성을 잘-특성화된 젖산 탈수소효소 (LDH) 검정에 의해 측정하였다. 24 시간의 공동-배양 후, 상청액을 수집하고, 후속으로 플레이트 판독기상에서 비흡광도에 의해 정량화되는 효소적 반응을 통해 세포 사멸과 상관 관계가 있는 LDH 수준을 측정하였다. 추가적으로, 암세포 수는 Trypan Blue 배제에 의해 사멸 세포에 대비한 생 세포를 계수하고 아넥신-V 및 프로피듐 아이오다이드 염색을 사용한 유세포분석 측정에 의해 아폽토시스/사멸 세포에 대비한 생 세포를 계수함으로써 사정하였다.
T 세포 및 난소암 세포 공동-배양 시스템 상에서 면역요법-발현 MSC의 영향. 테스트는 면역요법-발현 MSC가 면역 세포, 예컨대, T 세포를 자극하여 생체 외에서 난소암 세포에 대한 개선된 항-암 활성을 가질 수 있는지 여부를 결정하였다. 구체적으로, mMSC-mIT 후보는 마우스 비장세포 및 ID8 암 세포주와 공동-배양되거나, hMSC-hIT 후보는 인간 PBMC 및 OVCAR8 또는 SKOV3 세포주와 공동-배양된다. 공동-배양 검정은 MSC 유무에 관계없이 난소암 세포와 함께 PBMC/비장세포를 사용하고, 항-CD3/28 비드를 사용한 자극을 수반한다. 암세포 사멸을 사정하기 위해, 기술, 예컨대, LDH 세포독성 측정, 염료-표지된 난소암 세포를 고정된 비율로 비-표지된 이펙터 PBMC/비장세포와 조합하는 것 및 유세포분석법에 의한 사멸을 검정하는 것 (Jedema I, 등 (2004) Blood 103(7):2677-2682), 및 프로피듐 아이오다이드와 함께 아넥신-V를 사용한 유세포분석법에 의한 아폽토시스 판독을 사용하여 16 시간 사멸 검정을 수행하였다. T 세포 활성화/증식은 구체적으로 3-5 일에 CFSE 세포 분열 및 1-3 일에 IFN-감마의 사이토카인 생산에 의한 검정이다.
CTLA-4 및 PD1을 발현하는 T 세포를 생성하는 대안적인 전략은 세포 표면 수용체 PD1 및 CTLA4를 발현시키기 위해 파이토해마글루티닌 (PHA)으로 활성화시키는 것이다. 3 일차에, 활성화된 T 세포의 ~99 %가 PD1을 발현해야 하는 반면, 이들 중 ~15 %는 CTLA4를 발현해야 한다 (Pardoll DM (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-264; Legat A, 등 (2013) Front Immunol 4:455). 10 일차에, 활성화된 T 세포는 CTLA4 발현이 하향조절되지만 PD1 발현이 유지되는 이펙터 상에 있어야 한다. 이러한 항체의 직접적인 세포-표면-수용체 결합을 평가하였다. 유도-3 일차 및 10 일차 후에, 각자의 체크포인트 억제제 항체 발현 작제물을 갖는 MSC를 T 세포 배양물에 적용하였다. 표지된 검출 항체를 유세포분석법과 함께 사용하여 결합을 확인하였다. 상업적 항체를 대조군으로서 사용하였다.
실시예 2
이 실시예는 동계 난소암 모델에서 면역요법 페이로드를 발현하는 MSC의 생체 내 특성화를 설명한다. 면역요법-발현 MSC의 항-종양 효능을 난소암의 동계 마우스 모델 (마우스 면역계를 갖는 mMSC-mIT)을 사용하여 특성화하였다. 동계 난소 마우스 모델에서 조작된 MSC의 종양 호밍 및 개별 및 병용 면역요법의 발현을 측정하였다. 조작된 MSC 처리를 한 난소 종양 부담 및 마우스 생존을 또한 측정하였다. 이 실시예는 TME에 대한 조작된 MSC의 선택적인 호밍 및 다른 신체 부위에 대비하여 난소 종양에서 면역요법 인자의 국소화된 생산을 입증해야 한다. 이 실시예는 또한 면역요법-발현 조작된 MSC를 사용하여 종양 부담에서의 유의한 감소 및 마우스 생존의 연장을 입증해야 한다.
방법: 마우스 난소 상피 표면 세포 (MOSE)의 자발적인 형질전환으로부터 기인된 마우스 ID8 세포주를 사용하여 동계 난소 종양 모델을 생성하였다 (Roby KF, 등 (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591). ID8 세포주의 유도체를 또한 사용하였다 (예컨대, ID8-VEGF (ID8-Defb29/Vegf-a), ID8-P53DN, ID8-P53KO- PTEN KO, ID8-P53KO- BRCA2 KO, ID8-P53KO-BRCA1 KO, ID8-PD53KO-Nf1KO). ID8 세포주는 레닐라 루시퍼라제 (rLuc)를 발현하는 렌티바이러스로 감염되어 반딧불이 루시퍼라제 (ffLuc)를 발현하는 MSC에 직교하는 생체 내 생물발광 이미징을 허용한다. 성공적인 rLuc 발현을 마우스에서 동계 난소암 모델을 확립하기 전에 생체 외 ID8에서 확인하였다. 동계 모델의 경우, 5x105 개의 ID8 세포를 6 내지 8 주령 사이의 (36, 54) C57BL/6 마우스의 복막강에 주사하였다. MSC는 ffLuc-발현 플라스미드와 함께 실시예 1에서와 같이 조작된다.
mMSC-mIT 후보를 5 주 동안 매주 1 회 동물 당 106 개의 MSC의 용량으로 25 일차 (종양 세포 주사 후)에 시작하여 동계 마우스 모델에 도입하였다 (Dembinski JL, 등 (2013) Cytotherapy 15(1):20-32). 난소 종양 부하 및 mMSC-mIT 후보를 종결 시점에 따른 조직학적 분석뿐만 아니라, 각자 rLuc 및 ffLuc 생물발광 이미징을 통해 시간 경과에 따라 시각화하였다. 마우스는 고통의 징후, 예컨대, 체중 손실, 주름진 털, 불량한 신체 자세, 복부 팽만 및 황달이 발달하면 안락사시킨다. 마우스의 생존 곡선을 측정하였다. 종양 세포의 원위 전이는 생물발광 이미징 (BLI) 및 안락사시의 부검에 의해 정량화된다. 면역계 프로파일링 및 활성을 요법에 대한 반응의 바이오마커로서 상이한 시점에서 측정하였다.
MSC의 예상된 항-종양 효과의 가변성을 사정하기 위해, 모델을 확립하는 데 사용된 ID8 세포의 용량이 다양하고 (예컨대, 세포 수를 5x106 개로 증가시킴), 사용된 MSC의 용량이 변화되고, 종양 확립 후 MSC가 전달될 때 시간이 조정된다.
mMSC가 마우스 모델에서 난소 종양으로 호밍하는 것이 나타났지만 일부 페이로드가 이러한 호밍 활성을 방해할 가능성이 있다. 이러한 경우에서, 이러한 페이로드의 발현은 유도가능하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이는 플로레틴-유도성 시스템 (Gitzinger M, 등 (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(26):10638-10643)으로 달성될 수 있다. 대안적으로, 이량체화 시스템은 소분자를 사용하여 합성 징크-핑거 DNA-결합 도메인을 트랜스활성화제 도메인과 연결하는 데 사용될 수 있다 (Clackson T, 등 (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10437-10442). 대안적으로 또는 추가적으로, 신호, 예컨대, 낮은 O2에 기반하여 종양 미세환경에서 유발되는 유도성 페이로드 발현 작제물이 작제될 수 있다.
렌티바이러스 ffLuc 작제물은 또한 MSC를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 3
이 실시예는 인간 면역 세포를 갖는 마우스에서 인간 난소암의 이종이식 모델에서 면역요법 페이로드를 발현하는 MSC의 효능의 생체 내 특성화를 설명한다. CD34+ 세포 이식편 (인간화된 면역계를 갖는 hMSC-hIT)을 통해 인간 면역 세포로 생착된 면역결핍 마우스에서 인간 난소암 모델에서의 조작된 MSC의 활성을 테스트하였다. 조작된 MSC의 호밍 및 인간 면역 세포를 갖는 마우스에서 인간 이종이식 난소 종양에서의 개별 및 병용 면역요법의 발현을 측정하였다. 조작된 MSC 처리를 이용한 난소 종양 부담 및 마우스 생존을 또한 테스트하였다. 이 실시예는 조작된 MSC의 상승된 호밍 및 마우스의 다른 신체 부위에 대비하여 인간 이종이식 난소 종양에서 면역요법 인자의 국소화된 생산을 입증해야 한다. 이 실시예는 또한 면역계 조성물에서의 변화와 상관 관계가 있는 면역요법-발현 조작된 MSC를 이용한 종양 부담의 유의한 감소 및 마우스 생존의 연장을 입증해야 한다.
방법. 인간 임상 시험으로의 조작된 MSC의 번역을 가능하게하기 위해, hMSC-hIT 작제물을 인간 암의 인간화된 마우스 모델에서 테스트하였다. 마우스에서 면역요법-발현 hMSC의 영향을 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC)가 생착된 면역-결핍 마우스 (NSG)에서 인간 난소암 세포주의 이종이식편을 사용함으로써 모델링하였다.
인간 난소암 세포의 경우, OVCAR8 및 SKOV3 세포주를 사용하였다. 실시예 3에 기재된 것과 유사한 검정을 사용하여 시간 경과에 따른 종양 부하 및 마우스 생존을 조사하였다.
2 개의 대안적인 접근법이 또한 사용될 수 있다. (1) 인간 T 세포를 마우스에 주입할 수 있다. (2) 인간 PBMC를 마우스에 주입할 수 있다.
발현 벡터: pL+MCS
Figure pct00089
Figure pct00090
실시예 4. 4T1 삼중 음성 유방 암종
다음 실험에서, MSC를 다음 이펙터 분자 중 하나를 발현하도록 조작한 다음, 동소성 유방암 마우스 모델에 단독 또는 조합으로 투여하였다: IFNβ, IFNγ, IL12, IL15, IL36γ, IL7, TRAIL, cGAS, CCL21a, OX40L, CD40L 또는 HACv-PD1. 일부 예에서, 체크포인트 억제제 (항-CD40, 항-PD1 또는 항-CTLA-4 항체)를 조작된 MSC와의 투여와 조합하여 주사하였다.
MSC 호밍
다음 실험은 뮤린 MSC가 유방암의 동소성 마우스 모델에서 종양으로 호밍함을 입증한다. 루시퍼라제-발현 4T1 유방 종양 세포 (5x105 개)를 암컷 BALB/cJ 마우스 마우스의 등쪽 지방 패드 안으로 동소적으로 삽입하였다. 5 일 후, 마우스에 1 백만개의 형광-표지된 (XenoLight DiR (Caliper Life Sciences) 사용) 뮤린 BM-유래된 MSC (BM-MSC, 치료적 세포)를 복막 내로 주사하였다. MSC 주사 후 1 일 및 7 일차에, 형광 분석을 사용하여 Ami HT 살아있는 동물 이미저 (Spectral Instruments)를 사용하여 MSC 국소화를 결정하였다. 7 일차에, Ami HT 이미저를 사용하여 4T1 세포의 루시퍼라제 생물발광 리포터를 통해 종양 국소화 및 크기를 결정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 주사된 MSC는 종양 부위에 공동-국소화되었으며, 이는 이들 세포가 실제로 생체 내에서 4T1 유방 종양 부위에 특이적으로 호밍함을 나타낸다. 주사된 MSC는 1 일 이내에 종양으로 호밍하며 7 일 초과 동안 지속된다. 대조적으로, 주사된 MSC는 정상 마우스에서 종양의 부재 하에 등으로 호밍하지 않는다. 이러한 결과는 MSC가 항-암 분자, 단백질 또는 화합물에 대한 전달 비히클로서 사용될 수 있음을 시사한다.
조작된 인간 MSC가 마우스 종양을 향해 호밍할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, GFP, IL2 또는 CCL21a를 발현하는 조작된 인간 MSC의 상이한 라인을 4T1 종양이 있는 BALB/c 마우스에 주사하였다. 효능은 격일로 캘리퍼 측정으로부터의 종양 부피에 의해 결정하였다. 도 11a-11b는 인간 MSC가 마우스 4T1 종양으로 호밍하지 않음을 도시한다.
생체 내 효능
다음 실험은 유방암의 동소성 모델에서 면역요법 이펙터 (페이로드)를 발현하는 MSC의 생체 내 효능을 입증한다. 4T1-Neo-Fluc 마우스 유방 종양 세포 (Imanis Life Sciences, 5x105 개의 세포)를 암컷 BALB/cJ 마우스 (The Jackson Laboratory)의 등쪽 지방 패드 안으로 동소적으로 삽입하였다. 이어서, 마우스를 종양 삽입 5 일 후에 처리 그룹으로 무작위하였다. 마우스는 2 주 동안 주 1 회 대조군 MSC 성장 배지 또는 상이한 면역요법 이펙터 (페이로드)를 발현하는 조작된 MSC (2x106 개의 세포)의 복막 내 주사를 받았다. 각각의 면역요법은 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 종양 성장을 격일로 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하고, 마우스 중량을 매주 2 회 기록하였다. 제1 MSC 처리 14 일 후에 마우스를 안락사시키고, 추가 분석을 위해 조직을 수집하였다.
도 4는 종양 성장이 배지로 처리된 대조군과 비교하여 조합 유전자 IL-12 및 CCL21a가 발현된 조작된 MSC로 처리된 마우스에서 지연되었음을 도시한다.
도 5a-5c는 단일 면역요법 이펙터 (예컨대, IFN-β, IFN-γ, IL-12 또는 CCL21a)를 발현하는 조작된 MSC가 배지-처리된 마우스와 비교하여 동계 4T1 마우스 종양의 성장을 억제하였음을 도시한다. 놀랍게도, 면역요법 이펙터가 조합될 때, 특히 IL-12와 CCL21a의 조합, IFN-β, IFN-γ, IL-12 및 CCL21a의 조합일 때 종양 성장에 대한 상승작용 효과가 관찰되었다 (도 5a-5c).
도 6a-6b는 OX40L, TRAIL, IL15, cGAS 또는 이들의 조합을 발현하는 조작된 MSC가 종양 성장을 억제하지 않음을 도시한다.
도 7a-7b는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 종양 성장을 억제하나; 항-CD40 항체의 첨가는 종양 성장을 감소시키지 않음을 도시한다.
도 8a-8b는 OX40L, TRAIL, IL15, HACvPD-1 또는 이들의 조합을 발현하는 조작된 MSC가 피하 유방암 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하지 않음을 도시한다.
도 9a-9b는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 종양 성장을 억제하나; CCL21a, IL-36 감마 및 IL-7을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 도시한다. 그러나, 테스트된 이펙터 조합 중 일부는 독성을 야기할 수 있다.
용량 단계적 확대
용량 단계적 확대 연구를 수행하였다. 이 실험은 조작된 MSC 세포 발현 GFP가 독성을 유발하지 않음을 결정하였다 (도 10a-10b).
큰 종양에 대한 영향
이 실험은 IL12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 마우스 MSC가 더 큰 종양 (>800 mm3)으로부터 종양 부담을 감소시킬 수 있는지 여부를 테스트하였다. 더 큰 종양은 작은 종양보다 치료하기가 더 어렵고, 이 실험은 이 이펙터 조합이 종양 확장을 감소시킬 수 있음을 입증한다 (도 12a-12b).
체크포인트 억제제
도 13a는 주사에 의한 체크포인트 억제제 (항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체)의 첨가가 피하 종양 모델에서 효능을 증가시키지 않았지만, IL-12 및 CCL21을 발현하는 조작된 MSC가 종양 성장을 억제하기에 충분함을 도시한다.
실시예 5. CT26 결장직장 암종
다음 실험에서, MSC를 다음 이펙터 분자 중 하나를 발현하도록 조작한 다음, 결장직장 암종 마우스 모델에 단독 또는 조합으로 투여하였다: IFNβ, IL12, IL15, IL36γ, IL7, CCL21a, HACv-PD1 또는 41BB. 일부 예에서, 체크포인트 억제제 (항-CD40 또는 항-CTLA-4 항체)를 조작된 MSC와의 투여와 조합하여 주사하였다.
도 14는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 유의한 종양 성장 지연을 유도하였음을 도시한다.
도 15는 조작된 MSC 세포를 투약하기 위한 최적의 시간을 결정하기 위한 CT26 마우스 모델에서의 종양 성장 동역학을 도시한다.
생체 내 효능
다음 실험은 결장 (결장직장) 암의 피하 마우스 모델에서 면역요법 이펙터 (페이로드)를 발현하는 MSC의 생체 내 효능을 입증한다. CT26-Neo-Fluc 마우스 결장암 세포 (Imanis Life Sciences, 5 x 105 개)를 암컷 BALB/cJ 마우스 (The Jackson Laboratory)의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 삽입 7 일 후, 이어서 마우스를 다음 처리 그룹으로 무작위하였다: 대조군 MSC 성장 배지, 조작된 MSC (MSC-12+CCL21a), 항-CD40 항체, 항-CTLA4 항체 (Bio X 세포), 항-CD40 항체와 조합된 MSC-12+CCL21a 또는 항-CTLA4 항체와 조합된 MSC-12+CCL21a. 조작된 MSC (2x106 개의 세포)를 2 주 동안 주 1 회 (0 일 및 7 일차) 복막 내 (ip) 주사하였다. 항-CD40 항체를 0 일 및 3 일차에 ip (100 μg) 주사하였다. 항-CTLA4 항체를 0, 3 및 7 일차에 ip (100 μg) 주사하였다. 종양 성장을 격일로 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하고, 마우스 중량을 매주 2 회 기록하였다. 제1 MSC 처리 11 일 후에 마우스를 안락사시키고, 종양을 수집하고 칭량하였다. 각각의 처리 그룹에서 개별 마우스의 종양 중량을 측정하고 그 결과를 도 16b의 왼쪽 하단 (왼쪽 그래프)에 도시하였다. 각각의 처리 그룹의 평균량 종양 부피를 시간 경과에 따라 모니터링하였다 (도 16b, 오른쪽 그래프). 처리 그룹 2 (IL-12+CCL21a+항-CTLA4 항체), 4 (IL-12+CCL21a) 및 7 (IL-12+CCL21a+항-CD40 항체)은 GFP-처리된 마우스와 비교하여 CT26 결장 종양의 평균량 성장을 억제하였다 (도 16b, 오른쪽 그래프). 각각의 처리 그룹에서 개별 마우스의 종양 부피를 시간 경과에 따라 측정하였을 때 유사한 결과가 관찰되었다 (도 16a). 따라서, 면역요법을 발현하는 MSC와의 병용 처리는 생체 내에서 결장암 세포의 성장을 억제하였다.
도 18a는 IL-12, CCL21a, 및 IL15 또는 HACvPD-1을 발현하는 조작된 MSC가 모우 모델 결장직장암에서 종양 성장을 유의하게 억제함을 도시한다. 도 18b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 도 18c는 종양 미세환경 내 침윤성 면역 집단의 대표적인 그래프이다. 도 18d는 전체 CD3 집단에서 조절 T 세포 (Treg)의 백분율을 도시한다. 조작된 MSC-IL2 및 CCL21a로 처리된 종양 미세환경에서 Treg의 수의 유의한 저감이 있었다. 도 18e는 면역 침윤의 백분율과 종양 중량의 상관 관계를 나타낸다. 림프구 (CD3+)의 증가가 있는 샘플은 낮은 종양 중량과 상관 관계가 있는 것으로 나타난 반면, 높은 골수성 (CD11b+) 침윤을 갖는 샘플은 더 높은 종양 부담과 상관 관계가 있었다.
장기간 생존
마우스에, 주사된 항-CD40 항체와 병용하여 상이한 농도의 조작된 MSC-IL12 및 CCL21a 요법을 2 회 투약하였다. 제2 용량 후, 종양 부담이 1500 mm3를 초과할 때까지 종양 부피를 주 2 회 모니터링하고, 마우스를 희생시켰다. 도 17a는 개별 그룹의 종양 부피를 도시한다. 도 17b, 왼쪽 그래프는 시간 경과에 따른 개별 그룹으로부터의 마우스 중량 및 종양 부피를 추적한다. 도 17b, 오른쪽 그래프는 상이한 그룹의 생존 플롯을 도시한다.
MSC 효능
도 20a는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 부피를 도시한다. 도 20b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. 효능은 격일로 캘리퍼 측정으로부터의 종양 부피에 의해 결정되었다.
종양 성장 동역학
도 21a-21b는 복막 내 공간에서의 CT26-LUC (루시퍼라제) 종양 성장의 동역학을 도시한다. CT26 세포주를 0 일차에 주사하고 3 마리 (3)의 마우스를 7 일차, 10 일차, 14 일차 및 18 일차에 수확하여 종양 성장의 동역학을 결정하였다. 도 21a의 제1 행은 종양 부담을 모니터링하기 위해 IVIS 이미저로 마우스 체중 및 ROI를 측정하였다. 제2 행은 각각의 그룹에서 개별 마우스 종양의 종양 중량 및 ROI를 모니터링하였다. 제3 행은 종양 중량과 전신 ROI 또는 종양 ROI의 상관 관계를 나타낸다. 도 21b는 종양 미세환경을 보다 잘 이해하기 위해 18 일차 그룹에서 3 마리 (3)의 마우스의 면역 프로파일을 도시한다.
종양 침윤 통계/면역 백분율/종양 중량
피하 마우스 모델
도 22a는 IL-12 및 CCL21a를 발현하는 조작된 MSC가 결장직장암의 피하 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; CCL21a 및 IL-36 감마 또는 IL-7을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 23a-23b는 종양 면역 침윤 통계를 포함한다. PBS, 나이브 MSC 및 MSC-IL12+MSC-CCL21a (콤보) 그룹으로부터 3 마리의 마우스를 선택하여 면역 프로파일 종양 미세환경에 대한 유세포분석법을 실행하였다. 도 23a는 나이브 MSC를 투약한 그룹과 비교하여 콤보 그룹에서 침윤성 CD3 및 CD8 세포독성 T 집단의 유의한 증가를 도시한다. 도 23b는 나이브 MSC로 처리된 그룹과 비교하여 콤보 그룹에서 과립구 골수-유래된 억압인자 세포 (gMDSC) 및 대식세포 집단의 유의한 감소를 도시한다.
도 24a-24b는 면역 백분율 및 종양 중량와 관련된 데이터를 포함하며, 이는 더 많은 CD3+ 및 CD8+ T 세포를 갖는 샘플 (왼쪽 상단 및 중앙 그래프)이 종양 중량의 저감과 강하게 상관 관계가 있음을 도시한다. 이들 도면은 또한 대식세포, 수지상 세포 및 MDSC를 포함하는 더 적은 CD11b 골수성 세포를 갖는 샘플이 더 낮은 종양 부담을 나타냄을 도시한다 (도 24a의 하부 중앙 및 오른쪽 그래프 및 도 24b의 상부 행).
동소성 마우스 모델
도 26a는 IL-12 및 CCL21a, 또는 CCL21a 및 IFN-β을 발현하는 조작된 MSC가 결장직장암의 동소성 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하나; CCL21a 및 s41BBL을 발현하는 MSC의 조합은 종양 성장을 감소시키지 않음을 도시한다. 각각의 이펙터는 상이한 MSC에 의해 발현되었으며, MSC는 병용 처리를 위해 (1:1 비율로) 조합되었다. 각각의 차트는 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장에 대한 표시된 면역요법을 단독으로 또는 조합하여 발현하는 조작된 MSC의 영향을 도시한다 (n = 6-8). 도 26a의 각각의 라인은 개별 마우스를 나타낸다. 도 26b는 각각의 처리에서 개별 마우스에 대한 종양 중량을 도시한다. MSC-IL12 + MSC-CCL21a는 나이브 MSC를 주사한 마우스와 비교하여 최상의 효능을 도시한다. 처리 효능는 또한 MSC-IFNb + MSC-CCL21a로 처리한 그룹에서 관찰되었다.
도 27a-27b는 표시된 조작된 MSC로 처리된 각각의 그룹의 면역 프로파일을 도시하는 그래프이다. MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리한 후 대식세포 집단에서의 일관된 저감이 관찰되었다 (도 27a). 나이브 MSC에 대하여 MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리된 그룹과 비교할 때 CD3+ 집단에서 증가된 침윤 및 CD11b+ 집단에서 저감된 침윤의 일반적인 경향이 또한 관찰되었다 (도 27a 및 도 27b).
도 28a-28b는 면역 침윤과 종양 중량의 상관 관계를 도시한다. 낮은 대식세포 및 수지상 세포를 갖는 샘플은 더 낮은 종양 부담을 갖는다 (도 28b, 상단 중앙 및 상단 오른쪽). 도 28c는 각각의 그룹으로부터의 평균량 종양 중량을 도시한다. 통계적 유의성이 나이브 MSC와 비교하여 MSC-IL12 + MSC-CCL21a, 또는 MSC-IFNb + MSC-CCL21a 둘 모두에서 관찰되었다.
도 29는 상기 결장직장암 모델로부터의 생체 내 데이터를 조합한 그래프를 도시한다 (도 22a 및 도 26a). 도 22a 및 도 26a로부터의 조합된 CT26 데이터는 다음의 3 개의 그룹을 캡처한다: 종양만 (PBS), 나이브 MSC로 처리됨, MSC-IL12 + MSC-CCL21a로 처리됨.
도 30a-30c는 또한 도 22a 및 도 26a로부터의 조합된 데이터를 도시한다. 그래프는 유세포분석법 실험 데이터로부터의 면역 침윤의 평균량 수를 도시한다. 통계적 유의성이 도 30a로부터 CD8+ T에서 관찰되며, 이는 종양 미세환경을 재분극시키고 더 많은 세포독성 T 세포 침윤을 허용하는 MSC-IL12 + MSC-CCL21a의 능력을 입증한다. 더욱이, MSC-IL12 + MSC-CCL21a에 의해 처리된 그룹에서 CD11b+ 골수성 집단 침윤에서의 감소가 있었다 (도 30b). 수지상 세포 및 대식세포 집단을 사용하여 수집된 데이터는 통계적 유의성이였다.
결장직장암의 복막 내 및 피하 마우스 모델에서의 IL12 및 CCL21a 요법
도 25a-25b는 복막 내 및 피하 결장직장암 마우스 모델에서 MSC-IL-12+CCL21a 요법으로부터의 데이터를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입된 라인의 3 개의 상이한 로트를 MSC-IL12 및 CCL21a에 대해 테스트하였다 (TLOO8-3/4, TL019-01/02 및 TL022-01/02; 각각의 TL 번호는 하나의 로트를 나타냄). 도 25a는 MSC-IL12 + MSC-CCL21a의 3 개의 로트 모두가 피하 및 복막 내 모델 둘 모두에서 종양 부담을 감소시킬 수 있음을 도시한다 (처음 5 개의 그래프는 SC 모델로부터의 것이고, 마지막 3 개는 IP 모델로부터의 것임). 모든 마우스로부터의 종양을 11 일차에 수집하였다. 도 25b는 각각의 그룹으로부터의 평균량 종양 중량을 도시한다.
실시예 6. MSC 병용 사이토카인 요법 방법
표시된 바와 같이, 다음 방법을 실험에 사용하였다.
방법:
MSC 배양
골수 유래된 C57BL/6 및 Balb/C 뮤린 MSC (mMSC)는 Cyagen (각자 Cat. No. MUBMX-01001 및 MUCMX-01001)으로부터 구입하였다. mMSC 배양 배지를 다음으로 구성하였다: MEM Corning Cat # 10-022-CV (500 ml) + MSC FBS Gibco Cat #12662-029 (최종 농도 10%) + L-Glut (200 mM) 줄기 세포 07100 (최종 농도 2 mM) + PenStrep 100X VWR Cat # 97063-708 (최종 농도 1X) + 뮤린 FGF Peprotech Cat# 450-33-100uG (최종 농도-1:10,000 희석). TrypLE Express를 구입하였다 (ThermoFisher - #12604021). PBS는 마그네슘, 칼슘 또는 페놀 레드를 함유하지 않는다.
mMSC를 하기 프로토콜에 따라 계대배양하였다:
1. mMSC는 70-90 % 밀집도(confluency)에서 계대배양해야 한다.
2. 접시/플라스크로부터 배지를 흡인한다.
3. PBS로 플레이트를 헹군다 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 2 mL, 15 cm 접시의 경우 3 ml).
4. TrypLE Express를 첨가한다 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 2 mL, 15 cm 접시의 경우 3 ml)
5. 37 도에서 3-4 분 동안 항온처리한다.
6. 측면의 플레이트를 두드려 세포를 이탈시킨다. 현미경으로 대부분의 세포가 이탈되었는지 확인한다.
7. 배지 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 8 mL)를 사용하여 플레이트에서 세포를 세척 제거한다.
8. 세포를 15 개의 원추형에 놓고 5 분 동안 400Xg로 원심분리한다.
9. 배지를 흡인한다.
10. 적절한 배지에서 세포를 재현탁시키고 세포를 신선한 플레이트/플라스크에 플레이팅한다. 참고: 70 % 밀집된 세포는 1:3으로 분할될 수 있다. 90 % 밀집된 세포는 1:4로 분할될 수 있다. 대안적으로, 세포는 3000-5000 개의 세포/cm2로 플레이팅될 수 있다.
골수 유래된 인간 MSC를 구입하였다 (RoosterBank-hBM-1M-XF, RoosterBio). 다양한 hMSC 배양 배지를 구입하였다: Xeno-free hMSC 배지- (RoosterBio - #KT-016); +FBS (혈청-함유) hMSC 배지 (Lonza - MSCGM 배지 - #PT-3001). TrypLE Express를 구입하였다 (ThermoFisher - #12604021). PBS는 마그네슘, 칼슘 또는 페놀 레드를 함유하지 않는다.
hMSC를 하기 예시적인 프로토콜에 따라 계대배양하였다:
1. hMSC는 70-90 % 밀집도에서 계대배양해야 한다.
2. 접시/플라스크로부터 배지를 흡인한다.
3. PBS로 플레이트를 헹군다 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 2 mL).
4. TrypLE Express를 첨가한다 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 2 mL)
5. 37 도에서 3-4 분 또는 RT에서 5 분 동안 항온처리한다.
6. 측면의 플레이트를 두드려 세포를 이탈시킨다. 현미경으로 대부분의 세포가 이탈되었는지 확인한다.
7. Lonza MSCGM 배지 (예컨대, 10 cm 접시의 경우 8 mL)를 사용하여 플레이트에서 세포를 세척 제거한다.
8. 세포를 15 개의 원추형에 놓고 5 분 동안 400Xg로 원심분리한다.
9. 배지를 흡인한다.
10. Rooster xeno-free 배지에서 세포를 재현탁시키고 세포를 신선한 플레이트/플라스크에 플레이팅한다. 참고: 70 % 밀집된 세포는 1:3으로 분할될 수 있다. 90 % 밀집된 세포는 1:4로 분할될 수 있다. 대안적으로, 세포는 3000-5000 개의 세포/cm2로 플레이팅될 수 있다.
hMSC를 하기 예시적인 프로토콜에 따라 해동하였다:
1. hMSC 배지를 37°로 미리-가온한다.
2. 액체 질소로부터 hMSC 분취량을 제거한다.
3. 냉동 샘플의 2/3가 해동될 때까지 튜브 1/2을 37 ° 수조에 60-90 초 동안 담근 상태로 유지함으로써 해동한다.
4. 70 % 에탄올로 튜브를 닦아 튜브를 멸균한다.
5. cryotube에 0.5 mL 배지를 첨가하고, 2-3 회 부드럽게 피펫팅한 다음, 15 mL 원추형 튜브 중의 9 mL 배지 (총 10 mL)로 세포를 전이시킨다.
6. 5 분 동안 400Xg로 원심분리한다.
7. 배지를 흡인한 다음, 적절한 부피의 Rooster xeno-free 배지에서 펠릿을 부드럽게 재현탁시킨다. 세포를 3000-5000 개의 세포/cm2의 농도로 플레이팅한다.
렌티바이러스 생산
렌티바이러스는 다음을 사용하여 생산하였다: Lenti-X 293T 패키징 세포주 (Clontech, Cat# 632180); 항생제가 없는, LX293T 완전 성장 배지; DMEM, hi-글루코스; 1 mM 소듐 피루베이트; 10 % FBS, 열-불활성화됨; Opti-Mem I 감소된 혈청 배지 (Gibco/Thermo Fisher; Cat# 31985); FuGene HD (Promega, Cat#E2311); 외피, 패키징 및 전이 벡터 플라스미드; VSV-G-슈도형 외피 벡터 (pMD2.G); 2 세대 및 3 세대 전이 벡터와 함께 사용될 수 있는 Gag, Pol, Rev 및 Tat를 함유하는 패키징 벡터 (psMAX2). 90 % 밀집된 10 cm 접시로부터의 293T (FT) 세포를 들어내고 형질주입 전날 오후 늦게 1:3 희석으로 분배하고 37 ℃, 5 % CO2에서 밤새 정상의 세포를 항온처리하였다 (형질주입시 다음날 세포는 60-85 % 밀집되어야 함).
형질주입 반응을 하기 프로토콜에 따라 각각의 10 cm 접시에 대해 준비하였다:
1. 별개의 1.7 mL 튜브에서 각각의 10 cm 접시에 대한 형질주입 반응을 준비한다.
2. RT에서 900 uL Opti-Mem I를 첨가한다.
3. 반응당 9 ug 벡터 백본 (관심 유전자를 함유함)을 첨가한다.
4. 반응당 8 ug 패키징 벡터를 첨가한다.
5. 반응당 1 ug 외피 벡터 (pMD2.G)를 첨가한다.
6. 3 초 동안 빠르게 볼텍싱함으로써 철저히 혼합한다.
7. 반응당 55 uL Fugene HD를 첨가한다.
8. 위아래로 20-30 회 빠르게 피펫팅함으로써 혼합한다.
9. 10 분 동안 RT에서 그대로 둔다 (DNA 복합체가 형성되는 것을 허용함).
10. 접시 주변에 혼합물을 적가 방식으로 천천히 첨가한 다음, 5-10 초 동안 앞-뒤로 및 위-아래로 부드럽게 락킹함으로써 혼합한다 (스윌하지 않는다).
11. 접시를 바이러스 항온처리기에 놓는다.
바이러스 상청액을 혈청학적 피펫을 사용하여 2 일 및 3 일차에 수확하였다. Millipore steriflip 0.45 um 필터를 사용하여 세포 파편을 제거하였다. Lenti-X 농축기 (Cat. Nos. 631231 & 631232)를 다음 프로토콜에 따라 사용하였다: 1) 1 부피의 Lenti-X 농축기와 3 부피의 정화된 상청액을 조합한다. 부드러운 반전으로 혼합한다; 2) 혼합물을 얼음 또는 4 ℃에서 30 분 동안 밤새 항온처리한다; (3) 샘플을 4 ℃에서 45 분 동안 1,500 x g에서 원심분리한다; (4) 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상청액을 조심스럽게 제거하고 폐기한다; (5) 멸균 PBS + 0.1 % BSA를 사용하여 펠릿을 원래 부피의 1/10 내지 1/100로 부드럽게 재현탁시킨다.
벡터
사이토카인 발현 카세트를 pL17D로 클로닝하였으며, 이의 벡터 맵은 주석이 달린 다음의 핵심적인 특징과 함께 도 31에 도시된다; 예컨대, SFFV 프로모터; FLAG 및 MYC 에피토프 태그; LTR 등.
렌티바이러스 형질도입
뮤린 MSC를 6-웰 플레이트에 씨딩하고 세포가 50 % 밀집될 때 감염시켰다. 적절한 MOI에 바이러스를 첨가하고 세포를 형질도입하기 위해 3 시간 동안 항온처리하였다. 감염 후, 신선한 배지를 세포에 첨가하였다.
인간 MSC를 하기 예시적인 프로토콜에 따라 형질도입시켰다:
1. 200,000 개의 인간 MSC를 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 2 mL xeno-free 인간 MSC 배지에 플레이팅하였다.
2. 2 시간 후에, 배지를 제거하고 1 mL의 PBS로 대체하였다.
3. 하기 MOI에 의해 표시된 바와 같이 적절한 양의 바이러스를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 37 도 및 5 % CO2에서 가끔씩 락킹하면서 3 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리하였다.
4. 3 시간 후에 바이러스를 제거하고, 플레이트를 배지로 세척한 다음, 세포가 노쇠에 도달할 때까지 MSC를 정상적으로 (상기 언급한 바와 같이) 배양하였다. 총 세포 수를 결정할 수 있도록 각각의 계대배양에서 세포를 카운팅하였다.
실시예 7: MSC 병용 사이토카인 요법 (CT26)
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 다양한 사이토카인을 발현하도록 조작하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 단일 약제 또는 mMSC의 조합으로서 이펙터 분자를 발현하는 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개)로 처리하여 약제의 조합을 전달하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 종양 부담을 12 일 및 17 일차에 사정하였다. 생물발광 신호 (광자/초)를 초기 신호 (전-처리)에 비례하여 각각의 개별 마우스에 대해 정규화하였다. BLI 신호의 100 배 초과 감소 (0.01)는 완전한 치유와 동등하다 (부검시 종양이 분명하지 않음). 도 32에 도시된 바와 같이, 상이한 이펙터 분자를 단독으로 또는 조합하여 발현하도록 조작된 MSC는 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 CT26 종양 부담을 감소시키는 효능을 입증하였다.
실시예 8: MSC 병용 사이토카인 요법 (B16F10)
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 다양한 사이토카인을 발현하도록 조작하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 단일 약제 또는 mMSC의 조합으로서 이펙터 분자를 발현하는 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개)로 처리하여 약제의 조합을 전달하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 종양 부담을 12 일 및 17 일차에 사정하였다. 생물발광 신호 (광자/초)를 초기 신호 (전-처리)에 비례하여 각각의 개별 마우스에 대해 정규화하였다. BLI 신호의 100 배 초과 감소 (0.01)는 완전한 치유와 동등하다 (부검시 종양이 분명하지 않음). 도 33에 도시된 바와 같이, 상이한 이펙터 분자를 단독으로 또는 조합하여 발현하도록 조작된 MSC는 BLI 수준에 의해 사정된 바와 같이 IP 종양 모델에서 B16F10 종양 부담을 감소시키는 효능을 입증하였다.
실시예 9: 조작된 인간 MSC 사이토카인 생산
다음 실시예에서, 골수 유래된 hMSC (3 명의 인간 지원자 건강한 공여자로부터 유래됨)를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 인간 IL12 (p70) 및 인간 CCL21a를 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터 (도 34에 도시된 도식적 벡터 맵)는 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다.
도 35에 도시된 바와 같이, 조작된 hMSC는 사이토카인 ELISA에 의해 사정된 바와 같이, hIL12 (도 35a) 및 hCCL21a (도 35b) 둘 모두를 생산할 수 있었다. 특히, 단백질 분비는 MSC의 형질도입 중에 사용된 바이러스 입자의 양 (MOI)과 상관 관계가 있었다.
실시예 10: 조작된 인간 MSC 기능 사정
다음 실시예에서, 골수 유래된 hMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 인간 IL12 (p70)를 발현하도록 조작하였다. 조작된 hMSC를 건강한 혈액 공여자로부터 단리된 인간 T-세포와 함께 0.4 μm 트랜스웰 인서트로 공동-배양하였다 (트랜스웰 검정의 도식적 표현은 도 36a에 도시됨). 활성화된 나이브 T-세포에서 IL12 유도된 Th1 분극화를 사정하기 위해, T-세포에 의한 IFNγ 생산은 하부 구획으로부터 수집된 상청액 (T-세포)에서 ELISA에 의해 측정하였다. 도 36b에 도시된 바와 같이, IFNγ 생산을 IL12p70을 발현하는 hMSC와 CD3 T-세포를 공동-배양함으로써 MOI 용량-의존적 방식으로 증가시켰다.
실시예 11: MSC는 IP 모델에서 종양으로 호밍한다
다음 실시예에서, fLUC를 발현하는 balb/c MSC (2x106 개의 세포)는 CT-26 IP 종양-보유 마우스에 IP 주사하였다. 마우스를 안락사시키고 조직을 주사 24 시간 후에 수집하였다. 도 37에 도시된 바와 같이, fLUC-MSC는 생물발광 이미징 (도 37a에 도시된 이미지, 도 37b에서의 이미지의 정량화), 정량적 실시간 PCR (도 37c) 및 반딧불이 루시퍼라제에 대한 형광 현미경검사 (도 37d)에 의해 검출된 바와 같이 종양에서 유의하게 풍부하였다.
추가적으로, C57Bl/6 마우스에 5x104 개의 B16F10-fLUC 세포를 IP 삽입하였다. 종양 삽입 7 일 후, Nanoluc-EGFP를 발현하도록 조작된 1 x106 개의 C57Bl/6 뮤린 BM-MSC에 IP 주사하였다. MSC의 주사 24 시간 후에 마우스를 안락사시키고 복막 장기 (위, 신장, 간, 결장, 비장, 췌장, 장막/종양, 난소 및 나팔관)를 nanoluc 신호전달에 대해 엑스-비보 이미징하였다 (NanoGlo Substrate Kit ,Vendor:　Promega,　Catalog No.:　N1110). 도 37e에 도시된 바와 같이, 뮤린 MSC nanoluc 신호는 B16F10 종양 모델에서 복막강의 다른 장기와 비교하여 종양에서 우선적으로 풍부하였다.
실시예 12: IL12 생산 MSC는 IP 모델에서의 CT26 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70을 발현하도록 조작하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 IL12p70을 발현하는 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 38에 도시된 바와 같이, IL12p70 발현 MSC는 CT26 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래한다.
실시예 13: IL12 생산 MSC는 IP 모델에서 B16F10 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70을 발현하도록 조작하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 IL12p70을 발현하는 복막 내 전달된 mMSC 1x106 개로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 39에 도시된 바와 같이, IL12p70 발현 MSC는 B16F10 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래한다.
실시예 14: IL12 및 CCL21a를 생산하는 MSC는 CT26 IP 종양 모델에서의 종양 부담을 감소시키고 생존을 연장한다
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 CCL21a를 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현시키기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (1x106 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 동일한 MSC ("MSC-IL-12p70_2A_CCL21a")에 의해 IL12p70 및 CCL21a를 발현하는 복막 내 전달된 mMSC 1x106 개로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 40에 도시된 바와 같이, IL12p70/CCL21a 발현 MSC는 CT26 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소 (상단 패널 및 하단 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 검출가능한 복막 내 종양의 완전한 제거 (하단 오른쪽 패널)를 초래한다. 도 40a는 PBS 처리된 (원), MSC-Flag-Myc ("나이브 MSC" 사각형) 및 IL12p70/CCL21a 발현 MSC (삼각형)에 대해 BLI에 의해 사정된 바와 같이 평균 종양 부담을 입증한다. 도 40b는 PBS 처리된, MSC-Flag-Myc ("나이브 MSC") 및 IL12p70/CCL21a 발현 MSC (각자 왼쪽, 중간 및 오른쪽 패널)에 대해 BLI에 의해 사정된 바와 같이 개별 마우스의 종양 부담을 입증한다. 특히, 도 40c에 도시된 바와 같이, IL12p70/CCL21a 발현 MSC를 사용한 처리는 연장된 생존 (90 일 초과의 100 % 생존)을 초래한 반면, 대조군 처리된 마우스는 모두 사멸하였거나 20 일차에 안락사시켰다.
실시예 15: IL12 및 IL21을 생산하는 MSC는 B16F10 IP 종양 모델에서의 종양 부담을 감소시키고 생존을 연장한다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12 (p70) 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 IL21을 발현하는 mMSC (1x106 개의 세포) 또는 IL12p70을 단독으로 발현하는 mMSC (1x106 개의 세포)와 조합하여 IL12p70을 발현하는 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 41에 도시된 바와 같이, IL12p70 발현 MSC를 사용한 처리는 대조군 처리된 마우스에 비해 연장된 생존을 초래하였지만 모든 마우스는 여전히 모두 사멸하였거나 50 일차까지 안락사시켰다. 대조적으로, IL21 발현 MSC와 조합된 IL12p70 발현 MSC를 사용한 처리는 IL12p70 발현 MSC를 사용한 처리에 비해 연장된 생존을 초래하였다 (60 일 경과후 60 % 생존). 따라서, MSC에 의한 IL21 발현은 IL12p70 발현 MSC의 효능을 향상시켰다.
실시예 16: IL12 및 CCL21a를 생산하는 동종이계 MSC는 CT26 IP 종양 모델에서의 종양 부담을 감소시키고 생존을 연장한다
다음 실시예에서, balb/c mMSC (동계) 및 C57BL/6 mMSC (동종이계)를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 CCL21a를 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다.
루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (1x106 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 동일한 MSC ("MSC-IL12+CCL21")에 의해 IL12p70 및 CCL21a를 발현하는 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. balb/c 대조군 mMSC (동계) 및 C57BL/6 대조군 mMSC (동종이계) 둘 모두를 MSC-Flag-Myc ("나이브")를 발현하도록 조작하였다. PBS는 또한 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, IL12p70/CCL21a를 발현하는 동계 및 동종이계 MSC 둘 모두는 CT26 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소를 초래한 반면, 대조군 처리는 그렇지 않았다. 추가적으로, 이전에 동계 및 동종이계 모델 둘 모두에서 IL12p70 및 CCL21a를 발현하는 mMSC로 처리되고 90 일 동안 무종양인 것으로 결정된 마우스는 도 2a에 도식화된 바와 같이, 후속적으로 허벅지에 피하 삽입된 CT26 종양 세포 (100 μl PBS 중의 0.5x106 개의 세포)로 재시험되었다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 무종양 마우스는 종양이 확립된 나이브 대조군 마우스와 대조적으로 종양 삽입을 거부하였다. 따라서, IL12p70/CCL21a를 발현하는 MSC를 사용한 처리는 면역학적 기억뿐만 아니라 연장된 종양 부담 감소를 초래한다.
실시예 17: IL12 및 CCL21a를 생산하는 MSC는 변형되지 않은 세포에 비해 향상된 성장을 나타낸다
다음 실시예에서, 3 명의 상이한 공여자로부터의 인간 MSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 인간 IL-12 및 인간 CCL21a를 발현하고 분비하도록 상이한 감염 다중도 (MOI)로 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다.
도 42에 도시된 바와 같이, 유전적으로 조작된 MSC (MOI = 95000, 9500 또는 950)는 테스트된 3 명의 공여자 (도 42a, 공여자 1; 도 42b, 공여자 2; 도 42c, 공여자 3)에서 비-유전적으로 조작된 인간 MSC (MOI = 0)와 비교하여 향상된 세포 확장 및 성장을 나타냈다. GFP를 발현하기 위해 렌티바이러스를 이용하여 유전적으로 조작된 인간 MSC는 유사한 향상된 세포 확장 또는 성장 표현형을 나타내지 않았다 (데이터를 도시하지 않음).
실시예 18: 인간 골수 MSC (BM-MSC)에서 지속된 단백질 발현을 위한 프로모터의 선택
다음 실시예에서, 인간 MSC에서 리포터 EGFP 작제물의 발현을 구동하기 위해 다양한 프로모터를 테스트하였다. 테스트된 프로모터는 CMV, SFFV, EF1a, EF1a-LTR, EFS, MND, PGK, UbC였다 (표 4 참고). 실시예에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 동등한 MOI (감염의 다중도)를 사용하여 세포를 형질도입하였다. EGFP 백분율 및 중앙값 형광 세기 (MFI)는 유세포분석법을 사용하여 연속 계대배양을 통해 정량화하였다.
도 43에 도시된 바와 같이, 2 명의 상이한 공여자로부터의 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주 (각자 상단 및 하단 행)를 조작하였고 조작된 세포의 GFP 백분율 (왼쪽 패널) 및 MFI (오른쪽 패널)를 형질도입 후 25 일차에 사정하였다. SFFV 프로모터는 GFP 백분율 및 MFI 둘 모두에 의해 세포주 둘 모두에서 GFP 발현을 입증하였다.
도 44에 도시된 바와 같이, EGFP MFI를 개별적으로 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주 (왼쪽 패널) 또는 조합된 2 개의 독립적인 인간 BM-MSC 세포주로부터의 데이터 (오른쪽 패널)를 이용하여 시간 경과에 따라 (형질도입-7 일차 내지 28 일차 후) 추적하였다. 단백질 발현은 28 일 초과 동안 시간 경과에 따라 안정적이었다. 추가적으로, EF1a 프로모터와 비교하여, SFFV 프로모터는 MFI로 정량화된 바와 같이 거의 10-배 더 많은 단백질 발현을 일관되게 구동하였다.
실시예 19: 인간 MSC를 조작하여 IL12 및 IL21을 생산한다
다음 실시예에서, 인간 골수 MSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 다양한 작제물로부터 IL12p70 및 IL21을 발현하도록 안정적으로 형질도입시켰다. 세포를 형질도입-3 내지 4 계대배양 후 동안 확장시키고 0.2x106 개의 세포를 배지의 4 mL 중의 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 제어된 배지를 24 시간 후에 수집하고 ELISA를 수행하여 생산된 IL-12 및 IL-21 농도를 결정하였다.
다양한 작제물을 프로모터 - 신호 서열 1 - 사이토카인 1 - 2A 링커 - 신호 서열 2 - 사이토카인 2의 상이한 조합 및/또는 배열로 테스트하였다. 테스트된 조합은 하기 표 7에 기재되어 있다. 작제물 SB00880의 구체적인 세부사항은 하기 표 8에 나타나 있다.
표 7 - IL-12 및 IL-21 발현 작제물
Figure pct00091
표 8 - SB00880 발현 작제물 서열
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
조작된 MSC에 의한 IL-12p70 및 IL-21의 분비는 ELISA에 의해 사정된 바와 같이 각자 도 45 및 도 46에 도시된다. SB00880은 테스트된 대부분의 작제물보다 더 높은 수준에서 조작된 MSC에 의한 사이토카인 둘 모두의 발현을 입증하였다. 추가적으로, IL-21에 대한 IL-12의 비율은 ELISA에 의해 사정된 바와 같이 결정되었고 도 47에 도시된다. SB00880을 사용하여 조작된 MSC는 IL-21에 비해 IL-12p70의 10 배 더 높은 비율을 나타냈다. 특히, 10:1의 비율은 전-임상 효능을 입증하였다 (데이터는 도시되지 않음).
조작된 MSC에 의한 IL-12p70의 발현을 입증하는 기능적 검정을 수행하였다. IL12p70이 이의 수용체에 결합하고 JAK-STAT4 경로를 통해 신호전달을 보고하는 STAT4-SEAP 리포터가 있는 HEK-293T 세포를 사용하여 조작된 hMSC에 의해 생산된 IL12p70의 효력 및 활성을 결정하였다. 조작된 MSC를 24 시간 동안 배양하고 배지를 수집하고 HEK-293T STAT4-SEAP 리포터 세포와 함께 항온처리하였다. SEAP 생산은 분광광도계로 결정하였다. 도 48에 도시된 바와 같이, IL-12를 코딩하는 모든 작제물은 기능적 IL12p70 신호전달을 나타내는 리포터 활성을 나타냈다.
조작된 MSC에 의한 IL-21의 발현을 입증하는 기능적 검정을 수행하였다. NK-92 인간 자연 살해 세포를 사용하여 조작된 hMSC에 의해 생산된 IL-21의 기능을 결정하였다. 조작된 hMSC를 24 시간 동안 배양하고 제어된 배지를 수집하고 IL-2가 결핍된 NK-92 세포를 처리하는 데 사용하였다. IL-21 활성에 대한 판독값으로서 포스포-STAT1 및 포스포-STAT3 활성화를 정량화하기 위해 세포 내 포스포-플로우를 수행하였다. 도 49에 도시된 바와 같이, IL-21을 코딩하는 모든 작제물은 기능적 IL-21 신호전달을 나타내는 STAT1 (왼쪽 패널) 및 STAT3 (오른쪽 패널) 인산화를 나타냈다.
IL-21에 대한 기능적 검정을 또한 IL21R-U2OS IL21R/IL2RG 이량체화 리포터 (PathHunter® U2OS IL21R/IL2RG 이량체화 세포주, DiscoverX Cat. No: 93-1035C3)를 사용하여 수행하였다. 리포터 세포를 조작된 인간 MSC 또는 적절한 양성 (재조합 사이토카인) 또는 음성 대조군으로부터의 제어된 배지와 함께 항온처리하였다. 도 50에 도시된 바와 같이, IL-21을 코딩하는 모든 작제물은 이량체화를 나타냈다.
실시예 20: CT26 종양 모델에서의 조작된 MSC 효능
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 도 51a에 도시된 다양한 뮤린 면역 이펙터 각각을 발현하도록 조작하였다. 각각의 MSC를 단일 약제만 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c 암컷 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 복막 내 전달된 조작된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 51a에 도시된 바와 같이, CT26 동계 종양 모델에서 선택된 이펙터-생산 조작된-MSC 및 선택된 이펙터-생산 조작된-MSC를 사용하여 종양 부담의 유의한 감소를 달성하였다. 종양 부담 배수 변화를 처리-후 BLI (10 일차) 대 전-처리 BLI의 정규화에 의해 각각의 개별 마우스에 대해 계산하였다. 종양 부담 배수 변화가 1 (점선)보다 낮은 모든 경우는 종양 부담 감소를 나타낸다. 종양 부담에서의 유의한 감소를 달성한 상위 MSC-이펙터는 다음과 같다: IL12, IL15, IL12+항-PD1(마이크로바디), IL12+IL21, IL12+CCL21a, IL12+CXCL10, IL12+CXCL11, IL21+CXCL11, IL21+CCL21a, IL15+CXCL10, GM-CSF+IL12, IL12+IL21+CCL21a.
실시예 21: B16F10 종양 모델에서의 조작된 MSC 효능
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 도 51b에 도시된 다양한 뮤린 면역 이펙터 각각을 발현하도록 조작하였다. 각각의 MSC를 단일 약제만 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 암컷 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 면역-조정 사이토카인 또는 케모카인, 예컨대, IL12p70을 발현하는 복막 내 전달된 mMSC 1x106 개로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 51b에 도시된 바와 같이, CT26 동계 종양 모델에서 선택된 이펙터-생산 조작된-MSC 및 선택된 이펙터-생산 조작된-MSC로 종양 부담의 유의한 감소가 달성되었다. 다음의 선택된 이펙터 또는 조합이 종양 부담에서의 유의한 감소를 달성하였다: IL12, IL12+CD40L, IL12+CXCL10, IL12+IL21, IL12+IL21+Flt3L, IL12+IL21+CXCL10, IL12+CCL21a+Flt3L.
실시예 22: IL12 생산 MSC는 IP 모델에서 CT26 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 게다가, 종결 시점 (종양 삽입 후 17 일차)에 종양 중량을 결정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 실험 코호트는 다음을 포함한다: 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC, 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC, 및 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC의 병용 처리 (조합에서 각각에 대해 전달된 1x106 개의 세포).
도 52a 및 도 52b에 도시된 바와 같이, IL12p70-발현 MSC, IL21-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 받은 그룹은 대조군에 비해, 병용 처리의 유의한 감소를 포함하여, CT26 모델에서 BLI (도 52a 왼쪽 패널) 및 종양 중량에 의해 (도 52a 오른쪽 패널) 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소를 초래하였다. 도 52b는 개별 마우스의 BLI 루시퍼라제 측정을 나타낸다 (결과는 도 52a 왼쪽 패널에 요약됨).
상기 실험을 더 낮은 용량의 조작된 mMSC (1x105 개의 세포)를 전달하는 변형으로 반복하였다. 도 53a에 도시된 바와 같이, IL12p70-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 받은 그룹은 대조군에 비해, 병용 처리의 유의한 감소를 포함하여, CT26 모델에서 BLI에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소를 초래하였다 (도 53a; 마우스의 개별 BLI 측정 - 왼쪽 패널; BLI 측정의 요약 - 오른쪽 패널). 추가적으로, 병용 처리는 IL12p70-발현 MSC를 단독으로 받은 그룹에 비해 증가된 효능을 나타냈다. 도 53b에 도시된 바와 같이, 1x105 개의 IL21 발현 MSC와 조합된 1x105 개의 IL12p70 발현 MSC를 이용한 처리는 처리된 모든 마우스에서 최대 40 일까지 무-종양 생존을 초래하였다 (n = 8; 중앙값 생존에 도달하지 않음). 컨스트랙트에서, MSC를 단독으로 발현하는 1x105 개의 IL12p70을 이용한 처리는 40 일까지 25 % 생존율을 나타냈다 (n = 8; 19 일 중앙값 생존). FLAG-MSC에 대해 PBS로 처리된 대조군 그룹은 40 일까지 0 % 생존율을 나타냈다 (각각 n = 8, 각각 12 일 중앙값 생존). 따라서, MSC에 의한 IL21 발현은 IL12p70 발현 MSC의 효능을 향상시켰다.
실시예 23: IL12 생산 MSC는 IP 모델에서 B16F10 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 게다가, 종결 시점 (종양 삽입 후 17 일차)에 종양 중량을 결정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 실험 코호트는 다음을 포함한다: 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC, 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC, 및 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC의 병용 처리 (조합에서 각각에 대해 전달된 1x106 개의 세포).
도 54 및 도 55에 도시된 바와 같이, IL12p70-발현 MSC, 및 IL12p70 및 IL21-발현 MSC의 조합을 받은 그룹은 대조군에 비해, 병용 처리의 유의한 감소를 포함하여, B16F10 모델에서 BLI (도 54 왼쪽 패널) 및 종양 중량 (도 54 오른쪽 패널)에 의해 사정된 바와 같이 종양 부담의 감소를 초래하였다. 특히, IL21-발현 MSC만으로는 종양 부담 또는 종양 중량의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 도 55는 대조군 FLAG-발현 MSC, 및 IL12-발현 MSC 및 IL21-발현 MSC의 조합에 대한 개별 마우스의 BLI 루시퍼라제 측정을 입증한다 (결과는 도 54 왼쪽 패널에 요약됨).
실시예 24: IL12 및 IL21을 생산하는 MSC는 B16F10 IP 종양 모델에서 무-종양 생존을 연장하고 종양 재시험에서 생존한다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12 (p70) 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 실험 코호트는 다음을 포함한다: 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC, 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC, 및 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC의 병용 처리 (조합에서 각각에 대해 전달된 1x106 개의 세포).
도 56에 도시된 바와 같이, IL12p70 발현 MSC를 이용한 처리는 대조군 처리된 마우스에 비해 연장된 생존 (처리-27 일 후 중앙값 생존)을 초래하였다 (PBS 처리된 및 FLAG-발현 MSC 둘 모두에 대한 처리-8 일 후의 중앙값 생존). IL21 발현 MSC와 조합된 IL12p70 발현 MSC를 이용한 처리는 IL12p70 발현 MSC 단독 처리에 비해 연장된 생존 (54.5 % 생존; 중앙값 생존에 도달하지 않음)을 초래하였다. 따라서, MSC에 의한 IL21 발현은 IL12p70 발현 MSC의 효능을 향상시켰다.
추가적으로, 90 일 초과 동안 무-종양이였던 마우스를 후속적으로 옆구리에 삽입된 B16-F10 종양 세포 (1x106 개의 세포)로 재-시험하였다. 나이브 미-처리된 마우스에 대조군과 동시에 삽입하였다. 피하 종양 부담은 캘리퍼에 의해 측정되었다. 도 57c에 도시된 바와 같이, 이전에 IL12-발현 MSC 및 IL21-발현 MSC의 병용 처리를 받은 생존한 모든 마우스 (n = 4)는 새로 삽입된 종양을 거부하여, 처리가 항-종양 면역 기억을 달성하였음을 나타낸다. 이전에 IL12-발현 MSC 단독 처리를 받은 마우스는 50 % 종양-거부율을 가졌다 (4 마리 중 2 마리의 마우스; 도 57b). 대조적으로, 종양은 나이브 마우스의 60 %에서 확립되었다 (5 마리 중 3 마리의 마우스; 도 57a).
실시예 25: 면역 체크포인트 요법과 병용하여 IL12를 생산하는 MSC는 B16F10 IP 종양 모델에서 생존을 연장한다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12 (p70)를 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고, 200 mg/kg 단독 용량 또는 IL12-발현 뮤린 MSC의 저용량 (1e5)과 조합하여 항-PD1 항체 (클론 RMP1-14)의 IP 투여로 처리하였다.
도 56에 도시된 바와 같이, 항-PD1 단독 처리는 12.5 % 생존율 및 23 일의 중앙값 생존을 나타냈다 (도 56 "항-PD1"; 8 마리 중 1 마리의 마우스는 장기간 무-종양 생존을 가짐). 대조적으로, 항-PD1과 IL12p70 발현 MSC의 병용 처리는 50 % 생존율을 나타냈다 (도 56 "MSC-IL12 (p70) + 항-PD1"; 8 마리 중 4 마리의 마우스는 장기간 무-종양 생존을 가짐; 중앙값 생존은 아직 확립되지 않음). 따라서, MSC에 의한 IL12 발현은 항-PD1 면역 체크포인트 요법의 효능을 향상시키고 체크포인트 불응성 또는 내성 모델 (B16F10)을 반응성으로 전환시킨다..
실시예 26: IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하는 MSC는 CT26 IP 종양 모델에서의 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 1x105 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 암컷 balb/c 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 1x104 내지 1x106 개의 세포 범위의 상이한 양의 mMSC로 IP 처리하였다. MSC-Flag-Myc (1x106 개의 세포) 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 58a-c에 도시된 바와 같이, 항-종양 활성을 BLI에 의해 사정된 바와 같이 IL12 및 IL21 둘 모두를 발현하는 MSC의 용량-의존적 방식으로 관찰하였다 (도 58a는 17 일차 대 7 일차로 정규화됨; 도 58b 및 도 58c 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI). 대조군 FLAG 또는 PBS 마우스에서 효능이 관찰되지 않았다 (도 58a 및 도 58b). 컨스트랙트에서, 최소 효능은 1x104 개의 용량에서 관찰되었으며, 각각의 증가된 용량에서 효능이 증가하였다 (도 58a 및 도 58c). 도 58d에 도시된 바와 같이, 종양 삽입 후 최대 60 일까지 장기간 무-종양 생존이 용량-의존적 방식으로 관찰되었으며, 1x106 내지 1x105 개로 처리된 마우스는 유의하게 연장된 무-종양 생존 (삽입-후 중앙값 생존: PBS/FLAG - 19 일; 1x106 내지 1x105 개 - 도달하지 않음; 3x104 개 - 53 일; 1x104 개 - 18-19 일)을 가졌다.
실시예 27: IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하는 MSC는 B16F10 IP 종양 모델에서 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 5x104 개의 세포) (B16F10-Fluc-Puro Cat#:CL052, lot#: CL-IM150 Imanis Life Sciences)를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 1x105 내지 1x107 개의 세포 범위의 상이한 양의 mMSC로 처리하였다). MSC-Flag-Myc (3x106 개의 세포) 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 일부 그룹은 5 일에 의해 분리된 다중 용량으로 처리하였다 (종양-삽입 7, 12 및 17 일차 후에 처리).
도 59a-d에 도시된 바와 같이, 항-종양 활성은 BLI에 의해 사정된 바와 같이 IL12 및 IL21 둘 모두를 발현하는 MSC의 용량-의존적 방식으로 관찰되었다 (도 59a는 17 일차 대 7 일차로 정규화됨; 도 59b-d 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI). 대조군 FLAG 또는 PBS 마우스에서 효능이 관찰되지 않았다 (도 59a 및 도 59b). 1x105 또는 3x105 개의 세포의 용량에서 또한 효능이 관찰되지 않았다 (도 59a 및 도 59c). 대조적으로, 최소 효능은 1x106 개의 용량에서 관찰되었으며, 각각의 증가된 용량에서 효능이 증가하였다 (도 59a 및 도 59c). 더 높은 용량의 다중 투여 후에 효능이 또한 관찰되었다 (도 59d). 도 59e에 도시된 바와 같이, 장기간 무-종양 생존이 용량-의존적 방식으로 관찰되었으며, 더 높은 용량의 다중 투여 후에 또한 관찰되었다 (삽입-후 중앙값 생존: PBS - 20 일; FLAG (x3) - 27 일; 1x107 개 - 31.5 일; 3x106 개 - 36 일; 3x106 개 (x3) - 39 일; 1x106 개 - 33 일; 1x106 개 (x3) - 39 일; 3x105 개 - 27 일; 3x105 개 (x3) - 27 일 [곡선이 3x105 개의 처리와 오버랩됨]; 1x105 개 - 24 일).
실시예 28: IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하는 MSC는 MC-38 IP 종양 모델에서 종양 부담을 감소시킨다
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. MC-38 종양 세포를 fLUC-EGFP 작제물로 형질도입하고 EGFP 형광을 기준으로 분류한 다음, 5x105 개의 세포를 면역적격 C57BL/6 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 9 일 후, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 3x104 내지 1x106 개의 세포 범위의 상이한 양의 mMSC로 처리하였다. MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 60a 및 도 60b에 도시된 바와 같이, BLI에 의해 사정된 바와 같이 IL12 및 IL21 둘 모두를 발현하는 MSC의 용량-의존적 방식으로 항-종양 활성이 관찰되었다 (도 60a는 18 일차 대 9 일차로 정규화됨; 도 60b 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 BLI). 대조군 FLAG 또는 PBS 마우스에서 효능이 관찰되지 않았다 (도 60a 및 도 60b). 1x105 또는 3x104 개의 세포의 용량에서 또한 효능이 관찰되지 않았다 (도 60a 및 도 60b). 대조적으로, 최소 효능은 3x105 개의 용량에서 관찰되었으며, 1x106 개의 세포의 증가된 용량에서 효능이 증가하였다 (도 60a 및 도 60b). 도 60c에 도시된 바와 같이, 장기간 무-종양 생존이 용량-의존적 방식으로 관찰되었으며, 1x106 개의 세포로 처리한 모든 마우스는 30 일 이상 경과후 생존하였다 (삽입-후 중앙값 생존: PBS - 21 일; FLAG - 29 일; 1x106 개 - 도달하지 않음; 3x105 개 - 28 일; 1x105 개 - 21 일; 3x104 개 - 21 일 [PBS, 1x105 개, 및 3x104 개 오버랩). 따라서, 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작된 mMSC는 MC-38 종양 모델에서 효능을 입증하였다.
실시예 29: 인간 MSC는 IP 모델에서 종양으로 호밍한다
다음 실시예에서, NSG 마우스에 OVCAR8-fLUC 세포를 IP 삽입하였다. 종양 삽입 14-21 일 후, Nanoluc-EGFP를 발현하도록 조작된 1x106 개의 인간 BM-MSC를 IP 전달하였다. MSC의 주사 후 24 시간에 마우스를 안락사시키고 복막 장기 (위, 신장, 간, 결장, 비장, 췌장, 점막/종양, 난소 및 나팔관)를 NanoLuc 신호전달에 대해 엑스-비보 이미징하였다 (NanoGlo Substrate Kit, Vendor: Promega, Catalog No.: N1110). 인간 MSC를 주사 후 24 시간뿐만 아니라 22 일에 수집된 종양 섹션에서 EGFP 형광에 의해 이미징하였다.
도 61a 및 도 61b에 도시된 바와 같이, 인간 MSC NanoLuc 신호는 복막 강의 다른 장기와 비교하여 종양에서 우선적으로 풍부하였다 (도 61a는 루시퍼라제 정량화를 요약함; 도 61b 루시퍼라제 신호의 대표적인 이미지). 추가적으로, MSC의 지속성은 22 일보다 낮았으며, 가장 최근의 시점에서 세포가 검출되지 않았다 (도 61b 가장 오른쪽 패널).
실시예 30: 이펙터 사이토카인의 생물분포 및 PK
다음 실시예에서, 조작된 MSC에 의해 생산된 이펙터 사이토카인의 생물분포 및 PK를 사정하였다.
제1 실험에서, NSG 마우스에 5x106 개의 OVCAR8-fLUC 종양 세포를 IP 삽입하였다. 종양 삽입 21-27 일 후, BLI에 의해 측정된 종양 부담에 기반하여 마우스를 무작위화하고 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 인간 IL12 (p70) 및 인간 IL21을 발현하도록 조작된 1x106 개의 hMSC로 처리하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. MSC 처리 후 16-24 시간 또는 3, 4 및 7 일에 마우스를 안락사시키고 PBS의 1 mL을 복막 공간에 주사하고 이를 수집함으로써 IP 세정을 통해 복막액을 수집하였다. 심장 천자 후 전혈로부터 혈청을 분리하였다. ELISA (R&D 시스템)를 사용하여 각각의 시점 및 처리 타입에 대한 각각의 구획 (복막액 대 혈청)의 단백질 양을 결정하였다.
도 62a에 도시된 바와 같이, 인간 IL12 (왼쪽 패널) 및 인간 IL21 (오른쪽 패널) 둘 모두의 일시적인 생산이 복막액 (각각의 각자 시점에 대한 왼쪽 열) 및 혈청 (각각의 각자 시점에 대한 오른쪽 열) 둘 모두에서 관찰되었다. 전신 (혈청)과 비교하여 복막 공간 (국소)에서 10 배 이상 증가된 단백질 풍부도가 관찰되었으며, 이는 조작된 MSC에 의한 사이토카인의 국소 전달을 나타낸다.
다른 실험에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다. CT26-fLUC 종양 세포 (100 μl 중의 1x105 개의 세포)를 면역적격 balb/c (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC (조합에서 각각에 대해 전달된 1x106 개의 세포)를 IP 전달하였다. MSC 처리 후 24 또는 72 시간에 마우스를 안락사시키고 PBS의 1 mL을 복막 공간에 주사하고 이를 수집함으로써 IP 세정을 통해 복막액을 수집하였다. 심장 천자 후 전혈로부터 혈청을 분리하였다. Luminex (Millipore)를 사용하여 각각의 시점 및 처리 타입에 대한 각각의 구획 (복막액 대 혈청)의 단백질 양을 결정하였다.
도 62b에 도시된 바와 같이, 뮤린 IL12 (왼쪽 패널) 및 뮤린 IL21 (오른쪽 패널) 둘 모두의 일시적인 생산을 복막액 (각각의 각자 시점에 대한 왼쪽 열) 및 혈청 (각각의 각자 시점에 대한 오른쪽 열) 둘 모두에서 관찰하였다. 전신 (혈청)과 비교하여 복막 공간 (국소)에서 10 배 이상 증가된 단백질 풍부도가 관찰되었으며, 이는 조작된 MSC에 의한 사이토카인의 국소 전달을 나타낸다.
실시예 31: CT26 IP 종양 모델에서 MSC 처리 및 재조합 사이토카인 처리의 비교
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. Balb/c mMSC를 또한 뮤린 IL12 (p70) 또는 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (100 μl 중의 1x105 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 암컷 balb/c 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. MSC 처리된 마우스의 경우, 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 복막 내 전달된 mMSC (1x106 개의 세포)로 처리하여, 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC, 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC, 또는 뮤린 IL12 및 IL21-발현 뮤린 MSC를 받았으며, MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 추가적으로, 처리 그룹은 또한 생체 외 MSC에 의해 생산된 양의 4-배 용량으로 각자의 재조합 사이토카인의 볼루스 용량을 받은 마우스를 포함하였다 (ELISA에 의해 측정됨 - 재조합 IL12: 5 ug/마우스; 재조합 IL21: 0.4 ug/마우스). 종양 부담을 시점에 걸쳐 fLUC BLI에 의해 측정하였고, 종양 부담으로 인해 엔드포인트 기준에 도달할 때 마우스를 안락사시켰다. 카플란 마이어 생존 곡선을 무-종양 생존을 계산하기 위해 결정하였다.
도 63a-c에 도시된 바와 같이, 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리된 마우스는 모든 경우에서 연장된 무-종양 생존의 측면에서 재조합 사이토카인 요법을 능가하였다 (도 63a - MSC-IL12 대 rIL12; 도 63b - MSC-IL21 대 rIL21; 도 63c - MSC-IL12/IL21 대 rIL12+rIL21). 추가적으로, 도 63d-e에 도시된 바와 같이, 사이토카인을 생산하도록 조작된 MSC로 처리된 마우스는 모든 경우에서 종양 부담 BLI)에 의해 사정된 바와 같이 재조합 사이토카인 요법을 능가하였다 (도 63d 하단 행 - MSC-IL12 대 rIL12; 도 63e 상단 행 - MSC-IL21 대 rIL21; 도 63e 하단 행 - MSC-IL12/IL21 대 rIL12+rIL21).
실시예 32: B16F10 IP 종양 모델에서 MSC 처리 및 재조합 사이토카인 처리의 비교
다음 실시예에서, C57BL/6 mMSC를 단일 렌티바이러스 발현 벡터로부터 뮤린 IL12 (p70) 및 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. C57BL/6 mMSC를 또한 뮤린 IL12 (p70) 또는 뮤린 IL21을 발현하도록 조작하였다. 렌티바이러스 발현 벡터는 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 단일 전사체로부터 사이토카인 둘 모두를 발현하기 위해 2A 리보솜 스키핑 요소를 사용하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 B16F10 종양 세포 (100 μl 중의 1x105 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 암컷 balb/c 마우스 (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. MSC 처리된 마우스의 경우, 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 IL12 및 IL21-발현 뮤린 MSC 둘 모두를 발현하도록 조작된 복막 내 전달된 mMSC (3x106 개의 세포)로 처리하였으며, MSC-Flag-Myc 및 PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 추가적으로, 처리 그룹은 또한 생체 외 MSC에 의해 생산된 양의 4-배 용량으로 각자의 재조합 사이토카인의 볼루스 용량을 받은 마우스를 포함하였다 (ELISA에 의해 측정됨 - 재조합 IL12: 3 ug/마우스; 재조합 IL21: 0.03 ug/마우스). 종양 부담은 처리 후 7 일차에 종양 중량에 의해 측정하였고, 종양 부담으로 인해 엔드포인트 기준에 도달하였을 때 마우스를 안락사시켰다. 카플란 마이어 생존 곡선을 무-종양 생존을 계산하기 위해 결정하였다.
도 64a에 나타낸 바와 같이, IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하도록 조작된 MSC로 처리된 마우스는 종양 중량에 의해 사정된 바와 같이 재조합 사이토카인 요법을 능가하였다. 추가적으로, 도 64b에 도시된 바와 같이, IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하도록 조작된 MSC로 처리된 마우스는 무-종양 연장된 생존에 의해 사정된 바와 같이 재조합 사이토카인 요법을 능가하였다.
실시예 33: CT26 IP 종양 모델에서 IL12 및 IL21 둘 모두를 생산하는 MSC를 사용한 처리 후 면역 프로파일
다음 실시예에서, balb/c mMSC를 실시예 6에 기재된 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 뮤린 IL12p70 또는 뮤린 IL21 (즉, 단일 약제만을 발현하도록 조작된 각각의 MSC)을 발현하도록 조작하였다. 루시퍼라제 효소를 구성적으로 발현하도록 변형된 CT26 종양 세포 (1x105 개의 세포) (Cat no: CL043, Lot no: CL-IM147 Imanis Life Sciences)를 면역적격 balb/c (6-8 주령)의 복막 공간에 주사하였다. 종양 삽입 후 1 주에, AMI 이미저를 사용하여 루시퍼라제 이미징 (BLI)에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하고 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC의 복막 내 전달된 병용 처리로 처리하거나 (각각의 조합에 대해 1x106 개의 세포가 전달됨), 음성 대조군으로서 MSC-Flag-Myc 및 PBS를 처리하였다. 마우스를 안락사시키고 장기를 처리 후 72 시간에 수집하였다. 다색 유세포분석법을 사용하여 처리에 대한 반응으로 면역 침윤을 특성화하였다.
도 65a 및 도 65b에 도시된 바와 같이, T-세포 서브세트 및 활성화 마커 (CD3, CD4, CD8, CD8/CD38+, CD8/IFNg+, CD8/Gzmb+, NK/Gzmb+ 및 비율 CD8:Treg-FoxP3)는 MSC-IL12 + MSC IL21을 사용한 처리 후 복막액에서 유의하게 증가하였다. 추가적으로, 도 65c에 도시된 바와 같이, 항원-제시 세포, 예컨대, 수지상 세포 (CD11c/MHC-II hi, CD86+, CD103+, CD11b+)는 또한 MSC-IL12 + MSC-IL21을 사용한 처리 후 복막 종양-배수 림프절에서 유의하게 증가하였다. 따라서, 뮤린 IL12-발현 뮤린 MSC 및 뮤린 IL21-발현 뮤린 MSC의 병용 처리는 활성화된 면역 프로파일을 나타냈다.
실시예 34: 신호 펩티드 서열의 최적화
다음 실시예에서, 이펙터 분자를 이들의 천연 신호 펩티드 서열을 외인성 신호 펩티드 서열로 대체하도록 변형시켰다 (테스트되는 예시적인 신호 펩티드 서열에 대해 표 5 참고). 변형된 이펙터 분자를 기능적 개선, 예컨대, 개선된 발현 및 유지된 분비, 예컨대, 특정 환경 (예컨대, 종양 미세환경)에 대해 테스트하였다. 변형된 이펙터 분자에 대한 기능적 성능 (예컨대, 종양을 없애는 개선된 능력, 상이한 환경에서 종양을 없애는 개선된 능력 또는 상이한 타입의 종양을 없애는 개선된 능력)을 종양 모델에서 또한 테스트하였다.
실시예 35: 조작된 MSC의 풍부함
다음 실시예에서, MSC를, 변형되지 않은 세포, 예컨대, 변형되지 않은 MSC를 포함하는 세포의 집단 내에서 이펙터 분자를 발현하도록 조작하였다. 조작된 MSC는 조작된 MSC를 성장 인자 (예컨대, 표 1에 설명된 이펙터 분자)와 접촉시킴으로써 집단 내에서 풍부하게 되어, 이들 풍부한 조작된 MSC가 성장 인자에 대한 수용체 또는 수용체 리간드를 발현하는 조작된 MSC의 하위-집단이 되도록 하였다. 관심있는 조작된 MSC의 하위-집단을 다양한 방식으로 성장 인자와 접촉시킨다:
1. 인자를 발현하기 위해 MSC 자체를 유전적으로 조작함으로써 자가분비 방식으로.
2. 인자를 발현하고 이들 인자를 MSC에 공급하기 위해 배양보조 또는 지지 세포를 유전적으로 조작함으로써, 또는 이러한 인자를 발현하기 위해 조작된 배양보조 또는 지지 세포 (예컨대, 293T)로부터 인자를 함유하는 제어된 배지를 사용함으로써 주변분비 방식으로.
3. MSC 이식 후 환자에 이러한 인자의 재조합 단백질 또는 핵산 버전을 주사함으로써 내분비 방식으로.
4. MSC 배양 조건에 이러한 인자의 가용성 재조합 단백질 버전의 첨가를 통해.
5. 이러한 인자의 재조합 버전으로 MSC 증식에 사용된 조직 배양 플레이트/플라스크 표면의 코팅을 통해.
참고문헌:
Figure pct00097
Figure pct00098
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각이 인용되는 요지와 관련하여 참고로 원용되며, 일부 경우에 문서의 전체를 포함할 수 있다.
본원에서 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 부정 관사 "a" 및 "an"은 반대로 명확하게 표시되지 않는 한, "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 본 방법의 단계 또는 작용의 순서는 본 방법의 단계 또는 작용이 인용된 순서에 반드시 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
상기 명세서에서 뿐만 아니라 청구범위에서, 모든 이행 구문, 예컨대, "포함하는", "비롯하는", "수반하는", "갖는", "함유하는", "포괄하는", "보유하는" 및 "~로 구성되는" 등은 개방형, 즉, 비제한적으로 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 오직 이행 구문 "~로 이루어지는" 및 "본질적으로 이로 이루어지는" 만이 각자 미국 특허청의 특허 심사 절차의 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 이행 구문이어야 한다.
<110> SENTI BIOSCIENCES, INC. <120> COMBINATORIAL CANCER IMMUNOTHERAPY <130> STB-011WO <140> PCT/US2019/056824 <141> 2019-10-17 <150> 62/843,180 <151> 2019-05-03 <150> 62/747,114 <151> 2018-10-17 <150> 62/747,109 <151> 2018-10-17 <160> 145 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 agagggtata taatggaagc tcgacttcca g 31 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc 52 <210> 3 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 caccagacag tgacgtcagc tgccagatcc catggccgtc atactgtgac gtctttcaga 60 caccccattg acgtcaatgg gagaa 85 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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polynucleotide <400> 20 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ccactagttc catgtcctta tatggactca tctttgccta ttgcgacaca cactcaatga 60 acacctacta cgcgctgcaa agagccccgc aggcctgagg tgcccccacc tcaccactct 120 tcctattttt gtgtaaaaat ccagcttctt gtcaccacct ccaaggaggg ggaggaggag 180 gaaggcaggt tcctctaggc tgagccgaat gcccctctgt ggtcccacgc cactgatcgc 240 tgcatgccca ccacctgggt acacacagtc tgtgattccc ggagcagaac ggaccctgcc 300 cacccggtct tgtgtgctac tcagtggaca gacccaaggc aagaaagggt gacaaggaca 360 gggtcttccc aggctggctt tgagttccta gcaccgcccc gcccccaatc ctctgtggca 420 catggagtct tggtccccag agtcccccag cggcctccag atggtctggg agggcagttc 480 agctgtggct gcgcatagca gacatacaac ggacggtggg cccagaccca ggctgtgtag 540 acccagcccc cccgccccgc agtgcctagg tcacccacta acgccccagg cctggtcttg 600 gctgggcgtg actgttaccc tcaaaagcag gcagctccag ggtaaaaggt gccctgccct 660 gtagagccca ccttccttcc cagggctgcg gctgggtagg tttgtagcct tcatcacggg 720 ccacctccag ccactggacc gctggcccct gccctgtcct ggggagtgtg 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1620 cagcgggggg cgcatggggg gggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga gaagcccctg 1680 ggcctccgga gatgggggac accccacgcc agttcggagg cgcgaggccg cgctcgggag 1740 gcgcgctccg ggggtgccgc tctcggggcg ggggcaaccg gcggggtctt tgtctgagcc 1800 gggctcttgc caatggggat cgcagggtgg gcgcggcgga gcccccgcca ggcccggtgg 1860 gggctggggc gccattgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc gtgcgcgctg 1920 ggaattggcg ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaagg cgctaactgc gcgtgcgttc 1980 tggggcccgg ggtgccgcgg cctgggctgg ggcgaaggcg ggctcggccg gaaggggtgg 2040 ggtcgccgcg gctcccgggc gcttgcgcgc acttcctgcc cgagccgctg gccgcccgag 2100 ggtgtggccg ctgcgtgcgc gcgcgccgac ccggcgctgt ttgaaccggg cggaggcggg 2160 gctggcgccc ggttgggagg gggttggggc ctggcttcct gccgcgcgcc gcggggacgc 2220 ctccgaccag tgtttgcctt ttatggtaat aacgcggccg gcccggcttc ctttgtcccc 2280 aatctgggcg cgcgccggcg ccccctggcg gcctaaggac tcggcgcgcc ggaagtggcc 2340 agggcggggg cgacctcggc tcacagcgcg cccggctat 2379 <210> 24 <211> 529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gttgatttcc ttcatccctg gcacacgtcc aggcagtgtc gaatccatct ctgctacagg 60 ggaaaacaaa taacatttga gtccagtgga gaccgggagc agaagtaaag ggaagtgata 120 acccccagag cccggaagcc tctggaggct gagacctcgc cccccttgcg tgatagggcc 180 tacggagcca catgaccaag gcactgtcgc ctccgcacgt gtgagagtgc agggccccaa 240 gatggctgcc aggcctcgag gcctgactct tctatgtcac ttccgtaccg gcgagaaagg 300 cgggccctcc agccaatgag gctgcggggc gggccttcac cttgataggc actcgagtta 360 tccaatggtg cctgcgggcc ggagcgacta ggaactaacg tcatgccgag ttgctgagcg 420 ccggcaggcg gggccggggc ggccaaacca atgcgatggc cggggcggag tcgggcgctc 480 tataagttgt cgataggcgg gcactccgcc ctagtttcta aggaccatg 529 <210> 25 <211> 794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 agttccccaa ctttcccgcc tctcagcctt tgaaagaaag aaaggggagg gggcaggccg 60 cgtgcagtcg cgagcggtgc tgggctccgg ctccaattcc ccatctcagt cgctcccaaa 120 gtccttctgt ttcatccaag cgtgtaaggg tccccgtcct tgactcccta 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cttagaggcc aaggccgccc aggcaaaggg gcggtcccac gcgtgagggg 360 cccgcggagc catttgattg gagaaaagct gcaaaccctg accaatcgga aggagccacg 420 cttcgggcat cggtcaccgc acctggacag ctccgattgg tggacttccg ccccccctca 480 cgaatcctca ttgggtgccg tgggtgcgtg gtgcggcgcg attggtgggt tcatgtttcc 540 cgtcccccgc ccgcgagaag tgggggtgaa aagcggcccg acctgcttgg ggtgtagtgg 600 gcggaccgcg cggctggagg tgtgaggatc cgaacccagg ggtggggggt ggaggcggct 660 cctgcgatcg aaggggactt gagactcacc ggccgcacgt c 701 <210> 28 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 gggccgccca ctcccccttc ctctcagggt ccctgtcccc tccagtgaat cccagaagac 60 tctggagagt tctgagcagg gggcggcact ctggcctctg attggtccaa ggaaggctgg 120 ggggcaggac gggaggcgaa aaccctggaa tattcccgac ctggcagcct catcgagctc 180 ggtgattggc tcagaaggga aaaggcgggt ctccgtgacg acttataaaa gcccaggggc 240 aagcggtccg gataacggct agcctgagga gctgctgcga cagtccacta cctttttcga 300 gagtgactcc cgttgtccca aggcttccca gagcgaacct gtgcggctgc 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 ttccagagct ttcgaggaag gtttcttcaa ctcaaattca tccgcctgat aattttctta 60 tattttccta aagaaggaag agaagcgcat agaggagaag ggaaataatt ttttaggagc 120 ctttcttacg gctatgagga atttggggct cagttgaaaa gcctaaactg cctctcggga 180 ggttgggcgc ggcgaactac tttcagcggc gcacggagac ggcgtctacg tgaggggtga 240 taagtgacgc aacactcgtt gcataaattt gcgctccgcc agcccggagc atttaggggc 300 ggttggcttt gttgggtgag cttgtttgtg tccctgtggg tggacgtggt tggtgattgg 360 caggatcctg gtatccgcta acaggtactg gcccacagcc gtaaagacct gcgggggcgt 420 gagagggggg aatgggtgag gtcaagctgg aggcttcttg gggttgggtg ggccgctgag 480 gggaggggag ggcgaggtga cgcgacaccc ggcctttctg ggagagtggg ccttgttgac 540 ctaagggggg cgagggcagt tggcacgcgc acgcgccgac agaaactaac agacattaac 600 caacagcgat tccgtcgcgt ttacttggga ggaaggcgga aaagaggtag tttgtgtggc 660 ttctggaaac cctaaatttg gaatcccagt atgagaatgg tgtcccttct tgtgtttcaa 720 tgggattttt acttcgcgag tcttgtgggt ttggttttgt tttcagtttg cctaacaccg 780 tgcttaggtt tgaggcagat tggagttcgg tcgggggagt ttgaatatcc ggaacagtta 840 gtggggaaag ctgtggacgc ttggtaagag agcgctctgg attttccgct gttgacgttg 900 aaaccttgaa tgacgaattt cgtattaagt gacttagcct tgtaaaattg aggggaggct 960 tgcggaatat taacgtattt aaggcatttt gaaggaatag ttgctaattt tgaagaatat 1020 taggtgtaaa agcaagaaat acaatgatcc tgaggtgaca cgcttatgtt ttacttttaa 1080 actaggtcac c 1091 <210> 31 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atgtgtcacc agcagctcgt tatatcctgg tttagtttgg tgtttctcgc ttcacccctg 60 gtggca 66 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgcc 66 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 atgcaactgc tgtcatgtat cgcactcatc ctggcgctgg ta 42 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atgtatcgga tgcaactttt gagctgcatc gcattgtctc tggcgctggt gacaaattcc 60 60 <210> 35 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Homo sapiens <400> 56 atgtgccatc agcagcttgt catatcttgg ttttcacttg tattcctggc cagccctttg 60 gttgcgatct gggagctcaa gaaggatgtg tacgttgtag agctggactg gtaccccgat 120 gctcccggtg agatggtcgt tttgacatgt gacactccag aagaggacgg tattacgtgg 180 actctggacc agtcctccga agttcttggt tctggtaaga ctctgactat ccaggtgaaa 240 gaatttgggg atgcgggaca atacacatgc cacaagggag gcgaggtgtt gtctcatagt 300 ttgctgcttc tccacaagaa agaggatgga atctggagca ccgacatact caaggatcaa 360 aaggaaccca aaaataagac atttctgcga tgtgaggcta agaactatag tggccgcttc 420 acttgttggt ggctgactac catcagcaca gatctcacgt tttcagtaaa aagtagtaga 480 ggttcaagtg atcctcaagg ggtaacgtgc ggtgctgcaa cactgtctgc tgaacgcgta 540 agaggagata ataaggagta cgagtattcc gtagaatgcc aagaggacag tgcttgtcct 600 gcggccgagg agtctctccc aatagaagtg atggtggacg cggtgcataa actgaaatat 660 gagaactaca caagcagttt ttttataaga gatatcatca agcccgatcc gccgaagaat 720 ttgcaactta aaccgcttaa aaactcacgc caggttgaag tatcctggga gtatccggat 780 acatggtcaa caccacacag ctatttttcc cttaccttct gtgtgcaggt ccaagggaag 840 agcaaaaggg agaagaagga cagggtattc actgataaaa cttccgcgac ggtcatctgc 900 cgaaaaaacg ctagtatatc tgtacgggcg caggataggt actatagttc ttcttggtct 960 gagtgggcct cagttccgtg ctctggggga ggaagtggag gagggtccgg cggtggaagc 1020 gggggaggga gtcgcaactt gccagtggct acaccagatc caggcatgtt tccatgtctg 1080 catcattccc agaatctcct gagagcggtg tcaaatatgc tccaaaaagc gagacaaaca 1140 ctggaatttt acccgtgtac cagtgaggag attgatcacg aggacataac caaggacaag 1200 acctcaactg tagaagcgtg tttgccgctg gagttgacta agaatgagtc ctgcctcaat 1260 tccagagaaa cttcattcat tactaacggc agttgtcttg catcccggaa aacgtccttt 1320 atgatggccc tttgccttag ttcaatttac gaggatctta aaatgtatca agtggagttt 1380 aaaaccatga atgctaaact tcttatggac cccaaacgac aaatttttct ggatcagaat 1440 atgcttgccg tgatagacga actcatgcag gcgcttaatt ttaactccga aacagttcca 1500 caaaaatcta gccttgaaga acctgatttt tataaaacga agattaaact gtgtatcctg 1560 ctgcatgcct ttcgcatccg agctgtcaca atcgataggg ttatgtccta ccttaacgcg 1620 agctag 1626 <210> 57 <211> 1623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgccattt gggaactgaa gaaggacgtc tacgtggtcg agctggattg gtacccggac 120 gcccctggag aaatggtcgt gctgacttgc gatacgccag aagaggacgg cataacctgg 180 accctggatc agagctccga ggtgctcgga agcggaaaga ccctgaccat tcaagtcaag 240 gagttcggcg acgcgggcca gtacacttgc cacaagggtg gcgaagtgct gtcccactcc 300 ctgctgctgc tgcacaagaa agaggatgga atctggtcca ctgacatcct caaggaccaa 360 aaagaaccga agaacaagac cttcctccgc tgcgaagcca agaactacag cggtcggttc 420 acctgttggt ggctgacgac aatctccacc gacctgactt tctccgtgaa gtcgtcacgg 480 ggatcaagcg atcctcaggg cgtgacctgt ggagccgcca ctctgtccgc cgagagagtc 540 aggggagaca acaaggaata tgagtactcc gtggaatgcc aggaggacag cgcctgccct 600 gccgcggaag agtccctgcc tatcgaggtc atggtcgatg ccgtgcataa gctgaaatac 660 gagaactaca cttcctcctt ctttatccgc gacatcatca agcctgaccc ccccaagaac 720 ttgcagctga agccactcaa gaactcccgc caagtggaag tgtcttggga atatccagac 780 acttggagca ccccgcactc 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<212> DNA <213> Mus sp. <400> 58 atgtgtccac agaagctgac aataagttgg tttgccattg tcctcctggt gagcccactc 60 atggcaatgt gggaactcga aaaggatgtc tacgtggtag aagtagattg gactccagac 120 gcgccagggg agacagtgaa tttgacatgt gacacaccag aagaagatga cattacatgg 180 acatctgacc aacgccatgg cgtaataggg agtgggaaaa cactcacgat cacagttaaa 240 gagttcttgg atgctggtca atatacttgc cataaaggcg gcgagacact cagccactca 300 catttgcttt tgcataaaaa agagaatggc atttggagca ctgaaatact taagaacttt 360 aagaacaaga catttctcaa gtgtgaggcc cctaattaca gcggcaggtt cacgtgctca 420 tggctggtcc agcgcaacat ggacctcaag tttaacataa aatcttcttc ctcttcacct 480 gactccagag ctgttacttg cggcatggct tctctgagcg cagaaaaagt aacgttggat 540 caaagagact acgaaaagta ctctgtttct tgtcaagagg atgttacgtg cccgacggcc 600 gaagaaacgc ttccaattga actcgcgttg gaagctcgcc aacaaaacaa gtatgaaaac 660 tacagtacaa gcttctttat acgggatata attaaacccg atccccccaa gaacttgcaa 720 atgaaaccac ttaagaacag ccaggtggaa gtttcctggg agtatccaga ctcatggagt 780 actcctcaca gctatttttc tctgaaattc tttgtaagga tacaacggaa gaaagagaag 840 atgaaagaga ccgaggaggg ttgtaatcag aagggagcgt ttctcgtgga gaaaacgtct 900 accgaagtcc aatgtaaagg tggcaatgtg tgcgtccaag ctcaggatag atactataat 960 tcaagttgct ccaagtgggc ctgtgttcca tgccgcgttc ggagcggggg aggtagcgga 1020 ggaggtagtg ggggtgggtc aggaggaggg agtcgagtta tcccggtgtc aggccccgca 1080 cgctgcttga gccagagtcg caacctcctt aagacaacag atgacatggt gaaaacagca 1140 cgcgaaaagc ttaaacacta ctcttgtacg gcggaggata ttgatcacga ggatattacc 1200 cgagaccaaa ctagcacttt gaaaacctgt ctgccccttg aacttcataa aaatgagagc 1260 tgtctggcta cacgagagac gtcaagtacg actaggggca gctgtctccc gccgcaaaag 1320 acaagcctca tgatgacgct ctgtttgggt tccatttacg aggacttgaa aatgtatcaa 1380 acggagttcc aggctataaa tgcggcgttg cagaaccata accatcaaca aattatactt 1440 gataaaggca tgttggtggc gattgatgaa ctcatgcaga gtctcaatca caacggggaa 1500 acgttgagac agaaaccccc agtcggtgaa gcggacccat atcgagtaaa aatgaagctc 1560 tgcattctgc ttcacgcatt cagcactaga gttgttacca tcaaccgggt aatgggatat 1620 ctctccagtg cgtag 1635 <210> 59 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 atggaacgca ttgtgatctg cctgatggtc atcttcctgg gcaccttagt gcacaagtcg 60 agcagccagg gacaggacag gcacatgatt agaatgcgcc agctcatcga tatcgtggac 120 cagttgaaga actacgtgaa cgacctggtg cccgagttcc tgccggcccc cgaagatgtg 180 gaaaccaatt gcgaatggtc ggcattttcc tgctttcaaa aggcacagct caagtccgct 240 aacaccggga acaacgaacg gatcatcaac gtgtccatca aaaagctgaa gcggaagcct 300 ccctccacca acgccggacg gaggcagaag cataggctga cttgcccgtc atgcgactcc 360 tacgagaaga agccgccgaa ggagttcctg gagcggttca agtcgctcct gcaaaagatg 420 attcatcagc acctgtcctc ccggactcat gggtctgagg attca 465 <210> 60 <211> 2163 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgccattt gggaactgaa gaaggacgtc tacgtggtcg agctggattg gtacccggac 120 gcccctggag aaatggtcgt gctgacttgc gatacgccag aagaggacgg cataacctgg 180 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Unknown: Anti-PD1 sequence <400> 104 atggaaactg acacacttct tctgtgggtc ttgctcctgt gggtcccagg ctctactggt 60 gacagtcctg ataggccatg gaacccacct acctttagtc cagccttgct cgtcgtaacc 120 gaaggggaca acgctacatt cacctgctct tttagcaata cttctgagag ttttcatgta 180 gtctggcatc gggagagtcc atccggacaa acagatactt tggccgcttt tccagaggat 240 aggtctcaac ctgggcaaga cgcaaggttt cgagtcacac agcttcctaa cgggagagat 300 tttcacatgt ctgtagttcg ggcacgccga aatgattctg gcacatatgt ttgcggtgtg 360 atctcacttg ctccaaagat tcaaataaag gagagccttc gcgccgagtt gcgggtgact 420 gagcgggagc ccaagtcctg cgacaaaacc catacttgtc caccctgtgg cggcgggtca 480 tccggtggcg ggtctggggg gcaaccaaga gagccacagg tatatactct tccccccagc 540 agagaagaaa tgacaaaaaa ccaagtgtcc ctgacatgtc tggttaaagg attttatccc 600 agtgacattg ctgtagaatg ggaatccaat ggtcaacccg agaataacta caaaaccact 660 cctccagtat tggacagtga cggttccttc ttcctctatt ccaaacttac agtggataaa 720 tcccgctggc agcaagggaa tgtattcagc tgtagtgtca tgcacgaagc tcttcataac 780 cattatacac agaaatctct ttccctgagc ccaggtaaat ag 822 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ccaggacaca acggtactcc aggtcgagac 120 ggtcgggatg ggactcctgg ggagaaaggc gagaaagggg acgctggttt gctcggtcct 180 aagggggaaa ccggggatgt aggaatgaca ggggctgaag ggcctcgggg atttcctggg 240 acaccaggca ggaagggtga accaggggag gccctccagc gcaccgagcc acggccagct 300 ctgaccataa caacaagtcc aaacctgggc acacgcgaaa acaatgctga ccaggtgact 360 cctgtaagtc acatcggatg ccctaacact acacaacagg gctctcctgt atttgcaaag 420 cttctcgcaa aaaatcaagc atcactttgt aatacaaccc tgaactggca ttctcaggac 480 ggagcagggt cctcttattt gtctcaaggg ctccgctacg aagaagataa aaaggaattg 540 gttgttgaca gtccaggttt gtattatgtg tttttggaac ttaagctgtc accaaccttc 600 actaacaccg gccacaaggt ccaaggctgg gttagtcttg ttttgcaagc caaacctcaa 660 gtggatgatt ttgacaatct ggctttgact gttgagcttt ttccatgcag tatggagaat 720 aaactggttg atcggtcatg gtcacagctc cttctgctca aggccggaca taggctgagt 780 gtgggacttc gggcctactt gcacggcgcc caggacgcat accgagactg ggaactcagc 840 taccctaaca caacttcttt tgggttgttc cttgtcaaac ccgataatcc ttgggaatag 900 900 <210> 109 <211> 870 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 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gaagagtccc tgcctatcga ggtcatggtc gatgccgtgc ataagctgaa atacgagaac 600 tacacttcct ccttctttat ccgcgacatc atcaagcctg acccccccaa gaacttgcag 660 ctgaagccac tcaagaactc ccgccaagtg gaagtgtctt gggaatatcc agacacttgg 720 agcaccccgc actcatactt ctcgctcact ttctgtgtgc aagtgcaggg aaagtccaaa 780 cgggagaaga aagaccgggt gttcaccgac aaaacctccg ccactgtgat ttgtcggaag 840 aacgcgtcaa tcagcgtccg ggcgcaggat agatactact cgtcctcctg gagcgaatgg 900 gccagcgtgc cttgttccgg tggcggatca ggcggaggtt caggaggagg ctccggagga 960 ggttcccgga acctccctgt ggcaaccccc gaccctggaa tgttcccgtg cctacaccac 1020 tcccaaaacc tcctgagggc tgtgtcgaac atgttgcaga aggcccgcca gacccttgag 1080 ttctacccct gcacctcgga agaaattgat cacgaggaca tcaccaagga caagacctcg 1140 accgtggaag cctgcctgcc gctggaactg accaagaacg aatcgtgtct gaactcccgc 1200 gagacaagct ttatcactaa cggcagctgc ctggcgtcga gaaagacctc attcatgatg 1260 gcgctctgtc tttcctcgat ctacgaagat ctgaagatgt atcaggtcga gttcaagacc 1320 atgaacgcca agctgctcat ggacccgaag cggcagatct tcctggacca gaatatgctc 1380 gccgtgattg atgaactgat gcaggccctg aatttcaact ccgagactgt gcctcaaaag 1440 tccagcctgg aagaaccgga cttctacaag accaagatca agctgtgcat cctgttgcac 1500 gctttccgca ttcgagccgt gaccattgac cgcgtgatgt cctacctgaa cgccagt 1557 <210> 137 <211> 519 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 137 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln 130 135 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cgacgcgggc cagtacactt gccacaaggg tggcgaagtg 720 ctgtcccact ccctgctgct gctgcacaag aaagaggatg gaatctggtc cactgacatc 780 ctcaaggacc aaaaagaacc gaagaacaag accttcctcc gctgcgaagc caagaactac 840 agcggtcggt tcacctgttg gtggctgacg acaatctcca ccgacctgac tttctccgtg 900 aagtcgtcac ggggatcaag cgatcctcag ggcgtgacct gtggagccgc cactctgtcc 960 gccgagagag tcaggggaga caacaaggaa tatgagtact ccgtggaatg ccaggaggac 1020 agcgcctgcc ctgccgcgga agagtccctg cctatcgagg tcatggtcga tgccgtgcat 1080 aagctgaaat acgagaacta cacttcctcc ttctttatcc gcgacatcat caagcctgac 1140 ccccccaaga acttgcagct gaagccactc aagaactccc gccaagtgga agtgtcttgg 1200 gaatatccag acacttggag caccccgcac tcatacttct cgctcacttt ctgtgtgcaa 1260 gtgcagggaa agtccaaacg ggagaagaaa gaccgggtgt tcaccgacaa aacctccgcc 1320 actgtgattt gtcggaagaa cgcgtcaatc agcgtccggg cgcaggatag atactactcg 1380 tcctcctgga gcgaatgggc cagcgtgcct tgttccggtg gcggatcagg cggaggttca 1440 ggaggaggct ccggaggagg ttcccggaac ctccctgtgg caacccccga ccctggaatg 1500 ttcccgtgcc tacaccactc ccaaaacctc ctgagggctg tgtcgaacat gttgcagaag 1560 gcccgccaga cccttgagtt ctacccctgc acctcggaag aaattgatca cgaggacatc 1620 accaaggaca agacctcgac cgtggaagcc tgcctgccgc tggaactgac caagaacgaa 1680 tcgtgtctga actcccgcga gacaagcttt atcactaacg gcagctgcct ggcgtcgaga 1740 aagacctcat tcatgatggc gctctgtctt tcctcgatct acgaagatct gaagatgtat 1800 caggtcgagt tcaagaccat gaacgccaag ctgctcatgg acccgaagcg gcagatcttc 1860 ctggaccaga atatgctcgc cgtgattgat gaactgatgc aggccctgaa tttcaactcc 1920 gagactgtgc ctcaaaagtc cagcctggaa gaaccggact tctacaagac caagatcaag 1980 ctgtgcatcc tgttgcacgc tttccgcatt cgagccgtga ccattgaccg cgtgatgtcc 2040 tacctgaacg ccagtagacg gaaacgcgga agcggagagg gcagaggctc gctgcttaca 2100 tgcggggacg tggaagagaa ccccggtccg atggaacgca ttgtgatctg cctgatggtc 2160 atcttcctgg gcaccttagt gcacaagtcg agcagccagg gacaggacag gcacatgatt 2220 agaatgcgcc agctcatcga tatcgtggac cagttgaaga actacgtgaa cgacctggtg 2280 cccgagttcc tgccggcccc cgaagatgtg gaaaccaatt gcgaatggtc ggcattttcc 2340 tgctttcaaa aggcacagct caagtccgct aacaccggga acaacgaacg gatcatcaac 2400 gtgtccatca aaaagctgaa gcggaagcct ccctccacca acgccggacg gaggcagaag 2460 cataggctga cttgcccgtc atgcgactcc tacgagaaga agccgccgaa ggagttcctg 2520 gagcggttca agtcgctcct gcaaaagatg attcatcagc acctgtcctc ccggactcat 2580 gggtctgagg attcatga 2598 <210> 145 <211> 7213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 145 tgactcctgc gcagtccaaa aaaaaaggct ccaaaaggag cctttaattg tatcggtggg 60 cccttagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 120 aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 180 ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 240 acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 300 gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 360 ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 420 ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 480 cgaatgcaac cggcgcagga 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ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 1380 acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 1440 acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 1500 actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1560 gagctggttt agtgaaccgg gtctctctgg ttagaccaga tttgagcctg ggagctctct 1620 ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 1680 gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 1740 gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag 1800 aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc 1860 ggcgactgca gagtacgcca aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg 1920 cgagagcgtc agtattaagc gggggaaaat agcggccgcc acaattttaa aagaaaaggg 1980 gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa 2040 actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaattt tcgggggatc cgtaacgcca 2100 ttttgcaagg catggaaaaa taccaaacca agaatagaga agttcagatc aagggcgggt 2160 acatgaaaat agctaacgtt gggccaaaca ggatatctgc ggtgagcagt ttcggccccg 2220 gcccggggcc aagaacagat ggtcaccgca gtttcggccc cggcccgagg ccaagaacag 2280 atggtcccca gatatggccc aaccctcagc agtttcttaa gacccatcag atgtttccag 2340 gctcccccaa ggacctgaaa tgaccctgcg ccttatttga attaaccaat cagcctgctt 2400 ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgcttccc gagctctata aaagagctca caacccctca 2460 ctcggcgcgc cagtcctccg acagactgag tcgcccgggg gatccgcgga attcgccgcc 2520 accatgtgcc atcagcaact cgtcatctcc tggttctccc ttgtgttcct cgcttcccct 2580 ctggtcgcca tttgggaact gaagaaggac gtctacgtgg tcgagctgga ttggtacccg 2640 gacgcccctg gagaaatggt cgtgctgact tgcgatacgc cagaagagga cggcataacc 2700 tggaccctgg atcagagctc cgaggtgctc ggaagcggaa agaccctgac cattcaagtc 2760 aaggagttcg gcgacgcggg ccagtacact tgccacaagg gtggcgaagt gctgtcccac 2820 tccctgctgc tgctgcacaa gaaagaggat ggaatctggt ccactgacat cctcaaggac 2880 caaaaagaac cgaagaacaa gaccttcctc cgctgcgaag ccaagaacta cagcggtcgg 2940 ttcacctgtt ggtggctgac gacaatctcc accgacctga ctttctccgt gaagtcgtca 3000 cggggatcaa gcgatcctca gggcgtgacc 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caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 5580 gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 5640 gtgtggaaaa tctctagcat ctagagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 5700 aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 5760 tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 5820 tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 5880 gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggctag 5940 agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 6000 acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 6060 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6120 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgct 6180 agccgggctt ttttttctta ggccttcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 6240 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 6300 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6360 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 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Claims (29)

  1. 조작된 세포로서,
    a) 프로모터; 및
    b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
    Figure pct00099

    여기서
    S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드
    를 포함하되,
    상기 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
    상기 조작된 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조작된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가, 폴리뉴클레오티드가 화학식
    Figure pct00100
    를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되는, 조작된 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 별개의 폴리펩티드로서 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 번역과 작동가능하게 연관되는, 조작된 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하거나 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하되, 임의로 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하는 경우, 2A 리보솜 스키핑 태그는 P2A, T2A, E2A 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커 폴리뉴클레오티드 서열이 제2 프로모터를 코딩하며, 상기 프로모터가 화학식
    Figure pct00101
    을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 프로모터가 화학식
    Figure pct00102
    를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 별개의 폴리뉴클레오티드인, 조작된 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포가 인간 세포이며, 임의로 상기 인간 세포가 골수, 지방 조직, 탯줄, 태아 간, 근육 및 폐 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터 단리되는, 조작된 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포가 MSC이며, MSC가 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-, CD14-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD11b-, CD79α-를 포함하는 세포 마커 표현형; CD105+, CD73+, CD90+, CD19-, HLA 클래스 II-를 포함하는 세포 마커 표현형; 또는 CD73+, CD90+, CD105+ 및 CD166+, CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45- 및 HLA-DR-를 포함하는 세포 마커 표현형을 포함하는, 조작된 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 및/또는 제2 프로모터가 구성적 프로모터를 포함하며, 임의로 상기 구성적 프로모터가 CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb 및 hUBIb로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 및/또는 제2 프로모터가 유도성 프로모터를 포함하며, 임의로 상기 유도성 프로모터가 minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드가 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함하는, 조작된 세포.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 신호 펩티드 또는 제2 신호 펩티드가 각자 제1 이펙터 분자 또는 제2 이펙터 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호 펩티드를 포함하며, 임의로 상기 비-천연 신호 펩티드가 IL12, IL2, 최적화된 IL2, 트립시온겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 뮤린 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 신호 펩티드 및 제2 신호 펩티드가 동일한, 조작된 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 이펙터 분자가 치료적 클래스로부터 독립적으로 선택되며, 상기 치료적 클래스가 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질제 a, 수용체, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 상기 제1 이펙터 분자 및 제2 이펙터 분자의 치료적 클래스가 상이하며, 임의로 상기 제1 이펙터 분자 및/또는 제2 이펙터 분자가 발현될 때 조작된 MSC의 세포막에 테더링되는 변형된 이펙터 분자인, 조작된 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    i) 상기 사이토카인이 IL12, IL12p70 융합 단백질, IL7, IL21, IL18, IL15, 타입 I 인터페론 및 인터페론-감마로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    ii) 상기 케모카인이 CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9 및 XCL1로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    iii) 상기 성장 인자가 Flt3L 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    iv) 상기 공동-활성화 분자가 4-1BBL 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    v) 상기 종양 미세환경 개질제가 아데노신 데아미나제, TGF베타 억제제, 면역 체크포인트 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 임의로 여기서 TGF베타 억제제가 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 여기서 면역 체크포인트 억제제가 항-PD-1 항체를 포함하고, 임의로 여기서 VEGF 억제제가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 분자가 IL12p70 융합 단백질을 포함하며, 상기 제2 이펙터 분자가 CCL21a, IL7, IL15, IL21, Flt3L, 항-PD1 항체, CD40L 또는 CXCL10-CXCL11 융합 단백질을 포함하는, 조작된 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식을 포함하는 추가적인 외인성 폴리뉴클레오티드 서열인 E2를 추가로 포함하되,
    Figure pct00103

    여기서
    S는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E는 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    X = 1 내지 20이되,
    상기 프로모터가 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 여기서 각각의 X에 대해 상응하는 신호 펩티드가 이펙터 분자와 작동가능하게 연관되고, 임의로 상기 추가적인 이펙터 분자 중 하나 이상이 IL15, Flt3L, 항-PD1 항체, 아데노신 데아미나제, CD40L, CXCL10-CXCL11 융합 단백질 및/또는 XCL1을 포함하는, 조작된 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이
    a) SFFV 프로모터; 및
    b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
    Figure pct00104

    여기서
    S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
    E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
    S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
    E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21인, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하되,
    상기 SFFV 프로모터가 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드가 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드가 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
    임의로 상기 작제물이 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 임의로 상기 하나 이상의 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열이 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 또는 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 하나 이상의 조작된 세포를 포함하는 세포 집단.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제19항의 세포 집단을 포함하는 약학 조성물.
  21. 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 제19항의 세포 집단, 또는 제20항의 약학 조성물 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 종양을 갖는 대상체에 전달하는 단계를 포함하되, 임의로 상기 조작된 세포는 대상체에 관하여 동종이계인 것인, 방법.
  22. 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 제19항의 세포 집단, 또는 제20항의 약학 조성물 중 임의의 것의 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하되, 임의로 상기 조작된 세포는 대상체에 관하여 동종이계인 것인, 방법.
  23. 프로모터 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열:
    Figure pct00105

    여기서
    S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하되,
    상기 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결됨.
  24. 제23항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 SFFV 프로모터를 포함하는 서열 및 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 것인, 외인성 폴리뉴클레오티드:
    Figure pct00106

    여기서
    S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 신호 펩티드는 인간 IL12 신호 펩티드이고;
    E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 분자는 인간 IL12p70 융합 단백질이고;
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로의 퓨린:Gly-Ser-Gly:T2A 배향으로 퓨린 인식 폴리펩티드 서열, Gly-Ser-Gly 폴리펩티드 서열 및 T2A 리보솜 스키핑 태그를 코딩하고;
    S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 신호 펩티드는 인간 IL21 신호 펩티드이고;
    E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제2 이펙터 분자는 인간 IL21이되;
    상기 SFFV 프로모터가 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드가 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드가 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함함.
  25. 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 각각의 조작된 세포는
    a) 프로모터; 및
    b) 다음을 포함하는 5'에서 3'으로 배향된 화학식에 기재된 발현 카세트를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이되,
    Figure pct00107

    여기서
    S1은 제1 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E1은 제1 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    L은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    S2는 제2 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    E2는 제2 이펙터 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하되,
    상기 프로모터는 발현 카세트에 작동가능하게 연결되고, 제1 신호 펩티드는 제1 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고, 제2 신호 펩티드는 제2 이펙터 분자에 작동가능하게 연결되고,
    상기 조작된 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 줄기 세포, 면역 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 선천성 림프구 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 골수성 세포, 수지상 세포, T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 바이러스-특이적 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 작제물이 서열번호 144에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
  27. 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로, 종양-매개 면역억압 메커니즘을 조정하는 다중 이펙터 분자를 생산하도록 세포를 조작할 수 있는 조성물을 대상체에 전달하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 제23항 또는 제24항의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조성물이 바이러스 시스템, 트랜스포존 시스템 및 뉴클레아제 게놈 편집 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 시스템을 포함하며, 임의로 상기 바이러스 시스템이 렌티바이러스, 레트로바이러스, 레트로트랜스포존 및 아데노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 상기 뉴클레아제 게놈 편집 시스템이 징크-핑거 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 체크포인트 억제제 및/또는 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 임의로 상기 체크포인트 억제제가 항-PD-1 항체, 항-PD-1L 항체 또는 항-CTLA-4 항체인 것인, 방법.
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