KR20230117107A

KR20230117107A - 단백질 페이로드 방출

Info

Publication number: KR20230117107A
Application number: KR1020237016633A
Authority: KR
Inventors: 미셸 엘리자베스 헝; 러셀 모리슨 고들리; 개리 이
Original assignee: 센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-08-07
Also published as: JP2023548586A; IL302568A; EP4240380A1; CA3197147A1; AU2021376208A1; TW202237640A; WO2022098922A1; US20240082303A1

Abstract

키메라 단백질, 구체적으로는 막 절단 가능 키메라 시스템이 본원에 기재된다. 또한, 핵산, 세포, 및 이를 대상으로 하는 방법이 본원에 기재된다.

Description

단백질 페이로드 방출

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 제63/193,004호 및 2020년 11월 4일에 출원된 제63/109,812호의 이익을 주장하고, 이들 각각은 사실상 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

서열 목록

본 출원은ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 20XX년 XXXX에 생성된 상기 ASCII 사본은 XXX-XXX_sequencelisting.txt으로 명명되며 ###,### 바이트의 크기이다.

세포 기반 요법 플랫폼은 다양한 질환을 치료하기 위한 유망한 수단을 제공한다. 이러한 유망한 플랫폼 중 하나는 암의 치료에서 CAR-T 기반 요법이다. 이들의 가능성을 감안할 때, 세포 기반 요법의 개선이 필요하다. 활성 탐색 영역은 세포 기반 요법을 향상시키는 외장(armoring)으로 지칭되는 과정인, 사이토카인과 같은 효과기 분자를 생산 및/또는 분비하기 위한 조작 세포 기반 요법이다. 예를 들어, 비외장 CAR-T 요법은 고형 종양에서 불량한 효능을 가지며, 외장은 전체 암 면역 사이클에 영향을 미치고 CAR-T의 활성을 증가시킬 수 있다. 그러나, 제어되지 않거나 조절되지 않는 외장 전략은 대상체에서 오프 타겟 효과 및 독성과 같은 치료에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 페이로드 효과기 분자의 생산 및/또는 분비를 조절하는 것과 같은, 세포 기반 요법의 외장을 제어하고 조절하는 추가적인 방법이 요구된다.

일부 구현예에서, 페이로드 효과기 분자의 조절된 분비와 같은, 세포 기반 요법의 조절된 외장을 포함하는 세포 기반 요법 플랫폼이 본원에 제공된다. 또한, 일부 구현예에서, 암, 예컨대, 난소암, 유방암, 대장암, 폐암, 및 췌장암의 표적화된 치료를 위한 조절된 외장을 포함하는 조합 세포 기반 면역요법이 본원에 제공된다.

그러나, 본원에 제공된 요법은 외장의 전신 독성을 제한할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 면역요법은 종양 특이적이고 효과적일 수 있는 반면, 외장으로 인한 전신 독성 및/또는 기타 오프 타겟 효과는 제한한다. 이들 요법은 분비 동역학의 조절, 세포 상태 특이성, 및 세포 또는 조직 특이성을 포함하는, 조절된 방식으로 관심 단백질, 예컨대, 면역조절 효과기 분자를 전달한다. 전달 비히클의 설계는, 막 절단 부위, 프로모터, 링커, 신호 펩티드, 전달 방법, 조합, 조절 및 면역조절 효과기 분자의 순서의 최적화를 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포 기반 요법, 예컨대 암 요법에서 전체 기능을 개선하도록 최적화된다.

본 개시에 포함되는 효과기 분자의 비제한적인 예는 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드, 효소, 및 종양 분해성 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 세포는 조절되는 방식으로 다음의 효과기 분자 중 적어도 1개, 2개 3개 또는 그 이상을 발현하고 분비하도록 조작될 수 있다: IL-12, IL-16, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, IL-21, OX40-리간드, CD40L, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TGFβ 항체, 항-TNFR2, MIP1α(CCL3), MIP1β(CCL5), CCL21, CpG 올리고디옥시뉴클레오티드, 및 항-종양 펩티드(예를 들어, 항-종양 활성을 갖는 항-미생물 펩티드, 예를 들어, Gaspar, D. 등의 문헌[Front Microbiol. 2013; 4: 294]; Chu, H. 등의 문헌[PLoS One. 2015; 10(5): e0126390], 및 웹사이트 aps.unmc.edu/AP/main.php 참조).

본원에서 프로모터 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산이 제공된다: S - C - MT 또는 MT - C - S, 식에서 S는 분비성 효과기 분자를 포함하고, C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되, 프로모터는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

또한, 본원에서 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질이 제공된다: S - C - MT 또는 MT - C - S, 식에서 S는 분비성 효과기 분자를 포함하고, C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

또한, 조작된 핵산을 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공되되, 조작된 핵산은 프로모터 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는, 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다: S - C - MT 또는 MT - C - S, 식에서 S는 분비성 효과기 분자를 포함하고, C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되, 프로모터는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

또한, 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공되되, 막 절단 가능 키메라 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 배향된, 다음의 식을 갖는다: S - C - MT 또는 MT - C - S, 식에서 S는 분비성 효과기 분자를 포함하고, C는 프로테아제 절단 부위를 포함하며, MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

또한, 다음 단계를 포함하는 막 테더링된 효과기 분자의 방출을 유도하는 방법이 본원에 제공된다: a) 세포를 제공하는 단계로서, 세포가 막 결합 프로테아제 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는, 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 것인, 단계(식에서, S는 분비성 효과기 분자를 포함하고, C는 막 결합 프로테아제의 동족 프로테아제 절단 부위를 포함하되, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨); 및 b) 막 결합 프로테아제 및 막 절단 가능 키메라 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계로서, 발현 시, 막 절단 가능 키메라 단백질은 세포의 세포막에 테더링되고, 발현 시, 막 결합 프로테아제는 막 절단 가능 키메라 단백질의 동족 막 결합 프로테아제 절단 부위를 절단함으로써 분비성 효과기 분자를 세포막으로부터 방출하는, 단계.

일부 양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 양태에서, 구성적 프로모터는 CAG, HLP, CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터는 최소 프로모터 및 NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도 인자 분자 반응성 프로모터 및 이들의 탠덤 반복체로 이루어진 군으로부터 선택된 반응 요소를 포함한다.

일부 양태에서, 프로모터는 합성 프로모터이다. 일부 양태에서, 합성 프로모터는 활성화-조건성 조절 폴리펩티드-(ACP-) 결합 도메인 서열 및 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터 서열은 minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도 인자 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복체로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래된다. 일부 양태에서, ACP 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 합성 프로모터는 합성 프로모터의 ACP-결합 도메인에 결합하는 활성화-조건성 조절 폴리펩티드(ACP)에 의해 조절 가능하다.

일부 양태에서, ACP는 전사 조절 인자이다. 일부 양태에서, ACP는 전사 억제 인자이다. 일부 양태에서, ACP는 전사 활성 인자이다. 일부 양태에서, ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, ACP는 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인(ERT2 도메인)을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, ACP는 전사 인자이다. 일부 양태에서, 전사 인자는 징크-핑거-함유 전사 인자이다. 일부 양태에서, ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인(ZF 단백질 도메인) 및 전사 효과기 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, ZF 단백질 도메인은 설계상 모듈식이며, 징크 핑거 어레이(ZFA)로 구성된다. 일부 양태에서, ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 효과기 도메인은 단순 포진 바이러스 단백질 16(VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인인 4개의 VP16의 탠덤 카피를 포함하는 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성인자(Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 3부 활성인자(VPR 활성화 도메인); 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 코어 도메인(p300 HAT 코어 활성화 도메인); 크루펠 연관 박스(KRAB) 억제 도메인; 억제 요소 침묵 전사 인자(REST) 억제 도메인; 터럭 관련(hairy-related) 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA(시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B(DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화된다. 일부 양태에서, 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)이다. 일부 양태에서, 상기 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 양태에서, NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함한다. 일부 양태에서, NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다. 일부 양태에서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, ACP는 ERT2 도메인이 타목시펜 또는 이의 대사 산물에 결합할 때 핵 국소화될 수 있다. 일부 양태에서, 타목시펜 대사 산물은 4-하이드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥사이드, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, ACP는 데그론을 추가로 포함하고, 데그론 도메인은 ACP에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 데그론 도메인은 HCV NS4 데그론, PEST(인간 I

Bα의 잔기 277~307의 2개의 카피), GRR(인간 p105의 잔기 352~408), DRR(효모 Cdc34의 잔기 210~295), SNS(SP2 및 NB의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2)), RPB(효모 RPB의 잔기 1688~1702의 4개의 카피), SPmix(SP1 및 SP2의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2)), NS2(인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79~93의 3개의 카피), ODC(오르니틴 데카르복실라아제의 잔기 106~142), Nek2A, 마우스 ODC(잔기 422~461), 마우스 ODC_DA(D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422~461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가아제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 악틴필린-결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호 전달의 하이드록시프롤린 변형, 식물호르몬-의존성 SCF-LRR-결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가아제 결합 포스포데그론, 식물호르몬-의존성 SCF-LRR-결합 데그론, DSGxxS 인-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택된 데그론으로부터 유래한다. 일부 양태에서, 데그론 도메인은 면역조절 약물(IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있음으로써 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진하는 세레블론(CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827 또는 CRNB에 약물 유도적으로 결합할 수 있는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 산물이다. 일부 양태에서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(서열번호 175)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 산물이다. 일부 양태에서, IMiD는 FDA 승인 약물이다. 일부 양태에서, IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 데그론 도메인은 억제성 프로테아제의 N-말단, 억제성 프로테아제의 C-말단, ZF 단백질 도메인의 N-말단, ZF 단백질 도메인의 C-말단, 효과기 도메인의 N-말단, 또는 효과기 도메인의 C-말단이다.

일부 양태에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다.

일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 신호 펩티드 또는 신호-앵커 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 신호 펩티드는 분비성 효과기 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 비천연 신호 펩티드를 포함하거나 신호-앵커 서열은 분비성 효과기 분자에 고유하지 않은 비천연 신호-앵커 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 비천연 신호 펩티드 또는 비천연 신호-앵커 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL-12, IL-2, 최적화된 IL-2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 쥣과 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL6, IL8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12, IL21, CD8, NKG2D, TNFR2, 및 GMCSF.

일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 치료적 클래스로부터 선택되되, 치료적 클래스는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-15, IL-12, 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-15를 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 199의 아미노산 서열을 갖는 IL-15를 포함한다 . 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15Rα 스시 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 202의 아미노산 서열을 갖는 IL-15/IL-15Rα 스시 도메인 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15Rα 스시 도메인으로 구성된다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-12를 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 203의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-12로 구성된다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-12p70 융합 단백질로 구성된다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 IL-15이다. 일부 양태에서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1. 일부 양태에서, 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; SDF1; 및 MMP-2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: FLT3L 및 GM-CSF. 일부 양태에서, 공동-활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 4-1BBL 및 CD40L. 일부 양태에서, 종양 미세환경 개질 인자는 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMI 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 분비성 효과기 분자는 인간 유래의 효과기 분자이다.

일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 1형 막관통 프로테아제 절단 부위, II형 막관통 프로테아제 절단 부위, GPI 고정 프로테아제 절단 부위, ADAM8 프로테아제 절단 부위, ADAM9 프로테아제 절단 부위, ADAM10 프로테아제 절단 부위, ADAM12 프로테아제 절단 부위, ADAM15 프로테아제 절단 부위, ADAM17 프로테아제 절단 부위, ADAM19 프로테아제 절단 부위, ADAM20 프로테아제 절단 부위, ADAM21 프로테아제 절단 부위, ADAM28 프로테아제 절단 부위, ADAM30 프로테아제 절단 부위, ADAM33 프로테아제 절단 부위, BACE1 프로테아제 절단 부위, BACE2 프로테아제 절단 부위, SIP 프로테아제 절단 부위, MT1-MMP 프로테아제 절단 부위, MT3-MMP 프로테아제 절단 부위, MT5-MMP 프로테아제 절단 부위, 퓨린 프로테아제 절단 부위, PCSK7 프로테아제 절단 부위, 마트립타아제 프로테아제 절단 부위, 마트립타아제-2 프로테아제 절단 부위, MMP9 프로테아제 절단 부위, 및 NS3 프로테아제 절단 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, MMP9 프로테아제, 및 NS3 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.

일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 ADAM17 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX1X2KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되, X1은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X2는 V, L, S, I, Y, T, 또는 A이다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX1X2KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되, X1은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X2는 V, L, S, I, Y, 또는 T이다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD의 아미노산 서열(서열번호 190)을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포 내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 막관통-세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인은 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-사슬, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래된다. 일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함한다.

일부 양태에서, 세포막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키기 위해 번역 후 변형이 가능한 모티프를 포함하며, 여기서 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 번역 후 변형 태그는 지질-앵커 도메인을 포함하고, 선택적으로, 지질-앵커 도메인은 GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 및 팔미토일화 태그로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자는 세포의 세포막에 테더링된다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자는 세포막으로부터 방출된다. 일부 양태에서, 세포막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 내인성이다. 일부 양태에서, 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로테아제는 ADAM17 프로테아제이다.

일부 양태에서, 세포막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 대해 이종이다. 일부 양태에서, 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)이다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 양태에서, NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다. 일부 양태에서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아스나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르 및 복실로프레비르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로테아제의 발현 및/또는 국소화는 조절될 수 있다. 일부 양태에서, 발현 및/또는 국소화는 세포의 세포 상태에 의해 조절된다.

일부 양태에서, 조작된 핵산은 DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산이다.

일부 양태에서, 단리된 세포는 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 자연 살해(NK) 세포이다.

일부 양태에서, 단리된 세포는 자가유래이다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 동종이계이다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경교종 세포, 신장 종양 세포, 간 종양 세포, 폐 종양 세포, 흑색종 세포, 난소 종양 세포, 췌장 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포이다.

일부 양태에서, 단리된 세포는 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작되었다.

일부 양태에서, 단리된 세포는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제는 내인성 프로테아제이다. 일부 양태에서, 내인성 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 내인성 프로테아제는 ADAM17 프로테아제이다. 일부 양태에서, 프로테아제는 이종 프로테아제이다. 일부 양태에서, 이종 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)이다. 일부 양태에서, 프로테아제는 단리된 세포의 세포막 상에서 발현된다. 일부 양태에서, 프로테아제는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위의 절단은 단리된 세포의 세포막으로부터 분비성 효과기 분자를 방출한다.

일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX1X2KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되, X1은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X2는 V, L, S, I, Y, T, 또는 A이다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX1X2KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되, X1은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X2는 V, L, S, I, Y, 또는 T이다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD의 아미노산 서열(서열번호 190)을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 단리된 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 인식한다: 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, C4.4, CA6, 카드헤린 3, 카드헤린 6, CCR4, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-카드헤린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S. 아우레우스(S Aures), SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 수르비빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 양태에서, 항원-결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 양태에서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 양태에서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이다. 일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)이다.

일부 양태에서, 항원 인식 수용체는 CAR이다. 일부 양태에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3제타-사슬 세포내 신호 전달 도메인, CD97 세포내 신호 전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호 전달 도메인, CD2 세포내 신호 전달 도메인, ICOS 세포내 신호 전달 도메인, CD27 세포내 신호 전달 도메인, CD154 세포내 신호 전달 도메인, CD8 세포내 신호 전달 도메인, OX40 세포내 신호 전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인, CD28 세포내 신호 전달 도메인, ZAP40 세포내 신호 전달 도메인, CD30 세포내 신호 전달 도메인, GITR 세포내 신호 전달 도메인, HVEM 세포내 신호 전달 도메인, DAP10 세포내 신호 전달 도메인, DAP12 세포내 신호 전달 도메인 및 MyD88 세포 내 신호 전달 도메인. 일부 양태에서, CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD3제타-사슬 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인. 일부 양태에서, CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다.

본원은 또한 본원에 기재된 임의의 단리된 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본원에 기재된 임의의 단리된 세포 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 대상체로부터 유래한다. 일부 양태에서, 단리된 세포는 대상체에 관하여 동종이계이다. 일부 양태에서, 본 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

또한, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 또는 본원에 기재된 임의의 발현 벡터, 또는 본원에 기재된 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 지질 기반 구조가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 지질 기반 구조는 세포외 소포, 지질 나노입자, 미셀, 또는 리포솜을 포함한다. 일부 양태에서, 세포외 소포는 나노소포 및 엑소좀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 지질 기반 구조는 지질 나노입자 또는 미셀을 포함한다. 일부 양태에서, 지질 기반 구조는 리포솜을 포함한다.

또한 본원에 기재된 임의의 지질 기반 구조 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

또한, 본원에 기재된 임의의 지질 기반 구조 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 투여는 전신 투여를 포함한다. 일부 양태에서, 지질 기반 구조는 대상체 내 세포를 조작할 수 있다. 일부 양태에서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

또한, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 나노입자가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 나노입자는 무기 물질을 포함한다.

또한, 본원에 기재된 임의의 나노입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

또한, 본원에 기재된 임의의 나노입자 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 투여는 전신 투여를 포함한다. 일부 양태에서, 나노입자는 대상체 내 세포를 조작할 수 있다. 일부 양태에서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

또한, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 발현 벡터를 포함하도록 조작된 바이러스가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 바이러스는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 종양용해성 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 및 바이러스-유사 입자(VLP)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 본원에 기재된 임의의 조작된 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

또한, 본원에 기재된 임의의 조작된 바이러스 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 투여는 전신 투여를 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 바이러스는 대상체의 세포를 감염시키고 발현 카세트를 발현한다. 일부 양태에서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

도 1a는 프로테아제 절단 부위가 페이로드와 막-테더링 도메인 사이에 삽입되는 키메라 단백질로서 원하는 페이로드가 발현되는, 본원에 기재된 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다. 좌측 패널은 막관통 걸친 구조를 사용하는 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다(예를 들어, 키메라 단백질은 막관통 도메인을 함유한다). 우측 패널은 막-결합 구조를 사용하는 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다(예를 들어, 키메라 단백질은 세포 막과의 결합을 허용하는 번역 후 변형 태그를 함유한다).
도 1b는 IL-15의 분비 조절을 위한 대표적인 막 절단 가능 시스템을 도시하며, 여기서 IL-15는 IL-15 페이로드와 막 테더링 도메인 사이에 삽입된 TACE에 의해 절단될 수 있는 절단 부위를 갖는 키메라 단백질로서 발현된다. 좌측 패널은 PDGFR-베타 및 CD8과 같은 I형 막관통 도메인의 사용을 통한 I형 막관통 구조(예를 들어, S - C - MT)를 도시한다. 우측 패널 NKG2D 및 TNFR2와 같은 II형 막관통 도메인의 사용을 통한 II형 막관통 구조(예를 들어, MT - C - S).
도 2는 각 막 절단 가능 IL-15 작제물에 대해 ELISA(pg/ml, x-축으로 측정됨)에 의해 결정된 바와 같은 유세포 계측법(기하 평균 형광 강도, "gMFI", y 축으로 계산됨) 및 IL-15 분비에 의해 분석된 막 결합 발현의 도표를 제공한다.
도 3a~3c는 IL-12 막 절단 가능 시스템의 막 결합 발현 및 분비를 제공한다. 도 3a는 유세포 계측법으로 측정된, NK 세포 내 각각의 막 절단 가능 IL-12 시스템의 막 결합 발현을 나타낸다. 도 3b는 유세포 계측법에 의해 측정된, T 세포 내 각각의 막 절단 가능 IL-12 시스템의 막 결합 발현을 나타낸다. 도 3c는 NK 세포 및 T 세포에서 발현된 각각의 막 절단 가능 IL-12 시스템에 대한 IL-12 분비를 보여준다.
도 4a~4b는 다양한 IL-15 막 절단가능 시스템의 막 결합 NK 세포 발현 및 분비를 제공한다. 도 4a는 유세포 계측법으로 측정된, NK 세포 내 각각의 막 절단 가능 IL-15 시스템의 막 결합 발현을 나타낸다. 도 4b는 NK 세포에서 발현된 각각의 막 절단 가능 IL-15 시스템에 대한 IL-15 분비를 보여준다.

N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 단일 폴리펩티드로서 발현되는, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 키메라 단백질(또는 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산)이 본원에 제공된다. S는 분비성 효과기 분자를 지칭한다. C는 프로테아제 절단 부위를 지칭한다. MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다. 효과기 분자의 분비가 프로테아제 의존적 방식으로 조절될 수 있도록 막 절단 가능 키메라 단백질이 조작된다. 구체적으로, 막 절단 가능 키메라 단백질은, 효과기 분자의 분비가 "막 절단 가능" 시스템의 일부로서 조절될 수 있도록 조작되며, 여기서 프로테아제 절단 부위("C") 및 세포 막 테더링 도메인("MT")의 혼입은 프로테아제 의존적 방식으로 효과기 분자의 분비 조절을 허용한다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 막 절단 가능 키메라 단백질에 존재하는 막 절단 가능 시스템의 구성 요소는 일반적으로 하기 세포 공정을 통해 분비를 조절한다:

- MT: 세포 막 테더링 도메인은, 단백질이 세포막 내에 삽입되거나 그렇지 않으면 결합("테더링됨")되도록 키메라 단백질의 세포-전달을 유도하는 막관통 도메인(또는 막관통-세포내 도메인)을 함유한다.

- C: 키메라 단백질의 발현 및 세포막 내로의 국소화에 이어서, 프로테아제 절단 부위는 효과기 분자가 세포외 공간으로 방출("분비")되도록 키메라 단백질의 절단을 유도한다. 일반적으로, 프로테아제 특이적이도록 조작된 부위를 포함하는, 프로테아제 절단 부위는 프로테아제 특이적이다. 프로테아제 절단 부위는 최적의 단백질 발현, 세포 유형 특이적 절단, 세포 상태 특이적 절단, 및/또는 원하는 동역학으로 페이로드의 절단 및 방출(예를 들어, 분비된 키메라 단백질 수준에 대한 막 결합의 비율)을 달성하도록 선택되거나 조작될 수 있다.

일부 양태에서, 관심 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 효과기 분자), 프로테아제 절단 부위, 및 세포막 테더링 도메인을 갖는, 막 절단 가능 키메라 단백질(또는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산)이 본원에 제공된다.

"효과기 분자"는 다른 분자에 결합하고 결합하는 분자의 생물학적 활성을 조절하는 분자(예를 들어, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질(폴리펩티드) 또는 펩티드)를 지칭한다. 예를 들어, 효과기 분자는 효소 활성, 유전자 발현, 또는 세포 신호 전달을 증가시키거나 감소시키는 리간드로서 작용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 효과기 분자는 상이한 면역조절 기전을 조절(활성화 또는 억제)한다. 효과기 분자는 분자에 직접 결합하고 이를 조절함으로써 제2 하류 분자를 간접적으로 조절할 수도 있다.

본원에 기재된 특정 구현예에서(예를 들어, 일반적으로, 본원에 기재된 모든 막 절단 가능 키메라 단백질에 대해), 효과기 분자는 분비성 효과기 분자이다(예를 들어, 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S에서 "S"로 지칭됨). 효과기 분자의 비제한적 예는 사이토카인, 케모카인, 대사 산물 수준을 조절하는 효소, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 펩티드, 효소, 항체, 사이토카인을 조절하는 항체 또는 유인(decoy) 분자, 귀소 분자 및/또는 인테그린을 포함한다.

용어 "조절하다"는 생물학적 활성의 유지, 생물학적 활성의 (부분적 또는 완전한) 억제, 및 생물학적 활성의 (부분적 또는 완전한) 자극/활성화를 포함한다. 본 용어는 또한 생물학적 활성을 감소 또는 증가(예를 들어, 향상)시키는 것을 포함한다. 2개의 상이한 효과기 분자는 하나의 효과기 분자가 (예컨대, 항원 제시 및/또는 가공을 자극하는) 다른 효과기 분자에 의해 조절된 종양-매개 면역억제성 기전과 상이한 종양-매개 면역억제성 기전을 조절(예컨대, T 세포 신호 전달을 자극)할 때, "상이한 종양-매개 면역억제성 기전을 조절하는" 것으로 간주된다.

효과기 분자에 의한 조절은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 직접적인 조절은 효과기 분자가 다른 분자에 결합하여 그 분자의 활성을 조절할 때 발생한다. 간접적인 조절은 효과기 분자가 다른 분자에 결합하고 그 분자의 활성을 조절하고, 그 조절의 결과로 (효과기 분자가 결합되지 않은) 또 다른 분자의 활성이 조절될 때 발생한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 효과기 분자에 의한 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 (예를 들어, 전신으로 또는 종양 미세환경에서) 항종양 면역 반응에서 적어도 10%(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 200%)만큼의 증가를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 만큼의 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서 10~20%, 10~30%, 10~40%, 10~50%, 10~60%, 10~70%, 10~80%, 10~90%, 10~100%, 10~200%, 20~30%, 20~40%, 20~50%, 20~60%, 20~70%, 20~80%, 20~90%, 20~100%, 20~200%, 50~60%, 50~70%, 50~80%, 50~90%, 50~100%, 또는 50~200% 만큼의 증가를 초래한다. 예를 들어, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서의 "증가"는 효과기 분자(들)의 부재 하에 발생할 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에 대해 상대적인 것으로 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 효과기 분자에 의한 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서 (예를 들어, 전신으로 또는 종양 미세환경에서) 적어도 2배(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50, 또는 100배)만큼의 증가를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 만큼의 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 반응에서 2~10, 2~20, 2~30, 2~40, 2~50, 2~60, 2~70, 2~80, 2~90, 또는 2~100배 만큼의 증가를 초래한다.

면역자극성 및/또는 항-종양 면역 기전의 비제한적인 예는 T 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원, 항원 제시 및/또는 가공, 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호 전달, 활성 및/또는 동원, 수지상 세포 분화 및/또는 성숙, 면역 세포 동원, 전-염증성 대식세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원, 간질 분해, 면역자극성 대사 산물 생산, 인터페론 유전자의 자극인자(STING) 신호 전달(이는 IFN 분비 및 Th1 분극화를 증가시켜 항-종양 면역 반응을 촉진함) 및/또는 I형 인터페론 신호 전달을 포함한다. 효과기 분자는 전술한 면역자극성 기전 중 적어도 하나(하나 이상)를 자극하여, 면역자극성 반응의 증가를 초래할 수 있다. 전술한 면역자극성 및/또는 항-종양 면역 기전에서의 변화는 예를 들어, T 세포 증식 또는 세포독성에 대한 시험관 내 검정, 시험관 내 항원 제시 검정, (예컨대, 특정 마커의) 발현 검정 및/또는 (예컨대, 사이토카인의) 세포 분비 검정을 사용하여 평가할 수 있다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 효과기 분자에 의한 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역억제성 반응에서 (예를 들어, 전신으로 또는 종양 미세환경에서) 적어도 10%(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 200%)만큼의 감소를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 먼역억제성 반응에서 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%만큼의 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 먼역억제성 반응에서 10~20%, 10~30%, 10~40%, 10~50%, 10~60%, 10~70%, 10~80%, 10~90%, 10~100%, 10~200%, 20~30%, 20~40%, 20~50%, 20~60%, 20~70%, 20~80%, 20~90%, 20~100%, 20~200%, 50~60%, 50~70%, 50~80%, 50~90%, 50~100%, 또는 50~200%만큼의 감소를 초래한다. 예를 들어, 전신적으로 또는 종양 미세환경에서 면역억제성 반응의 "감소"는 효과기 분자(들)의 부재 하에 발생할 면역억제성 반응에 대해 상대적인 것으로 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 효과기 분자에 의한 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역억제성 반응에서 (예를 들어, 전신으로 또는 종양 미세환경에서) 적어도 2배(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50, 또는 100배)만큼의 감소를 초래한다. 예를 들어, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역억제성 반응에서 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배만큼의 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-매개 면역억제성 기전의 조절은 면역억제성 반응에서 2~10, 2~20, 2~30, 2~40, 2~50, 2~60, 2~70, 2~80, 2~90, 또는 2~100배 만큼의 감소를 초래한다.

면역억제성 기전의 비제한적인 예는 음성 공동자극 신호 전달, 세포독성 세포(예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포)의 친세포자멸사 신호 전달, T 조절(Treg) 세포 신호 전달, 종양 관문 분자 생산/유지, 골수-유래 억제 인자 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원, 면역억제 인자/대사 산물 생산 및/또는 혈관 내피 성장 인자 신호 전달을 포함한다. 효과기 분자는 전술한 면역억제성 기전 중 적어도 하나(하나 이상)를 억제하여, 면역억제성 반응에서의 감소를 초래할 수 있다. 전술한 면역억제성 기전에서의 변화는, 예를 들어, T 세포 증식에서의 증가 및/또는 IFNγ 생산에서의 증가(음성 공동-자극 신호 전달, T_reg 세포 신호 전달 및/또는 MDSC); 아넥신 V/PI 유동 염색(친세포자멸사 신호 전달); 발현, 예컨대, PDL1 발현에 대한 유동 염색(종양 관문 분자 생산/유지); ELISA, LUMINEX®, qPCR을 통한 RNA, 효소적 검정, 예컨대, IDO 트립토판 이화작용(면역억제성 인자/대사산물 생산); 및 PI3K, Akt, p38의 인산화(VEGF 신호 전달)에 대해 검정함으로써 평가할 수 있다.

일부 구현예에서, 효과기 분자는 부가적으로 기능하는데, 예를 들어, 2개의 효과기 분자의 효과는 별도로 기능하는 2개 효과기 분자의 효과의 합과 동등할 수 있다. 다른 구현예에서, 효과기 분자는 상승적으로 기능하는데, 예를 들어, 2개의 효과기 분자의 효과는 2개의 효과기 분자의 기능의 합보다 더 클 수 있다.

종양-매개 면역억제성 기전을 조절하고/하거나 종양 미세환경을 변형하는 효과기 분자는, 예를 들어, 분비된 인자(예를 들어, 면역계에 관여된 세포외 기전을 조절하는 사이토카인, 케모카인, 항체 및/또는 유인 수용체), 억제제(예를 들어, 항체, 항체 단편, 리간드 TRAP 및/또는 작은 차단 펩티드), 세포 상태를 조절하는 세포내 인자(예컨대, 친-염증성 성질을 향상시키도록 세포의 상태를 조절하는 마이크로RNA 및/또는 전사 인자), 엑소좀 내로 패키징된 인자 (예를 들어, 마이크로RNA, 세포질 인자 및/또는 세포외 인자), 표면 전시된 인자(예를 들어, 관문 억제제, TRAIL) 및/또는 대사 유전자(예를 들어, 대사산물 또는 아미노산을 생산/조절 또는 분해하는 효소)일 수 있다.

일부 구현예에서, 효과기 분자 중 적어도 하나는 종양 미세환경에서 면역자극성 기전을 자극하고/하거나 종양 미세환경에서 면역억제성 기전을 억제한다.

일부 구현예에서, 효과기 분자 중 적어도 하나는 (a) T 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하고/하거나, (b) 항원 제시 및/또는 가공을 자극하고/하거나, (c) 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하고/하거나, (d) 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하고/하거나, (e) 면역 세포 동원을 자극하고/하거나, (f) 전-염증성 대식세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 항-염증성 대식세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (g) 간질 분해를 자극하고/하거나, (h) 면역자극 대사산물 생산을 자극하고/하거나, (i) I형 인터페론 신호 전달을 자극하고/하거나, (j) 음성 공동자극 신호 전달을 억제하고/하거나, (k) 항-종양 면역 세포의 친세포자멸사 신호 전달을 억제하고/하거나, (l) T 조절(T_reg) 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (m) 종양 관문 분자를 억제하고/하거나, (n) 인터페론 유전자의 자극 인자(STING) 신호 전달을 자극하고/하거나, (o) 골수-유래된 억제 인자 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하고/하거나, (p) 면역억제 인자/대사 산물을 분해하고/하거나, (q) 혈관 내피 성장 인자 신호 전달을 억제하고/하거나, (r) 종양 세포를 직접적으로 사멸시킨다.

일부 구현예에서, 효과기 분자는 다음의 분자의 비제한적인 부류로부터 선택될 수 있다: 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드 및 효소. 전술한 부류의 효과기 분자의 비제한적인 예는 표 1에 나열되어 있고 예시적인 효과기 분자를 암호화하는 특이적 서열은 표 2에 나열되어 있다. 효과기 분자는 인간, 예컨대, 표 1 또는 표 2에 나열된 것 또는 표 1 또는 표 2에 나열된 쥣과 효과기 분자의 인간 등가물일 수 있다. 효과기 분자는 인간 유래, 예컨대, 내인성 인간 효과기 분자일 수 있거나, 효과기 분자는 기능을 위해 변형 및/또는 최적화, 예컨대, 발현을 최적화하기 위해 코돈 최적화되거나 안정성을 개선하도록 변형되거나, 이의 신호 서열에서 변형된다(하기 참고). 기능을 최적화하기 위한 다양한 프로그램 및 알고리즘이 당업자에게 알려져 있으며, 원하는 개선, 예컨대, 특이적 종(예컨대, 인간, 마우스, 박테리아 등)에 대한 코돈 최적화에 기반하여 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 효과기 분자는 인터류킨 12(IL-12), 예를 들어, 일반적으로 IL12p70으로 당업계에 지칭되는 이량체로 p35 및 p40을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 효과기 분자는 IL12p70 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, IL12p70 융합 단백질은 인간 IL12p70 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 인간 IL12p70 융합 단백질은 서열번호 203에 도시된 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 효과기 분자는 인터류킨 15(IL-15)를 포함한다. 일부 구현예에서, 효과기 분자는 IL-15로 구성된다(예를 들어, 서열번호 199 참조). 일부 구현예에서, 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15 수용체 α(IL-15Rα)의 세포외 부분, 예컨대 서열번호 201에 나타낸 바와 같은 스시 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 예시적인 IL-15/IL-15Rα 스시 도메인 융합은 서열번호 202에 제공된다.

분비 신호 및 신호 앵커

본원에 제공된 키메라 단백질의 하나 이상의 효과기 분자는, 분비 또는 막 국소화(막 삽입으로도 지칭됨)를 위해 새롭게 합성된 단백질을 적절한 단백질 가공 경로로 유도하는, 키메라 단백질의 N-말단(예를 들어, S - C - MT의 경우, 효과기 분자의 N-말단)에서 분비 신호 펩티드(신호 펩티드 또는 신호 서열로도 지칭됨)를 갖는 분비성 효과기 분자일 수 있다. 식 MT - C - S를 갖는 키메라 단백질의 경우, 막 테더링 도메인은 일반적으로 막 국소화를 위해 새롭게 합성된 단백질을 적절한 단백질 가공 경로로 유도하는 신호-앵커 서열(예를 들어, II형 막관통 단백질의 신호-앵커 서열)을 갖는다. 식 S - C - MT를 갖는 키메라 단백질의 경우, 일반적으로 별도의 분비 신호 펩티드 없이, 막 국소화를 위해 새롭게 합성된 단백질을 적절한 단백질 가공 경로로 유도하는, 역 신호-앵커 서열(예를 들어, 특정 III형 막관통 단백질의 신호-앵커 서열)을 갖는 막 테더링 도메인이 사용될 수 있다.

일반적으로, 본원에 기재된 모든 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 하나 이상의 효과기 분자는 분비성 효과기 분자이다(식 S - C - MT 또는 MT - C - S에서, "S"로 지칭됨). 2개 이상의 키메라 단백질을 갖는 구현예에서, 각각의 키메라 단백질은 분비 신호를 포함할 수 있다. 2개 이상의 키메라 단백질을 갖는 구현예에서, 각각의 키메라 단백질은 각각의 효과기 분자가 프로테아제 절단 부위의 절단 후 조작된 세포로부터 분비될 수 있도록 분비 신호를 포함할 수 있다.

효과기 분자와 작동가능하게 연결된 분비 신호 펩티드는 천연 분비 신호 펩티드 (예를 들어, 주어진 효과기 분자와 일반적으로 내인성으로 연관된 분비 신호 펩티드)일 수 있다. 효과기 분자와 작동 가능하게 연결된 분비 신호 펩티드는 비-천연 분비 신호 펩티드 천연 분비 신호 펩티드일 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드는 종양 미세환경과 같은 특정 환경에서 분비 유지와 같은 발현 및 기능 개선을 촉진할 수 있다. 비-천연 분비 신호 펩티드의 비제한적인 예는 표 3에 도시되어 있다.

프로테아제 절단 부위

특정 구현예에서, 본원에 제공된 키메라 단백질(예를 들어, 일반적으로, 본원에 기재된 모든 막 절단 가능 키메라 단백질)은 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우 식 S - C - MT 또는 MT - C - S에서 "C"로 지칭됨)를 함유한다. 일반적으로, 프로테아제 절단 부위는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 임의의 아미노산 서열 모티프일 수 있다. 프로테아제 절단 부위의 예는, 이에 한정되지는 않으나, 1형 막관통 프로테아제 절단 부위, II형 막관통 프로테아제 절단 부위, GPI 고정 프로테아제 절단 부위, ADAM8 프로테아제 절단 부위, ADAM9 프로테아제 절단 부위, ADAM10 프로테아제 절단 부위, ADAM12 프로테아제 절단 부위, ADAM15 프로테아제 절단 부위, ADAM17 프로테아제 절단 부위, ADAM19 프로테아제 절단 부위, ADAM20 프로테아제 절단 부위, ADAM21 프로테아제 절단 부위, ADAM28 프로테아제 절단 부위, ADAM30 프로테아제 절단 부위, ADAM33 프로테아제 절단 부위, BACE1 프로테아제 절단 부위, BACE2 프로테아제 절단 부위, SIP 프로테아제 절단 부위, MT1-MMP 프로테아제 절단 부위, MT3-MMP 프로테아제 절단 부위, MT5-MMP 프로테아제 절단 부위, 퓨린 프로테아제 절단 부위, PCSK7 프로테아제 절단 부위, 마트립타아제 프로테아제 절단 부위, 마트립타아제-2 프로테아제 절단 부위, MMP9 프로테아제 절단 부위, 또는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함한다.

프로테아제 절단 부위의 일 예는, NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 절단 부위를 포함하지만 이에 한정되지 않는, C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3) 프로테아제 절단 부위이다. 다양한 HCV 균주에 대한 NS3 프로테아제 및 이의 절단 부위의 대표적인 서열에 대한 설명은, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 S.L. Tan(ed.)의 문헌[Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology (S.L. Tan ed., Taylor & Francis, 2006), Chapter 6, pp. 163-206]을 참조한다. 예를 들어, HCV NS4A/4B 프로테아제 절단 부위; HCV NS5A/5B 프로테아제 절단 부위; NS4A/4B 프로테아제 절단 부위를 갖는 C-말단 데그론; HCV NS5A/5B 프로테아제 절단 부위를 갖는 N-말단 데그론의 서열이 제공된다. 대표적인 NS3 서열은 국립 생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 데이터베이스에 열거되어 있다. 예를 들어, 다음의 NCBI 항목을 참조한다: 수탁 번호 YP_001491553, YP_001469631, YP_001469632, NP_803144, NP_671491, YP_001469634, YP_001469630, YP_001469633, ADA68311, ADA68307, AFP99000, AFP98987, ADA68322, AFP99033, ADA68330, AFP99056, AFP99041, CBF60982, CBF60817, AHH29575, AIZ00747, AIZ00744, ABI36969, ABN05226, KF516075, KF516074, KF516056, AB826684, AB826683, JX171009, JX171008, JX171000, EU847455, EF154714, GU085487, JX171065, JX171063; (본 출원의 출원일까지 입력된 바와 같은) 이들 서열 모두가 참조로서 본원에 통합된다.

프로테아제 절단 부위의 또 다른 예는 ADAM17-특이적 프로테아제(종양 괴사 인자-α 전환 효소[TACE]로도 지칭됨) 절단 부위이다. ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의해 자연적으로 절단되는 기질의 내인성 서열일 수 있다. ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의해 절단될 수 있는 조작된 서열일 수 있다. 조작된 ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위는 키메라 단백질의 최적의 발현, ADAM17에 대한 특이성, ADAM17에 의한 절단 속도, 분비된 및 막에 결합된 키메라 단백질 수준의 비율, 및 상이한 세포 상태에서의 절단을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 구체적으로 원하는 특성을 위해 조작될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의한 특이적 절단을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, ADAM17에 의해 절단될 수 있는 특정 프로테아제 절단 부위는 또한 ADAM10과 같은 추가 ADAM 패밀리 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 따라서, ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위는 ADAM10과 같은 다른 프로테아제에 의한 절단이 감소되거나 제거되도록 선택되고/되거나 조작될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의한 절단 속도에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, ADAM17에 의해 자연적으로 절단되는 기질의 내인성 서열과 비교하여 감소된 절단 동역학과 같은, ADAM17에 의한 특이적 절단 속도를 나타내는 프로테아제 절단 부위를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 일반적으로, 키메라 단백질의 가공 속도를 조절하기 위해 특정 절단 속도가 선택될 수 있으며, 이는 결국 페이로드 효과기 분자의 방출/분비 속도를 조절한다. 따라서, ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위는 서열이 ADAM17에 의한 원하는 절단 속도를 나타내도록 선택 및/또는 조작될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의한 특이적 절단 및 ADAM17에 의한 절단 속도 둘 다에 대해 선택될 수 있다. 특정 특이성 및 절단 속도 동역학을 나타내는 것을 포함하는, 예시적인 ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위가 절단 부위(P5-P1: N-말단; P1'-P5': C-말단)를 참조하여 아래 표 4A에 나타나 있다. 발현 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 ADAM17 및 ADAM10의 추가의 세부 사항은 Sharma 등의 문헌[(J Immunol October 15, 2017, 199 (8) 2865-2872)], Pham 등의 문헌[(Anticancer Res. 2017 Oct;37(10):5507-5513)], Caescu 등의 문헌[(Biochem J. 2009 Oct 23; 424(1): 79-88)], 및 Tucher 등의 문헌[(J. Proteome Res. 2014, 13, 4, 2205-2214)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 KGG의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역(서열번호 177)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG의 아미노산 서열(서열번호 178)을 포함하되, X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X₂는 V, L, S, I, Y, T, 또는 A이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되, X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고, X₂는 V, L, S, I, Y, 또는 T이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 187, 189 및 191의 프로테아제 절단 부위는 ADAM17에 의해 절단될 수 있다.

일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 CD16에 고유하고 ADAM17에 의해 절단 가능한 절단 부위인 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함한다.

프로테아제 절단 부위는 분비성 효과기 분자의 C-말단일 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 분비성 효과기 분자의 N-말단일 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 모든 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 프로테아제 절단 부위는 다음 중 하나이다: (1) 분비성 효과기 분자의 C-말단 및 세포막 테더링 도메인의 N-말단(즉, 프로테아제 절단 부위는 분비성 효과기 분자와 세포막 테더링 도메인 사이에 있음); 또는 (2) 분비성 효과기 분자의 N-말단 및 세포막 테더링 도메인의 C-말단(또한 분비성 효과기 분자와 도메인 배향이 역전된 세포막 테더링 도메인 사이에 있음). 프로테아제 절단 부위는 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 효과기 분자 또는 프로테아제 절단 부위의 일부로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 분비성 효과기 분자에 연결될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 세포 막 테더링 도메인 또는 프로테아제 절단 부위의 일부인 것으로 간주되지 않는, 폴리펩티드 서열에 의해 세포 막 테더링 도메인에 연결될 수 있다. 폴리펩티드 링커는 제1 폴리펩티드 서열과 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 폴리펩티드 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)일 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는, 이에 한정되지는 않으나, GSG 링커(예를 들어, [GS]₄GG[서열번호 182]), A(EAAAK)₃A(서열번호 183), 및 Whitlow 링커(예를 들어, 아미노산 서열 KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 184)와 같은 "KEGS" 링커 및 아미노산 서열 EGKSSGSGSESKST(서열번호 185)와 같은 eGK 링커, 및 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제5,990,275호에 더욱 상세히 기재된 링커)를 포함한다. 추가적인 예시적인 폴리펩티드 링커는 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197을 포함한다. 다른 폴리펩티드 링커는 원하는 특성(예를 들어, 길이, 유연성, 아미노산 조성물 등)에 기초하여 선택될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다.

막 절단 가능 시스템에서, 키메라 단백질의 발현 및 세포막 내로의 국소화에 이어서, 프로테아제 절단 부위는 효과기 분자가 세포의 세포외 공간으로 방출("분비")되도록 키메라 단백질의 절단을 유도한다.

일반적으로, 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 해당 특이적 프로테아제 절단 부위에 특이적인 프로테아제이다. 예를 들어, 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제("ADAM") 패밀리 프로테아제의 경우, 특이적 ADAM 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 일반적으로 특이적 ADAM 프로테아제 절단 부위 모티프를 특이적으로 인식하는 ADAM 프로테아제(들)로 제한된다. 프로테아제 절단 부위는 원하지 않는 프로테아제에 의한 절단이 감소되거나 제거되도록 선택되고/되거나 조작될 수 있다. 프로테아제는 막 결합되거나 막 연결될 수 있다. 프로테아제는, 예를 들어, 종양 미세환경("TME")과 같은 특정 세포 환경에서 분비될 수 있다.

키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 키메라 단백질을 발현하는 동일한 세포에서 발현될 수 있다. 키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 키메라 단백질을 발현하는 세포에 내인성일 수 있다. 즉, 키메라 단백질을 발현하도록 조작된 세포는 키메라 단백질에 존재하는 프로테아제 절단 부위에 특이적인 프로테아제를 내인성으로 발현할 수 있다. 프로테아제의 내인성 발현은 일반적으로 항상성 조건(예를 들어, 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 세포) 하에서의 발현과, 비 항상성 조건 하에서의 차등 발현(예를 들어, 종양 세포에서의 상향 조절된 발현) 모두를 지칭한다. 프로테아제 절단 부위는 원하는 세포 집단에 의해 내인성으로 발현되는, 공지된 프로테아제에 기초하여 선택될 수 있다. 이러한 경우, 일반적으로, 프로테아제 절단 부위의 절단(및 이에 따른 페이로드의 방출/분비)은 세포-제한 프로테아제로 인해 동일한 세포에서 발현된 키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위와 접촉할 필요가 있는 관심 세포로만 제한될 수 있다. 예를 들어, 이론에 구속되고자 함이 없이, ADAM17은 내인성 발현이 NK 세포 및 T 세포로 제한되는 것으로 여겨진다. 따라서, ADAM17-특이적 프로테아제 절단 부위의 선택은 키메라 단백질을 공발현하는 NK 세포 및 T 세포로 프로테아제 절단 부위의 절단을 제한할 수 있다. 다른 예에서, 프로테아제 절단 부위는 관심있는 특정 종양 집단(예를 들어, 키메라 단백질을 발현하도록 조작된 특정 종양 세포)에서 발현되는 것으로 알려진 특정 종양 관련 프로테아제에 대해 선택될 수 있다. 프로테아제 및/또는 발현 데이터베이스는 적절한 프로테아제 절단 부위를 선택, 예컨대, 각각이 사실상 참조로서 본원에 통합된, 온코민(www.oncomine.org), 유럽 생물정보 연구소(www.ebi.ac.uk), 특히 (www.ebi.ac.uk/gxa), PMAP(www.proteolysis.org), ExPASy 펩티드 절단기(ca.expasy.org/tools/peptide cutter) 및 PMAP 절단 DB (cutdb.burnham.org)의 상담을 통해 종양 연관 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제 절단 부위를 선택하는데 사용될 수 있다.

키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 키메라 단백질을 발현하는 세포에 대해 이종일 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질을 발현하도록 조작된 세포는 또한 키메라 단백질에 존재하는 프로테아제 절단 부위에 특이적인 세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는 프로테아제를 발현하도록 조작될 수 있다. 키메라 단백질 및 프로테아제 둘 다를 발현하도록 조작된 세포는 별도의 조작된 핵산으로부터 또는 다중시스트론 시스템으로부터 각각을 발현하도록 조작될 수 있다(다중시스트론 및 다중-프로모터 시스템은 본원에서 "다중시스트론 및 다중 프로모터 시스템"이라는 제목의 섹션에 보다 상세히 기술된다). 이종 프로테아제 및 이들의 상응하는 프로테아제 절단 부위는 내인성 프로테아제를 참조하여 전술한 바와 같이 선택될 수 있다.

키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 키메라 단백질을 발현하는 세포와는 구별되는 별도의 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제는 일반적으로 종양 미세환경과 같은 특정 세포 환경에서 발현될 수 있다. 이러한 경우, 일반적으로, 프로테아제 절단 부위의 절단은, 환경 제한 프로테아제로 인해 프로테아제 절단 부위와 접촉할 필요가 있는 관심 세포 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에만 제한될 수 있다. 막 절단 가능 키메라 단백질을 갖는 구현예에서, 일반적으로, 효과기 분자의 분비는 환경 제한 프로테아제로 인해 프로테아제 절단 부위와 접촉할 필요가 있는 관심 세포 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에만 제한될 수 있다. 키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 별도의 구별되는 세포에 대해 내인성일 수 있다. 키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 프로테아제는 별도의 구별되는 세포에 대해 이종일 수 있다. 예를 들어, 별도의 구별되는 세포는 일반적으로 별도의 구별되는 세포에 의해 발현되지 않는 프로테아제를 발현하도록 조작될 수 있다.

프로테아제는, 이에 한정되지는 않으나, 다음을 포함한다: 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제. 프로테아제는 NS3 프로테아제일 수 있다. 프로테아제는 ADAM17 프로테아제일 수 있다.

프로테아제는 카텝신, 시스테인 프로테아제, 아스파틸 프로테아제, 세린 프로테아제, 또는 메탈로프로테아제와 같은 종양 연관 프로테아제일 수 있다. 종양 연관 프로테아제의 구체적인 예는, 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 S, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 A, 카텝신 G, 트롬빈, 플라스민, 유로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 메탈로프로테이나제 1(MMP1), MMP2, MMP3, MMP4, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP20, MMP21, MMP23, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, ADAM, ADAMTS, CD10(CALLA) 또는 전립선 특이적 항원을 포함한다. 프로테아제는 또한 하기 표 4B에 열거된 프로테아제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 프로테아제에 대한 예시적인 동족 프로테아제 절단 부위도 표 4B에 열거되어 있다.

프로테아제는 다음의 인간 프로테아제 중 어느 하나일 수 있다(괄호로 제공된 MEROPS 펩티다아제 데이터베이스 번호; Rawlings N. D., Morton F. R., Kok, C. Y., Kong, J. & Barrett A. J. (2008) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 36 Database issue, D320-325; 사실상 참조로서 본원에 통합됨): 펩신 A(MER000885), 가스트릭신(MER000894), 메맙신-2(MER005870), 레닌(MER000917), 카텝신 D(MER000911), 카텝신 E(MER000944), 메맙신-1(MER005534), 납신 A(MER004981), 메르네임-AA034 펩티다아제(MER014038), 펩신 A4(MER037290), 펩신 A5(호모 사피엔스)(MER037291), hCG1733572(호모 사이엔스)-유형 추정 펩티다아제(MER107386), 납신 B 위유전자(MER004982), CYMP g.p. (호모 사피엔스)(MER002929), 서브패밀리 A1A 미할당 펩티다아제(MER181559), 마우스 유방 종양 바이러스 레트로펩신(MER048030), 토끼 내인성 레트로바이러스 엔도펩티다아제(MER043650), S71-관련 인간 내인성 레트로펩신(MER001812), RTVL-H-형 추정 펩티다아제(MER047117), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047133), RTVL-H-형 추정 펩티다아제(MER047160), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047206), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047253), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047260), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047291), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047418), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047440), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047479), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047559), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER047583), RTVL-H형 추정 펩티다아제(MER015446), 인간 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 상동체 1(MER015479), 인간 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 상동체 2(MER015481), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 1(호모 사피엔스 염색체 14)(MER029977), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 2(호모 사피엔스 염색체 8)(MER029665), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 3(호모 사피엔스 염색체 17)(MER002660), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 3(호모 사피엔스 염색체 17)(MER030286), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 3(호모 사피엔스 염색체 17)(MER047144), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 5(호모 사피엔스 염색체 12)(MER029664), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 6(호모 사피엔스 염색체 7)(MER002094), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 7(호모 사피엔스 염색체 6)(MER029776), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 8(호모 사피엔스 염색체 Y)(MER030291), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 9(호모 사피엔스 염색체 19)(MER029680), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 10(호모 사피엔스 염색체 12) (MER002848), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 11(호모 사피엔스 염색체 17)(MER004378), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 12(호모 사피엔스 염색체 11)(MER003344), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 13(호모 사피엔스 염색체 2 및 유사)(MER029779), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 14(호모 사피엔스 염색체 2)(MER029778), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 15(호모 사피엔스 염색체 4)(MER047158), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 15(호모 사피엔스 염색체 4)(MER047332), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 15(호모 사피엔스 염색체 4)(MER003182), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER047165), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER047178), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER047200), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER047315), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER047405), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 16(MER030292), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 17(호모 사피엔스 염색체 8)(MER005305), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 18(호모 사피엔스 염색체 4)(MER030288), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 19(호모 사피엔스 염색체 16)(MER001740), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 21(호모 사피엔스)(MER047222), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 21(호모 사피엔스)(MER047454), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 21(호모 사피엔스)(MER047477), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 21(호모 사피엔스)(MER004403), 내인성 레트로바이러스 레트로펩신 위유전자 22(호모 사피엔스 염색체 X)(MER030287), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047046), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047052), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047076), 서브패밀리 A2A 비펩티다아제 상동체(MER047080), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047088), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047089), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047091), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047092), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047093), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047094), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047097), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047099), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 MER047101), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047102), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047107), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047108), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047109), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047110), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 MER047111), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047114), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047118), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047121), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047122), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047126), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047129), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047130), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047134), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047135), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047137), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047140), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047141), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047142), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047148), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047149), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047151), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047154), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047155), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047156), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047157), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047159), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047161), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047163), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047166), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047171), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047173), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체 (MER047174), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047179), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047183), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047186), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047190), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047191), 서브패밀리 A2A 비-펩티다아제 상동체(MER047196), 서브패밀리 A2A 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DJ-1 추정 펩티다아제(MER003390). 메르네임-AA100 추정 펩티다아제(MER014802). 메르네임-AA101 비펩티다아제 상동체(MER014803). KIAA0361 단백질(호모 사피엔스-형)(MER042827). F1134283 단백질(호모 사피엔스)(MER044553). 비-펩티다아제 상동체 염색체 21 열린 해독틀 33(호모 사피엔스)(MER160094). 패밀리 C56 비-펩티다아제 상동체(MER177016), 패밀리 C56 비-펩티다아제 상동체(MER176613). 패밀리 C56 비펩티다아제 상동체(MER176918). 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2를 함유하는 EGF-유사 모듈(MER037230). CD97 항원(인간형)(MER037286). 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 3을 함유하는 EGF-유사 모듈(MER037288). 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1을 함유하는 EGF-유사 모듈(MER037278). 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 4를 함유하는 EGF-유사 모듈(MER037294). 캐드헤린 EGF LAG 7-패스 G형 수용체 2 전구체(호모 사피엔스)(MER045397), Gpr64(무스 무스쿨루스)-형 단백질(MER123205). GPR56(호모 사피엔스)-형 단백질(MER122057). 라트로필린 2(MER122199). 라트로필린-1(MER126380). 라트로필린 3 (MER124612). 프로토캐드헤린 플라밍고 2(MER124239). ETL 단백질(MER126267). G 단백질 결합 수용체 112(MER126114). 7개의 막관통 나선 수용체(MER125448). Gpr114 단백질(MER159320). GPR126 혈관 유도성 G 단백질 결합 수용체(MER140015). GPR125(호모 사피엔스)-형 단백질(MER159279). GPR116(호모 사피엔스)-형 G-단백질 결합 수용체(MER159280). GPR128(호모 사피엔스)-형 G-단백질 결합 수용체(MER162015). GPR133(호모 사피엔스)-형 단백질(MER159334) GPR110 G-단백질 결합 수용체(MER159277), GPR97 단백질(MER159322), KPG_006 단백질(MER161773) KPG_008 단백질(MER161835), KPG_009 단백질(MER159335), 미할당 상동체(MER166269), GPR113 단백질(MER159352), 뇌 특이적 혈관 신생 억제제 2(MER159746), PIDD 자동 처리 단백질 단위 1(MER020001), PIDD 자동 처리 단백질 단위 2(MER063690), MUC1 자가 절단 뮤신(MER074260), 디스트로글리칸(MER054741), 프로단백질 전환효소 9(MER022416), 사이트-1 펩티다아제(MER001948), 퓨린(MER000375), 프로단백질 전환효소 1(MER000376), 프로단백질 전환효소 2(MER000377), 프로단백질 전환효소 4(MER028255), PACE4 프로단백질 전환효소(MER000383), 프로단백질 전환효소 5(MER002578), 프로단백질 전환효소 7(MER002984), 트리펩티딜-펩티다아제 II(MER000355), 서브패밀리 S8A 비-펩티다아제 상동체(MER201339), 서브패밀리 S8A 비-펩티다아제 상동체(MER191613), 서브패밀리 S8A 미할당 펩티다아제(MER191611), 서브패밀리 S8A 미할당 펩티다아제(MER191612), 서브패밀리 S8A 미할당 펩티다아제(MER191614), 트리펩티딜-펩티다아제 I(MER003575), 프롤릴 올리고펩티다아제(MER000393), 디펩티딜-펩티다아제 IV(진핵)(MER000401), 아실아미노아실-펩티다아제(MER000408), 섬유아세포 활성화 단백질 알파 서브유닛(MER000399), PREPL A 단백질(MER004227), 디펩티딜-펩티다아제 8(MER013484), 디펩티딜-펩티다아제 9(MER004923), FLJ1 추정 펩티다아제(MER017240), 메르네임-AA194 추정 펩티다아제(MER017353), 메르네임-AA195 추정 펩티다아제(MER017367), 메르네임-AA196 추정 펩티다아제(MER017368), 메르네임-AA197 추정 펩티다아제(MER017371), C14orf29 단백질(MER033244), 가상 단백질(MER033245), 가상 에스테라아제/리파아제/티오에스테라아제(MER047309), 단백질 bat5(MER037840), 가상 단백질 flj40219(MER033212), 가상 단백질 flj37464(MER033240), 가상 단백질 flj33678(MER033241), 디펩티딜펩티다아제 상동체 DPP6(MER000403), 디펩티딜펩티다아제 상동체 DPP10(MER005988), 무스 무스쿨루스 염색체 20 열린 해독틀 135와 유사한 단백질(MER037845), 키뉴레닌 포르마미다아제(MER046020), 티로글로불린 전구체(MER011604), 아세틸콜린에스테라아제(MER033188), 콜린에스테라아제(MER033198), 카르복실에스테라아제 D1(MER033213), 간 카르복실에스테라아제(MER033220), 카르복실에스테라아제 3(MER033224), 카르복실에스테라아제 2(MER033226), 담즙산염 의존성 리파아제(MER033227), 카르복실에스테라아제-관련 단백질(MER033231), 뉴로리진 3(MER033232), 뉴로리진 4, X-연결(MER033235), 뉴로리진 4, Y-연결(MER033236), 에스테라아제 D(MER043126), 아릴아세트아미드 탈아세틸화효소(MER033237), KIAA1363-유사 단백질(MER033242), 호르몬 민감성 리파아제(MER033274), 뉴로리진 1(MER033280), 뉴로리진 2(MER033283), 패밀리 S9 비-펩티다아제 상동체(MER212939), 패밀리 S9 비-펩티다아제 상동체(MER211490), 서브패밀리 S9C 미할당 펩티다아제(MER192341), 패밀리 S9 미할당 펩티다아제(MER209181), 패밀리 S9 미할당 펩티다아제(MER200434), 패밀리 S9 미할당 펩티다아제(MER209507), 패밀리 S9 미할당 펩티다아제(MER209142), 세린 카르복시펩티다아제 A(MER000430), 비텔로겐 카르복시펩티다아제-유사 단백질(MER005492), RISC 펩티다아제(MER010960), 패밀리 S15 미할당 펩티다아제(MER199442), 패밀리 S15 미할당 펩티다아제(MER200437), 패밀리 S15 미할당 펩티다아제(MER212825), 리소좀 Pro-Xaa 카르복시펩티다아제(MER000446), 디펩티딜-펩티다아제 II(MER004952), 흉선-특이적 세린 펩티다아제(MER005538), 에폭시드 가수분해 효소-유사 추정 펩티다아제(MER031614), Loc328574-유사 단백질(MER033246), 아브하이드롤라아제 도메인-함유 단백질 4(MER031616), 에폭시드 가수분해효소(MER000432), 중배엽 특이적 전사 단백질(MER199890), 중배엽 특이적 전사 단백질(MER017123), 세포질 에폭시드 가수분해효소(MER029997), 세포질 에폭시드 가수분해효소(MER213866), 가상 단백질 FLJ22408과 유사(MER031608), CGI-58 추정 펩티다아제(MER030163), 윌리엄스-버우렌 증후군 임계 영역 단백질 21 에폭시드 가수분해 효소(MER031610), 에폭시드 가수분해효소(MER031612), 가상 단백질 flj22408(에폭시드 가수분해 효소)(MER031617), 모노글리세리드 리파아제(MER033247), 가상 단백질(MER033249), 발라시클로비르 가수분해효소(MER033259), Ccg1-상호작용 인자 b(MER210738).

프로테아제 효소 활성은 조절될 수 있다. 예를 들어, 특정 프로테아제는 (예를 들어, 특정 소분자 억제제와 같은 프로테아제에 결합하는) 특정 제제의 존재 또는 부재에 의해 불활성화될 수 있다. 이러한 프로테아제는 "억제성 프로테아제"로 지칭될 수 있다. 특정 프로테아제에 대한 예시적인 억제제는 표 4B에 열거되어 있다. 예를 들어, NS3 프로테아제는, 이에 제한되지 않지만, 시메프레비르, 다노프레비르, 아수나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실로프레비르를 포함하는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있다. 또 다른 예에서, 프로테아제 활성은, 유도성 프로모터 시스템(예를 들어, Tet 온/오프 시스템) 또는 세포 특이적 프로모터(본원 "프로모터"라는 제목의 섹션에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이종 프로테아제를 발현하는 데 사용될 수 있는 프로모터)를 사용하여 프로테아제를 발현하도록 세포를 조작하는 것과 같이, 프로테아제 자체의 발현을 조절함으로써 조절될 수 있다. 프로테아제는 또한 본원에 기재된 데그론 중 임의의 것과 같은 데그론을 함유할 수 있고, 본원에 기재된 데그론 시스템 중 어느 하나를 사용하여 조절될 수 있다.

프로테아제 효소 활성은 또한 특이적 프로테아제 절단 부위의 선택을 통해 조절될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 절단 부위는, 원하는 프로테아제에 의한 원하는 절단 속도, 예컨대, 원하는 프로테아제에 의해 자연적으로 절단된 기질의 내인성 서열에 비해 감소된 절단 동역학을 나타내도록 선택되고/되거나 조작될 수 있다. 다른 예로서, 프로테아제 절단 부위는 서열이 세포 상태 특이적 방식으로 원하는 절단 속도를 나타내도록 선택 및/또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포 상태는 (예를 들어, 면역 세포 활성화와 같은 세포 신호 전달 후) 특정 프로테아제의 발현 및/또는 국소화에 영향을 미칠 수 있다. 예시적인 예로서, ADAM17 단백질 수준 및 국소화는, 예를 들어, 단백질 키나아제 C(PKC) 신호 전달 경로(예를 들어, PKC 활성 인자 포르볼-12-미리스태트-13-아세테이트[PMA])의한 활성화)를 통한 신호 전달에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서, 프로테아제 절단 부위는, 특정 세포 상태에서 프로테아제 특성(예를 들어, 발현 및/또는 국소화)에 따라, 원하는 대로, 프로테아제 절단 부위의 절단 및 효과기 분자의 후속 방출이 증가되거나 감소되도록 선택되고/되거나 조작될 수 있다. 또 다른 실시예로서, 프로테아제 절단 부위가 (특히 특이적 막 테더링 도메인과 조합되어) 키메라 단백질의 최적의 단백질 발현을 위해 선택되고/되거나 조작될 수 있다.

세포막 테더링 도메인

본원에 제공된 막 절단 가능 키메라 단백질은 세포-막 테더링 도메인(식 S - C - MT 또는 MT - C - S에서 "MT"로 지칭됨)을 함유한다. 일반적으로, 세포-막 테더링 도메인은 키메라 단백질을 발현하는 세포의 세포막에 키메라 단백질을 국소화(예를 들어, 삽입)하거나, 그렇지 않으면 연결되도록 유도할 수 있는 임의의 아미노산 서열 모티프일 수 있다. 세포-막 테더링 도메인은 막관통-세포내 도메인일 수 있다. 세포-막 테더링 도메인은 막관통 도메인일 수 있다. 세포-막 테더링 도메인은 내재성 막 단백질 도메인(예를 들어, 막관통 도메인)일 수 있다. 세포-막 테더링 도메인은 I형, II형, 또는 III형 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 세포-막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키기 위해 번역 후 변형이 가능한 모티프를 포함하며, 여기서 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있다. 번역 후 변형 태그의 예는 지질-앵커 도메인(예를 들어, GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 또는 팔미토일화 태그)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 세포-막 테더링 도메인의 예는 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-사슬, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래된 막관통-세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포-막 테더링 도메인은 B-71 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV(서열번호 204)를 포함한다.

일부 구현예에서, 세포-막 테더링 도메인은 CD8 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 임의의 적합한 CD8 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CD8 폴리펩티드는, 제한 없이, NCBI 참조 번호 NP_001139345 및 AAA92533.1을 포함한다. CD8 막관통 도메인의 예는 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 205), IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR(서열번호 206), 및 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(서열번호 207)을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 205)를 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR(서열번호 206)을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(서열번호 207)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포-막 테더링 도메인은 CD8에서 유래된 힌지 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8 힌지는 서열 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 208)를 포함한다. 일부 구현예에서, CD8 힌지는 서열 AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(서열번호 209)을 포함한다.

일반적으로, 본원에 기재된 모든 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 세포막 테더링 도메인은 다음 중 하나이다: (1) 프로테아제 절단 부위의 C-말단 및, 존재하는 경우, 임의의 세포내 도메인의 N-말단(즉, 세포막 테더링 도메인은 프로테아제 절단 부위와, 존재하는 경우,세포내 도메인 사이), 또는 (2) 프로테아제 절단 부위의 N-말단 및, 존재하는 경우, 임의의 세포내 도메인의 C-말단(또한, 프로테아제 절단 부위와 사, 존재하는 경우, 도메인 배향이 역전된 세포내 도메인 사이). 키메라 단백질과 연결된 데그론을 특징으로 하는 구현예에서, 데그론 도메인은, 특이적으로 세포막-테더링에 대해 말단 세포질-배향 도메인이다(즉, 세포 막 테더링 도메인은 프로테아제 절단 부위와 데그론 사이에 있음). 세포막 테더링 도메인은 폴리펩티드 링커, 즉, 일반적으로 세포막 테더링 도메인 또는 프로테아제 절단 부위의 일부인 것으로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 프로테아제 절단 부위에 연결될 수 있다. 세포막 테더링 도메인은, 존재하는 경우, 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 세포막 테더링 도메인 또는 세포내 도메인의 일부인 것으로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 세포내 도메인에 연결될 수 있다. 세포막 테더링 도메인은, 존재하는 경우, 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 세포막 테더링 도메인 또는 데그론의 일부인 것으로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 데그론에 연결될 수 있다. 폴리펩티드 링커는 제1 폴리펩티드 서열과 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 폴리펩티드 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)일 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는, 이에 한정되지는 않으나, GSG 링커(예를 들어, [GS]₄GG[서열번호 182]), A(EAAAK)₃A(서열번호 183), 및 Whitlow 링커(예를 들어, 아미노산 서열 KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 184)와 같은 "KEGS" 링커 및 아미노산 서열 EGKSSGSGSESKST(서열번호 185)와 같은 eGK 링커, 및 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제5,990,275호에 더욱 상세히 기재된 링커)를 포함한다. 추가 폴리펩티드 링커는 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197을 포함한다. 다른 폴리펩티드 링커는 원하는 특성(예를 들어, 길이, 유연성, 아미노산 조성물 등)에 기초하여 선택될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다.

일반적으로, 세포-막 테더링 도메인은 분비된 효과기 분자 및 프로테아제 절단 부위가 세포막에 삽입되거나 세포막과의 결합 후에 세포외로 노출되도록 배향되어, 프로테아제 절단 부위가 그 각각의 프로테아제에 의해 절단되고 효과기 분자를 세포외 공간으로 방출("분비")할 수 있다.

데그론 시스템 및 도메인

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 단백질은 프로테아제, 전사 인자, 프로모터 시스템(예를 들어, ACP)의 프로모터 또는 구성성분, 및/또는 본원에 기재된 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하되, 이들로 한정되지 않는 데그론 도메인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 데그론 도메인은 조절된 분해, 예컨대 유비퀴틴-매개 경로를 통한 조절된 분해를 유도할 수 있는 임의의 아미노산 서열 모티프일 수 있다. 면역조절 약물(IMiD)의 존재 시에, 데그론 도메인은 데그론-융합 단백질의 유비퀴틴-매개 분해를 유도한다.

데그론 도메인은, 이에 한정되지 않지만, IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN에 약물 유도성 결합을 할 수 있는 이의 단편을 포함하는 면역조절 약물(IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론(CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인일 수 있다. CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 산물, 예컨대, FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(서열번호 175)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 산물일 수 있다. 데그론 도메인, 특히 CRBN 데그론 시스템은 국제 출원 공개 WO2019/089592Al에 더욱 상세히, 기재되어 있고, 사실상 참조로서 본원에 통합된다. 데그론 도메인의 다른 예는, 이에 한정되지는 않으나, HCV NS4 데그론, PEST(인간 IκBα의 잔기 277~307의 2개 카피; 서열번호 161), GRR(인간 p105의 잔기 352~408; 서열번호 162), DRR(효모 Cdc34의 잔기 210~295; 서열번호 163), SNS(SP2 및 NB의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2; 예를 들어, 서열번호 164), RPB(효모 RPB의 잔기 1688~1702의 4개 카피; 서열번호 165), SPmix(SP1 및 SP2의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2; 서열번호 166), NS2(인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79~93의 3개 카피; 서열번호 167), ODC(오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106~142; 서열번호 168), Nek2A, 마우스 ODC(잔기 422~461; 서열번호 169), 마우스 ODC_DA(D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422~461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가아제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호 전달의 하이드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가아제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 또는 PCNA 결합 PIP 박스를 포함한다.

조절된 분해는 약물 유도성일 수 있다. 분해를 매개/조절할 수 있는 약물은 소분자 화합물일 수 있다. 분해를 매개/조절할 수 있는 약물은 "면역조절 약물"(IMiD)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바와 같이, IMiD는 이미드기를 함유하는 소분자 면역조절 약물의 부류를 지칭한다. 세레블론(CRBN)은 IMiD의 알려진 표적이며, IMiD의 CRBN 또는 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인에 대한 결합은 CRBN E3 유비퀴틴 리가아제 복합체의 기질 특이성을 변경시켜 CRBN 폴리펩티드 기질 도메인을 갖는 단백질의 분해를 초래한다(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 분비성 효과기 분자 또는 다른 관심 단백질). CRBN 폴리펩티드 기질 도메인을 갖는 데그론 도메인의 경우, 이미드 함유 IMiD의 예는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 또는 포말리도마이드를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. IMiD는 FDA 승인 약물일 수 있다.

본원에 기재된 키메라 단백질은 데그론 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 식 S - C - MT - D 또는 D - MT - C - S에서 "D"로 지칭됨)을 함유할 수 있다. IMiD가 없는 경우, 키메라 단백질의 데그론/유비퀴틴 매개 분해는 발생하지 않는다. 키메라 단백질의 발현 및 세포막 내로의 국소화에 이어서, 프로테아제 절단 부위는 효과기 분자가 세포외 공간으로 방출("분비")되도록 키메라 단백질의 절단을 유도한다. 면역조절 약물(IMiD)의 존재 시에, 데그론 도메인은 키메라 단백질의 유비퀴틴 매개 분해를 유도하여 효과기 분자의 분비가 감소되거나 제거된다. 일반적으로, 데그론 도메인에 융합된 막 절단 가능 키메라 단백질의 경우, 데그론 도메인은, 특히 세포막 테더링 도메인에 대해 말단 세포질-배향 도메인, 예를 들어, 식 S - C - MT - D에서 가장 C-말단 도메인 또는 식 D - MT - C - S에서 가장 N-말단 도메인이다. 데그론 도메인은 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 세포막 테더링 도메인 또는 데그론 도메인의 일부인 것으로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 세포막 테더링 도메인에 연결될 수 있다. 폴리펩티드 링커는 제1 폴리펩티드 서열과 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 폴리펩티드 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)일 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는, 이에 한정되지는 않으나, GSG 링커(예를 들어, [GS]₄GG[서열번호 182]), A(EAAAK)₃A(서열번호 183), 및 Whitlow 링커(예를 들어, 아미노산 서열 KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 184)와 같은 "KEGS" 링커 및 아미노산 서열 EGKSSGSGSESKST(서열번호 185)와 같은 eGK 링커, 및 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제5,990,275호에 더욱 상세히 기재된 링커)를 포함한다. 추가 폴리펩티드 링커는 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197을 포함한다. 다른 폴리펩티드 링커는 원하는 특성(예를 들어, 길이, 유연성, 아미노산 조성물 등)에 기초하여 선택될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 데그론은 세포막 테더링 도메인에 대해 세포막으로의 국소화 후에 데그론이 세포질에 노출되도록 배향되어, 데그론 도메인이 분해를 매개할 수 있고(예를 들어, 세포질 및 세포질에 대한 노출) 유비퀴틴 매개 분해를 매개할 수 있도록 한다.

데그론-융합 단백질의 경우, 데그론 도메인은 관심 단백질의 N-말단 또는 C-말단, 예를 들어, 효과기 분자일 수 있다. 데그론 도메인은 폴리펩티드 링커, 즉 일반적으로 관심 단백질 또는 데그론 도메인의 일부인 것으로 간주되지 않는 폴리펩티드 서열에 의해 관심 단백질에 연결될 수 있다. 폴리펩티드 링커는 제1 폴리펩티드 서열과 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 폴리펩티드 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)일 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는, 이에 한정되지는 않으나, GSG 링커(예를 들어, [GS]₄GG[서열번호 182]), A(EAAAK)₃A(서열번호 183), 및 Whitlow 링커(예를 들어, 아미노산 서열 KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 184)와 같은 "KEGS" 링커 및 아미노산 서열 EGKSSGSGSESKST(서열번호 185)와 같은 eGK 링커, 및 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제5,990,275호에 더욱 상세히 기재된 링커)를 포함한다. 추가 폴리펩티드 링커는 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197을 포함한다. 다른 폴리펩티드 링커는 원하는 특성(예를 들어, 길이, 유연성, 아미노산 조성물 등)에 기초하여 선택될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. 폴리펩티드 링커는 절단 가능한, 예를 들어, 본원에 기재된 프로테아제 절단 부위 중 어느 하나일 수 있다.

귀소 분자

"종양 미세환경"은 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 골수 유래 염증 세포, 림프구, 신호 전달 분자 및 세포외 기질(ECM)을 포함하여, 종양이 존재하는 세포 환경이다(예를 들어, Pattabiraman, D.R. & Weinberg, R.A.의 문헌[Nature Reviews Drug Discovery 13, 497-512 (2014)]; Balkwill, F.R.등의 문헌[J Cell Sci 125, 5591-5596, 2012]; 및 Li, H.등의 문헌[J Cell Biochem 101(4), 805-15, 2007]을 참조).

일부 구현예에서, 조작된 핵산은 적어도 하나의 귀소 분자를 생산하도록 구성된다. 예를 들어, 분비된 효과기 분자를 함유하는 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질에서, 분비된 효과기 분자는 귀소 분자일 수 있다. "귀소"는 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직 (예를 들어, 종양), 또는 장기)로의 세포의 활성 조정(이동)을 지칭한다. "귀소 분자"는 세포를 표적 부위로 안내하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 귀소 분자는 표적 부위에 대한 조작된 세포의 상호 작용을 인식 및/또는 개시하는 기능을 한다. 귀소 분자의 비제한적인 예는 CXCR1, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR4, FPR2, VEGFR, IL6R, CXCR1, CSCR7, 및 PDGFR을 포함한다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는 케모카인 수용체(케모카인에 결합하는 세포 표면 분자)이다. 케모카인은 세포에서 지향된 화학주성을 유도할 수 있는 세포에 의해 분비된 작은 사이토카인 또는 신호 전달 단백질이다. 케모카인은 다음의 4개의 주요 서브패밀리로 분류된다: CXC, CC, CX3C 및 XC, 이들 모두는 표적 세포의 표면에 위치한 케모카인 수용체에 선택적으로 결합함으로써 생물학적 효과를 발휘한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 조작된 세포가 케모카인 구배에 따라 간질 세포-유래된 인자 1(또한, SDF1, C-X-C 모티프 케모카인 12, 및 CXCL12로도 알려짐)-발현 세포, 조직, 또는 종양으로 귀소되도록 하는 케모카인 수용체인 CXCR4를 생산하도록 구성된다. 본 개시의 조작된 핵산에 의해 암호화될 수 있는 케모카인 수용체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: CXC 케모카인 수용체(예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 및 CXCR7), CC 케모카인 수용체(CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 및 CCR11), CX3C 케모카인 수용체(예를 들어, CX3CL1에 결합하는 CX3CR1), 및 XC 케모카인 수용체(예를 들어, XCR1). 일부 구현예에서, 케모카인 수용체는 G 단백질-결합 막관통 수용체, 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원(이에 한정되지는 않으나, NFRSF1A, TNFRSF1BB를 포함함)이다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 CXCL8, CXCL9, 및/또는 CXCL10(T-세포 동원을 촉진), CCL3 및/또는 CXCL5, CCL21(Th1 동원 및 분극화)을 생산하도록 구성된다.

일부 구현예에서, 조작된 핵산은 N-포르밀화-함유 올리고펩티드(이에 한정되지는 않으나, FPR2 및 FPRL1을 포함함)를 검출하는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)를 생산하도록 구성된다.

일부 구현예에서, 조작된 핵산은 인터류킨(비제한적으로 IL6R을 포함함)을 검출하는 수용체를 생산하도록 구성된다.

일부 구현예에서, 조작된 핵산은 다른 세포, 조직, 또는 종양으로부터 분비된 성장 인자(이에 한정되지는 않으나, FGFR, PDGFR, EGFR, 및 이에 한정되지는 않으나, VEGF-C 및 VEGF-D를 포함하는 VEGF 계열의 수용체를 포함함)를 검출하는 수용체를 생산하도록 구성된다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는 인테그린이다. 인테그린은 세포-세포외 매트릭스(ECM) 부착을 촉진하는 막관통 수용체이다. 인테그린은 2개 서브유닛인 α(알파) 및 β(베타)을 갖는 절대 이종이량체이다. 인테그린의 α 서브유닛은, 제한없이, 다음과 같을 수 있다: ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, IGTA7, ITGA8, ITGA9, IGTA10, IGTA11, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAV, ITGA2B, ITGAX. 인테그린의 β 서브유닛은, 제한 없이, 다음과 같을 수 있다: ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, 및 ITGB8. 조작된 핵산은 인테그린 α 및 β 서브유닛의 임의의 조합을 생산하도록 구성될 수 있다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는 매트릭스 금속단백분해효소(MMP)이다. MMP는 내피 세포벽 아래에 있는 기저막의 구성요소를 절단하는 효소이다. MMP의 비제한적인 예는 MMP-2, MMP-9, 및 MMP를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 MMP를 억제하는 분자(예컨대, 단백질)의 억제제를 생산하도록 구성된다. 예를 들어, 조작된 핵산은 막 1형 MMP(MT1-MMP)의 억제제 (예컨대, RNAi 분자) 또는 TIMP 메탈로펩티다아제 억제제 1(TIMP-1)를 발현하도록 구성될 수 있다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는, 예를 들어, 표적 조직의 내피 상의 셀렉틴(예를 들어, 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL), Dykstran 등의 문헌[Stem Cells. 2016 Oct;34(10):2501-2511])에 결합하는 리간드이다.

용어 "귀소 분자"는 또한 세포의 귀소를 개선/향상시키는 분자의 생산을 조절하는 전사 인자를 포괄한다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7 또는 항-MAdCAM과 같은 항체를 포함한다.

조작된 핵산

본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질과 같은, 본 개시의 적어도 하나의 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산이 본원에 제공된다. 2개 이상의 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산이 본원에 제공된다.

본원에 기재된 특정 구현예에서, 조작된 핵산은 프로모터 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 다음의 식을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 암호화한다: S - C - MT 또는 MT - C - S . S는 분비성 효과기 분자를 지칭한다. C는 프로테아제 절단 부위를 지칭한다. MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다. 프로모터는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

본원에 기재된 특정 구현예에서, 조작된 핵산은 프로모터 및 관심 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 효과기 분자 중 어느 하나)을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 암호화한다. 프로모터는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, 막 절단 가능 키메라 단백질은 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성된다.

"조작된 핵산"은 자연적으로 발생하지 않는 핵산이다. 그러나, 조작된 핵산은 그 전체가 자연적으로 발생하지 않지만, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 상이한 유기체(예를 들어, 상이한 종)로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 쥣과 뉴클레오티드 서열, 박테리아 뉴클레오티드 서열, 인간 뉴클레오티드 서열 및/또는 바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 핵산 분자를 연결함으로써 구성되고, 일부 구현예에서, 살아있는 세포에서 복제될 수 있는 분자를 지칭한다. "합성 핵산"은 증폭되거나 화학적으로, 또는 다른 수단에 의해 합성된 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나 아니면 변형되지만 자연적으로 발생하는 핵산 분자와 염기쌍을 이룰 수 있는 것들을 포함한다. 변형은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 간 결합 및 비-천연 핵산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 변형은 미국 특허 제6,673,611호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0019001호에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 변형된 뉴클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합일 수 있다. 비-천연 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 글리콜 핵산(GNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO 또는 "모르폴리노"), 및 트레오스 핵산(TNA)일 수 있다. 비-천연 핵산은 국제 출원 WO 1998/039352, 미국 출원 공개 제2013/0156849호, 및 미국 특허 제6,670,461호; 제5,539,082호; 제5,185,444호에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 재조합 핵산 및 합성 핵산은 또한 전술한 것 중 하나의 복제로부터 생성된 이들 분자를 포함한다. 본 개시의 조작된 핵산은 단일 분자 (예를 들어, 동일한 플라스미드 또는 다른 벡터에 포함됨)에 의하거나 또는 다수의 상이한 분자(예를 들어, 다수의 상이한 독립적으로 복제하는 분자)에 의해 암호화될 수 있다. 조작된 핵산은 단리된 핵산일 수 있다. 단리된 핵산은 cDNA 폴리뉴클레오티드, RNA 폴리뉴클레오티드, RNAi 올리고뉴클레오티드(예를 들어, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA 등), mRNA 폴리뉴클레오티드, 원형 플라스미드, 선형 DNA 단편, 벡터, 미니서클, ssDNA, 박테리아 인공 염색체(BAC), 및 효모 인공 염색체(YAC), 및 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 개시의 조작된 핵산은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 제조될 수있다(예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press] 참고). 일부 구현예에서, 조작된 핵산 작제물은 GIBSON ASSEMBLY® 클로닝(예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는, Gibson, D.G.등의 문헌[Nature Methods, 343-345, 2009]; 및 Gibson, D.G.등의 문헌[Nature Methods, 901-903, 2010] 참고)을 사용하여 생산된다. GIBSON ASSEMBLY®는 통상적으로 단일-튜브 반응에서 다음의 3 가지 효소적 활성을 사용한다: 5' 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소의 'Y 연장 활성 및 DNA 리가아제 활성. 5' 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단 서열을 다시 츄잉하고 어닐링을 위한 상보적 서열을 노출시킨다. 그런 다음, 중합효소 활성은 어닐링된 영역 상의 갭을 충진한다. 이어서, DNA 리가아제는 닉을 밀봉하고 DNA 단편을 함께 공유적으로 연결한다. 인접한 단편의 오버랩 서열은 골든게이트 어셈블리에 사용된 것보다 훨씬 길어, 더 높은 백분율의 올바른 어셈블리를 초래한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산 작제물은 IN-FUSION® 클로닝(Clontech)을 사용하여 생산된다.

프로모터

일반적으로, 본원에 기재된 모든 구현예에서, 하나 이상의 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산은 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 암호화한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산(예를 들어, 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산)은 적어도 2개의 구별되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 조작된 핵산은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 구분되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 구별되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산(예를 들어, 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산)은 적어도 2개의 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 조작된 핵산은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

"프로모터"는 핵산 서열의 나머지의 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 조절 영역을 지칭한다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 하위 영역을 함유할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 이를 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다. 여기에서, 프로모터는 그것이 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어("구동")하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대하여 정확한 기능적 위치 및 방향에 있을 때 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다.

프로모터는, 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절의 상류에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같은, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 핵산 서열은, 이것의 자연적인 환경에서 암호화된 서열과 일반적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭하는, 재조합 또는 이종 프로모터의 조절 하에 위치될 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 예를 들어, 당업계에 공지된 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경하는 상이한 전사 조절 영역 및/또는 돌연변이의 상이한 요소를 함유하는 것들과 같은 "자연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 외에, 서열은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제5,928,906호 참조).

조작된 핵산의 프로모터는 "유도성 프로모터"일 수 있으며, 이는 신호의 존재 하에, 신호에 의해 영향을 받거나 또는 신호에 의해 접촉될 때 전사 활성을 조절(예를 들어, 개시 또는 활성화)하는 것을 특징으로 하는 프로모터를 지칭한다. 신호는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 조절하는 데에 있어 활성이 되는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉하는 내인성 또는 보통 외인성 조건(예를 들어, 광), 화합물(예를 들어, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질(예를 들어, 사이토카인)일 수 있다. 전사의 활성화는 전사를 구동하기 위해 프로모터에 직접적으로 작용하는 것 또는 프로모터가 전사를 구동하는 것을 방지하는 억제 인자를 불활성화시킴으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 비활성화는 프로모터에 직접적으로 작용하여 전사를 방지하거나 프로모터에 후에 작용하는 억제 인자를 활성화시킴으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다.

프로모터는 해당 상태 또는 신호의 존재 하에 프로모터로부터의 전사가 활성화, 비활성화, 증가 또는 감소되는 경우 국소 종양 상태(예를 들어, 염증 또는 저산소증) 또는 신호에 "반응성"이거나 "이에 의해 조절"된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 반응 요소를 포함한다. "반응 요소"는 프로모터로부터 유전자 발현을 조정(조절)하는 특이적 분자(예를 들어, 전사 인자)에 결합하는 프로모터 영역 내의 짧은 DNA 서열이다. 본 개시에 따라 사용될 수 있는 반응 요소는, 비제한적으로, 플로레틴-조정가능한 조절 요소(PEACE), 징크-핑거 DNA-결합 도메인(DBD), 인터페론-감마-활성화 서열(GAS)(참조로서 본원에 통합된, Decker, T.등의 문헌[J Interferon Cytokine Res. 1997 Mar;17(3):121-34]), 인터페론-자극 반응 인자(ISRE)(참조로서 본원에 통합된, Han, K. J.등의 문헌[J Biol Chem. 2004 Apr 9;279(15):15652-61]), NF-카파B 반응 요소(참조로서 본원에 통합된, Wang, V.등의 문헌[Cell Reports. 2012; 2(4): 824-839]), 및 STAT3 반응 요소(참조로서 본원에 통합된, Zhang, D.등의 문헌[J of Biol Chem. 1996; 271: 9503-9509])를 포함한다. 다른 반응 요소가 본원에 포괄된다. 반응 요소는 또한 탠덤 반복체(예를 들어, 반응 요소를 암호화하는 동일한 뉴클레오티드 서열의 연속 반복체)를 함유하여 일반적으로 이의 동족 결합 분자에 대한 반응 요소의 민감도를 증가시킬 수 있다. 탠덤 반복체는 존재하는 반복의 수를 나타내기 위해 2X, 3X, 4X, 5X 등으로 표시될 수 있다.

반응성 프로모터("유도성 프로모터"라고도 함)(예를 들어, TGF-베타 반응성 프로모터)의 비제한적 예는 표 5A에 나열되어 있고, 이는 프로모터 및 전사 인자의 설계 뿐만 아니라 전사 인자(TF) 및 이식유전자 전사(T)에 대한 유도 분자의 효과가 나타나 있다(B, 결합; D, 해리; n.d., 결정되지 않음)(A, 활성화; DA, 비활성화; DR, 억제)(Horner, M. & Weber, W.의 문헌[FEBS Letters 586 (2012) 20784-2096m], 및 문헌에 인용된 참고 문헌 참조). 유도성 프로모터의 구성요소의 비제한적인 예는 표 5B에 나타낸 것들을 포함한다.

프로모터의 비제한적인 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 신장 인자(EFS) 프로모터, MND 프로모터(골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터), 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 비장 초점-형성 바이러스(SFFV) 프로모터, 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터, 및 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터를 포함한다(표 5C 참조).

프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일반적으로, 조직-특이적 프로모터는 핵산(예를 들어, 키메라 단백질, 예컨대, 식 S - C - MT 또는 MT- C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 핵산)의 전사를 유도하여, 발현이 특정 세포 유형, 소기관 또는 조직으로 제한되도록 한다. 조직-특이적 프로모터는, 이에 한정되지는 않으나, 다음을 포함한다: 알부민(간 특이적, Pinkert 등(1987)), 림프구 특이적 프로모터(Calame 및 Eaton, 1988), T 세포 수용체(Winoto 및 Baltimore, (1989)) 및 면역글로불린의 특정 프로모터; Banerji 등 (1983); Queen 및 Baltimore, 1983), 뉴런 특이적 프로모터(예를 들어, 신경 미세섬유 프로모터; Byrne 및 Ruddle, 1989), 췌장 특이적 프로모터(Edlund 등, (1985)) 또는 유선 특이적 프로모터(우유 유장 프로모터, 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호) 뿐만 아니라, 발달 조절 프로모터, 예컨대, 쥣과 hox 프로모터(Kessel 및 Gruss의 문헌[Science 249:374-379 (1990)]) 또는 α-태아단백질 프로모터(Campes 및 Tilghman의 문헌[Genes Dev. 3:537-546 (1989)])(이들 각각의 내용은 참조로서 본원에 완전히 통합됨). 프로모터는 각각의 특정 세포 유형, 기관 또는 조직에서 구성적일 수 있다. 조직-특이적 프로모터 및/또는 조절 요소는 또한 결장 상피 세포에 대해 특이적인, 간 지방산 결합(FAB) 단백질 유전자로부터의 프로모터; 췌장 세포에 대해 특이적인 인슐린 유전자; 간 세포에 특이적인 트랜스피레틴, .알파.1- 항트립신, 플라스미노겐 활성 인자 억제제 1형(PAI-I), 아포지질단백질 AI 및 LDL 수용체 유전자; 희돌기교세포에 특이적인 미엘린 염기성 단백질(MBP) 유전자; 아교세포에 대해 특이적인 아교세포 섬유성 산성 단백질(GFAP) 유전자; 안구 표적화에 특이적 OPSIN; 및 신경 세포에 특이적인 신경-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터를 포함할 수 있다. 조직 특이적 프로모터의 예는, 근육 및 심장 조직에서의 발현을 유도하기 위해 사용된 크레아틴 키나아제에 대한 프로모터 및 B 세포에서의 발현을 위한 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 조직 특이적 프로모터는 인간 평활근 알파-액틴 프로모터를 포함한다. 간에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는, 이에 한정되지는 않으나, HMG-COA 환원효소 프로모터, 스테롤 조절 요소 1, 포스포에놀 피루브산 카르복시 키나아제(PEPCK) 프로모터, 인간 C-반응성 단백질(CRP) 프로모터, 인간 글루코키나아제 프로모터, 콜레스테롤 L 7-알파 가수분해효소(CYP-7) 프로모터, 베타-갈락토시다아제 알파-2,6 시알릴칸스페라제 프로모터, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-I) 프로모터, 알돌라아제 B 프로모터, 인간 트랜스페린 프로모터, 및 콜라겐 I형 프로모터를 포함한다. 전립선에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 전립선 산성 포스파타아제(PAP) 프로모터, 94의 전립선 분비 단백질(PSP 94) 프로모터, 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터, 및 인간 선상 칼리크레인 유전자 프로모터(hgt-1)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 위 조직에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 인간 H+/K+-ATPase 알파 서브유닛 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 췌장에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 췌장염 관련 단백질 프로모터(PAP), 엘라스타아제 1 전사 인핸서, 췌장 특이적 아밀라아제 및 엘라스타아제 인핸서 프로모터, 및 췌장 콜레스테롤 에스테라아제 유전자 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 자궁내막에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 유테로글로빈 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 부신 세포에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 콜레스테롤 측쇄 절단(SCC) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일반적인 신경계에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 감마-에놀라아제(뉴런-특이적 에놀라아제, NSE) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 뇌에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 신경미세섬유 중쇄(NF-H) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 림프구에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 인간 CGL-1/그랜자임 B 프로모터, 말단 데옥시 트랜스퍼라아제(TdT), 람다 5, VpreB, 및 lck(림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 p561ck) 프로모터, 인간 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서, 및 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화(NKG5) 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 결장에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터, 기관 특이적 신생항원(OSN) 프로모터, 및 결장 특이적 항원-P 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 유방 세포에 대한 조직 특이적 발현 요소는, 예를 들어, 인간 알파-락트알부민 프로모터이지만, 이에 한정되지 않는다. 폐에 대한 예시적인 조직 특이적 발현 요소는 낭성 섬유증 막관통 전도 조절인자(CFTR) 유전자 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 프로모터는 종양 미세환경 내에서 신호에 의해 조절된다. 종양 미세환경은 종양 미세환경의 존재 하에서 프로모터의 활성이 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 적어도 10% 증가하거나 감소하는 경우 프로모터를 조절하는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%만큼 증가하거나 감소한다. 예를 들어, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 10~20%, 10~30%, 10~40%, 10~50%, 10~60%, 10~70%, 10~80%, 10~90%, 10~100%, 10~200%, 20~30%, 20~40%, 20~50%, 20~60%, 20~70%, 20~80%, 20~90%, 20~100%, 20~200%, 50~60%, 50~70%, 50~80%, 50~90%, 50~100%, 또는 50~200%만큼 증가하거나 감소한다.

일부 구현예에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 적어도 2배(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 20, 25, 50, 또는 100배)만큼 증가하거나 감소한다. 예를 들어, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배만큼 증가하거나 감소한다. 일부 구현예에서, 프로모터의 활성은 종양 미세환경의 부재 하의 프로모터의 활성에 비하여 2~10, 2~20, 2~30, 2~40, 2~50, 2~60, 2~70, 2~80, 2~90, 또는 2~100배만큼 증가하거나 감소한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 프로모터는 저산소 조건 하에서 활성화된다. "저산소 조건"은 신체 또는 신체 영역이 조직 수준에서의 적절한 산소 공급이 부족한 상태이다. 저산소 조건은 염증을 유발할 수 있다(예를 들어, 저산소 조건에서 염증성 사이토카인의 수준은 증가한다). 일부 구현예에서, 저산소 조건 하에서 활성화되는 프로모터는 염증성 사이토카인의 활성의 발현을 감소시키는 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 따라서 저산소 조건에 의해 야기되는 염증을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 저산소 조건 하에서 활성화되는 프로모터는 저산소증 반응성 요소(HRE)를 포함한다. "저산소 반응성 요소(HRE)"는 저산소증-유도성 인자(HIF)에 반응하는 반응 요소이다. 일부 구현예에서, HRE는 컨센서스 모티프 NCGTG(여기서 N은 A 또는 G임)를 포함한다.

활성화-조건부 조절 폴리펩티드(ACP) 프로모터 시스템

일부 구현예에서, 합성 프로모터는 활성화-조건부 조절 폴리펩티드-(ACP-) 결합 도메인 서열 및 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 시스템이다. 이러한 시스템은 본원에서 "ACP-반응성 프로모터"로도 지칭된다. 일반적으로, ACP 프로모터 시스템은 활성화-조건부 조절 폴리펩티드(ACP)를 암호화하는 제1 발현 카세트 및 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질 또는 임의의 다른 관심 단백질(예를 들어, 프로테아제)을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 ACP-반응성 프로모터를 암호화하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 각각 별개의 조작된 핵산에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 동일한 조작된 핵산에 의해 암호화된다. ACP-반응성 프로모터는 단일 관심 단백질 또는 다수의 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

ACP 프로모터 시스템의 프로모터, 예를 들어, ACP의 발현을 유도하는 프로모터 또는 ACP-반응성 프로모터의 프로모터 서열은 본원에 기재된 임의의 프로모터 서열을 포함할 수 있다(위의 "프로모터" 참조). ACP-반응성 프로모터는 minP, NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, minCMV, YB_TATA, minTK, 유도 분자 반응성 프로모터, 및 이들의 탠덤 반복체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ACP-반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함한다.

일부 구현예에서, ACP-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, ACP-반응성 프로모터는 최소 프로모터를 포함하고, ACP-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함한다. ACP-결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 징크-핑거-함유 전사 인자이다. 일부 구현예에서, 징크-핑거-함유 전사 인자는 합성 전사 인자이다. 일부 구현예에서, ACP-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하고, ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인(ZF 단백질 도메인)을 갖는다. 일부 구현예에서, ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인(ZF 단백질 도메인) 및 효과기 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, ACP-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하고, ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인(ZF 단백질 도메인) 및 효과기 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 설계상 모듈식이며, 징크 핑거 어레이(ZFA)로 구성된다. 징크 핑거 어레이는 함께 연결된 다수의 징크 핑거 단백질 모티프를 포함한다. 각각의 징크 핑거 모티프는 상이한 핵산 모티프에 결합한다. 이는 임의의 원하는 핵산 서열에 대한 특이성을 갖는 ZFA, 예를 들어, 특이적 징크 핑거 결합 부위 조성물 및/또는 구성을 갖는 ACP-결합 도메인에 대한 원하는 특이성을 갖는 ZFA를 생성한다. ZF 모티프는 서로 직접 인접하거나, 유연한 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, ZFA는 일렬로 배열된 ZF 모티프의 어레이, 스트링 또는 사슬이다. ZFA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,1 3, 14, 또는 15개의 징크 핑거 모티프를 가질 수 있다. ZFA는 1~10, 1~15, 1~2, 1~3, 1~4, 1~5, 1~6, 1~7, 1~8, 1~9, 2~3, 2~4, 2~5, 2~6, 2~7, 2~8, 2~9, 2~10, 3~4, 3~5 3~6, 3~7, 3~8, 3~9, 3~10, 4~5, 4~6, 4~7, 4~8, 4~9, 4~10, 5~6, 5~7, 5~8, 5~9, 5~10, 또는 5~15개의 징크 핑거 모티프를 가질 수 있다. ZF 단백질 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 이상의 ZFA를 가질 수 있다. ZF 도메인은 1~10, 1~15, 1~2, 1~3, 1~4, 1~5, 1~6, 1~7, 1~8, 1~9, 2~3, 2~4, 2~5, 2~6, 2~7, 2~8, 2~9, 2~10, 3~4, 3~5 3~6, 3~7, 3~8, 3~9, 3~10, 4~5, 4~6, 4~7, 4~8, 4~9, 4~10, 5~6, 5~7, 5~8, 5~9, 5~10, 또는 5~15개의 ZFA를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 1 내지 10개의 ZFA(들)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 하나의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 2개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 3개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 4개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 5개의 ZFA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ZF 단백질 도메인은 적어도 10개의 ZFA를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, ACP는 전사 조절 인자이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 억제 인자이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 활성 인자이다. 일부 구현예에서, ACP는 전사 인자이다. 일부 구현예에서, ACP는 DNA-결합 도메인 및 전사 효과기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA-결합 도메인은 테트라사이클린(또는 이의 유도체) 억제 인자(TetR) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 본 개시의 항원 인식 수용체이다.

ACP는 또한 효과기 도메인, 예를 들어 전사 효과기 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 전사 효과기 도메인은 전사 인자의 효과기 또는 활성 인자 도메인일 수 있다. 전사 인자 활성화 도메인은 또한 트랜스활성화 도메인으로 알려져 있으며, 유전자 전사를 활성화하거나 억제하는 작용을 하는 전사 공조절제와 같은 단백질에 대한 스캐폴드 도메인으로 작용한다. 임의의 적합한 전사 효과기 도메인은, 이에 한정되지 않으나, 단순 포진 바이러스 단백질 16(VP16) 활성화 도메인; VP16의 4개의 탠덤 카피로 이루어진 활성화 도메인인 VP64 활성화 도메인; NF*?*B의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화 인자(Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 세 부분으로 된 활성 인자, 세 부분으로 된 활성 인자는 VPR 활성화 도메인으로 알려져 있음; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스(KRAB) 억제 도메인; 억제 요소 침묵 전사 인자(REST) 억제 도메인; 터럭 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA(시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B(DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, ACP에서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 효과기 도메인은 다음으로부터 선택된 전사 효과기 도메인이다: 단순 포진 바이러스 단백질 16(VP16) 활성화 도메인; VP16의 4개의 탠덤 카피로 이루어진 활성화 도메인인 VP64 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화 인자(Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인을 포함하는 세 부분으로 된 활성 인자, 세 부분으로 된 활성 인자는 VPR 활성화 도메인으로 알려져 있음; p300 HAT 코어 활성화 도메인으로 알려진, 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 코어 도메인; 크루펠 연관 박스(KRAB) 억제 도메인; 억제 요소 침묵 전사 인자(REST) 억제 도메인; 터럭 관련된 염기성 나선-루프-나선 억제 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA(시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B(DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인.

일부 구현예에서, ACP는 소분자(예를 들어, 약물) 유도성 폴리펩티드이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ACP는 테트라사이클린(또는 이의 유도체)에 의해 유도될 수 있고, TetR 도메인 및 VP16 효과기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ACP는 ERT2와 같은 에스트로겐 수용체 변이체를 포함하고, 타목시펜 또는 이의 대사산물(예를 들어, 4-하이드록시-타목시펜[4-OHT], N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥사이드, 또는 엔독시펜)에 의해 타목시펜-조절 핵 국소화를 통해 조절될 수 있다.

일부 구현예에서, ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 포함하는 소분자(예를 들어, 약물) 유도성 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 억제성 프로테아제는 특이적 제제의 부재 하에 활성(동족 절단 부위를 절단)이고, 특이적 제제의 존재 하에 불활성(동족 절단 부위를 절단하지 않음)이다. 일부 구현예에서, 특이적 제제는 프로테아제 억제제이다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제는 본 개시의 주어진 억제성 프로테아제를 특이적으로 억제한다. 억제성 프로테아제는 특이적 제제의 존재 또는 부재에 의해 불활성화될 수 있는 본원에 기재된 프로테아제 중 어느 하나일 수 있다(예시적인 억제성 프로테아제, 동족 절단 부위, 및 프로테아제 억제제에 대해서는 위의 "프로테아제 절단 부위" 참조).

일부 구현예에서, ACP는 데그론 도메인을 갖는다(예시적인 데그론 서열에 대해서는 위의 "데그론 시스템 및 도메인" 참조). 데그론 도메인은 ACP의 개별 도메인에 대해 임의의 순서 또는 위치에 있을 수 있다. 예를 들어, 데그론 도메인은 억제성 프로테아제의 N-말단, 억제성 프로테아제의 C-말단, ZF 단백질 도메인의 N-말단, ZF 단백질 도메인의 C-말단, 효과기 도메인의 N-말단, 또는 효과기 도메인의 C-말단일 수 있다.

다중시스트론 및 다중 프로모터 시스템

일부 구현예에서, 조작된 핵산(예를 들어, 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산)은 다수의 키메라 단백질을 생산하도록 구성된다. 예를 들어, 핵산은 2~20개의 상이한 키메라 단백질을 생산하도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 2~20, 2~19, 2~18, 2~17, 2~16, 2~15, 2~14, 2~13, 2~12, 2~11, 2~10, 2~9, 2~8, 2~7, 2~6, 2~5, 2~4, 2~3, 3~20, 3~19, 3~18, 3~17, 3~16, 3~15, 3~14, 3~13, 3~12, 3~11, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~20, 4~19, 4~18, 4~17, 4~16, 4~15, 4~14, 4~13, 4~12, 4~11, 4~10, 4~9, 4~8, 4~7, 4~6, 4~5, 5~20, 5~19, 5~18, 5~17, 5~16, 5~15, 5~14, 5~13, 5~12, 5~11, 5~10, 5~9, 5~8, 5~7, 5~6, 6~20, 6~19, 6~18, 6~17, 6~16, 6~15, 6~14, 6~13, 6~12, 6~11, 6~10, 6~9, 6~8, 6~7, 7~20, 7~19, 7~18, 7~17, 7~16, 7~15, 7~14, 7~13, 7~12, 7~11, 7~10, 7~9, 7~8, 8~20, 8~19, 8~18, 8~17, 8~16, 8~15, 8~14, 8~13, 8~12, 8~11, 8~10, 8~9, 9~20, 9~19, 9~18, 9~17, 9~16, 9~15, 9~14, 9~13, 9~12, 9~11, 9~10, 10~20, 10~19, 10~18, 10~17, 10~16, 10~15, 10~14, 10~13, 10~12, 10~11, 11~20, 11~19, 11~18, 11~17, 11~16, 11~15, 11~14, 11~13, 11~12, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14, 12~13, 13~20, 13~19, 13~18, 13~17, 13~16, 13~15, 13~14, 14~20, 14~19, 14~18, 14~17, 14~16, 14~15, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 15~16, 16~20, 16~19, 16~18, 16~17, 17~20, 17~19, 17~18, 18~20, 18~19, 또는 19~20개의 키메라 단백질을 생산하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 키메라 단백질을 생산하도록 구성된다.

일부 구현예에서, 조작된 핵산은 다중시스트론일 수 있는데, 즉, 하나를 초과하는 개별 폴리펩티드(예를 들어, 다수의 키메라 단백질)가 단일 mRNA 전사체로부터 생성될 수 있다. 조작된 핵산은 다양한 링커의 사용을 통해 다중시스트론일 수 있으며, 예컨대, 5'에서 3' 배향으로 제1 유전자:링커:제2 유전자와 같이, 제1 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 2A 리보솜 스키핑 요소, 예컨대, T2A를 코딩할 수 있다. 다른 2A 리보솜 스키핑 요소는 E2A, P2A 및 F2A를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2A 리보솜 스키핑 요소는 번역 중 생산되는, 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화되는 별개의 폴리펩티드의 생산을 허용한다. 링커는 퓨린 절단 부위 또는 TEV 절단 부위와 같은 절단 가능한 링커 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있고, 여기서 발현 후 절단 가능한 링커 폴리펩티드는 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생산되도록 절단된다. 절단 가능한 링커는 절단을 추가로 촉진하는, 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)와 같은 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.

링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 암호화할 수 있어, 번역 중 제1 및 제2 유전자에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생성된다. 링커는 바이러스 스플라이스 수용기와 같은 스플라이스 수용기를 암호화할 수 있다.

링커는 2A 리보솜 스키핑에 이어 2A 잔기의 완전한 제거를 가능하게 하는 퓨린 부위의 추가 절단을 통해 별도의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 퓨린-2A 링커와 같은 링커의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 조합은 퓨린 서열, 가요성 링커 및 2A 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 링커는 퓨린-Gly-Ser-Gly-2A 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 링커는 퓨린-Gly-Ser-Gly-T2A 융합 폴리펩티드이다.

일반적으로, 다중시스트론 시스템은 임의의 수의 유전자 또는 이의 일부를 발현하기 위해 임의의 수의 링커 또는 조합을 사용할 수 있다(예를 들어, 조작된 핵산은 제1, 제2 및 제3 키메라 단백질에 의해 암호화된 별도의 폴리펩티드가 생산되도록, 각각 링커에 의해 분리된 제1, 제2 및 제3 키메라 단백질을 암호화할 수 있다).

조작된 핵산은 다수의 프로모터를 사용하여 다수의 ORF로부터의 유전자를 발현할 수 있는데, 즉, 하나를 초과하는 별도의 mRNA 전사체가 조작된 단일 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 제1 프로모터는 제1 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 제2 프로모터는 제2 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일반적으로, 임의의 수의 프로모터가 임의의 수의 키메라 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 프로모터로부터 발현된 ORF 중 적어도 하나는 다중시스트론일 수 있다.

본원에 사용된 "링커"는 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 폴리펩티드, 전술된 다중시스트론 링커, 또는 전술된 추가적인 ORF에 작동가능하게 연결되는 추가적인 프로모터를 지칭할 수 있다.

조작된 세포

조작된 세포, 및 막 절단 가능 키메라 단백질을 생성하는 조작된 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일반적으로, 본 개시의 조작된 세포는 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질과 같은, 본원에 제공된 키메라 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 이들 세포는 본원에서 "조작된 세포"로 지칭된다. 통상적으로 조작된 핵산을 함유하는 이러한 세포는 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 키메라 단백질, 예를 들어, 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하도록 조작된다. 조작된 세포는 세포의 게놈 내로 통합된 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 조작된 세포는 예를 들어, 플라스미드 또는 mRNA와 같은 일시적 발현 시스템으로 조작된, 세포의 게놈으로 통합되지 않고 발현할 수 있는 조작된 핵산을 포함할 수 있다.

본 개시는, 또한, 키메라 단백질(들) 및 이들이 생성되는 조작된 세포 사이의 부가성 및 상승작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 2개의 키메라 단백질(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상), 예를 들어 적어도 2개의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 다른 구현예에서, 세포는 세포에 의해 자연적으로 생성되지 않는 효과기 분자를 갖는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 이러한 효과기 분자는 예를 들어, 세포에 의해 자연적으로 생성된 효과기 분자의 기능을 보완할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 막-테더링된 항-CD3 및/또는 항-CD28 작용제 세포외 도메인을 발현하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 다수의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 2~20개의 상이한 키메라 단백질, 예컨대 2~20개의 상이한 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 2~20, 2~19, 2~18, 2~17, 2~16, 2~15, 2~14, 2~13, 2~12, 2~11, 2~10, 2~9, 2~8, 2~7, 2~6, 2~5, 2~4, 2~3, 3~20, 3~19, 3~18, 3~17, 3~16, 3~15, 3~14, 3~13, 3~12, 3~11, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~20, 4~19, 4~18, 4~17, 4~16, 4~15, 4~14, 4~13, 4~12, 4~11, 4~10, 4~9, 4~8, 4~7, 4~6, 4~5, 5~20, 5~19, 5~18, 5~17, 5~16, 5~15, 5~14, 5~13, 5~12, 5~11, 5~10, 5~9, 5~8, 5~7, 5~6, 6~20, 6~19, 6~18, 6~17, 6~16, 6~15, 6~14, 6~13, 6~12, 6~11, 6~10, 6~9, 6~8, 6~7, 7~20, 7~19, 7~18, 7~17, 7~16, 7~15, 7~14, 7~13, 7~12, 7~11, 7~10, 7~9, 7~8, 8~20, 8~19, 8~18, 8~17, 8~16, 8~15, 8~14, 8~13, 8~12, 8~11, 8~10, 8~9, 9~20, 9~19, 9~18, 9~17, 9~16, 9~15, 9~14, 9~13, 9~12, 9~11, 9~10, 10~20, 10~19, 10~18, 10~17, 10~16, 10~15, 10~14, 10~13, 10~12, 10~11, 11~20, 11~19, 11~18, 11~17, 11~16, 11~15, 11~14, 11~13, 11~12, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14, 12~13, 13~20, 13~19, 13~18, 13~17, 13~16, 13~15, 13~14, 14~20, 14~19, 14~18, 14~17, 14~16, 14~15, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 15~16, 16~20, 16~19, 16~18, 16~17, 17~20, 17~19, 17~18, 18~20, 18~19, 또는 19~20개의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 조작된 세포는 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 암호화하는 하나 이상의 조작된 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 또는 3개)의 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 각각 암호화하는, 복수의 조작된 핵산, 예를 들어, 적어도 2개의 조작된 핵산을 포함하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있으며, 각각은 적어도 하나(예컨대, 1, 2 또는 3개)의 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 암호화한다. 일부 구현예에서, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 조작된 핵산을 포함하도록 조작되며, 각각은 적어도 하나(예컨대, 1, 2 또는 3개)의 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 암호화한다. 조작된 세포는 적어도 하나의 전술된 바와 같은 링커, 예컨대 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열을 연결하는 폴리펩티드, 전술된 하나 이상의 다중시스트론 링커, 추가 ORF에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 추가 프로모터, 또는 이들의 조합을 암호화하는 조작된 핵산을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 프로테아제를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 세포에 이종인 프로테아제를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 키메라 단백질을 발현하는 세포에 이종인 프로테아제, 예컨대 막 절단 가능 키메라 단백질의 프로테아제 절단 부위를 절단하는 이종 프로테아제를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 프로테아제, 예컨대, 이종 프로테아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 암호화하는 하나 이상의 조작된 핵산을 포함한다. 프로테아제 및 프로테아제 절단 부위는 본원의 "프로테아제 절단 부위"라는 제목의 섹션에 보다 상세히 기술되어 있다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 적어도 하나의 귀소 분자를 생산하도록 조작된다. "귀소"는 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직 (예를 들어, 종양), 또는 장기)로의 세포의 활성 조정(이동)을 지칭한다. "귀소 분자"는 세포를 표적 부위로 안내하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 귀소 분자는 표적 부위에 대한 조작된 세포의 상호 작용을 인식 및/또는 개시하는 기능을 한다. 귀소 분자의 비제한적인 예는 CXCR1, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR4, FPR2, VEGFR, IL6R, CXCR1, CSCR7, 및 PDGFR을 포함한다.

일부 구현예에서, 귀소 분자는 케모카인 수용체(케모카인에 결합하는 세포 표면 분자)이다. 본 개시의 조작된 세포에 의해 생산될 수 있는 케모카인 수용체의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: CXC 케모카인 수용체(예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 및 CXCR7), CC 케모카인 수용체(CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 및 CCR11), CX3C 케모카인 수용체(예를 들어, CX3CL1에 결합하는 CX3CR1), 및 XC 케모카인 수용체(예를 들어, XCR1). 일부 구현예에서, 케모카인 수용체는 G 단백질-결합 막관통 수용체, 또는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원(이에 한정되지는 않으나, NFRSF1A, TNFRSF1BB를 포함함)이다. 일부 구현예에서, 세포는 CXCL8, CXCL9, 및/또는 CXCL10(T-세포 동원을 촉진), CCL3 및/또는 CXCL5, CCL21(Th1 동원 및 분극화)을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 CXCR4를 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 N-포르밀화-함유 올리고펩티드(이에 한정되지는 않으나, FPR2 및 FPRL1을 포함함)를 검출하는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)를 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 인터류킨(IL6R을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 검출하는 수용체를 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 다른 세포, 조직 또는 종양으로부터 분비된 성장 인자(이에 한정되지는 않으나, FGFR, PDGFR, EGFR, 및, 이에 한정되지는 않으나, VEGF-C 및 VEGF-D를 포함하는 VEGF 패밀리의 수용체를 포함함)를 검출하는 수용체를 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 하나 이상의 인테그린을 생산하도록 조작된다. 본 개시의 세포는 임의의 조합의 인테그린 α 및 β 서브유닛을 생산하도록 조작될 수 있다. 인테그린의 α 서브유닛은, 제한없이, 다음과 같을 수 있다: ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, IGTA7, ITGA8, ITGA9, IGTA10, IGTA11, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAV, ITGA2B, ITGAX. 인테그린의 β 서브유닛은, 제한 없이, 다음과 같을 수 있다: ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, 및 ITGB8.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 하나 이상의 매트릭스 금속단백분해효소(MMP)를 생산하도록 조작된다. MMP의 비제한적인 예는 MMP-2, MMP-9, 및 MMP를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 MMP를 억제하는 분자의 억제제(예컨대, 단백질)를 생산하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 막 유형 1 MMP(MT1-MMP) 억제제(예를 들어, RNAi 분자) 또는 TIMP 메탈로펩티다아제 억제제 1(TIMP-1)을 발현하도록 조작될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는, 예를 들어, 표적 조직의 내피 상에서 셀렉틴에 결합하는 리간드(예를 들어, 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL), Dykstran등의 문헌[Stem Cells 2016 Oct;34(10):2501-2511])를 생산하도록 조작된다.

또한, 다수의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된 세포가 본원에 제공되며, 이들 중 적어도 2개는 상이한 종양 매개 면역억제 기전을 조절하는 효과기 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)의 키메라 단백질은 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역자극 기전을 자극하거나, 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역억제성 기전을 억제하는 효과기 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)의 키메라 단백질은 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역억제성 기전을 억제하는 효과기 분자를 포함하고, 적어도 하나의 키메라 단백질(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)은 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역억제성 기전을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 2개(예컨대, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)의 키메라 단백질은 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역자극 기전을 자극하는 효과기 분자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 2개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)의 키메라 단백질은 종양 미세환경에서 적어도 하나의 면역억제성 기전을 억제하는 효과기 분자를 포함한다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 T 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 항원 제시 및/또는 가공을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포 동원을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 M1 대식세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 Th1 분극화를 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 기질 분해를 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 면역자극성 대사 산물 생산을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 I형 인터페론 신호 전달을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 음성 공동자극 신호 전달을 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 항종양 면역 세포의 (예를 들어, TRAIL을 통한) 친세포자멸사 신호 전달을 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 조절(Treg) 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 종양 관문 분자를 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 인터페론 유전자의 자극 인자(STING) 신호 전달을 활성화하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 골수-유래 억제 인자 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 면역억제성 인자/대사 산물을 분해하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 혈관 내피 성장 인자 신호 전달을 억제하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 종양 세포를 직접적으로 사멸시키는 효과기 분자(예를 들어, 그랜자임, 퍼포린, 종양용해성 바이러스, 세포질분해성 펩티드 및 효소, 예를 들어, ADCC를 유발하는 항종양 항체)를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, T 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 항원 제시 및/또는 가공을 자극하거나, 자연 살해 세포-매개 세포독성 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 자극하거나, 수지상 세포 분화 및/또는 성숙을 자극하거나, 면역 세포 동원을 자극하거나, 대식세포 신호 전달을 자극하거나, 기질 분해를 자극하거나, 면역자극성 대사 산물 생산을 자극하거나, I형 인터페론 신호 전달을 자극하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질; 및 음성 공동자극 신호 전달을 억제하거나, 항종양 면역 세포의 친세포자멸사 신호 전달을 억제하거나, T 조절(Treg) 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하거나, 종양 관문 분자를 억제하거나, 인터페론 유전자 자극 인자(STING) 신호 전달을 활성화하거나, 골수-유래 억제 인자 세포 신호 전달, 활성 및/또는 동원을 억제하거나, 면역억제성 인자/대사 산물을 분해하거나, 혈관 내피 성장 인자 신호 전달을 억제하거나 직접적으로 종양 세포를 사멸하는 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 IL-12, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드, 및 CD40L로부터 선택된 효과기 분자; 및/또는 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 차단 또는 억제를 위해 표적화될 수 있는 예시적인 면역 관문 분자는, 이에 한정되지는 않으나, CTLA-4, 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4(CD2 패밀리의 분자에 포함되고, 모든 NK, γδ Τ, 및 메모리 CD8+(αβ) T 세포 상에서 발혐됨), CD160(BY55로도 지칭됨), 및 CGEN-15049를 포함한다. 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160, 및 CGEN-15049 중 하나 이상에 결합하여 그 활성을 차단하거나 억제하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 다른 결합 단백질을 포함한다. 예시적인 관문 억제제는, 이에 한정되지는 않으나, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체를 포함한다. 예시적인 면역 관문 억제제는 펨브롤리주맙(항-PD-1; MK-3475/Keytruda® - Merck), 니볼루맙(항-PD-1; Opdivo® - BMS), 피딜리주맙(항-PD-1 항체; CT-011 - Teva/CureTech), AMP224(항-PD-1; NCI), 아벨루맙(항-PD-L1; Bavencio® - Pfizer), 더발루맙(항-PD-L1; MEDI4736/Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca), 아테졸리주맙(항-PD-L1; Tecentriq® - Roche/Genentech), BMS-936559(항-PD-L1 - BMS), 트레멜리루맙(항-CTLA-4; Medimmune/AstraZeneca), 이필리무맙(항-CTLA-4; Yervoy ® - BMS), 리릴루맙(항-KIR; BMS), 모날리주맙(항-NKG2A; Innate Pharma/AstraZeneca)을 포함한다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 IL-12, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드, 및 CD40L로부터 선택된 효과기 분자; 및/또는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 및 항-IL-35 항체로부터 선택된 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질; 및/또는 MIP1α(CCL3), MIP1β(CCL5), 및 CCL21로부터 선택된 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질; 및/또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드로부터 선택된 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질; 및/또는 미생물 펩티드로부터 선택된 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 IFN-β 및 사이토카인, 항체, 케모카인, 뉴클레오티드, 펩티드, 효소, 및 인터페론 유전자의 자극 인자(STING)로부터 선택된 효과기 분자를 포함하는 적어도 하나의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 IFN-β 및 적어도 하나의 사이토카인 또는 수용체/리간드(예를 들어, IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-15, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드, 및/또는 CD40L)를 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 분비성 효과기 분자(예를 들어, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S의 "S")가 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 펩티드 또는 효소인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 사이토카인인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 케모카인인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 귀소 분자인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 성장 인자인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 공동 활성화 분자인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 종양 미세환경 개질 인자인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 리간드인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 항체인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 펩티드인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 효소인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자(예를 들어, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S의 "S")가 IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL17A, IL18, IL21, IL22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 또는 TNF-알파인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 또는 XCL1인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 항-인테그린 알파4,베타7, 항-MAdCAM, SDF1, 또는 MMP-2인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 4-1BBL 또는 CD40L인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제, 또는 HPGE2인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 또는 이들의 조합인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 또는 항-TREM2 항체인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다.

일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자(예를 들어, S - C - MT 또는 MT - C - S의 "S")가 IL-15를 포함하는, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15와 IL-15Rα의 스시 도메인의 융합인 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기가 IL-15로 구성되는 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 하나 이상의 추가 효과기 분자를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 하나 이상의 추가 분비성 효과기 분자를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되며, 세포는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 또는 효소를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드, 또는 CD40L을 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-12를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되며, 세포는 IFN-γ를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되며, 세포는 IL-2를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-7을 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-36γ를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-18을 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 IL-1β를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 OX40-리간드를 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 CD40L을 생산하도록 추가로 조작된다.

일부 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 하나 이상의 추가 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 추가로 조작된다.

일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자(예를 들어, 식 S - C - MT 또는 MT - C - S에서 "S")가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 하나 이상의 추가 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가 조작되어 추가 분비성 효과기 분자가 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 효소를 생산한다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막-절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-36γ, IL-18, IL-1β, OX40-리간드, 또는 CD40L인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질울 생산하도록 조작되고, 세포는 추가의 분비성 효과기 분자는 IL-12인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IFN-γ인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-2인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-7인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-36γ인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-18인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 IL-1β인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 OX40-리간드인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 분비성 효과기 분자가 IL-15인, 적어도 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고, 세포는 추가 분비성 효과기 분자가 CD40L인, 추가 막 절단 가능 키메라 단백질로 추가로 조작된다.

세포는 또한 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질), 관심 단백질, 또는 본원에 기재된 효과기 분자에 추가하여 추가 단백질을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 세포는 하나 이상의 항원 인식 수용체를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 하나 이상의 항원 인식 수용체에 의해 표적화될 수 있는 항원의 예는, 이에 한정되지는 않으나, 5T4, ADAM9, AFP, AXL, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BCMA, C4.4, CA6, 캐드헤린 3, 캐드헤린 6, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD123, CD133, CD138, CD142, CD166, CD25, CD30, CD33, CD352, CD37, CD38, CD44, CD56, CD66e, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD80, CEA, CEACAM5, 클라우딘18.2, cMet, CSPG4, CTLA, DLK1, DLL3, DR5, EGFR, ENPP3, EpCAM, EphA2, 에프린 A4, ETBR, FGFR2, FGFR3, FLT3, FR알파, FRb, GCC, GD2, GFRa4, gpA33, GPC2, GPC3, gpNBM, GPRC5, HER2, IL-13R, IL-13Ra, IL-13Ra2, IL-8, IL-15, IL1RAP, 인테그린 aV, KIT, L1CAM, LAMP1, 루이스 Y, LeY, LIV-1, LRRC, LY6E, MCSP, 메소텔린, MUC1, MUC16, MUC1C, NaPi2B, 넥틴 4, NKG2D, NOTCH3, NY ESO 1, 오바린, P-캐드헤린, 범-Erb2, PSCA, PSMA, PTK7, ROR1, S 아우레스, SCT, SLAMF7, SLITRK6, SSTR2, STEAP1, 수르비빈, TDGF1, TIM1, TROP2, 및 WT1을 포함한다.

항원 인식 수용체는 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함할 수 있다. 항원 인식 수용체는 scFv를 포함할 수 있다. scFv는 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함할 수 있다. 예를 들어, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인이다.

항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. CAR은 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인, 예컨대, CD3제타-쇄 세포 내 신호 전달 도메인, CD97 세포내 신호 전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호 전달 도메인, CD2 세포내 신호 전달 도메인, ICOS 세포내 신호 전달 도메인, CD27 세포내 신호 전달 도메인, CD154 세포내 신호 전달 도메인, CD8 세포내 신호 전달 도메인, OX40 세포내 신호 전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인, CD28 세포내 신호 전달 도메인, ZAP40 세포내 신호 전달 도메인, CD30 세포내 신호 전달 도메인, GITR 세포내 신호 전달 도메인, HVEM 세포내 신호 전달 도메인, DAP10 세포내 신호 전달 도메인, DAP12 세포내 신호 전달 도메인 및 MyD88 세포내 신호 전달 도메인, 이의 단편, 이의 조합, 또는 이의 단편의 조합을 가질 수 있다. CAR은 막관통 도메인, 예컨대, CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인, 이의 단편, 이의 조합, 또는 이의 단편의 조합을 가질 수 있다.. CAR은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 가질 수 있다.

항원 인식 수용체는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다.

조작된 세포 유형

또한, 조작된 세포가 본원에 제공된다. 세포는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 임의의 조작된 핵산)을 포함하도록 조작될 수 있다. 세포는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포 의 임의의 특징을 보유하도록 조작될 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된 세포가 본원에 제공되며, 여기서 하나 이상의 키메라 단백질은 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질이다. 특정 양태에서, 둘 이상의 키메라 단백질을 생산하도록 조작된 세포가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 둘 이상을 생산하도록 조작된 세포가 본원에 제공되며, 여기서 각각의 키메라 단백질은 상이한 관심 단백질 또는 효과기 분자이다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 생산하도록 조작되고 상이한 효과기 분자 또는 관심 단백질(예를 들어, 귀소 분자, 항원 수용체 등)을 개별적으로 생산하도록 조작된 세포가 본원에 제공된다.

조작된 세포는 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타(γδ) T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스-특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 선천성 림프 세포, 비만 세포, 호산구, 호염구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역 세포일 수 있다. 조작된 세포는 T 세포일 수 있다. 조작된 세포는 T 세포일 수 있다.

조작된 세포는 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC-유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽 기질 세포(MSC), 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 또는 iPSC-유래 세포를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 줄기 세포일 수 있다.

조작된 세포는 종양-유래 세포일 수 있다. 종양 세포의 예는, 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경교종 세포, 신장 종양 세포, 간 종양 세포, 폐 종양 세포, 흑색종 세포, 중피종 세포, 난소 종양 세포, 췌장 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 키메라 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포를 형질도입하여 종양을 조작할 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 바이러스를 사용하여 형질도입된다.

특정 구현예에서, 세포는 종양용해성 바이러스를 사용하여 형질도입된다. 종양용해성 바이러스의 예는 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본원에 기재된 임의의 종양용해성 바이러스를 포함하는 바이러스는 하나 이상의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 암호화하는 하나 이상의 이식유전자를 암호화하는 재조합 바이러스일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 종양용해 바이러스를 포함하는 바이러스는 하나 이상의 둘 이상의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 암호화하는 하나 이상의 이식유전자를 암호화하는 재조합 바이러스일 수 있다.

또한, 조작된 적혈구가 본원에 제공된다. 적혈구는 본원에 기재된 조작된 핵산 중 어느 하나를 포함하도록 조작될 수 있다. 적혈구는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포의 임의의 특징을 보유하도록 조작될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 하나 이상을 생산하도록 조작된 적혈구가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 둘 이상을 생산하도록 조작된 적혈구가 본원에 제공된다.

또한, 조작된 혈소판 세포가 본원에 제공된다. 혈소판 세포는 본원에 기재된 조작된 핵산 중 어느 하나를 포함하도록 조작될 수 있다. 혈소판 세포는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포의 임의의 특징을 보유하도록 조작될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 하나 이상을 생산하도록 조작된 혈소판 세포가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 2개 이상을 생산하도록 조작된 혈소판 세포가 본원에 제공된다.

또한, 조작된 박테리아 세포가 본원에 제공된다. 박테리아 세포는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있다. 박테리아 세포는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포의 임의의 특징을 보유하도록 조작될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 둘 이상을 생산하도록 조작된 박테리아 세포가 본원에 제공된다. 박테리아 세포는 하나 이상의 포유류 유래 키메라 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 박테리아 세포는 둘 이상의 포유류 유래 키메라 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 박테리아 세포의 예는, 이에 한정되지 않지만, 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 스포로게네스(Clostridium sporogenes), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 및 살모넬라 콜레라기스(Salmonella choleraesuis)를 포함한다.

조작된 세포는 인간 세포일 수 있다. 조작된 세포는 인간 일차 세포일 수 있다. 조작된 일차 세포는 종양 침윤 일차 세포일 수 있다. 조작된 일차 세포는 일차 T 세포일 수 있다. 조작된 일차 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)일 수 있다. 조작된 일차 세포는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다. 조작된 일차 세포는 임의의 체세포일 수 있다. 조작된 일차 세포는 MSC일 수 있다. 인간 세포(예를 들어, 면역 세포)는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있다. 인간 세포(예를 들어, 면역 세포)는 본원에 기재된 임의의 조작된 세포의 임의의 특징 을 보유하도록 조작될 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 하나 이상을 생산하도록 조작된 인간 세포(예를 들어, 면역 세포)가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 2개 이상을 생산하도록 조작된 인간 세포(예를 들어, 면역 세포)가 본원에 제공된다.

조작된 세포는 대상체(자가유래), 예컨대, 암이 있는 것으로 알려지거나 의심되는 대상체로부터 단리될 수 있다. 세포 단리 방법은 당업자에게 공지되어 있고 FACS 분류, 양성 단리 기술 및 음성 단리, 자기 단리, 및 이들의 조합과 같은 세포-표면 마커 발현에 기초한 분류 기술을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 조작된 세포는 치료를 받는 대상체에 대하여 동종이형일 수 있다. 동종이형 변형 세포는 치료를 받는 대상체에 대해 HLA-일치될 수 있다. 조작된 세포는 배양된 세포, 예컨대, 생체 외 배양된 세포일 수 있다. 조작된 세포는 생체 외 배양된 세포, 예컨대, 대상체로부터 단리된 일차 세포일 수 있다. 배양된 세포는 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양될 수 있다.

또한 본 개시의 조작된 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 조작된 세포를 배양하는 방법은 공지되어 있다. 당업자는 배양 조건이 특정 조작된 관심 세포에 의존할 것임을 인식할 것이다. 당업자는 배양 조건이 조작된 세포의 특정 하류 용도, 예를 들어 조작된 세포의 대상체에게로의 후속 투여를 위한 특정 배양 조건에 의존할 것임을 인식할 것이다.

세포 조작 방법

또한, 세포를 조작하여 하나 이상의 관심 단백질 또는 효과기 분자(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질)를 생산하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다.

일반적으로, 세포는 하나 이상의 관심 단백질 또는 효과기 분자, 예를 들어, 관심 단백질 또는 효과기 분자를 포함하는 본원에 기재된 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포의 세포질 및/또는 핵 내로 도입(즉, 전달)하여 관심 단백질 또는 효과기 분자를 생산하도록 조작된다. 예를 들어, 하나 이상의 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 임의의 조작된 핵산일 수 있다. 전달 방법은 바이러스 매개 전달, 지질 매개 형질주입, 나노입자 전달, 전기천공, 초음파 처리 및 물리적 수단에 의한 세포막 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 전달 방법의 선택이 조작될 특정 세포 유형에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.

바이러스 매개 전달

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼을 사용하여 세포를 조작할 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 숙주 세포에 도입(즉, 전달)을 통해 세포를 조작한다. 예를 들어, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 임의의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 N-말단에서 C-말단으로 배향된, 프로모터 및 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 본원에 기재된 임의의 발현 카세트)의 도입을 통해 세포를 조작할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 핵산일 수 있고, 따라서 조작된 핵산은 조작된 바이러스 유래 핵산을 포함할 수도 있다. 이러한 조작된 바이러스 유래 핵산은 재조합 바이러러스 또는 조작된 바이러스로 지칭될 수도 있다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 동일한 핵산 내에서 하나를 초과하는 조작된 핵산, 유전자 또는 이식유전자를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 조작된 바이러스 유래 핵산, 예를 들어, 재조합 바이러스 또는 조작된 바이러스는 하나 이상의 키메라 단백질을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이식유전자를 암호화할 수 있다. 하나 이상의 키메라 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이식유전자는 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 발현하도록 구성될 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나 이상의 이식유전자(예를 들어, 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 이식유전자)에 더해 하나 이상의 유전자, 예컨대, 시스 작용 요소 또는 유전자라고 지칭되는, 바이러스 감염성 및/또는 바이러스 생산에 필요한 바이러스 유전자(예를 들어, 캡시드 단백질, 외피 단백질, 바이러스 중합효소, 바이러스 전사효소 등)를 암호화할 수 있다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나를 초과하는 바이러스 벡터, 예컨대, 본원에 기재되고, 트랜스-작용 요소 또는 유전자로 지칭되는 조작된 핵산, 유전자, 또는 이식유전자를 암호화하는 별도의 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 의존성 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 벡터에 더하여 바이러스 감염성 및/또는 바이러스 생산에 필요한 추가 유전자를 하나 이상의 추가의 개별 벡터 상에 제공할 수 있다. 하나의 바이러스 벡터는 하나를 초과하는 조작된 핵산, 예컨대, 둘 이상의 키메라 단백질 및/또는 관심 단백질을 생산하도록 구성된 조작된 핵산을 전달하는 하나의 벡터를 전달할 수 있다. 하나를 초과하는 바이러스 벡터는 하나를 초과하는 조작된 핵산, 예컨대, 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 관심 분자를 생산하도록 구성된 하나 이상의 조작된 핵산을 전달하는 하나를 초과하는 벡터를 전달할 수 있다. 사용되는 바이러스 벡터의 수는 전술된 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼의 패키징 용량에 의존할 수 있고, 당업자는 적절한 수의 바이러스 벡터를 선택할 수 있다.

일반적으로, 임의의 바이러스 벡터 기반 시스템은 분자, 예컨대, 본원에 기재된 키메라 단백질, 효과기 분자 및/또는 다른 관심 단백질의 시험관 내 생산에 사용되거나, 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 조작된 핵산의 생체 내 전달을 위한, 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에 사용될 수 있다 . 적절한 바이러스 벡터 기반 시스템의 선택은 화물/페이로드 크기, 바이러스 시스템의 면역원성, 관심 표적 세포, 유전자 발현 강도 및 시기, 그리고 당업자가 인식하는 기타 요인과 같은 다양한 요인에 따를 것이다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 RNA 기반 바이러스 또는 DNA 기반 바이러스일 수 있다. 예시적인 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인디애나 베시큘로바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 점액종 바이러스, 레오바이러스, 볼거리 바이러스, 마라바 바이러스, 광견병 바이러스, 로타바이러스, 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 모르빌리바이러스, 렌티바이러스, 복제 레트로바이러스, 랍도바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 당업게예 공지되어 있는데, 예컨대, 우두, 계두, 자가 복제 알파바이러스, 마라바바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, Tatsis 등의 문헌[Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616

629] 참조), 또는 2, 3 또는 혼성 2/3세대 렌티바이러스 및 특정 세포 유형 또는 수용체를 표적으로 하도록 설계된 임의의 세대의 재조합 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 렌티바이러스(예를 들어, Hu 등의 문헌[Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61], Sakuman 등의 문헌[Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18], Cooper 등의 문헌[Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promotor, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690], Zufferey 등의 문헌[Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880] 참조)와 같다.

서열은 세포하 구획을 표적으로 하는 하나 이상의 서열이 선행될 수 있다. 숙주 세포 내로 도입(즉, 전달) 시, 감염된 세포(즉, 조작된 세포)는 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 발현할 수 있다. 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,722,848호에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover 등의 문헌 [Nature 351:456-460 (1991)]에 기재되어 있다. 조작된 핵산의 도입(즉, 전달)에 유용한 매우 다양한 다른 벡터, 예를 들어, 살모넬라 티피 벡터 등은 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 본원에서 종양용해성 바이러스로 지칭되는, 종양 세포를 표적으로 하는 바이러스일 수 있다. 종양용해성 바이러스는 종양용해성 단순포진 바이러스, 종양용해성 아데노바이러스, 종양용해성 홍역 바이러스, 종양용해성 인플루엔자 바이러스, 종양용해성 인디애나 소포바이러스, 종양용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양용해성 백시니아 바이러스, 종양용해성 소아마비 바이러스, 종양용해성 점액종 바이러스, 종양용해성 레오바이러스, 종양용해성 이하선염 바이러스, 종양용해성 마라바 바이러스, 종양용해성 광견병 바이러스, 종양용해성 로타바이러스, 종양용해성 간염 바이러스, 종양용해성 풍진 바이러스, 종양용해성 뎅기열 바이러스, 종양용해성 치쿤구니야 바이러스, 종양용해성 호흡기 세포융합 바이러스, 종양용해성 림프구성 맥락수막염 바이러스, 종양용해성 모르빌리바이러스, 종양용해성 렌티바이러스, 종양용해성 복제 레트로바이러스, 종양용해성 랍도바이러스, 종양용해성 세네카 밸리 바이러스, 종양용해성 신드비스 바이러스, 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이식유전자(예를 들어, 조작된 핵산)를 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스일 수 있다. 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 이식유전자는 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 발현하도록 구성될 수 있다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 레트로바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 최대 6~10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 갖는 시스 작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스 작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하고, 그런 다음 이는 하나 이상의 조작된 핵산(예를 들어, 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 이식유전자)을 표적 세포에 통합하여 영구적인 이식유전자 발현을 제공하는 데 사용된다. 레트로바이러스 기반 전달 시스템은 쥣과 백혈병, 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합을 기반으로 하는 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Buchscher 등의 문헌[J. Virol. 66:2731-2739 (1992)]; Johann 등의 문헌[J. Virol. 66:1635-1640 (1992)]; Sommnerfelt 등의 문헌[Virol. 176:58-59 (1990)]; Wilson 등의 문헌[J. Virol. 63:2374-2378 (1989)]; Miller 등의 문헌[J, Virol. 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참조). 다른 레트로바이러스 시스템은 피닉스 레트로바이러스 시스템을 포함한다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 렌티바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 통상적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 ViraPower 시스템(ThermoFisher) 또는 pLenti 시스템(Cell Biolabs)과 같은 HIV 기반일 수 있다. 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 SIV, 또는 FIV-기반일 수 있다. 다른 예시적인 렌티바이러스 기반 전달 플랫폼은 미국 특허 제7,311,907호; 제7,262,049호; 제7,250,299호; 제7,226,780호; 제7,220,578호; 제7,211,247호; 제7,160,721호; 제7,078,031호; 제7,070,993호; 제7,056,699호; 제6,955,919호에 상세히 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 아데노바이러스 기반일 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하고, 세포 분열이 필요하지 않고, 높은 역가 및 발현 수준을 달성하고, 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스는 숙주의 게놈에 통합되지 않기 때문에 감염된 세포 내에서 이식유전자의 일시적인 발현을 위해 아데노바이러스를 사용할 수 있다. 아데노바이러스 기반 전달 플랫폼은 Li 등의 문헌[Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994]; Borras 등의 문헌[Gene Ther 6:515 524, 1999]; Li 및 Davidson의 문헌[PNAS 92:7700 7704, 1995]; Sakamoto 등의 문헌[H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655에 상세히 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다. 다른 예시적인 아데노바이러스 기반 전달 플랫폼은 미국 특허 제5585362호; 제6,083,716호, 제7,371,570호; 제7,348,178호; 제7,323,177호; 제7,319,033호; 제7,318,919호; 및 제7,306,793호 및 국제 특허 출원 WO96/13597에 상세히 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 아데노 연관 바이러스(AAV) 기반일 수 있다. 아데노-연관 바이러스("AAV") 벡터는 조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)으로 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 시스템은 관심 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 키메라 단백질 및/또는 효과기 분자의 시험관 내 생산에 사용될 수 있거나, 예를 들어, 하나 이상의 키메라 단백질 및/또는 관심 단백질을 암호화하는 조작된 핵산의 생체 내 전달을 위한 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에 사용될 수 있다(예를 들어, West 등의 문헌[Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 제4,797,368호; 제5,436,146호; 제6,632,670호; 제6,642,051호; 제7,078,387호; 제7,314,912호; 제6,498,244호; 제7,906,111호; 미국 특허 공개 US 2003-0138772, US 2007/0036760, 및 US 2009/0197338; Gao, 등의 문헌[J. Virol, 78(12):6381-6388 (June 2004)]; Gao,등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (May 13, 2003)]; 및 국제 특허 출원 WO 2010/138263 및 WO 93/24641; Kotin의 문헌[Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]; Muzyczka의 문헌[J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다). 재조합 AAV 벡터를 구축하기 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제5,173,414호; Tratschin등의 문헌[Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]; Tratschin 등의 문헌[Mol. Cell, Biol. 4:2072-2081 (1984)]; Hermonat & Muzyczka의 문헌[PNAS 81:64666470 (1984)]; 및 Samuiski 등의 문헌[J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]에 상세히 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다. 일반적으로, AAV-기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.Rh10, AAV11 및 이들의 변이체 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 예에서, AAV-기반 벡터는 AAV2에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 갖는다. 특정 예에서, AAV-기반 벡터는 AAV8에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 갖는다.

AAV 벡터는 다음 식을 갖는 본원에 기재된 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 임의의 외인성 폴리뉴클레오티드을 가지도록 조작될 수 있다: S - C - MT 또는 MT - C - S.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 바이러스 유사 입자(VLP) 플랫폼일 수 있다. 일반적으로, VLP는 바이러스 구조 단백질을 생성하고 생성된 바이러스 입자를 정제하여 구성된다. 그런 다음, 정제 후, 화물/페이로드(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)는 생체 외에서 정제된 입자 내에 캡슐화된다. 따라서, VLP의 생산은 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 핵산과 화물/페이로드를 암호화하는 핵산의 분리를 유지한다. VLP 생산에 사용되는 바이러스 구조 단백질은 포유동물, 효모, 곤충, 박테리아를 포함하는 다양한 발현 시스템, 또는 생체 내 번역 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 정제된 바이러스 입자는 원하는 화물의 존재하에 변성 및 개질되어 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 VLP를 생성할 수 있다. VLP의 생산은 Seow 등의 문헌[Mol Ther. 2009 May; 17(5): 767-777] 상세히 기재되어 있고, 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 다양한 세포를 표적화(즉, 감염)시키거나, 세포의 좁은 하위세트를 표적화하거나, 특정 세포를 표적화하도록 조작될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼에 대해 선택된 외피 단백질은 바이러스 친화성을 결정한다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼에 사용되는 바이러스는 특정 관심 세포를 표적으로 하기 위해 유사형을 지정할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 범친화성일 수 있고 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 범친화성 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 VSV-G 외피를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼은 양친성일 수 있고 포유동물 세포를 감염시킬 수 있다. 따라서, 당업자는 원하는 세포 유형을 표적화하기 위한 적절한 친화성, 유사형 및/또는 외피 단백질을 선택할 수 있다.

지질 구조 전달 시스템

본 개시의 조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)은 지질 매개 전달 시스템을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 지질 매개 전달 시스템은 내부 구획을 감싸는 외부 지질막으로 구성된 구조를 사용한다. 지질 기반 구조의 예는 지질 기반 나노입자, 리포솜, 미셀, 엑소좀, 소포, 세포외 소포, 세포 또는 조직을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 지질 구조 전달 시스템은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 화물/페이로드(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)를 전달할 수 있다.

지질 기반 나노입자는 단층 리포솜, 다중층 리포솜, 및 지질 제제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 "리포솜"은 원하는 화물, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산과 같은 조작된 핵산을 지질 쉘 또는 지질 응집체 내에 포함시켜 형성된 지질 비히클의 시험관 내 제제를 포괄하는 일반 용어이다. 리포솜은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수용성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 리포솜은 에멀젼, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 리포솜은 단층 리포솜일 수 있다. 리포솜은 다중층 리포솜일 수 있다. 리포솜은 다소포성 리포솜일 수 있다. 리포솜은 양전하, 음전하 또는 중성으로 하전될 수 있다. 특정 구현예에서, 리포솜은 전하가 중성이다. 리포솜은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질과 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 원하는 목적, 예를 들어 리포솜 크기, 산 불안정성 및 혈류 내 리포솜의 안정성과 같은 생체 내 전달 기준을 고려하여 인도된다. 예를 들어, Szokan 등의 문헌[Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)], 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호에 기술된 바와 같이 다양한 방법으로 리포솜을 제조할 수 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

다중층 리포솜은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액에 현탁되어 다중 지질층이 수성 매질에 의해 분리될 때 자발적으로 생성된다. 물과 용해된 용질은 자가 재배열을 겪는 지질 성분에 따라 지질 이중층 사이의 닫힌 구조에 갇힌다. 원하는 화물(예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 소분자 약물, 조작된 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 바이러스 벡터, 바이러스 기반 전달 시스템 등)은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화, 리포솜 및 폴리펩티드/핵산 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재, 리포솜에 포획, 리포솜과 복합체화, 또는 그렇지 않으면 표적 개체에 전달될 수 있도록 리포솜과 결합될 수 있다. 친유성 분자 또는 친유성 영역을 가진 분자는 또한 지질 이중층에 용해되거나 결합될 수 있다.

본 구현예에 따라 사용되는 리포솜은 당업자에게 공지된 바와 같이 상이한 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포솜의 제조는 WO 2016/201323, 국제 출원 PCT/US85/01161 및 PCT/US89/05040, 및 미국 특허 제4,728,578호, 제4,728,575호, 제4,737,323호, 제4,533,254호, 제4,162,282호, 제4,310,505호, 및 제4,921,706호에 상세히 기재되어 있고; 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

리포솜은 양이온성 리포솜일 수 있다. 양이온성 리포솜의 예는 미국 특허 제5,962,016호; 제5,030,453호; 제6,680,068호, 미국 출원 제2004/0208921호, 및 국제 특허 출원 WO03/015757A1, WO04029213A2, 및 WO02/100435A1에 상세히 기재되어 있고, 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

지질 매개 유전자 전달 방법은 예를 들어, WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite의 문헌[BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)]; 미국 특허 제5,279,833호 Rose 미국 특허 제5,279,833호; WO91/06309; 및 Felgner 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)]에 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

엑소좀은 원형질막과 다소포체의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내 이입 기원의 작은 막 소포이다. 엑소좀의 크기는 30 내지 100 nm 직경 범위이다. 이들의 표면은 공여자 세포의 세포막에서 나온 지질 이중층으로 구성되어 있고, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포의 막 단백질을 나타낸다. 핵산의 전달에 유용한 엑소좀은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 사실상 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제9,889,210호에 상세히 기재된 엑소좀이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포외 소포" 또는 "EV"는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 소포를 지칭한다. 일반적으로, 세포외 소포는 이들이 유래된 세포보다 작은 직경을 갖는 모든 막 결합 소포를 포함한다. 일반적으로 세포외 소포는 직경이 20 nm 내지 1000 nm 범위이고, 세포외 소포의 외부 표면에 표시되는 내부 공간 및/또는 막에 걸쳐 있는 다양한 거대분자 화물을 포함할 수 있다. 화물은 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 세포외 소포는 세포사멸체, 세포의 단편, 직접 또는 간접 조작(예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리 용액으로 처리)에 의해 세포로부터 유래된 소포, 소포화된 소기관, 및 살아있는 세포에 의해 (예를 들어, 직접적인 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해) 생성된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 유기체 또는 죽은 유기체, 이식된 조직 또는 기관, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "엑소좀"은 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 작은 (직경 20~300 nm, 보다 바람직하게는 직경 40~200 nm) 소포를 지칭하고, 이는 직접적인 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해 세포로부터 생성된다. 엑소좀은 지질 또는 지방산 및 폴리펩티드를 포함하고 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 수용자(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래될 수 있고, 그의 크기, 밀도, 생화학적 매개변수, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 엑소좀은 세포외 소포의 일종이다. 일반적으로, 엑소좀 생산/생체발생은 생산자 세포의 파괴를 초래하지 않는다. 엑소좀 및 엑소좀의 제조는 WO 2016/201323에 추가로 상세히 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본원에 사용된 용어 "나노소포"("미세소포"로도 지칭됨)는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 작은 (직경 20~250 nm, 보다 바람직하게는 직경 30~150 nm) 소포를 지칭하고, 이는 직접 또는 간접적 조작에 의해 세포로부터 생성되어 상기 나노소포가 상기 조작 없이 상기 생산자 세포에 의해 생성되지 않는다. 일반적으로, 나노소포는 세포외 소포의 아종이다. 생산자 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액 처리, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 나노소포의 생산은 일부 경우에 상기 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 나노소포 집단은 원형질막으로부터의 직접 출아 또는 원형질막과 후기 엔도솜의 융합에 의해 생산자 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 없다. 나노소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩티드, 및 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 수용자(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 나노소포는 일단 상기 조작에 따라 생산자 세포로부터 유래되면, 이의 크기, 밀도, 생화학적 매개변수, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.

지질 나노입자(LNP)는 일반적으로, 지질의 양친매성 성질에 의존하여 막 및 소포 유사 구조를 형성하는 합성 지질 구조이다(Riley 2017). 일반적으로, 이들 소포는 표적 세포의 막으로 흡수되고 화물을 세포질 내로 방출함으로써 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산 또는 바이러스 시스템과 같은 화물/페이로드를 전달한다. LNP 형성에 사용되는 지질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 지질은 합성 또는 천연 유래일 수 있고, 경우에 따라 생분해성이다. 지질은 지방, 콜레스테롤, 인지질, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 접합체(페길화 지질), 왁스, 오일, 글리세리드 및 지용성 비타민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 지질 접합체를 포함할 수 있다. 지질 조성물은 일반적으로 양이온성, 중성, 음이온성 및 양친매성 지질과 같은 물질의 정의된 혼합물을 포함한다. 일부 예에서, 특정 지질은 LNP 응집을 방지하거나, 지질 산화를 방지하거나, 추가 모이어티의 부착을 용이하게 하는 기능적 화학기를 제공하기 위해 포함된다. 지질 조성물은 전체 LNP 크기와 안정성에 영향을 줄 수 있다. 한 예에서, 지질 조성물은 디리놀레일메틸- 4-디메틸아미노부티레이트(MC3) 또는 MC3-유사 분자를 포함한다. MC3 및 MC3-유사 지질 조성물은 PEG 또는 PEG-접합 지질, 스테롤, 또는 중성 지질과 같은 하나 이상의 다른 지질을 포함하도록 제형화될 수 있다. 또한, LNP는 특정 세포 유형의 표적화를 촉진하기 위해 추가로 조작되거나 기능화될 수 있다. LNP 설계에서 또 다른 고려 사항은 표적화 효율성과 세포 독성 간의 균형이다.

미셀은, 일반적으로, 단일 사슬 지질을 사용하여 형성되는 구형 합성 지질 구조로, 여기서 단일 사슬 지질의 친수성 머리는 외층 또는 막을 형성하고 단일 사슬 지질의 소수성 꼬리는 미셀 중심을 형성한다. 미셀은 통상적으로 지질 단일층만 포함하는 지질 구조를 지칭한다. 미셀은 Quader 등의 문헌 [Mol Ther. 2017 Jul 5; 25(7): 1501-1513]에 보다 상세히 기재되어 있고, 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

발현 벡터와 같은, 혈청에 직접 노출된 핵산 벡터는 혈청 뉴클레아제에 의한 핵산 분해 또는 유리 핵산에 의한 면역계의 표적외 자극을 포함하여 여러 가지 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다. 유사하게, 혈청에 직접 노출된 바이러스 전달 시스템은 원하지 않는 면역 반응 및/또는 바이러스 전달 시스템의 중화를 유발할 수 있다. 따라서 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템의 캡슐화는 분해를 방지하는 동시에 잠재적인 표적 외 영향을 방지하는 데 사용할 수 있다. 특정 예에서, 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템은 LNP의 수성 내부와 같은 전달 비히클 내에 완전히 캡슐화된다. LNP 내의 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템의 캡슐화는 미세유체 액적 생성 장치에서 수행되는 미세유체 혼합 및 액적 생성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 이러한 장치는 표준 T-접합 장치 또는 흐름 초점 장치를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 한 예에서, MC3 또는 MC3-유사 함유 조성물과 같은 원하는 지질 제형은 조작된 핵산 또는 바이러스 전달 시스템 및 임의의 다른 원하는 제제와 병행하여 액적 생성 장치에 제공되어, 전달 벡터 및 원하는 제제는 MC3 또는 MC3 유사 기반 LNP의 내부에 완전히 캡슐화된다. 한 예에서, 액적 생성 장치는 생성된 LNP의 크기 범위 및 크기 분포를 제어할 수 있다. 예를 들어, LNP는 직경 1 내지 1000 나노미터, 예를 들어, 1, 10, 50, 100, 500, 또는 1000 나노미터 범위의 크기를 가질 수 있다. 액적 생성 후, 화물/페이로드(예를 들어, 조작된 핵산 및/또는 바이러스 전달 시스템)를 캡슐화하는 전달 비히클은 투여를 위해 준비하도록 추가로 처리되거나 조작될 수 있다.

나노입자 전달

나노물질은 조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 나노물질 비히클은 중요하게는 비면역원성 물질로 만들어질 수 있고 일반적으로 전달 벡터 자체에 대한 면역을 유발하는 것을 피할 수 있다. 이러한 물질은 지질(이전에 기술된 바와 같음), 무기 나노물질, 및 기타 중합체 물질을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 나노물질 입자는 Riley 등의 문헌 [Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery―A Review. Nanomaterials 2017, 7(5), 94]에 더욱 자세히 기재되어 있고, 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

게놈 편집 시스템

게놈 편집 시스템은, 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질) 중 하나 이상을 암호화하는 조작된 핵산과 같은, 조작된 핵산을 암호화하도록 숙주 게놈을 조작하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, "게놈 편집 시스템"은 외인성 유전자를 숙주 세포의 게놈에 통합하는 임의의 시스템을 지칭한다. 게놈 편집 시스템은 트랜스포존 시스템, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템, 및 바이러스 벡터 기반 전달 플랫폼을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

트랜스포존 시스템은 조작된 핵산, 예컨대 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질) 중 하나 이상을 암호화하는 조작된 핵산을 숙주 게놈에 통합하는데 사용될 수 있다. 트랜스포존은 일반적으로 화물/페이로드 핵산 및 트랜스포사제 옆에 있는 말단 역반복체(TIR)를 포함한다. 트랜스포존 시스템은 TIR-측면 화물과 함께 시스 또는 트랜스로 트랜스포존을 제공할 수 있다. 트랜스포존 시스템은 레트로트랜스포존 시스템 또는 DNA 트랜스포존 시스템일 수 있다. 일반적으로, 트랜스포존 시스템은 화물/페이로드(예를 들어, 조작된 핵산)를 숙주 게놈에 무작위로 통합한다. 트랜스포존 시스템의 예는, 각각이 사실상 참조로서 본원에 포함된, Hudecek 등의 문헌 [Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017 Aug;52(4):355-380], 및 미국 특허 제6,489,458호, 제6,613,752호 및 제7,985,739호에 더욱 자세히 기술된, Tc1/마리너 트랜스포존 슈퍼패밀리, 예컨대 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템의 트랜스포존을 사용하는 시스템을 포함한다. 트랜스포존 시스템의 다른 예는 미국 특허 제6,218,185호 및 제6,962,810호에 상세히 기재된 PiggyBac 트랜스포존 시스템을 포함하고, 이들 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

뉴클레아제 게놈 편집 시스템은, 조작된 핵산, 예컨대 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질) 중 하나 이상을 암호화하는 조작된 핵산을 암호화하도록 숙주 게놈을 조작하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 일반적으로, 외인성 유전자를 도입하기 위해 사용되는 뉴클레아제-매개 유전자 편집 시스템은 세포의 천연 DNA 복구 기전, 특히 상동 재조합(HR) 복구 경로를 이용한다. 간단히, 게놈 DNA에 대한 손상(통상적으로 이중 가닥 파손) 후, 세포는 병변을 복구하기 위한 DNA 합성 중 5' 및 3' 말단 모두에서 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 갖는 다른 DNA 공급원을 주형으로 사용하여 손상을 해결할 수 있다. 자연스러운 상황에서, HDR은 세포에 있는 다른 염색체를 주형으로 사용할 수 있다. 유전자 편집 시스템에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합 주형(HRT 또는 HR 주형)으로 사용하기 위해 세포에 도입된다. 일반적으로, HRT 내의 5' 및 3' 상보적 말단 사이에 포함된 병변이 있는 염색체에서 원래 발견되지 않은 임의의 추가 외인성 서열(예를 들어, 유전자 또는 유전자의 일부)은 주형화된 HDR 중 주어진 게놈 유전자좌에 혼입(즉, "통합")될 수 있다. 따라서, 주어진 게놈 유전자좌에 대한 통상적인 HR 주형은 내인성 게놈 표적 유전자좌의 제1 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열, 내인성 게놈 표적 유전자좌의 제2 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 화물/페이로드 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 예컨대 하나 이상의 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질)을 암호화하는 임의의 조작된 핵산)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

일부 예에서, HR 주형은 선형일 수 있다. 선형 HR 주형의 예는 선형화된 플라스미드 벡터, ssDNA, 합성된 DNA, 및 PCR 증폭된 DNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 예에서, HR 주형은 플라스미드와 같은 원형일 수 있다. 원형 주형은 슈퍼코일 주형을 포함할 수 있다.

도입될 외인성 서열에 대하여, HR 주형의 5' 및 3' 말단에서 발견되는 동일하거나 실질적으로 동일한 서열은 일반적으로 아암(arms)(HR 아암)으로 지칭된다. HR 아암은 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일(즉, 100% 동일)할 수 있다. HR 아암은 일부 예에서 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 실질적으로 동일할 수 있다. 실질적으로 동일한 HR 아암이 사용될 수 있지만, HDR 경로의 효율성이 100% 미만의 동일성을 갖는 HR 아암에 의해 영향을 받을 수 있으므로 HR 아암이 동일한 것이 유리할 수 있다.

각각의 HR 아암, 즉, 5' 및 3' HR 아암은 동일한 크기이거나 다른 크기일 수 있다. 각각의 HR 아암은 각각 길이가 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 염기 이상일 수 있다. 일반적으로 HR 아암의 길이는 제한이 없지만, HR 아암 길이 및 전체 주형 크기가 전체 편집 효율성에 미치는 영향과 같은 실용적인 고려 사항도 고려할 수 있다. HR 아암은 절단 부위에 바로 인접한 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 각각의 HR 아암은 절단 부위에 바로 인접한 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 각각의 HR 아암은 서로 1개 염기쌍, 10개 염기쌍 이하, 50개 염기쌍 이하, 또는 100개 염기쌍 이하와 같이, 절단 부위의 특정 거리 내에서 내인성 게놈 표적 유전자좌의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다.

뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 간격이 있는 짧은 회문 반복(CRISPR) 패밀리 뉴클레아제 또는 이의 유도체, 전사 활성 인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 이의 유도체, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 이의 유도체, 및 귀소 엔도뉴클레아제(HE) 또는 이의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 표적 게놈 유전자좌를 절단하기 위한 다양한 뉴클레아제를 사용할 수 있다.

CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은, 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 데그론-융합 키메라 단백질 또는 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질) 중 하나 이상을 암호화하는 조작된 핵산과 같은 조작된 핵산을 암호화하도록 숙주 게놈을 조작하는 데 사용될 수 있다. CRISPR 시스템은 M. Adli("The CRISPR tool kit for genome editing and beyond" Nature Communications; volume 9 (2018), Article number: 1911)에 더욱 상세히 기재되어 있고, 본원에 교시하는 모든 내용에 대해 참조로 통합된다. 일반적으로, CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은 CRISPR-연관(Cas) 뉴클레아제 및 특정 표적 서열로의 절단을 지시하는 RNA(들)를 포함한다. 예시적인 CRISPR-매개 유전자 편집 시스템은 Cas9 뉴클레아제 및 CRISPR RNA(crRNA) 도메인 및 트랜스-활성화 CRISPR(tracrRNA) 도메인을 갖는 RNA(들)로 구성된 CRISPR/Cas9 시스템이다. crRNA는 통상적으로 2개의 RNA 도메인을 갖는다: 염기쌍 혼성화를 통해 표적 서열("정의된 뉴클레오티드 서열"), 예를 들어, 게놈 서열에 대한 특이성을 지시하는 가이드 RNA 서열(gRNA); 및 tracrRNA에 혼성화하는 RNA 도메인. tracrRNA는 게놈 유전자좌에 대한 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 상호 작용하고 이에 의해 이의 동원을 촉진할 수 있다. crRNA 및 tracrRNA 폴리뉴클레오티드는 별도의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. crRNA 및 tracrRNA 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드 RNA(sgRNA)로도 지칭되는, 단일 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 여기에서는 Cas9 시스템이 설명되어 있지만, Cpf1/Cas12 또는 Cas13 시스템과 같은 다른 CRISPR 시스템을 사용할 수 있다. 뉴클레아제는 이의 유도체, 예컨대, Cas9 기능적 돌연변이체, 예를 들어, 일반적으로 Cas9 효소에 의해 통상적으로 생성되는 완전한 이중 가닥 파손과 대조적으로 정의된 뉴클레오티드 서열의 단일 가닥의 절단만을 매개하는 Cas9 "니카아제" 돌연변이체를 포함할 수 있다.

일반적으로, CRISPR 시스템의 구성 요소는 서로 상호 작용하여 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하여 서열 특이적 절단을 매개한다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각 구성 요소를 별도로 생산하여 RNP 복합체를 형성하는 데 사용할 수 있다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각 구성 요소는 시험관 내에서 별도로 생산되고 시험관 내에서 서로 접촉(즉, "복합체화")되어 RNP 복합체를 형성할 수 있다. 그런 다음 시험관 내 생산된 RNP는 세포의 세포질 및/또는 핵, 예를 들어, T 세포의 세포질 및/또는 핵으로 도입(즉, "전달")될 수 있다. 시험관 내에서 생산된 RNP 복합체는 전기천공, 지질 매개 형질주입, 물리적 수단에 의한 세포막 변형, 지질 나노입자(LNP), 바이러스 유사 입자(VLP), 및 초음파 처리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 수단에 의해 세포에 전달할 수 있다. 특정 예에서, 시험관 내에서 생산된 RNP 복합체는 Nucleofactor/Nucleofection® 전기천공 기반 전달 시스템(Lonza®)을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 다른 전기천공 시스템은 MaxCyte 전기천공 시스템, Miltenyi CliniMACS 전기천공 시스템, Neon 전기천공 시스템, 및 BTX 전기천공 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. CRISPR 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9는 당업자에게 공지된 다양한 단백질 생산 기술을 사용하여 시험관 내에서 생산(즉, 합성 및 정제)될 수 있다. CRISPR 시스템 RNA, 예를 들어, sgRNA는 시험관 내 전사 또는 화학적 합성과 같은 당업자에게 공지된 다양한 RNA 생산 기술을 사용하여 시험관 내 생산(즉, 합성 및 정제)될 수 있다.

시험관 내에서 생산된 RNP 복합체는 다양한 뉴클레아제 대 gRNA 비율로 복합체를 형성할 수 있다. 시험관 내에서 생산된 RNP 복합체는 또한 CRISPR-매개 편집 시스템에서 상이한 양으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 편집하고자 하는 세포의 수에 따라, 반응에서 많은 수의 세포를 편집할 때 첨가되는 RNP 복합체의 양을 줄이는 것과 같이 총 RNP 첨가량을 조절할 수 있다.

일부 CRISPR 시스템에서, 각각의 구성 요소(예를 들어, Cas9 및 sgRNA)는 폴리뉴클레오티드에 의해 별도로 암호화될 수 있으며, 각각의 폴리뉴클레오티드는 함께 또는 개별적으로 세포 내로 도입된다. 일부 CRISPR 시스템에서, 각각의 구성 요소는 단일 폴리뉴클레오티드(즉, 다중-프로모터 또는 다중시스트론 벡터, 하기 예시적인 다중시스트론 시스템의 설명 참조)에 의해 암호화되고 세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내에서 각각의 폴리뉴클레오티드 암호화된 CRISPR 구성 요소의 발현(예를 들어, 뉴클레아제의 번역 및 CRISPR RNA의 전사) 후, RNP 복합체가 세포 내에서 형성될 수 있고 이어서 부위-특이적 절단을 지시할 수 있다.

일부 RNP는 핵으로의 RNP 전달을 촉진하는 모이어티를 갖도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 핵 국소화 신호(NLS) 도메인을 가질 수 있으므로, Cas9 RNP 복합체가 세포의 세포질 내로 전달되거나 Cas9의 번역 및 후속 RNP 형성 후에, NLS가 Cas9 RNP의 핵으로의 추가 트래피킹을 촉진할 수 있다.

본원에 기재된 조작된 세포는 비-바이러스 방법을 사용하여 조작될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레아제 및/또는 CRISPR 매개 유전자 편집 시스템은 비-바이러스 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 본원에 기재된 조작된 세포는 바이러스 방법을 사용하여 조작될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레아제 및/또는 CRISPR 매개 유전자 편집 시스템은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 본원에 기재된 임의의 다른 바이러스 기반 전달 방법과 같은 바이러스 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다.

일부 CRISPR 시스템에서, 하나를 초과하는 CRISPR 조성물이 제공될 수 있어서 각각이 동일한 유전자 또는 표적 뉴클레오티드 서열보다 많은 일반 게놈 유전자좌를 개별적으로 표적화한다. 예를 들어, 2개의 개별 CRISPR 조성물은 서로의 특정 거리 내에서 2개의 상이한 표적 뉴클레오티드 서열에서 절단을 지시하기 위해 제공될 수 있다. 일부 CRISPR 시스템에서, 동일한 유전자 또는 일반 게놈 유전자좌의 반대 가닥을 각각 별도로 표적화하도록 하나를 초과하는 CRISPR 조성물이 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 개별 CRISPR "니카아제" 조성물은 동일한 유전자 또는 일반 게놈 유전자좌의 반대 가닥에서 절단을 지시하기 위해 제공될 수 있다.

일반적으로, 본원에 기재된 CRISPR-매개 편집 시스템의 특징은 다른 뉴클레아제-기반 게놈 편집 시스템에 적용될 수 있다. TALEN은 조작된 부위 특이적 뉴클레아제이고, 이는 TALE(전사 활성화제 유사 효과기)의 DNA 결합 도메인 및 제한 엔도뉴클레아제 Fokl의 촉매 도메인으로 구성된다. DNA 결합 도메인의 단량체의 고도로 가변적인 잔기 영역에 존재하는 아미노산을 변경함으로써, 상이한 인공 TALEN을 생성하여 다양한 뉴클레오티드 서열을 표적화할 수 있다. DNA 결합 도메인은 후속적으로 뉴클레아제를 표적 서열로 지시하고 이중 가닥 파손을 생성한다. TALEN-기반 시스템은 미국 특허 제12/965,590호; 미국 특허 제8,450,471호; 미국 특허 제8,440,431호; 미국 특허 제8,440,432호; 미국 특허 제10,172,880호; 및 미국 특허 제13/738,381호에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. ZFN-기반 편집 시스템은 미국 특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국 특허 공개 제2005/0064474호; 제2007/0218528호; 제2005/0267061호에 상세히 기재되어 있고, 모두 그 전체가 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

기타 조작 전달 시스템

조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 세포 또는 다른 표적 수용자 개체로 도입하기 위한 다양한 추가 수단, 예컨대 본원에 기재된 임의의 지질 구조.

전기천공법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 수용자 개체에 전달할 수 있다. 전기천공법은 전기장을 적용하여 표적 세포 또는 개체의 외막 또는 껍질을 일시적으로 투과시켜 화물/페이로드를 표적 세포 또는 개체의 내부 구획으로 내부화하는 방법이다. 일반적으로, 방법은 관심 화물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 함유하는 용액에서 2개의 전극 사이에 세포 또는 표적 개체를 배치하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 화물이 세포의 세포질과 같은 개체의 내부로 들어갈 수 있도록 하는 일시적인 설정 전압을 적용함으로써 세포의 지질막이 파괴, 즉 투과화된다. 세포의 예에서, 세포의 다수는 아닐지라도 적어도 일부는 생존할 수 있다. 세포 및 다른 개체는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 전기천공될 수 있다. 전기천공 조건(예를 들어, 세포 수, 화물 농도, 복구 조건, 전압, 시간, 정전용량, 펄스 유형, 펄스 길이, 부피, 큐벳 길이, 전기천공 용액 조성 등)은 세포 또는 다른 수용자 개체의 유형, 전달할 화물, 원하는 내부화의 효율성, 및 원하는 생존 가능성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 인자에 따라 다르다. 이러한 기준의 최적화는 당업자의 범위 내에 있다. 다양한 장치 및 프로토콜을 전기천공에 사용할 수 있다. 예는 Neon^® 형질주입 시스템, MaxCyte^® Flow Electroporation??, Lonza^® Nucleofector?? 시스템, 및 Bio-Rad^® 전기천공 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

조작된 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 세포 또는 다른 표적 수용자 개체로 도입하기 위한 다른 수단은 초음파 처리, 유전자 총, 유체역학적 주입 및 물리적 수단에 의한 세포막 변형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

생체 내에서 조작된 mRNA, 예를 들어 네이키드 플라스미드 또는 mRNA를 전달하기 위한 조성물 및 방법은 Kowalski 등의 문헌 [Mol Ther. 2019 Apr 10; 27(4): 710-728] 및 Kaczmarek 등의 문헌 [Genome Med. 2017; 9: 60.]에 자세히 기재되어 있고, 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

전달 비히클

또한, 화물/페이로드("전달 수단")를 전달하기 위한 조성물이 본원에 제공된다.

화물은 전술된 바와 같은 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산, 예컨대 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산)을 포함할 수 있다. 화물은 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 화물은 본원에 제공된 임의의 키메라 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 임의의 막 절단 가능 키메라 단백질)일 수 있다. 화물은 본원에 기재된 키메라 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 키메라 단백질 중 2개 이상의 조합일 수 있다. 화물은 본원에 기재된 키메라 단백질 및 또 다른 관심 화물, 예컨대 또 다른 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이들의 조합의 조합일 수 있다.

전달 비히클은 화물을 전달하기에 적합한 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 전달 비히클은 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질)을 전달하기에 적합한 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 전달 비히클은 본원에 기재된 임의의 지질 구조 전달 시스템일 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 지질 기반 나노입자, 리포솜, 미셀, 엑소좀, 소포, 세포외 소포, 세포 또는 조직을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 지질 기반 구조일 수 있다. 전달 비히클은 본원에 기재된 임의의 나노입자, 예컨대, 지질(전술한 바와 같음)을 포함하는 나노입자, 무기 나노물질, 및 다른 중합체 물질일 수 있다.

전달 비히클은, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 세포에 전달하는 것과 같이, 세포에 화물을 전달할 수 있다. 전달 비히클은, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 세포에 전달하는 것과 같이, 세포에 화물을 전달할 수 있다. 전달 비히클은 특정 세포를 표적화하도록 구성될 수 있는데, 예컨대, 특정 세포를 표적화하기 위해 재유도 항체로 구성된다. 전달 비히클은 생체 내에서 세포에 화물을 전달할 수 있다 .

전달 비히클은, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 생체 내 조직 또는 조직 환경에 전달하는 것과 같이, 조직 또는 조직 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에 화물을 전달할 수 있다. 화물을 전달하는 단계는, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 분비하는 것과 같이, 화물을 분비하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 전달 비히클은, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 분비하는 것과 같이, 화물을 분비할 수 있다. 전달 비히클은, 본원에 기재된 임의의 키메라 단백질을 조직 또는 조직 환경으로 분비하는 것과 같이, 조직 또는 조직 환경(예를 들어, 종양 미세환경)으로 화물을 분비할 수 있다. 전달 비히클은 특정 조직 또는 조직 환경(예를 들어, 종양 미세환경)을 표적화하도록 구성될 수 있고, 예컨대, 특정 조직 또는 조직 환경을 표적화하기 위한 재유도 항체로 구성된다.

치료 방법

대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에 제공된 바와 같은 조작된 세포를 전달 또는 투여하는 단계로서, 조작된 세포에 의해 생산되는 적어도 하나의 관심 단백질(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질, 또는 키메라 단백질의 프로테아제 절단 후 본원에 제공된 분비된 효과기 분자)을 생체 내 생산하기 위한 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에 제공된 바와 같은 조작된 세포를 전달 또는 투여하는 단계로서, 조작된 세포에 의해 생산되는, 적어도 두 개의 관심 단백질, 예를 들어, 본원에 제공된 적어도 2개의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 생체 내 생산하기 위한 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.

대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에 기재된 임의의 전달 비히클, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 관심 단백질, 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 본원에 기재된 임의의 전달 비히클을 전달 또는 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에 기재된 임의의 전달 비히클, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 관심 단백질, 예를 들어, 2개 이상의 단백질, 예를 들어, 본원에 제공된 적어도 2개의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 전달 비히클을 전달 또는 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.

일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 정맥 내, 복막 내, 기관 내, 피하, 종양 내, 경구, 항문, 비강 내(예컨대, 전달 입자에 패키징됨) 또는 동맥(예컨대, 내부 경동맥) 경로를 통해 투여된다. 따라서, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 전신적으로 또는 (예를 들어, TME에 또는 종양내 투여를 통해) 국소적으로 투여될 수 있다. 조작된 세포는 대상체, 예컨대, 암이 있는 것으로 알려지거나 의심되는 대상체로부터 단리될 수 있다. 조작된 세포는 치료를 받는 대상체에 대하여 동종이형일 수 있다. 동종이형 변형 세포는 치료가 투여되는 대상체에 대해 HLA-일치될 수 있다. 전달 비히클은 본원에 기재된 임의의 지질 구조 전달 시스템일 수 있다. 전달 비히클은 본원에 기재된 임의의 나노입자일 수 있다.

조작된 세포 또는 전달 비히클은 단독으로 또는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 본원에 기재된 하나 이상의 IMiD와 조합하여 투여될 수 있다. FDA 승인 IMiD는 승인된 방식으로 투여할 수 있다. 또 다른 예에서, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 관문 억제제 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 관문 억제제는, 이에 한정되지는 않으나, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체,항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체를 포함한다. 예시적인 면역 관문 억제제는 펨브롤리주맙(항-PD-1; MK-3475/Keytruda® - Merck), 니볼루맙(항-PD-1; Opdivo® - BMS), 피딜리주맙(항-PD-1 항체; CT-011 - Teva/CureTech), AMP224(항-PD-1; NCI), 아벨루맙(항-PD-L1; Bavencio® - Pfizer), 더발루맙(항-PD-L1; MEDI4736/Imfinzi® - Medimmune/AstraZeneca), 아테졸리주맙(항-PD-L1; Tecentriq® - Roche/Genentech), BMS-936559(항-PD-L1 - BMS), 트레멜리루맙(항-CTLA-4; Medimmune/AstraZeneca), 이필리무맙(항-CTLA-4; Yervoy ® - BMS), 리릴루맙(항-KIR; BMS), 모날리주맙(항-NKG2A; Innate Pharma/AstraZeneca)을 포함한다. 다른 예에서, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 TGF베타 억제제, VEGF 억제제, 또는 HPGE2와 조합하여 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조작된 세포 또는 전달 비히클은 항-CD40 항체와 조합하여 투여될 수 있다.

일부 방법은 종양(또는 암)이 있는 대상체 (또는 환자 집단)을 선택하고 종양 매개 면역억제성 기전을 조절하는 조작된 세포 또는 전달 비히클로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

본 개시의 조작된 세포 또는 전달 비히클은 일부 경우에, 암, 예컨대, 난소암을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 암이 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 조작된 세포는 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 결장직장 종양, 식도 종양, 신경교종, 신장 종양, 간 종양, 폐 종양, 흑색종, 난소 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 갑상선 종양 및/또는 자궁 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 조작된 세포 또는 전달 비히클은 대상체의 복막 공간에 위치한 종양을 가진 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에 제공된 방법은 또한 조작된 세포 또는 전달 비히클의 제제를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 조작된 세포 이외의 세포를, 예를 들어, 5% 미만(예를 들어, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만) 함유하는 실질적으로 순수한 제제이다. 제제는 1x10⁵ 세포/kg 내지 1x10⁷ 세포/kg의 세포를 포함할 수 있다. 조작된 세포 또는 전달 비히클의 제조는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 갖는 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 세포 또는 전달 비히클의 제제는 임의의 조작된 바이러스, 예컨대 조작된 AAV 바이러스, 또는 본원에 기재된 AAV 벡터와 같은 임의의의 조작된 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.

생체 내 발현

본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 조작된 세포를 생체 내 생산할 수 있는, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 생체 내 세포에 전달할 수 있는 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 조성물은 임의의 바이러스 매개 전달 플랫폼, 임의의 지질 구조 전달 시스템, 임의의 나노입자 전달 시스템, 임의의 게놈 편집 시스템, 또는 생체 내 세포 조작을 할 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 조작 전달 시스템을 포함한다.

본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 임의의 관심 단백질, 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 키메라 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 식 S - C - MT 또는 MT - C - S를 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질을 생체 내 생산할 수 있는 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 방법은 또한 본원에 기재된 2개 이상의 관심 단백질을 생체 내 생산할 수 있는 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 관심 단백질의 생체 내 생산이 가능한 조성물은 본원에 기재된 임의의 조작된 핵산을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 관심 단백질의 생체 내 생산이 가능한 조성물은 네이키드 mRNA 또는 네이키드 플라스미드일 수 있다.

추가 구현예

1. 프로모터 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는, 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산:

S - C - MT 또는 MT - C - S

(식에서

S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,

C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고,

MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,

프로모터는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨).

2. 구현예 1에 있어서, 프로모터는 구성적 프로모터인, 조작된 핵산.

3. 구현예 2에 있어서, 구성적 프로모터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산: CAG, HLP, CMV, EFS, SFFV, SV40, MND, PGK, UbC, hEF1aV1, hCAGG, hEF1aV2, hACTb, heIF4A1, hGAPDH, hGRP78, hGRP94, hHSP70, hKINb, 및 hUBIb.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인, 조작된 핵산.

5. 구현예 4에 있어서, 유도성 프로모터는 NFkB 반응 요소, CREB 반응 요소, NFAT 반응 요소, SRF 반응 요소 1, SRF 반응 요소 2, AP1 반응 요소, TCF-LEF 반응 요소 프로모터 융합, 저산소증 반응성 요소, SMAD 결합 요소, STAT3 결합 부위, 유도 인자 분자 반응성 요소 및 이들의 탠덤 반복체로 이루어진 군으로부터 선택된 반응 요소를 포함하는, 조작된 핵산.

6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 합성 프로모터인, 조작된 핵산.

7. 구현예 6에 있어서, 합성 프로모터는 최소 프로모터 및 최소 프로모터에 이종인 적어도 하나의 조절 요소를 포함하는, 조작된 핵산.

8. 구현예 7에 있어서, 적어도 하나의 조절 요소는 활성화-조건 조절 폴리펩티드-(ACP-) 결합 도메인 서열 및 프로모터 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

9. 구현예 8에 있어서, ACP 결합 도메인이 하나 이상의 징크 핑거 결합 부위를 포함하는, 조작된 핵산.

10. 구현예 8 또는 9에 있어서, 합성 프로모터는 합성 프로모터의 ACP-결합 도메인에 결합하는 활성화-조건 조절 폴리펩티드(ACP)에 의해 조절 가능한, 조작된 핵산.

11. 구현예 10에 있어서, ACP가 전사 조절 인자인, 조작된 핵산.

12. 구현예 10 또는 11에 있어서, ACP는 전사 억제 인자인, 조작된 핵산.

13. 구현예 10 또는 11에 있어서, ACP는 전사 활성 인자인, 조작된 핵산.

14. 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, ACP는 억제성 프로테아제 및 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위를 추가로 포함하는, 조작된 핵산.

15. 구현예 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, ACP는 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인(ERT2 도메인)을 추가로 포함하는, 조작된 핵산.

16. 구현예 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, ACP는 전사 인자인, 조작된 핵산.

17. 구현예 16에 있어서, 전사 인자는 징크-핑거 함유 전사 인자인, 조작된 핵산.

18. 구현예 10 내지 17 중 어느 하나에 있어서, ACP는 DNA-결합 징크 핑거 단백질 도메인(ZF 단백질 도메인) 및 전사 효과기 도메인을 포함하는, 조작된 핵산.

19. 구현예 18에 있어서, ZF 단백질 도메인이 모듈식으로 설계되고, 징크 핑거 어레이(ZFA)로 구성된, 조작된 핵산.

20. 구현예 19에 있어서, ZF 단백질 도메인이 1 내지 10개의 ZFA를 포함하는, 조작된 핵산.

21. 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 효과기 도메인은 단순 포진 바이러스 단백질 16(VP16) 활성화 도메인; VP64 활성화 도메인인, VP16의 4개의 탠덤 카피를 포함하는 활성화 도메인; NFκB의 p65 활성화 도메인; 엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성인자(Rta) 활성화 도메인; VP64, p65, 및 Rta 활성화 도메인(VPR 활성화 도메인)을 포함하는 세 부분으로 된 활성 인자; 인간 E1A-연관 단백질 p300의 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 코어 도메인(p300 HAT 코어 활성화 도메인); 크루펠 연관 박스(KRAB) 억제 도메인; 억제 인자 요소 침묵 전사 인자(REST) 억제 도메인; 터럭 관련 염기성 나선-루프-나선 억제 인자 단백질의 WRPW 모티프, 모티프는 WRPW 억제 도메인으로 알려져 있음; DNA (시토신-5)-메틸트랜스퍼라제 3B(DNMT3B) 억제 도메인; 및 HP1 알파 크로모섀도우 억제 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조작된 핵산.

22. 구현예 14 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 억제성 프로테아제의 하나 이상의 동족 절단 부위는 ZF 단백질 도메인과 효과기 도메인 사이에 국소화되어 있는, 조작된 핵산.

23. 구현예 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 억제성 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)인, 조작된 핵산.

24. 구현예 23에 있어서, 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 조작된 핵산.

25. 구현예 24에 있어서, NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는, 조작된 핵산.

26. 구현예 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, NS3 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는, 조작된 핵산.

27. 구현예 26에 있어서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아수나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실라프레비르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

28. 구현예 15 내지 27 중 어느 하나에 있어서, ACP는 타목시펜 또는 이의 대사 산물에 대한 ERT2 도메인의 결합 시 핵 국소화를 겪을 수 있는, 조작된 핵산.

29. 구현예 28에 있어서, 타목시펜 대사 산물은 4-하이드록시타목시펜, N-데스메틸타목시펜, 타목시펜-N-옥사이드, 및 엔독시펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

30. 구현예 10 내지 29 중 어느 하나에 있어서, ACP는 데그론 도메인을 추가로 포함하되, 데그론 도메인은 ACP에 작동 가능하게 연결되는, 조작된 핵산.

31. 구현예 30에 있어서, 데그론 도메인은 HCV NS4 데그론, PEST(인간 I

Bα의 잔기 277~307의 2개 카피), GRR(인간 p105의 잔기 352~408), DRR(효모 Cdc34의 잔기 210~295), SNS(SP2 및 NB의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2), RPB(효모 RPB의 잔기 1688~1702의 4개 카피), SPmix(SP1 및 SP2의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2), NS2(인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79~93의 3개 카피), ODC(오르니틴 데카르복실라제의 잔기 106~142), Nek2A, 마우스 ODC(잔기 422~461), 마우스 ODC_DA(D433A 및 D434A 점 돌연변이를 포함하는 mODC의 잔기 422~461), APC/C 데그론, COP1 E3 리가아제 결합 데그론 모티프, CRL4-Cdt2 결합 PIP 데그론, 액틴필린 결합 데그론, KEAP1 결합 데그론, KLHL2 및 KLHL3 결합 데그론, MDM2 결합 모티프, N-데그론, 저산소증 신호 전달에서 하이드록시프롤린 변형, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, SCF 유비퀴틴 리가아제 결합 포스포데그론, 식물호르몬 의존성 SCF-LRR 결합 데그론, DSGxxS 포스포-의존성 데그론, Siah 결합 모티프, SPOP SBC 도킹 모티프, 및 PCNA 결합 PIP 박스로 이루어진 군으로부터 선택되는 데그론으로부터 유래된, 조작된 핵산.

32. 구현예 30에 있어서, 데그론 도메인은 면역조절 약물(IMiD)에 반응하여 CRBN에 결합할 수 있는 세레블론(CRBN) 폴리펩티드 기질 도메인을 포함하여 ACP의 유비퀴틴 경로 매개 분해를 촉진하는, 조작된 핵산.

33. 구현예 32에 있어서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: IKZF1, IKZF3, CKla, ZFP91, GSPT1, MEIS2, GSS E4F1, ZN276, ZN517, ZN582, ZN653, ZN654, ZN692, ZN787, 및 ZN827, 또는 CRBN의 약물 유도성 결합이 가능한 이의 단편.

34. 구현예 32에 있어서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 천연 CRBN 폴리펩티드 서열의 키메라 융합 생성물인 조작된 핵산.

35. 구현예 32에 있어서, CRBN 폴리펩티드 기질 도메인은 FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLHTGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(서열번호 175)의 아미노산 서열을 갖는 IKZF3/ZFP91/IKZF3 키메라 융합 생성물인, 조작된 핵산.

36. 구현예 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, IMiD는 FDA 승인 약물인, 조작된 핵산.

37. 구현예 32 내지 구현예 36 중 어느 하나에 있어서, IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

38. 구현예 30 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 데그론 도메인은 억제성 프로테아제의 N-말단, 억제성 프로테아제의 C-말단, ZF 단백질 도메인의 N-말단, ZF 단백질 도메인의 C-말단, 효과기 도메인의 N-말단, 또는 효과기 도메인의 C-말단인, 조작된 핵산.

39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터인, 조작된 핵산.

40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 신호 펩티드 또는 신호-앵커 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

41. 구현예 40에 있어서, 신호 펩티드는 분비성 효과기 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함하는, 조작된 핵산.

42. 구현예 40에 있어서, 신호 펩티드가 비천연 신호 펩티드를 포함하거나 신호-앵커 서열이 분비성 효과기 분자에 대한 비천연 신호-앵커 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

43. 구현예 42에 있어서, 비천연 신호 펩티드 또는 비천연 신호-앵커 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산: IL-12, IL-2, 최적화된 IL-2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 쥣과 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL-6, IL-8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12, IL-21, CD8, NKG2D, TNFR2, 및 GMCSF.

44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 치료적 클래스로부터 선택되고, 여기서 치료적 클래스는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

45. 구현예 44에 있어서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산: IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.

46. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15, IL-12, 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 조작된 핵산.

47. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15를 포함하는, 조작된 핵산.

48. 구현예 47에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산 .

49. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15Rα 스시 도메인 또는 IL15/IL-15Rα 스시 도메인 융합 단백질을 포함하는, 조작된 핵산.

50. 구현예 49에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산 .

51. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-12 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 조작된 핵산.

52. 구현예 51에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산 .

53. 구현예 44에 있어서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 핵산: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.

54. 구현예 44에 있어서, 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; SDF1; 및 MMP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

55. 구현예 44에 있어서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산: FLT3L 및 GM-CSF.

56. 구현예 44에 있어서, 공동 활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산: 4-1BBL 및 CD40L.

57. 구현예 44에 있어서, 종양 미세환경 개질 인자는 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

58. 구현예 57에 있어서, TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

59. 구현예 57에 있어서, 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

60. 구현예 57에 있어서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하는, 조작된 핵산.

61. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자인, 조작된 핵산.

62. 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 조작된 핵산: 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, MMP9 프로테아제, 및 NS3 프로테아제.

63. 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ADAM17 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 조작된 핵산.

64. 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는, 조작된 핵산.

65. 실시예 64에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하는, 조작된 핵산.

66. 실시예 65에 있어서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치하는, 조작된 핵산.

67. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는 V, L, S, I, Y, T, 또는 A인, 조작된 핵산.

68. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하고,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는 V, L, S, I, Y, 또는 T인, 조작된 핵산.

69. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

70. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

71. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

72. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

73. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

74. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

75. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

76. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

77. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR의 아미노산 서열(서열번호 187)을 포함하는, 조작된 핵산.

78. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

79. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

80. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

81. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

82. 구현예 1 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 핵산.

83. 구현예 1 내지 구현예 82 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함하는, 조작된 핵산.

84. 구현예 83에 있어서, 막관통-세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인은 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-쇄, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래된, 조작된 핵산.

85. 구현예 1 내지 84에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키기 위해 번역 후 변형이 가능한 모티프를 포함하며, 여기서 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있는, 조작된 핵산.

86. 구현예 85에 있어서, 번역 후 변형 태그는 지질-앵커 도메인을 포함하고, 선택적으로, 지질-앵커 도메인은 GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 및 팔미토일화 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

87. 구현예 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함하는, 조작된 핵산.

88. 구현예 1 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자는 세포의 세포막에 테더링되는, 조작된 핵산.

89. 구현예 88에 있어서, 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자는 세포 막으로부터 방출되는, 조작된 핵산.

90. 실시예 89에 있어서, 세포 막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 내인성인, 조작된 핵산.

91. 구현예 90에 있어서, 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

92. 구현예 91에 있어서, 프로테아제는 ADAM17 프로테아제인, 조작된 핵산.

93. 구현예 89에 있어서, 세포 막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 대해 이종인, 조작된 핵산.

94. 구현예 93에 있어서, 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)인, 조작된 핵산.

95. 구현예 94에 있어서, 동족 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 조작된 핵산.

96. 구현예 95에 있어서, NS3 프로테아제 절단 부위는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는, 조작된 핵산.

97. 구현예 89 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는, 조작된 핵산.

98. 구현예 97에 있어서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아수나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실라프레비르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.

99. 구현예 89 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제의 발현 및/또는 국소화는 조절될 수 있는, 조작된 핵산.

100. 실시예 99에 있어서, 발현 및/또는 국소화는 세포의 상태에 의해 조절되는, 조작된 핵산.

101. 구현예 1 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 조작된 핵산은 DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 네이키드 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 또는 이중 가닥 핵산인, 조작된 발현 시스템.

102. 구현예 1 내지 100 중 어느 하나의 조작된 핵산을 포함하는 발현 벡터.

103. 구현예 102에 있어서, 발현 벡터는 바이러스 벡터인, 발현 벡터.

104. 구현예 103에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 발현 벡터.

105. N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 다음의 식을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질:

S - C - MT 또는 MT - C - S

(식에서

S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,

C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고,

MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,

S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨).

106. 구현예 105에 있어서, 분비성 효과기 분자는 신호 펩티드 또는 신호-앵커 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

107. 구현예 106에 있어서, 신호 펩티드는 분비성 효과기 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함하는, 키메라 단백질.

108. 구현예 106에 있어서, 신호 펩티드가 비천연 신호 펩티드를 포함하거나 신호-앵커 서열이 분비성 효과기 분자에 대한 비천연 신호-앵커 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

109. 구현예 108에 있어서, 비천연 신호 펩티드 또는 비천연 신호 앵커 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질: IL-12, IL-2, 최적화된 IL-2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 쥣과 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL-6, IL-8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12, IL-21, CD8, NKG2D, TNFR2, 및 GMCSF.

110. 구현예 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 치료적 클래스로부터 선택되고, 여기서 치료적 클래스는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

111. 구현예 110에 있어서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메라 단백질: IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.

112. 구현예 105 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15, IL-12, 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 키메라 단백질.

113. 구현예 112에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15를 포함하는, 키메라 단백질.

114. 구현예 113에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질 .

115. 구현예 113에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15Rα 스시 도메인 또는 IL15/IL-15Rα 스시 도메인 융합 단백질을 포함하는, 키메라 단백질.

116. 구현예 115에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질 .

117. 구현예 112에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-12 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 키메라 단백질.

118. 구현예 117에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질 .

119. 구현예 110에 있어서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.

120. 구현예 110에 있어서, 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; SDFl; 및 MMP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

121. 구현예 110에 있어서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키메라 단백질: FLT3L 및 GM-CSF.

122. 구현예 110에 있어서, 공동 활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질: 4-1BBL 및 CD40L.

123. 구현예 110에 있어서, 종양 미세환경 개질 인자는 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

124. 구현예 123에 있어서, TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

125. 구현예 123에 있어서, 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

126. 구현예 123에 있어서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 단백질.

127. 구현예 105 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자인, 키메라 단백질.

128. 구현예 105 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, MMP9 프로테아제, 및 NS3 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된, 프로로테아제에 의해 절단 가능한, 키메라 단백질.

129. 구현예 105 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ADAM17 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 키메라 단백질.

130. 구현예 105 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는, 키메라 단백질.

131. 구현예 130에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하는, 키메라 단백질.

132. 실시예 131에 있어서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치하는, 키메라 단백질.

133. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는, V, L, S, I, Y, T, 또는 A인, 키메라 단백질.

134. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는 V, L, S, I, Y, 또는 T인, 키메라 단백질.

135. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

136. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

137. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

138. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

139. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

140. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

141. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

142. 구현예 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

143. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

144. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

145. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

146. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

147. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

148. 구현예 105 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

149. 구현예 105 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.

150. 구현예 149에 있어서, 막관통-세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인은 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-쇄, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래된, 키메라 단백질.

151. 구현예 105 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키기 위해 번역 후 변형이 가능한 모티프를 포함하며, 여기서 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있는, 키메라 단백질.

152. 구현예 151에 있어서, 번역 후 변형 태그는 지질-앵커 도메인을 포함하고, 선택적으로, 지질-앵커 도메인은 GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 및 팔미토일화 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

153. 구현예 105 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체, 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함하는, 키메라 단백질.

154. 구현예 105 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자는 세포의 세포막에 테더링되는, 키메라 단백질.

155. 구현예 154에 있어서, 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포에서 발현될 때, 분비성 효과기 분자가 세포막으로부터 방출되는, 키메라 단백질.

156. 구현예 155에 있어서, 세포막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 대해 내인성인, 키메라 단백질.

157. 구현예 156에 있어서, 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

158. 구현예 156에 있어서, 프로테아제는 ADAM17 프로테아제인, 키메라 단백질.

159. 구현예 155에 있어서, 세포막 상에 발현된 프로테아제는 세포에 대해 이종인, 키메라 단백질.

160. 구현예 159에 있어서, 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)인, 키메라 단백질.

161. 구현예 160에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 키메라 단백질.

162. 구현예 161에 있어서, NS3 프로테아제 절단 부위가 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는, 키메라 단백질.

163. 구현예 155 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는, 키메라 단백질.

164. 구현예 163에 있어서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아수나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실라프레비르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 단백질.

165. 구현예 155 내지 164 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 데그론을 추가로 포함하는, 키메라 단백질.

166. 구현예 155 내지 165 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제의 발현 및/또는 국소화는 조절될 수 있는, 키메라 단백질.

167. 구현예 166에 있어서, 발현 및/또는 국소화는 세포의 세포 상태에 의해 조절되는, 키메라 단백질.

168. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나의 조작된 핵산, 또는 구현예 102 내지 104 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 구현예 105 내지 167 중 어느 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.

169. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나의 조작된 핵산, 또는 구현예 102 내지 104 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 구현예 105 내지 167 중 어느 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 단리된 세포.

170. 조작된 핵산을 포함하는 단리된 세포로서, 여기서 조작된 핵산은 프로모터 및 N-말단에서 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는, 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 단리된 세포:

S - C - MT 또는 MT - C - S

(식에서

S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,

C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고,

MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,

171. 구현예 169 또는 구현예 170에 있어서, 조작된 핵산은 재조합적으로 발현되는, 단리된 세포.

172. 구현예 169 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 조작된 핵산은 세포의 게놈으로부터 선택된 유전자좌 또는 벡터로부터 발현되는 것인 단리된 세포.

173. 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 단리된 세포로서, 막 절단 가능 키메라 단백질은, N-말단에서 C-말단으로 배향된, 다음의 식을 갖는, 단리된 세포:

S - C - MT 또는 MT - C - S

(식에서

S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,

C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고,

MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,

식에서, S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨).

174. 구현예 169 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 세포는 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세 (ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포.

175. 구현예 169 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 세포는 자연 살해(NK) 세포인 단리된 세포.

176. 구현예 169 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 세포는 자가유래인, 단리된 세포.

177. 구현예 169 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 세포는 동종이계인, 단리된 세포.

178. 구현예 169 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 세포는 방광 종양 세포, 뇌종양 세포, 유방 종양 세포, 자궁경부 종양 세포, 결장직장 종양 세포, 식도 종양 세포, 신경 교종 세포, 신장 종양 세포, 간종양 세포, 폐종양 세포, 흑색종 세포, 난소종양 세포, 췌장 종양 세포, 전립선 종양 세포, 피부 종양 세포, 갑상선 종양 세포, 및 자궁 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포인, 단리된 세포.

179. 구현예 178에 있어서, 세포는 종양용해성 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 조작되는, 단리된 세포.

180. 구현예 169 내지 179 중 어느 하나에 있어서, 세포는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 추가로 포함하는, 단리된 세포.

181. 구현예 180에 있어서, 프로테아제는 내인성 프로테아제인, 단리된 세포.

182. 구현예 181에 있어서, 내인성 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된, 단리된 세포.

183. 구현예 181에 있어서, 내인성 프로테아제는 ADAM17 프로테아제인, 단리된 세포.

184. 구현예 180에 있어서, 프로테아제는 이종 프로테아제인, 단리된 세포.

185. 구현예 184에 있어서, 이종 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)인, 단리된 세포.

186. 구현예 180 내지 185 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 세포의 세포막 상에서 발현되는, 단리된 세포.

187. 구현예 186에 있어서, 프로테아제는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는, 단리된 세포.

188. 구현예 187에 있어서, 프로테아제 절단 부위의 절단은 분비성 효과기 분자를 세포의 세포막으로부터 방출하는, 단리된 세포.

189. 구현예 169 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는, 단리된 세포.

190. 실시예 189에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하는, 단리된 세포.

191. 실시예 190에 있어서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치하는, 단리된 세포.

192. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는 V, L, S, I, Y, T, 또는 A인, 단리된 세포.

193. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는 V, L, S, I, Y, 또는 T인, 단리된 세포.

194. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

195. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

196. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

197. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

198. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

199. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

200. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

201. 구현예 169 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

202. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

203. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

204. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

205. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

206. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

207. 구현예 169 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 세포.

208. 구현예 169 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 세포는 항원 인식 수용체를 추가로 포함하는, 단리된 세포.

209. 구현예 208에 있어서, 항원 인식 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는, 단리된 세포.

210. 구현예 209에 있어서, 항원-결합 도메인은 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함하는, 단리된 세포.

211. 구현예 209에 있어서, 항원-결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 단리된 세포.

212. 구현예 211에 있어서, scFv는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 단리된 세포.

213. 구현예 212에 있어서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리되는, 단리된 세포.

214. 구현예 213에 있어서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인인, 단리된 세포.

215. 구현예 208 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 항원 인식 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)인, 단리된 세포.

216. 구현예 208 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 항원 인식 수용체는 CAR인, 단리된 세포.

217. 구현예 216에 있어서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하고, 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3제타-쇄 세포내 신호 전달 도메인, CD97 세포내 신호 전달 도메인, CD11a-CD18 세포내 신호 전달 도메인, CD2 세포내 신호 전달 도메인, ICOS 세포내 신호 전달 도메인, CD27 세포내 신호 전달 도메인, CD154 세포내 신호 전달 도메인, CD8 세포내 신호 전달 도메인, OX40 세포내 신호 전달 도메인, 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인, CD28 세포내 신호 전달 도메인, ZAP40 세포내 신호 전달 도메인, CD30 세포내 신호 전달 도메인, GITR 세포내 신호 전달 도메인, HVEM 세포내 신호 전달 도메인, DAP10 세포내 신호 전달 도메인, DAP12 세포내 신호 전달 도메인, 및 MyD88 세포내 신호 전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포.

218. 구현예 216 또는 구현예 217에 있어서, CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인 및 CD3제타-쇄 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, OX40 막관통 도메인, ICOS 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, LAG-3 막관통 도메인, 2B4 막관통 도메인 및 BTLA 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포.

219. 구현예 216 내지 218 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함하는, 단리된 세포.

220. 구현예 169 내지 219 중 어느 하나의 단리된 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.

221. 구현예 169 내지 219 중 어느 하나의 단리된 세포 또는 구현예 220의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.

222. 구현예 221에 있어서, 단리된 세포는 대상체로부터 유래되는 것인 방법.

223. 구현예 221 또는 구현예 222에 있어서, 단리된 세포는 대상체에 대하여 동종이계인, 방법.

224. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나의 조작된 핵산, 또는 구현예 102 내지 104 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 구현예 105 내지 167 중 어느 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 지질 기반 구조.

225. 구현예 224에 있어서, 지질 기반 구조는 세포외 소포, 지질 나노입자 또는 미셀 또는 리포솜을 포함하는 지질 기반 구조.

226. 구현예 224 또는 구현예 225의 지질 기반 구조, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.

227. 구현예 224 또는 구현예 225의 임의의 지질 기반 구조 또는 구현예 226의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.

228. 구현예 227에 있어서, 투여는 전신 투여를 포함하는 방법.

229. 구현예 227 또는 구현예 228에 있어서, 지질 기반 구조는 대상체에서 세포를 조작할 수 있는, 방법.

230. 구현예 227 내지 229 중 어느 하나에 있어서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

231. 구현예 230에 있어서, 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREM1 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.

232. 구현예 227 내지 231 중 어느 하나에 있어서, 방법은 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

233. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나의 조작된 핵산 또는 구현예 105 내지 167 중 어느 하나의 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 나노입자.

234. 구현예 233에 있어서, 나노입자가 무기 물질을 포함하는, 나노입자.

235. 구현예 233 또는 구현예 234의 나노입자를 포함하는 조성물.

236. 구현예 233 또는 구현예 234 중 어느 하나의 나노입자, 또는 구현예 235의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.

237. 구현예 236에 있어서, 투여는 전신 투여를 포함하는, 방법.

238. 구현예 236 또는 구현예 237에 있어서, 나노입자는 대상체에서 세포를 조작할 수 있는, 방법.

239. 구현예 236 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

240. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나의 조작된 핵산 또는 구현예 102 내지 104 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하도록 조작된 바이러스.

241. 구현예 240에 있어서, 바이러스는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 종양용해성 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 및 바이러스-유사 입자(VLP)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 바이러스.

242. 구현예 240 또는 구현예 241의 조작된 바이러스, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.

243. 구현예 240 또는 구현예 241의 조작된 바이러스, 또는 구현예 242의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.

244. 구현예 243에 있어서, 투여는 전신 투여를 포함하는, 방법.

245. 구현예 244에 있어서, 조작된 바이러스는 대상체에서 세포를 감염시키고 발현 카세트를 발현하는, 방법.

246. 구현예 243 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 방법은 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

247. 막-테더링된 효과기 분자의 방출을 유도하는 방법으로서,

a) 세포를 제공하는 단계로서, 세포가 N-말단으로부터 C-말단으로 배향되고, 하기 식을 갖는 막 결합 프로테아제 및 막 절단 가능 키메라 단백질을 포함하는 단계:

S - C - MT 또는 MT - C - S

(식에서

S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,

C는 막 결합 프로테아제의 동족 프로테아제 절단 부위를 포함하고,

MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,

S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨); 및

b) 막 결합 프로테아제 및 막 절단 가능 키메라 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하되,

발현 시, 막 절단 가능 키메라 단백질은 세포의 세포막에 테더링되고,

발현 시, 막 결합 프로테아제는 막 절단 가능 키메라 단백질의 동족 막 결합 프로테아제 절단 부위를 절단하여, 분비성 효과기 분자를 세포막으로부터 방출하는, 방법.

248. 구현예 247에 있어서, 분비성 효과기 분자는 신호 펩티드 또는 신호-앵커 서열을 포함하는, 방법.

249. 구현예 248에 있어서, 신호 펩티드는 분비성 효과기 분자에 대해 고유한, 천연 신호 펩티드를 포함하는, 방법.

250. 구현예 248에 있어서, 신호 펩티드가 비-천연 신호 펩티드를 포함하거나 신호-앵커 서열이 분비성 효과기 분자에 고유하지 않은 비-천연 신호-앵커 서열을 포함하는, 방법.

251. 구현예 250에 있어서, 비-천연 신호 펩티드 또는 비-천연 신호 앵커 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: IL-12, IL-2, 최적화된 IL-2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 쥣과 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL-6, IL-8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12, IL-21, CD8, NKG2D, TNFR2, 및 GMCSF

252. 구현예 247 내지 250 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 치료적 클래스로부터 선택되고, 여기서 치료적 클래스는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동-활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

253. 구현예 252에 있어서, 사이토카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파.

254. 구현예 247 내지 253 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-12, IL-12p70 융합 단백질, 또는 IL-15를 포함하는, 방법.

255. 구현예 254에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15를 포함하는, 방법.

256. 구현예 255에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 .

257. 실시예 255에 있어서, 분비성 효과기 분자는 IL-15 및 IL-15Rα 스시 도메인 또는 IL15/IL-15Rα 스시 도메인 융합 단백질을 포함하는, 방법.

258. 구현예 257에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 .

259. 실시예 254에 있어서, 상기 분비성 효과기 분자는 IL-12 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 방법.

260. 구현예 259에 있어서, 분비성 효과기 분자는 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 .

261. 구현예 252에 있어서, 케모카인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1.

262. 구현예 252에 있어서, 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; SDFl; 및 MMP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

263. 구현예 252에 있어서, 성장 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: FLT3L 및 GM-CSF.

264. 구현예 252에 있어서, 공동 활성화 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: 4-1BBL 및 CD40L.

265. 구현예 252에 있어서, 종양 미세환경 개질 인자는 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

266. 구현예 265에 있어서, TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

267. 구현예 265에 있어서, 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

268. 구현예 265에 있어서, VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.

269. 구현예 243 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 분비성 효과기 분자는 인간 유래 효과기 분자인, 방법.

270. 구현예 243 내지 269 중 어느 하나에 있어서, 동족 프로테아제 절단 부위는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, MMP9 프로테아제, 및 NS3 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 방법.

271. 구현예 243 내지 270 중 어느 하나에 있어서, 동족 프로테아제 절단 부위는 ADAM17 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 방법.

272. 구현예 243 내지 271 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는, 방법.

273. 구현예 272에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하는, 방법.

274. 구현예 273에 있어서, 제1 영역은 제2 영역에 대해 N-말단에 위치하는, 방법.

275. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,

X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,

X₂는, V, L, S, I, Y, T, 또는 A인, 방법.

276. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAVKGG(서열번호 179)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

277. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

278. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

279. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

280. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

281. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

282. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

283. 구현예 243 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PRAEAAKGG(서열번호 186)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

284. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

285. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

286. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

287. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

288. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

289. 구현예 243 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

290. 구현예 243 내지 289 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 막관통-세포내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함하는, 방법.

291. 구현예 290에 있어서, 막관통-세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인은 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-쇄, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래된, 방법.

292. 구현예 243 내지 291 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키기 위해 번역 후 변형이 가능한 모티프를 포함하며, 여기서 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있는, 키메라 단백질.

293. 구현예 292에 있어서, 번역 후 변형 태그는 지질-앵커 도메인을 포함하고, 선택적으로, 지질-앵커 도메인은 GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 및 팔미토일화 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

294. 구현예 243 내지 291 중 어느 하나에 있어서, 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함하는, 방법.

295. 구현예 243 내지 294 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 세포에 내인성인, 방법.

296. 구현예 295에 있어서, 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

297. 실시예 296에 있어서, 프로테아제는 ADAM17 프로테아제인, 방법.

298. 구현예 243 내지 294 298 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 세포에 대해 이종인, 방법.

299. 구현예 298에 있어서, 프로테아제는 C형 간염 바이러스(HCV) 비구조 단백질 3(NS3)인, 방법.

300. 구현예 299에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 NS3 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 방법.

301. 구현예 300에 있어서, NS3 프로테아제 절단 부위가 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, 또는 NS5A/NS5B 접합 절단 부위를 포함하는 방법.

302. 구현예 243 내지 301 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 프로테아제 억제제에 의해 억제될 수 있는, 방법.

303. 구현예 302에 있어서, 프로테아제 억제제는 시메프레비르, 다노프레비르, 아수나프레비르, 실루프레비르, 보세프레비르, 소바프레비르, 파리타프레비르, 텔라프레비르, 그라조프레비르, 글레카프레비르, 및 복실라프레비르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

304. 구현예 243 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 데그론을 추가로 포함하는, 방법.

305. 구현예 243 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제의 발현 및/또는 국소화는 조절될 수 있는, 방법.

306. 구현예 305에 있어서, 발현 및/또는 국소화는 세포의 상태에 의해 조절되는, 방법.

실시예

하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예의 실시예이다. 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 아래에 기술되고 수행된 실험은 페이로드(예를 들어, 효과기 분자)를 분비하도록 세포를 조작하고, 이들 세포를 전달하여 종양에 대한 면역원성 반응을 유도하는 일반적인 유용성을 입증한다.

사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험적 오류 및 편차가 물론 허용되어야 한다.

실시예 1- 막 절단 가능 시스템을 사용한 조절된 사이토카인 분비

막 절단 가능 시스템을 사이토카인의 분비를 조절하는 능력에 대해 평가한다.

방법

IL-15 분비 세포의 조작:

막 절단 가능 IL-15 작제물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터가 생성된다.

렌티바이러스는 다음을 사용하여 생산된다: Lenti-X 293T 패키징 세포주(Clontech, Cat# 632180); 항생제가 없는, LX293T 완전 성장 배지; DMEM, 고-글루코스; 1 mM 피루브산 나트륨; 10 % FBS, 열-불활성화됨; Opti-Mem I 감소된 혈청 배지(Gibco/Thermo Fisher; Cat# 31985); FuGene HD(Promega, Cat#E2311); 외피, 패키징 및 전이 벡터 플라스미드; VSV-G-슈도형 외피 벡터(pMD2.G); 2세대 및 3세대 트랜스퍼 벡터와 함께 사용될 수 있는 Gag, Pol, Rev 및 Tat를 함유하는 패키징 벡터(psMAX2). 90% 컨플루언스의 10 cm 접시로부터의 293T(FT) 세포를 들어내고, 형질주입 전날 오후 늦게 1:3 희석으로 분배하고, 37℃ 5% CO2에서 밤새 세포를 평소처럼 인큐베이션하였다(형질주입 시 다음날 세포는 60~85% 컨플루언스어야 함).

형질주입 반응을 하기 프로토콜에 따라 각각의 10 cm 접시에 준비하였다:

1. 별개의 1.7 mL 튜브에서 각각의 10 cm 접시에 대한 형질주입 반응을 준비한다.

2. RT에서 900 uL Opti-Mem I를 첨가한다.

3. 반응당 9 ug 벡터 골격(관심 유전자를 함유함)을 첨가한다.

4. 반응당 8 ug 패키징 벡터를 첨가한다.

5. 반응당 1 ug 외피 벡터(pMD2.G)를 첨가한다.

6. 3초 동안 빠르게 볼텍싱함으로써 철저히 혼합한다.

7. 반응당 55 uL Fugene HD를 첨가한다.

8. 위아래로 20~30 회 빠르게 피펫팅함으로써 혼합한다.

9. 10분 동안 RT에서 그대로 둔다(DNA 복합체가 형성되는 것을 허용함).

10. 접시를 따라 혼합물을 적가 방식으로 천천히 첨가한 다음, 5~10초 동안 앞-뒤로 및 위-아래로 부드럽게 흔들면서 혼합한다(소용돌이 치게 하지 않는다).

11. 접시를 바이러스 인큐베이터에 놓는다.

바이러스 상청액을 혈청학적 피펫을 사용하여 2일 및 3일차에 수확한다. Millipore steriflip 0.45 um 필터를 사용하여 세포 파편을 제거한다. Lenti-X 농축기(Cat. Nos. 631231 & 631232)를 다음 프로토콜에 따라 사용한다: 1) 1 부피의 Lenti-X 농축액과 3 부피의 정화된 상청액을 조합한다. 부드럽게 반전시켜 혼합한다; 2) 혼합물을 얼음 또는 4℃에서 30분 동안 밤새 인큐베이션한다; (3) 샘플을 4℃에서 45분 동안 1,500 x g로 원심분리한다; (4) 펠릿을 파괴하지 않도록 주의하면서 상청액을 조심스럽게 제거하고 폐기한다; (5) 멸균 PBS + 0.1% BSA를 사용하여 펠릿을 원래 부피의 1/10 내지 1/100로 부드럽게 재현탁시킨다.

일차 T 세포는 하기 프로토콜에 따라 바이러스 상청액을 사용하여 형질도입된다:

1. Gibco(Thermo Fisher) Dynabeads 인간 T-활성 인자 항-CD3/항-CD28 비드를 사용하여 T 세포를 활성화한다.

a) T 세포를 계수한다 - 24 웰 플레이트에서 웰당 1e6 세포

b) OpTmizer 배지로 dynabead를 세척한다

c) 사용 직전에 Dynabeads를 철저히 볼텍싱한다

d) 원하는 부피의 Dynabead를 튜브에 옮긴다

e) 10배 부피의 PBS를 첨가하고, 혼합한다(5초 동안 볼텍스, 또는 적어도 5분 동안 롤러에 유지)

f) 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 흡입하여 상청액을 버린다

g) 비드 세척을 반복한다 - 두 번째 세척의 경우, IL-2가 없는 OpTmizer 배지 사용한다

h) 자석에서 튜브를 제거하고, 6e6 비드/mL에 도달하도록, 세척된 Dynabead를 필요한 부피의 100 U/mL IL-2 포함하는 OpTmizer 배지에 재현탁한다

i) 1 mL가 1e6 T 세포 및 mL당 3e6 Dynabead를 함유하도록 T 세포 현탁액을 비드에 첨가한다

j) 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 혼합물을 주입한다

k) 24-웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣는다.

l) 20시간 후, T 세포는 형질도입될 준비가 된다

2) T 세포 형질도입:

a) 위에서 조심스럽게 피펫팅하여 500 ul의 배지를 제거하고, 침전된 T 세포와 비드가 흐트러지지 않도록 한다

b) 렌티바이러스 혼합물을 각 해당 웰에 적가하여 세포 상에 첨가한다

c) 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 바이러스와 세포를 혼합한다

d) 플레이트를 37^oC 인큐베이터에 넣는다

e) 다음 날 500 ul의 배지를 다시 추가한다

f) 형질도입 3일 후 각 웰에서 CD3 dynabead를 제거한다

i) 위아래로 피페팅하여 세포-dynabead 혼합물을 세게 혼합한다

ii) 세포-dynabead 혼합물을 에펜도르프 튜브(1.5 mL)로 옮긴다

iii) 에펜도르프 튜브를 자석 홀더에 놓는다

iv) 에펜도르프 튜브를 자석 홀더에 보관하고 세포가 함유된 배지를 에펜도르프 튜브로부터 제거하여 또 다른 에펜도르프 튜브로 옮긴다

일차 NK 세포는 하기 프로토콜에 따라 바이러스 상청액을 사용하여 형질도입된다:

1. 비-TC 처리된 12 웰 플레이트의 레트로넥틴 코팅(1일차). 플레이트 1개를 코팅하기 위한 총 부피 13 mL의 경우(8 ug/cm2 플레이트 면적에 상응하는 웰 당 최종 레트로넥틴 농도는 32 ug/mL 부피임):

a. 레트로넥틴을 해동한다

b. 원래 스톡 병에서 0.416 mL를 취한다(1 ug/ul 농도).

c. 15 mL 팔콘 튜브에 첨가하고, DPBS(1X)로 13 mL까지 부피를 채운다

d. 부드럽게 혼합한다. 용액을 세게 혼합하지 않는다. 볼텍싱하지 않는다

e. 각 웰에 1 mL의 레트로넥틴 용액을 옮겨 담는다

f. 4℃에서 밤새 인큐베이션한다.(형질도입 1일 전)

2. 1% BSA 용액으로 플레이트를 차단한다(2일차)

a. 각 웰에서 레트로넥틴 용액을 수집하여 -20°C에서 보관한다

b. RT에서 5~30분 동안 PBS 중 1% 멸균 BSA 용액(1 mL/웰)으로 차단한다

c. BSA 용액을 흡인하고 DPBS로 1회 세척한다

3. NK 형질도입(2일차)

a. 1mL(0.5e6/mL) NK 세포를 첨가하고 12-웰 플레이트 상에서 각각 원하는 양의 바이러스 역가를 첨가한다

b. 플레이트를 1200 g, 20C에서 90분 동안 회전시킨다

c. 사이토카인이 포함된 1 mL MACS NK 배지를 웰에 첨가한다

d. 그런 다음 플레이트를 37℃ 인큐베이터로 옮긴다

표면-결합 IL-15의 측정:

조작된 세포를 형질도입 후 7일차에, 먼저 항-인간 IL-15 일차 항체(LS-C487337)인 다클론 토끼로 실온에서 1.5시간 동안 염색하고, 두번째로 항-토끼 이차 항체(Alexa Fluor 488로 표지됨)로 30분 동안 염색한다. 표면-결합 IL-15는 Beckman Coulter 유세포 분석기 상에서 유세포 분석에 의해 평가된다.

분비된 IL-15의 측정:

조작된 세포(10^6)를 형질도입 후 7일차에 1mL의 신선한 배지에 도말한다. 37도에서 48시간 인큐베이션한 후, 세포 배지에서 분비된 IL-15를 ELISA(인간 IL-15 Quantikine ELISA Kit cat# D1500)로 정량화한다.

단백질 발현 및 절단 효율의 결정

막 절단 가능 시스템은 식 S - C - MT 또는 MT - C - S(N-말단에서 C-말단으로 배향됨)를 갖는 키메라 단백질을 사용하는 것으로 설계되며, 여기서 S는 분비성 페이로드(예를 들어, 효과기 분자)를 지칭하고, C는 프로테아제 절단 부위를 지칭하며, MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다. 도 1a는 프로테아제 절단 부위가 페이로드와 막-테더링 도메인 사이에 삽입되는 키메라 단백질로서 원하는 페이로드가 발현되는, 본원에 기재된 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다. 좌측 패널은 막관통 걸친 구조를 사용하는 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다(예를 들어, 키메라 단백질은 막관통 도메인을 함유한다). 우측 패널은 막-결합 구조를 사용하는 막 절단 가능 시스템의 개략도를 도시한다(예를 들어, 키메라 단백질은 세포 막과의 결합을 허용하는 번역 후 변형 태그를 함유한다). 도 1b는 IL-15의 분비 조절을 위한 대표적인 막 절단 가능 시스템을 도시하며, 여기서 IL-15는 IL-15 페이로드와 막-테더링 도메인 사이에 삽입된 TACE에 의해 절단될 수 있는 절단 부위를 갖는 키메라 단백질로서 발현된다. 좌측 패널은 PDGFR-베타 및 CD8과 같은 I형 막관통 도메인의 사용을 통한 I형 막관통 구조(예를 들어, S - C - MT)를 도시한다. 우측 패널 NKG2D 및 TNFR2와 같은 II형 막관통 도메인의 사용을 통한 II형 막관통 구조(예를 들어, MT - C - S).

추정 ADAM17 모티프에 기초한 다양한 프로테아제 절단 부위 서열을 발현 및 절단 특성에 대해 평가한다. 구체적으로, 절단 부위에 대해 -1 및 +1 위치에서의 치환(후보 #1~5) 또는 서열 전체에 걸친 치환(후보 #6~10)을 갖는 표 A에 제시된 후보 프로테아제 절단 부위 서열을 검사한다. PDGFR-베타 및 CD8 막관통 도메인 서열과 같은 I형 막관통 도메인의 사용을 통해 I형 막관통 구조(예를 들어, S - C - MT)를 비롯하여, NKG2D 및 TNFR2와 같은 II형 막관통 도메인의 사용을 통한 II형 막관통 구조(예를 들어, MT - C - S)를 작제하는 것과 같은 키메라 단백질의 배향을 반전시키는 것을 포함하여, 다양한 막 테더링 도메인 서열도 또한 시스템에서 평가된다.

프로테아제 절단 부위 및 막 테더링 도메인의 다양한 조합을 특징으로 하는 다양한 막 절단 가능 시스템에 대한 분비 특성은 표면-결합 페이로드(예를 들어, 유동 세포 계측에 의한 표면-결합 IL-15) 및 분비된 페이로드(예를 들어, 상청액 ELISA에 의한 분비된 IL-15)의 분석을 통해 평가된다.

평가된 특성은 다음을 포함한다:

- 총 단백질 발현(분비 + 막 결합)

- T 세포, NK 세포, 및 HEK 293 세포와 같은 다양한 관심 세포 유형을 포함하는, 절단 효율(분비된 사이토카인 대 막 결합된 사이토카인의 비율, 즉 막 방출 효율),

최적의 총 단백질 발현 및 원하는 절단 효율을 보여주는 막 절단 가능 시스템이 결정된다.

세포 유형 및 세포 상태 분비 특성의 결정

추정 ADAM17 모티프에 기초한 다양한 프로테아제 절단 부위 서열을, 상이한 세포 유형 및 세포 상태에서 프로테아제 특이성 및 분비 동역학을 포함하는 분비 특성에 대해 평가한다. 구체적으로, 후보 프로테아제 절단 부위 서열은 위에 나타낸 바와 같이 표 A에 제시된 것들을 포함한다. PDGFR-베타 및 CD8 막관통 도메인 서열과 같은 I형 막관통 도메인의 사용을 통해 I형 막관통 구조(예를 들어, S - C - MT)를 비롯하여, NKG2D 및 TNFR2와 같은 II형 막관통 도메인의 사용을 통한 II형 막관통 구조(예를 들어, MT - C - S)를 작제하는 것과 같은 키메라 단백질의 배향을 반전시키는 것을 포함하여, 다양한 막 테더링 도메인 서열도 또한 시스템에서 평가된다.

평가된 특성은 다음을 포함한다:

- NK 세포 및 T 세포와 같은 관심 세포 유형에서 분비 특성(예를 들어, 특이성 및 동역학)

- 다양한 세포 상태, 특히 프로테아제 발현 및/또는 국소화를 조절할 수 있는 세포 상태에서의 분비 특성(예를 들어, 특이성 및 동역학)(예를 들어, +/- PMA 또는 다른 활성화 상태)

원하는 조절된 분비 특성을 나타내는 막 절단 가능 시스템을 결정한다. 구체적으로, 프로테아제 절단 부위 및 막 테더링 도메인 조합은 관심 세포 유형 및 세포 상태에서 원하는 속도로 페이로드의 조절된 분비(막 방출)에 대한 분비 동역학을 나타내는 것으로 결정된다.

실시예 2 - 다양한 링커/절단 부위/막관통 도메인 조합을 갖는 조절된 IL-15 분비

표 A(서열번호 180, 187, 및 191)에 제시된 프로테아제 절단 부위 중 3개, 다양한 폴리펩티드 링커, 다양한 폴리펩티드 링커 배향(즉, 절단 부위에 대해 N-말단 폴리펩티드 링커 및/또는 절단 부위에 대해 C-말단 폴리펩티드 링커) 및 2개의 막관통 도메인(CD8 막관통 도메인 및 B7-1 막관통 도메인)을 포함하는, 막 절단 가능 시스템의 변형을 분비성 페이로드인 IL-15의 분비를 조절하는 능력에 대해 평가하였다. 본 실시예의 막 절단 가능 시스템은 N-말단에서 C-말단 방향으로 S-C-MT의 배향을 포함하며, 여기서 S는 분비성 페이로드를 지칭하고, C는 프로테아제 절단 부위를 지칭하며, MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다.

IL-15 분비 세포의 조작:

다양한 링커, 링커 배향, 및 막관통 도메인을 갖는 막 절단 가능 IL-15 작제물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 생성하였다. 작제물에 대한 설명은 표 B에 제공되어 있다.

표 B에 기술된 작제물을 암호화하는 렌티바이러스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산하였다. 실시예 1에 기술된 형질도입 방법에 의해 렌티바이러스로 일차 NK 세포를 형질도입하였다. IL-15 막 결합 발현 및 분비를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 각각의 작제물에 대한 막 결합 발현 및 분비의 관계에 대한 그래프가 도 2에 제공된다. 작제물 SB03514 및 SB03536은 낮은 발현 수준으로 인해 그래프에 표시되지 않는다. 도 2에 도시된 바와 같이, 각각의 작제물에 대한 분비 수준은 매우 다양하다. SB03516, SB03515, SB03533, SB03518, SB03517, SB03531, SB03532 및 SB03520은 무바이러스 대조군(NV)에 비해 IL-15 분비 수준이 더 높다. 이들 작제물 중, SB03515, SB03517, SB03532, SB03531, 및 SB03518은 가장 높은 분비 수준을 나타냈다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 링커 유형 및 배향은 분비 수준과 상관된다. 예를 들어, 절단 부위에 대해 C-말단의 단일 gly-ser 링커(서열번호 195)를 포함하는 작제물(사각형 형상을 갖는 데이터 포인트 참조), 및 절단 부위에 대해 N-말단에 gly-ser 링커(서열번호 195) 및 절단 부위에 대해 C-말단의 제2 gly-ser 링커(서열번호 197)를 포함하는 작제물(다이아몬드 형상을 갖는 데이터 포인트 참조)은 가장 높은 분비 수준을 가졌다. 또한, 절단 부위에 대해 N-말단의 단일 gly-ser 링커(서열번호 195)의 사용(절단 부위에 대해 C-말단의 제2 gly-ser 링커 없음)은 중간 분비 수준과 상관이 있었다. 따라서, 표 B에 나타낸 바와 같은 링커 및 링커 배향의 변화는 원하는 비율의 결합된 IL-15 대 분비된 IL-15의 세포를 선택할 기회를 제공한다.

실시예 3 - 조절된 IL-12 분비

표 A에 나타낸 프로테아제 절단 부위 중 3개(서열번호 180, 187 및 191)를 포함하는 막 절단 가능 시스템의 변형을 NK 세포 및 T 세포에 의한 분비성 페이로드 IL-12의 분비를 조절하는 능력에 대해 평가하였다. 본 실시예의 막 절단 가능 시스템은 N-말단에서 C-말단 방향으로의 S - C - MT의 배향을 포함하였는데, 여기서 S는 분비성 페이로드를 지칭하고, C는 프로테아제 절단 부위를 지칭하며, MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다.

IL-12 분비 세포의 조작:

막 절단 가능 IL-12 작제물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터가 생성되었다. 작제물에 대한 설명은 표 C에 제공되어 있다.

표 C에 기술된 작제물을 암호화하는 렌티바이러스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산하였다. 작제물 SB04183, SB04183, 및 SB04183은 실시예 1에 기술된 절단 부위를 포함한다. 작제물 SB04184는 CD16에 대해 고유한 ADAM17 절단 부위를 포함한다. 일차 NK 세포를 증식시킨 다음 실시예 1에 기술된 형질도입 방법에 의해 렌티바이러스로 형질도입하였다. IL-12 막 결합 발현 및 분비를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 도 3a를 참조하면, 작제물 SB04812, SB04184, 및 SB04185를 갖는 NK 세포에서 높은 수준의 막 결합 IL-12 발현(세포의 적어도 90%가 양성)이 달성되었다. 또한, 실시예 1에 기술된 형질도입 방법에 의해 렌티바이러스로 일차 T 세포를 형질도입하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 낮은 내지 중등도 막 결합 IL-12 발현(약 20% 내지 약 15% 양성 세포)은 모든 작제물을 갖는 T 세포에서 달성되었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 작제물 SB04182 및 SB04184의 경우 형질도입 후 3일차 및 형질도입 후 4일차에 NK 세포에서 높은 수준의 IL-12 분비(적어도 50,000 pg/ml)를 달성하였다. 작제물 SB04185의 경우, 50,000 pg/ml을 초과하는 분비된 IL-12가 형질도입 후 4일차에 측정되었다. 또한, 작제물 SB04182 및 SB04184를 사용한 T 세포로부터 측정 가능한 양의 IL-12가 분비되었다.

실시예 4 - 조절된 IL-15 분비

서열번호 191의 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 막 절단 가능 시스템의 변형을 분비성 IL-15 페이로드의 분비를 조절하는 능력에 대해 평가하였다. 본 실시예의 막 절단 가능 시스템은 N-말단에서 C-말단 방향으로의 S - C - MT의 배향을 포함하였는데, 여기서 S는 분비성 페이로드를 지칭하고, C는 프로테아제 절단 부위를 지칭하며, MT는 세포막 테더링 도메인을 지칭한다.

이중 발현 작제물을 생성하였는데, 작제물은 막 절단 가능 시스템에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터, 및 키메라 항원 수용체에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하였다. 작제물에 대한 설명은 표 D에 제공되어 있다.

표 D에 기술된 작제물을 암호화하는 렌티바이러스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산하였다. (IL-15/IL-21 발현 피더 세포로 증식된) 일차, 공여자 유래 NK 세포를 각각의 바이러스로 형질도입하였다(또는 대조군으로서 형질도입지 않았다). 다음으로, 형질도입 후 18일차에, CAR의 표적 항원을 발현하는 표적 세포와의 공동 배양에 의해 NK 세포를 활성화시켰다(2개의 상이한 표적 세포주, "표적 세포 1" 및 "표적 세포 2"를 사용하였다). 활성화 24시간 후에, IL-15 막 결합 발현 및 분비를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 막 결합 IL-15 발현은 활성화 후 24시간 시점에 검출 가능하였다. 다음으로, 분비 수준을 활성화 후 24시간, 48시간 및 72시간에 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 24시간 시점 후 IL-15 분비의 증가를 달성하였다. 또한, 3개의 작제물 중, IL-15/IL-15R스시 작제물은 가장 높은 수준의 분비를 달성하였다.

기타 서열

HIV-1 프로테아제(서열번호 144): PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF

안지오텐신 전환 효소(ACE)(서열번호 156):

MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALALDPGLQPGNFSADEAGAQLFAQSYNSSAEQVLFQSVAASWAHDTNITAENARRQEEAALLSQEFAEAWGQKAKELYEPIWQNFTDPQLRRIIGAVRTLGSANLPLAKRQQYNALLSNMSRIYSTAKVCLPNKTATCWSLDPDLTNILASSRSYAMLLFAWEGWHNAAGIPLKPLYEDFTALSNEAYKQDGFTDTGAYWRSWYNSPTFEDDLEHLYQQLEPLYLNLHAFVRRALHRRYGDRYINLRGPIPAHLLGDMWAQSWENIYDMVVPFPDKPNLDVTSTMLQQGWNATHMFRVAEEFFTSLELSPMPPEFWEGSMLEKPADGREVVCHASAWDFYNRKDFRIKQCTRVTMDQLSTVHHEMGHIQYYLQYKDLPVSLRRGANPGFHEAIGDVLALSVSTPEHLHKIGLLDRVTNDTESDINYLLKMALEKIAFLPFGYLVDQWRWGVFSGRTPPSRYNFDWWYLRTKYQGICPPVTRNETHFDAGAKFHVPNVTPYIRYFVSFVLQFQFHEALCKEAGYEGPLHQCDIYRSTKAGAKLRKVLQAGSSRPWQEVLKDMVGLDALDAQPLLKYFQPVTQWLQEQNQQNGEVLGWPEYQWHPPLPDNYPEGIDLVTDEAEASKFVEEYDRTSQVVWNEYAEANWNYNTNITTETSKILLQKNMQIANHTLKYGTQARKFDVNQLQNTTIKRIIKKVQDLERAALPAQELEEYNKILLDMETTYSVATVCHPNGSCLQLEPDLTNVMATSRKYEDLLWAWEGWRDKAGRAILQFYPKYVELINQAARLNGYVDAGDSWRSMYETPSLEQDLERLFQELQPLYLNLHAYVRRALHRHYGAQHINLEGPIPAHLLGNMWAQTWSNIYDLVVPFPSAPSMDTTEAMLKQGWTPRRMFKEADDFFTSLGLLPVPPEFWNKSMLEKPTDGREVVCHASAWDFYNGKDFRIKQCTTVNLEDLVVAHHEMGHIQYFMQYKDLPVALREGANPGFHEAIGDVLALSVSTPKHLHSLNLLSSEGGSDEHDINFLMKMALDKIAFIPFSYLVDQWRWRVFDGSITKENYNQEWWSLRLKYQGLCPPVPRTQGDFDPGAKFHIPSSVPYIRYFVSFIIQFQFHEALCQAAGHTGPLHKCDIYQSKEAGQRLATAMKLGFSRPWPEAMQLITGQPNMSASAMLSYFKPLLDWLRTENELHGEKLGWPQYNWTPNSARSEGPLPDSGRVSFLGLDLDAQQARVGQWLLLFLGIALLVATLGLSQRLFSIRHRSLHRHSHGPQFGSEVELRHS

DENV NS3pro(NS2B/NS3) >sp|P33478|1475-2093(서열번호 157):

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DENV NS3pro(NS2B/NS3) >sp|P14340|1476-2093(서열번호 158):

AGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKQKGILGYSQIGAGVYKEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLISYGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALEPGKNPRAVQTKPGLFKTNAGTIGAVSLDFSPGTSGSPIIDKKGKVVGLYGNGVVTRSGAYVSAIAQTEKSIEDNPEIEDDIFRKRKLTIMDLHPGAGKTKRYLPAIVREAIKRGLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAIRAEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVEMGEAAGIFMTATPPGSRDPFPQSNAPIMDEEREIPERSWSSGHEWVTDFKGKTVWFVPSIKAGNDIAACLRKNGKKVIQLSRKTFDSEYVKTRTNDWDFVVTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMKPVILTDGEERVILAGPMPVTHSSAAQRRGRIGRNPKNENDQYIYMGEPLENDEDCAHWKEAKMLLDNINTPEGIIPSMFEPEREKVDAIDGEYRLRGEARKTFVDLMRRGDLPVWLAYRVAAEGINYADRRWCFDGIKNNQILEENVEVEIWTKEGERKKLKPRWLDAKIYSDPLALKEFKEFAAGRK

DENV NS3pro(NS2B/NS3) >sp|Q99D35|1474-2092(서열번호 159):

SGVLWDVPSPPETQKAELEEGVYRIKQQGIFGKTQVGVGVQKEGVFHTMWHVTRGAVLTHNGKRLEPNWASVKKDLISYGGGWRLSAQWQKGEEVQVIAVEPGKNPKNFQTMPGIFQTTTGEIGAIALDFKPGTSGSPIINREGKVVGLYGNGVVTKNGGYVSGIAQTNAEPDGPTPELEEEMFKKRNLTIMDLHPGSGKTRKYLPAIVREAIKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALKGLPIRYQTTATKSEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGTADAFPQSNAPIQDEERDIPERSWNSGNEWITDFVGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKNGKKVIQLSRKTFDTEYQKTKLNDWDFVVTTDISEMGANFKADRVIDPRRCLKPVILTDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRVGRNPQKENDQYIFMGQPLNKDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLKGESRKTFVELMRRGDLPVWLAHKVASEGIKYTDRKWCFDGERNNQILEENMDVEIWTKEGEKKKLRPRWLDARTYSDPLALKEFKDFAAGRK

DENV NS3pro(NS2B/NS3) >sp|Q5UCB8|1475-2092(서열번호 160):

SGALWDVPSPAATQKAALSEGVYRIMQRGLFGKTQVGVGIHIEGVFHTMWHVTRGSVICHETGRLEPSWADVRNDMISYGGGWRLGDKWDKEEDVQVLAIEPGKNPKHVQTKPGLFKTLTGEIGAVTLDFKPGTSGSPIINRKGKVIGLYGNGVVTKSGDYVSAITQAERIGEPDYEVDEDIFRKKRLTIMDLHPGAGKTKRILPSIVREALKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAVKSEHTGREIVDLMCHATFTTRLLSSTRVPNYNLIVMDEAHFTDPSSVAARGYISTRVEMGEAAAIFMTATPPGTTDPFPQSNSPIEDIEREIPERSWNTGFDWITDYQGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKSGKKVIQLSRKTFDTEYPKTKLTDWDFVVTTDISEMGANFRAGRVIDPRRCLKPVILPDGPERVILAGPIPVTPASAAQRRGRIGRNPAQEDDQYVFSGDPLKNDEDHAHWTEAKMLLDNIYTPEGIIPTLFGPEREKTQAIDGEFRLRGEQRKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASAGISYKDREWCFTGERNNQILEENMEVEIWTREGEKKKLRPKWLDARVYADPMALKDFKEFASGRK

PEST(인간 IκBα의 잔기 277~307의 2개의 카피; 서열번호 161):

LQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDGSLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDD

GRR(인간 p105의 잔기 352~408; 서열번호 162):

EIKDKEEVQRKRQKLMPNFSDSFGGGSGAGAGGGGMFGSGGGGGGTGSTGPGYSFPH

DRR(효모 Cdc34의 잔기 210~295; 서열번호 163):

IDDENGSVILQDDDYDDGNNHIPFEDDDVYNYNDNDDDDERIEFEDDDDDDDDSIDNDSVMDRKQPHKAEDESEDVEDVERVSKKD

SNS(SP2 및 NB의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 SP2-NB-SP2; 예를 들어, 서열번호 164):

PESMREEYRKEGSKRIKCPDCEPFCNKRGSPESMREEYRKE

RPB(효모 RPB의 잔기 1688~1702의 4개의 카피; 서열번호 165):

RSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSGGSRSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSG

SPmix(SP1 및 SP2의 탠덤 반복체(인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 SP2-SP1-SP2-SP1-SP2; 서열번호 166):

PESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKE

NS2(인플루엔자 A 바이러스 NS 단백질의 잔기 79~93의 3개의 카피; 서열번호 167):

LIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGS

ODC(오르니틴 데카르복실라아제의 잔기 106~142; 서열번호 168):

FPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV

마우스 ODC(잔기 422~461; 서열번호 169):

SHGFPPEVEEQAAGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV

SB03513(서열번호 210)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSDEPHYSQRRLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03514(서열번호 211)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSVTPEPIFSLILLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03515(서열번호 212)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSDEPHYSQRRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03516(서열번호 213)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSVTPEPIFSLISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03517(서열번호 214)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGDEPHYSQRRGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03518(서열번호 215)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03519(서열번호 216)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQDEPHYSQRRLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

SB03520(서열번호 217)

AATMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQVTPEPIFSLILLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

5X NFAT minADEp 프로모터(서열번호 218)

GGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTCCTGCAGGagctGGCGCGCCAGACGCTAGCGGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGTTCGTCCTCACTCT

해석

본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각이 인용되는 요지와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에 문서의 전체를 포함할 수 있다.

본원에서 명세서 및 청구 범위에서 사용된 바와 같은 부정 관사 "a" 및 "an"은, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 작용을 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 본 방법의 단계 또는 작용의 순서는 본 방법의 단계 또는 작용이 인용된 순서에 반드시 제한되는 것은 아니다는 것이 이해되어야 한다.

위 명세서에서 뿐만 아니라 청구범위에서, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "수반하는", "갖는", "함유하는", "포괄하는", "보유하는", "이루어지는" 등과 같은 모든 이행 어구는 개방형, 즉 비제한적으로 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 오직 이행 구문 "~로 이루어지는" 및 "본질적으로 이로 이루어지는" 만이 각각 미국 특허청의 특허 심사 절차의 매뉴얼, 2111.03절에 제시된 바와 같이 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 이행 구문이어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> SENTI BIOSCIENCES, INC. <120> PROTEIN PAYLOAD RELEASE <130> STB-024WO <140> PCT/US2021/058134 <141> 2021-11-04 <150> 63/193,004 <151> 2021-05-25 <150> 63/109,812 <151> 2020-11-04 <160> 226 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 agagggtata taatggaagc tcgacttcca g 31 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc 52 <210> 3 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 caccagacag tgacgtcagc tgccagatcc catggccgtc atactgtgac gtctttcaga 60 caccccattg acgtcaatgg gagaa 85 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 90 <210> 5 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 aggatgtcca tattaggaca tctaggatgt ccatattagg acatctagga tgtccatatt 60 aggacatcta ggatgtccat attaggacat ctaggatgtc catattagga catct 115 <210> 6 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 agtatgtcca tattaggaca tctaccatgt ccatattagg acatctacta tgtccatatt 60 aggacatctt gtatgtccat attaggacat ctaaaatgtc catattagga catct 115 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 tgagtcagtg actcagtgag tcagtgactc agtgagtcag tgactcag 48 <210> 8 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 agatcaaagg gtttaagatc aaagggctta agatcaaagg gtataagatc aaagggccta 60 agatcaaagg gactaagatc aaagggttta agatcaaagg gcttaagatc aaagggccta 120 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gtctagacgt ctagacgtct agacgtctag ac 32 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 cagacacaga cacagacaca gaca 24 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ggatccggta ctcgagatct gcgatctaag taagcttggc attccggtac tgttggtaaa 60 gccac 65 <210> 12 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctc 588 <210> 13 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgccgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcgaccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 gtcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc cgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggtcctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179 <210> 14 <211> 544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60 agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120 actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180 atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240 agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300 gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360 cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420 cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480 tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540 ctac 544 <210> 15 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60 aggatcaagg 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ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg 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ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320 cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380 tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440 gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500 cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560 gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620 gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680 tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattc 1718 <210> 22 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212 <210> 23 <211> 2379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ccactagttc catgtcctta tatggactca tctttgccta ttgcgacaca cactcaatga 60 acacctacta cgcgctgcaa agagccccgc aggcctgagg tgcccccacc tcaccactct 120 tcctattttt gtgtaaaaat ccagcttctt gtcaccacct ccaaggaggg ggaggaggag 180 gaaggcaggt tcctctaggc tgagccgaat gcccctctgt ggtcccacgc cactgatcgc 240 tgcatgccca ccacctgggt acacacagtc tgtgattccc ggagcagaac ggaccctgcc 300 cacccggtct tgtgtgctac tcagtggaca gacccaaggc aagaaagggt gacaaggaca 360 gggtcttccc aggctggctt tgagttccta gcaccgcccc gcccccaatc ctctgtggca 420 catggagtct tggtccccag agtcccccag cggcctccag atggtctggg agggcagttc 480 agctgtggct gcgcatagca gacatacaac ggacggtggg cccagaccca ggctgtgtag 540 acccagcccc cccgccccgc agtgcctagg tcacccacta acgccccagg cctggtcttg 600 gctgggcgtg actgttaccc tcaaaagcag gcagctccag ggtaaaaggt gccctgccct 660 gtagagccca ccttccttcc cagggctgcg gctgggtagg tttgtagcct tcatcacggg 720 ccacctccag ccactggacc gctggcccct gccctgtcct ggggagtgtg gtcctgcgac 780 ttctaagtgg ccgcaagcca 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polynucleotide <400> 24 gttgatttcc ttcatccctg gcacacgtcc aggcagtgtc gaatccatct ctgctacagg 60 ggaaaacaaa taacatttga gtccagtgga gaccgggagc agaagtaaag ggaagtgata 120 acccccagag cccggaagcc tctggaggct gagacctcgc cccccttgcg tgatagggcc 180 tacggagcca catgaccaag gcactgtcgc ctccgcacgt gtgagagtgc agggccccaa 240 gatggctgcc aggcctcgag gcctgactct tctatgtcac ttccgtaccg gcgagaaagg 300 cgggccctcc agccaatgag gctgcggggc gggccttcac cttgataggc actcgagtta 360 tccaatggtg cctgcgggcc ggagcgacta ggaactaacg tcatgccgag ttgctgagcg 420 ccggcaggcg gggccggggc ggccaaacca atgcgatggc cggggcggag tcgggcgctc 480 tataagttgt cgataggcgg gcactccgcc ctagtttcta aggaccatg 529 <210> 25 <211> 794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 agttccccaa ctttcccgcc tctcagcctt tgaaagaaag aaaggggagg gggcaggccg 60 cgtgcagtcg cgagcggtgc tgggctccgg ctccaattcc ccatctcagt cgctcccaaa 120 gtccttctgt ttcatccaag cgtgtaaggg tccccgtcct tgactcccta gtgtcctgct 180 gcccacagtc 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gcggtcccac gcgtgagggg 360 cccgcggagc catttgattg gagaaaagct gcaaaccctg accaatcgga aggagccacg 420 cttcgggcat cggtcaccgc acctggacag ctccgattgg tggacttccg ccccccctca 480 cgaatcctca ttgggtgccg tgggtgcgtg gtgcggcgcg attggtgggt tcatgtttcc 540 cgtcccccgc ccgcgagaag tgggggtgaa aagcggcccg acctgcttgg ggtgtagtgg 600 gcggaccgcg cggctggagg tgtgaggatc cgaacccagg ggtggggggt ggaggcggct 660 cctgcgatcg aaggggactt gagactcacc ggccgcacgt c 701 <210> 28 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 gggccgccca ctcccccttc ctctcagggt ccctgtcccc tccagtgaat cccagaagac 60 tctggagagt tctgagcagg gggcggcact ctggcctctg attggtccaa ggaaggctgg 120 ggggcaggac gggaggcgaa aaccctggaa tattcccgac ctggcagcct catcgagctc 180 ggtgattggc tcagaaggga aaaggcgggt ctccgtgacg acttataaaa gcccaggggc 240 aagcggtccg gataacggct agcctgagga gctgctgcga cagtccacta cctttttcga 300 gagtgactcc cgttgtccca aggcttccca gagcgaacct gtgcggctgc aggcaccggc 360 gcgtcgagtt tccggcgtcc ggaaggaccg agctcttctc gcggatccag tgttccgttt 420 ccagccccca atctcagagc ggagccgaca gagagcaggg aaccc 465 <210> 29 <211> 538 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 gccccacccc cgtccgcgtt acaaccggga ggcccgctgg gtcctgcacc gtcaccctcc 60 tccctgtgac cgcccacctg atacccaaac aactttctcg cccctccagt ccccagctcg 120 ccgagcgctt gcggggagcc acccagcctc agtttcccca gccccgggcg gggcgagggg 180 cgatgacgtc atgccggcgc gcggcattgt ggggcggggc gaggcggggc gccgggggga 240 gcaacactga gacgccattt tcggcggcgg gagcggcgca ggcggccgag cgggactggc 300 tgggtcggct gggctgctgg tgcgaggagc cgcggggctg tgctcggcgg ccaaggggac 360 agcgcgtggg tggccgagga tgctgcgggg cggtagctcc ggcgcccctc gctggtgact 420 gctgcgccgt gcctcacaca gccgaggcgg gctcggcgca cagtcgctgc tccgcgctcg 480 cgcccggcgg cgctccaggt gctgacagcg cgagagagcg cggcctcagg agcaacac 538 <210> 30 <211> 1091 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 ttccagagct ttcgaggaag gtttcttcaa ctcaaattca tccgcctgat aattttctta 60 tattttccta aagaaggaag agaagcgcat agaggagaag ggaaataatt ttttaggagc 120 ctttcttacg gctatgagga atttggggct cagttgaaaa gcctaaactg cctctcggga 180 ggttgggcgc ggcgaactac tttcagcggc gcacggagac ggcgtctacg tgaggggtga 240 taagtgacgc aacactcgtt gcataaattt gcgctccgcc agcccggagc atttaggggc 300 ggttggcttt gttgggtgag cttgtttgtg tccctgtggg tggacgtggt tggtgattgg 360 caggatcctg gtatccgcta acaggtactg gcccacagcc gtaaagacct gcgggggcgt 420 gagagggggg aatgggtgag gtcaagctgg aggcttcttg gggttgggtg ggccgctgag 480 gggaggggag ggcgaggtga cgcgacaccc ggcctttctg ggagagtggg ccttgttgac 540 ctaagggggg cgagggcagt tggcacgcgc acgcgccgac agaaactaac agacattaac 600 caacagcgat tccgtcgcgt ttacttggga ggaaggcgga aaagaggtag tttgtgtggc 660 ttctggaaac cctaaatttg gaatcccagt atgagaatgg tgtcccttct tgtgtttcaa 720 tgggattttt acttcgcgag tcttgtgggt ttggttttgt tttcagtttg cctaacaccg 780 tgcttaggtt tgaggcagat tggagttcgg tcgggggagt ttgaatatcc ggaacagtta 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Homo sapiens <400> 35 atgaatctct tgctcatact tacgtttgtc gctgctgccg ttgcg 45 <210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> Gaussia princeps <400> 36 atgggcgtga aggtcttgtt tgcccttatc tgcatagctg ttgcggaggc g 51 <210> 37 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atgccgatgg ggagccttca acctttggca acgctttatc ttctggggat gttggttgct 60 agttgccttg gg 72 <210> 38 <211> 63 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 38 atggaaactg acacgttgtt gctgtgggta ttgctcttgt gggtcccagg atctacgggc 60 gac 63 <210> 39 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atggatatga gggttcccgc ccagcttttg gggctgcttt tgttgtggct tcgaggggct 60 cggtgt 66 <210> 40 <211> 48 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: VSV-G sequence <400> 40 atgaagtgtc tgttgtacct ggcgtttctg ttcattggtg taaactgt 48 <210> 41 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atgaatatca aaggaagtcc gtggaagggt agtctcctgc tgctcctcgt atctaacctt 60 ctcctttgtc aatccgtggc accc 84 <210> 42 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atgaaatggg taacattcat atcacttctc 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atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgccattt gggaactgaa gaaggacgtc tacgtggtcg agctggattg gtacccggac 120 gcccctggag aaatggtcgt gctgacttgc gatacgccag aagaggacgg cataacctgg 180 accctggatc agagctccga ggtgctcgga agcggaaaga ccctgaccat tcaagtcaag 240 gagttcggcg acgcgggcca gtacacttgc cacaagggtg gcgaagtgct gtcccactcc 300 ctgctgctgc tgcacaagaa agaggatgga atctggtcca ctgacatcct caaggaccaa 360 aaagaaccga agaacaagac cttcctccgc tgcgaagcca agaactacag cggtcggttc 420 acctgttggt ggctgacgac aatctccacc gacctgactt tctccgtgaa gtcgtcacgg 480 ggatcaagcg atcctcaggg cgtgacctgt ggagccgcca ctctgtccgc cgagagagtc 540 aggggagaca acaaggaata tgagtactcc gtggaatgcc aggaggacag cgcctgccct 600 gccgcggaag agtccctgcc tatcgaggtc atggtcgatg ccgtgcataa gctgaaatac 660 gagaactaca cttcctcctt ctttatccgc gacatcatca agcctgaccc ccccaagaac 720 ttgcagctga agccactcaa gaactcccgc caagtggaag tgtcttggga atatccagac 780 acttggagca ccccgcactc atacttctcg ctcactttct gtgtgcaagt gcagggaaag 840 tccaaacggg agaagaaaga 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polynucleotide <400> 59 atggaacgca ttgtgatctg cctgatggtc atcttcctgg gcaccttagt gcacaagtcg 60 agcagccagg gacaggacag gcacatgatt agaatgcgcc agctcatcga tatcgtggac 120 cagttgaaga actacgtgaa cgacctggtg cccgagttcc tgccggcccc cgaagatgtg 180 gaaaccaatt gcgaatggtc ggcattttcc tgctttcaaa aggcacagct caagtccgct 240 aacaccggga acaacgaacg gatcatcaac gtgtccatca aaaagctgaa gcggaagcct 300 ccctccacca acgccggacg gaggcagaag cataggctga cttgcccgtc atgcgactcc 360 tacgagaaga agccgccgaa ggagttcctg gagcggttca agtcgctcct gcaaaagatg 420 attcatcagc acctgtcctc ccggactcat gggtctgagg attca 465 <210> 60 <211> 2163 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60 gtcgccattt gggaactgaa gaaggacgtc tacgtggtcg agctggattg gtacccggac 120 gcccctggag aaatggtcgt gctgacttgc gatacgccag aagaggacgg cataacctgg 180 accctggatc agagctccga ggtgctcgga agcggaaaga ccctgaccat tcaagtcaag 240 gagttcggcg 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gagggctgtg tcgaacatgt tgcagaaggc ccgccagacc 1140 cttgagttct acccctgcac ctcggaagaa attgatcacg aggacatcac caaggacaag 1200 acctcgaccg tggaagcctg cctgccgctg gaactgacca agaacgaatc gtgtctgaac 1260 tcccgcgaga caagctttat cactaacggc agctgcctgg cgtcgagaaa gacctcattc 1320 atgatggcgc tctgtctttc ctcgatctac gaagatctga agatgtatca ggtcgagttc 1380 aagaccatga acgccaagct gctcatggac ccgaagcggc agatcttcct ggaccagaat 1440 atgctcgccg tgattgatga actgatgcag gccctgaatt tcaactccga gactgtgcct 1500 caaaagtcca gcctggaaga accggacttc tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg 1560 ttgcacgctt tccgcattcg agccgtgacc attgaccgcg tgatgtccta cctgaacgcc 1620 agtagacgga aacgcggaag cggagagggc agaggctcgc tgcttacatg cggggacgtg 1680 gaagagaacc ccggtccgat ggaacgcatt gtgatctgcc tgatggtcat cttcctgggc 1740 accttagtgc acaagtcgag cagccaggga caggacaggc acatgattag aatgcgccag 1800 ctcatcgata tcgtggacca gttgaagaac tacgtgaacg acctggtgcc cgagttcctg 1860 ccggcccccg aagatgtgga aaccaattgc gaatggtcgg cattttcctg ctttcaaaag 1920 gcacagctca agtccgctaa caccgggaac aacgaacgga tcatcaacgt gtccatcaaa 1980 aagctgaagc ggaagcctcc ctccaccaac gccggacgga ggcagaagca taggctgact 2040 tgcccgtcat gcgactccta cgagaagaag ccgccgaagg agttcctgga gcggttcaag 2100 tcgctcctgc aaaagatgat tcatcagcac ctgtcctccc ggactcatgg gtctgaggat 2160 tca 2163 <210> 61 <211> 2103 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 atgtgccatc agcagcttgt catatcttgg ttttcacttg tattcctggc cagccctttg 60 gttgcgatct gggagctcaa gaaggatgtg tacgttgtag agctggactg gtaccccgat 120 gctcccggtg agatggtcgt tttgacatgt gacactccag aagaggacgg tattacgtgg 180 actctggacc agtcctccga agttcttggt tctggtaaga ctctgactat ccaggtgaaa 240 gaatttgggg atgcgggaca atacacatgc cacaagggag gcgaggtgtt gtctcatagt 300 ttgctgcttc tccacaagaa agaggatgga atctggagca ccgacatact caaggatcaa 360 aaggaaccca aaaataagac atttctgcga tgtgaggcta agaactatag tggccgcttc 420 acttgttggt ggctgactac catcagcaca gatctcacgt tttcagtaaa aagtagtaga 480 ggttcaagtg atcctcaagg ggtaacgtgc ggtgctgcaa cactgtctgc tgaacgcgta 540 agaggagata ataaggagta cgagtattcc gtagaatgcc aagaggacag tgcttgtcct 600 gcggccgagg agtctctccc aatagaagtg atggtggacg cggtgcataa actgaaatat 660 gagaactaca caagcagttt ttttataaga gatatcatca agcccgatcc gccgaagaat 720 ttgcaactta aaccgcttaa aaactcacgc caggttgaag tatcctggga gtatccggat 780 acatggtcaa caccacacag ctatttttcc cttaccttct gtgtgcaggt ccaagggaag 840 agcaaaaggg agaagaagga cagggtattc actgataaaa cttccgcgac ggtcatctgc 900 cgaaaaaacg ctagtatatc tgtacgggcg caggataggt actatagttc ttcttggtct 960 gagtgggcct cagttccgtg ctctggggga ggaagtggag gagggtccgg cggtggaagc 1020 gggggaggga gtcgcaactt gccagtggct acaccagatc caggcatgtt tccatgtctg 1080 catcattccc agaatctcct gagagcggtg tcaaatatgc tccaaaaagc gagacaaaca 1140 ctggaatttt acccgtgtac cagtgaggag attgatcacg aggacataac caaggacaag 1200 acctcaactg tagaagcgtg tttgccgctg gagttgacta agaatgagtc ctgcctcaat 1260 tccagagaaa cttcattcat tactaacggc agttgtcttg catcccggaa aacgtccttt 1320 atgatggccc tttgccttag ttcaatttac gaggatctta aaatgtatca agtggagttt 1380 aaaaccatga atgctaaact tcttatggac cccaaacgac 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tccatatagt gcaaatgttc ataaacactt ccagaagaaa gcgaggctct 420 ggggaggggc gaggctctct gctgacctgt ggggatgtag aagagaatcc aggtcccatg 480 gaccggctga ccagctcatt cctgcttctg attgtgccag cctacgtgct ctccatcaca 540 tgtcctcccc caatgagcgt cgagcatgct gacatctggg tgaagtcata ctccttgtac 600 agcagagaga gatacatttg taattccgga ttcaagcgca aggccggcac ctcctctctg 660 acagagtgcg tccttaacaa agcaaccaac gtagcacatt ggaccacacc atccttgaag 720 tgcatacgag aacctaaatc ttgcgataag actcatactt gtccaccttg tccagcccca 780 gaactgcttg gcggaccctc agtatttttg ttcccaccaa agccaaaaga cacactcatg 840 atatccagaa ctcctgaggt gacctgtgtc gttgtagacg tttcccacga agatcctgaa 900 gtaaaattca actggtacgt ggatggggtc gaagtccata acgccaagac taaaccaagg 960 gaggaacagt ataactctac ttaccgagta gtttctgtgt tgaccgtgct gcaccaggac 1020 tggttgaacg ggaaggagta caaatgcaag gtgagcaata aagctctgcc cgcaccaatc 1080 gaaaagacaa tatctaaggc caaggggcag ccacgagagc cccaggtata cacactgcca 1140 ccctcacgcg atgaattgac taagaaccag gtttccctga cctgtcttgt aaaaggtttc 1200 tacccttccg acatagctgt 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gtccactggt 60 gacactgtac ttacacaatc acccgctttg gccgtttctc ctggtgaacg ggtcacaatt 120 agttgccgag cttccgattc tgtatctact cttatgcatt ggtatcaaca aaaacctggt 180 cagcagccaa aattgctcat ttatcttgct agtcacttgg agtccggcgt acctgctcga 240 ttcagcggta gtgggtctgg cacagatttc actttgacca tagatcccgt ggaggccgat 300 gacactgcaa cctactattg ccagcaatcc tggaacgacc cttggacttt cggcggcggc 360 accaagctgg aactcaagcg agcagatgct gccccaaccg ttagtatatt cccaccctca 420 accgaacaac tcgccacagg aggcgctagt gtcgtgtgtc ttatgaacaa tttctatcca 480 cgagacatta gcgtcaagtg gaaaattgat gggacagaaa ggcgagatgg agttttggat 540 tcagtaacag accaggattc aaaggattct acctatagca tgagctccac cttgagcctg 600 accaaagctg attatgaatc tcataacctg tatacttgtg aagtggtgca taagacttct 660 agctcaccag tggttaaatc ttttaaccgc aacgaatgtc ggcgcaagag gggttccgga 720 gagggaaggg gtagtctgct cacctgcggc gatgttgaag aaaatcctgg tcccatggac 780 attcggctct ctttggtatt cctggtactt tttataaagg gggtgcaatg tgaagtccag 840 ctcgtggaaa gcggtggggg cctggttcag cccggtcgca gccttaaact tagttgcgca 900 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atggcctggt cccctctttt tctgaccctc atcacacact gtgcaggctc atgggctgag 60 accgtcttga cccagtcccc aggaactttg tctctgtctc ctggtgaaag agctaccctt 120 agttgtcgag cctctcagtc ccttggttct agctatctcg cttggtacca gcaaaagcca 180 ggccaggccc cacgactgct gatctacgga gcatcttcac gggctcccgg cattcccgat 240 cgattttccg gatctggtag tggtacagat ttcacactga ccatatctcg cctggagccc 300 gaggactttg ctgtttatta ttgtcagcag tacgccgatt ctcctatcac ttttggacag 360 ggaacccgcc tggagattaa gcgcacagta gcagctccat ccgtctttat ctttccacca 420 tcagatgaac agctcaagag tgggaccgca agtgtagtat gcctgctgaa caatttttac 480 cctagagagg ccaaagtgca gtggaaggtg gataacgccc tccagagtgg caatagtcaa 540 gaaagtgtta ctgagcaaga tagtaaggac tctacatact ctttgagttc tactttgacc 600 ctgtcaaaag cagattatga aaaacataag gtgtatgcat gtgaagttac acaccaaggg 660 ttgtcctctc cagttacaaa atcttttaat agaggagagt gccgccgcaa acgcggtagt 720 ggagaaggtc gaggctcact cttgacctgt ggcgacgtgg aagaaaatcc cggtcctatg 780 gattggactt ggagggtatt ttgtcttttg gcagtaacac ctggagctca cccccaagta 840 cagctcgtcc aatctggtgc cgaggttaaa aagcctggaa gttcagtgaa ggtctcttgc 900 aaggcatctg gatacacctt ttcatctaac gtcatatcct gggtacggca agccccagga 960 cagggacttg agtggatggg aggggtcatc cccatcgtgg acattgctaa ttacgctcag 1020 cgattcaaag ggcgggttac tataactgcc gacgagtcta cctcaactac ctacatggag 1080 ttgtcctctc tccgctccga ggacactgct gtatattact gtgccagcac tctcgggttg 1140 gtgttggatg ccatggacta ttggggacaa ggaaccctgg tgacagttag ctccgcaagc 1200 actaaaggcc cttctgtttt tcccttggca ccttgtagta ggtctacctc tgagtctaca 1260 gcagcacttg gatgcttggt taaggactat tttcccgagc cagttacagt ctcttggaac 1320 agtggtgccc tcacaagtgg ggttcatacc ttccccgcag tcctccagag tagtggcctt 1380 tacagcctct catcagttgt gactgttcct agttcatcac tcggtactaa gacatataca 1440 tgtaacgtag accacaagcc aagcaacaca aaagtagaca aacgagtcga atctaagtat 1500 ggaccccctt gtccctcctg tcctgctccc gagttccttg ggggcccttc cgtgttcttg 1560 tttcctccca agcccaagga taccctcatg atctcacgaa ccccagaggt aacatgtgtg 1620 gttgttgacg taagtcagga agatcccgaa gtgcaattta attggtacgt ggatggcgtc 1680 gaagtccata acgctaaaac 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tgccttcttc tttatcggat tcttcggggg tatctttttt 360 atcacagtta ttagcattga ccgatacctt gccatagtgc tcgcagccaa ctcaatgaac 420 aaccgcaccg tgcagcatgg agtgactatt tccttgggtg tgtgggccgc tgctatactt 480 gtcgccagcc ctcaattcat gtttaccaaa aggaaagaca atgagtgcct cggagattac 540 cctgaggtgt tgcaagaaat gtggcctgta cttcgaaata gcgaagtgaa tatactcggc 600 tttgctcttc ctctgctcat catgtcattc tgttattttc gaataatcca aacattgttc 660 agctgtaaga accgaaagaa agcccgcgcc gtacgcctga ttctgctcgt tgtgttcgcc 720 ttttttctgt tttggactcc ttacaacata atgatattcc tggagactct caaattctat 780 aacttttttc cctcctgtga tatgaaaagg gaccttagat tggctctcag tgtcactgaa 840 acagtagcct ttagccattg ttgtctcaac cctttcatat atgcatttgc aggggaaaag 900 ttccggcggt atctcggaca tttgtatcgg aagtgcttgg ccgtgttgtg tggtcatcct 960 gtccataccg gattctctcc tgagagtcaa cggagccgcc aagattcaat cctgtccagt 1020 ttcactcact atacttcaga gggggatggc agccttctgc tc 1062 <210> 100 <211> 1458 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Kyneurinase #1 sequence <400> 100 atggagaccg 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ttccatccat agatcttagc 180 ctcgtgtccg aggatgacga tgccatatat tttcttggga acagtcttgg gttgcagcca 240 aaaatggtac ggacatatct cgaagaggag ctggacaaat gggctaaaat gggtgcttac 300 ggccacgacg tgggaaaacg cccctggata gttggcgacg aatctatcgt gagtcttatg 360 aaagatatag ttggagcaca tgagaaagaa attgcactga tgaatgccct tactatcaat 420 ctgcatctcc tcttgctttc attctttaag cccactccta aacgccacaa aatacttttg 480 gaagcaaaag cctttccaag cgaccactac gctattgagt cacaaataca actccatgga 540 cttgatgtgg aaaagtctat gcggatggta aaaccacgcg aaggcgagga gacccttcga 600 atggaggaca tacttgaggt catcgaagaa gaaggagata gtatagcagt tatccttttc 660 agcgggctgc acttctacac aggtcaactc tttaacattc cagctattac taaggcaggc 720 cacgctaaag gatgcttcgt gggctttgac cttgcacacg cagtaggaaa cgtagagctc 780 cgcttgcacg attggggcgt tgatttcgcc tgctggtgtt catataagta tcttaactca 840 ggagctggtg ggttggcagg cgcattcgta cacgagaaac acgctcatac cgtaaagcct 900 gcactggtag ggtggttcgg acacgatctc tctacccgct tcaatatgga taataaactc 960 cagcttatac ctggcgccaa tggattcagg atctcaaatc ctcctatttt gctcgtttgc 1020 agtttgcacg catctcttga ggtgttccag caggctacca tgactgcact ccgccggaag 1080 tcaatccttt tgaccggata cttggagtat atgctgaaac attatcactc aaaagataac 1140 actgagaata agggccccat agtaaacatt atcactccat ctcgggctga agagcgcggc 1200 tgccaactca cattgacttt ttccattccc aagaagtcag tgttcaaaga gttggagaaa 1260 cggggggttg tatgtgataa gcgggagcca gatggaatcc gcgttgcccc agtccccctc 1320 tataattctt ttcacgatgt atacaagttt attagactgc tgacaagtat cttggactca 1380 tctgagcgat cttag 1395 <210> 102 <211> 573 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: VEGF sequence <400> 102 atgaatttct tgctgagctg ggtgcattgg acactcgcat tgttgctgta cttgcaccat 60 gccaagtggt cccaggctgc acccactact gagggcgagc aaaagtctca tgaggtgatt 120 aaatttatgg acgtttacca acgatcatac tgtcggccaa tcgaaaccct cgtagatata 180 ttccaggagt acccagacga gatcgaatac attttcaagc cctcatgtgt cccattgatg 240 cgatgtgctg ggtgctgtaa cgacgaagca cttgaatgtg tccccacctc cgagagtaac 300 atcacaatgc aaataatgag aatcaagccc caccaatccc aacatatcgg tgaaatgtca 360 ttccttcagc attcccgctg cgagtgccgg cctaagaagg accgcaccaa accagagaac 420 cattgtgaac cctgttctga gagacggaag cacttgttcg tacaggaccc tcaaacatgc 480 aagtgcagct gtaagaatac cgactcacgg tgtaaagcta ggcaactgga gcttaatgaa 540 aggacctgcc gatgcgataa acccaggagg taa 573 <210> 103 <211> 426 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: GM-CSF sequence <400> 103 atgtggttgc agaatttgct cttcctgggg attgtggtct acagcctctc cgcacctacc 60 cgctctccta tcacagttac aagaccctgg aaacatgtgg aggccattaa agaagcattg 120 aatttgttgg acgatatgcc cgtcaccctg aatgaagaag tagaagttgt ttctaatgag 180 ttcagcttta aaaaattgac ctgtgtgcag acacggctta aaatttttga acagggactt 240 agaggaaact ttactaagct gaagggggca cttaacatga cagcttctta ttatcagacc 300 tattgtcctc caacacctga aaccgactgt gaaacacagg taaccactta cgccgatttt 360 attgattctt tgaaaacatt cctcaccgat ataccatttg agtgtaagaa gccaggccaa 420 aagtag 426 <210> 104 <211> 822 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anti-PD1 sequence <400> 104 atggaaactg acacacttct tctgtgggtc ttgctcctgt gggtcccagg ctctactggt 60 gacagtcctg ataggccatg gaacccacct acctttagtc cagccttgct cgtcgtaacc 120 gaaggggaca acgctacatt cacctgctct tttagcaata cttctgagag ttttcatgta 180 gtctggcatc gggagagtcc atccggacaa acagatactt tggccgcttt tccagaggat 240 aggtctcaac ctgggcaaga cgcaaggttt cgagtcacac agcttcctaa cgggagagat 300 tttcacatgt ctgtagttcg ggcacgccga aatgattctg gcacatatgt ttgcggtgtg 360 atctcacttg ctccaaagat tcaaataaag gagagccttc gcgccgagtt gcgggtgact 420 gagcgggagc ccaagtcctg cgacaaaacc catacttgtc caccctgtgg cggcgggtca 480 tccggtggcg ggtctggggg gcaaccaaga gagccacagg tatatactct tccccccagc 540 agagaagaaa tgacaaaaaa ccaagtgtcc ctgacatgtc tggttaaagg attttatccc 600 agtgacattg ctgtagaatg ggaatccaat ggtcaacccg agaataacta caaaaccact 660 cctccagtat tggacagtga cggttccttc ttcctctatt ccaaacttac agtggataaa 720 tcccgctggc agcaagggaa tgtattcagc tgtagtgtca tgcacgaagc tcttcataac 780 cattatacac agaaatctct ttccctgagc ccaggtaaat ag 822 <210> 105 <211> 1116 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 105 atggagactg atacactttt 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 161 Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu 1 5 10 15 Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr 35 40 45 Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp 50 55 60 <210> 162 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Glu Ile Lys Asp Lys Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met 1 5 10 15 Pro Asn Phe Ser Asp Ser Phe Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Met Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser 35 40 45 Thr Gly Pro Gly Tyr Ser Phe Pro His 50 55 <210> 163 <211> 86 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Yeast Cdc34 sequence <400> 163 Ile Asp Asp Glu Asn Gly Ser Val Ile Leu Gln Asp Asp Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Asp Gly Asn Asn His Ile Pro Phe Glu Asp Asp Asp Val Tyr Asn Tyr 20 25 30 Asn Asp Asn Asp Asp Asp Asp Glu Arg Ile Glu Phe Glu Asp Asp 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 166 Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gly Ser Ser Leu Leu 1 5 10 15 Thr Glu Val Glu Thr Pro Gly Ser Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Arg Lys Glu Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Gly Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu 50 55 <210> 167 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 167 Leu Ile Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Thr Thr Glu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ile Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Thr Thr Glu Asn Ser 20 25 30 Gly Ser Leu Ile Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Thr Thr Glu Asn 35 40 45 Ser Gly Ser 50 <210> 168 <211> 37 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: ODC sequence <400> 168 Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser 1 5 10 15 Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala Ser 20 25 30 Ala Arg Ile Asn Val 35 <210> 169 <211> 40 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 169 Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Ala Ala Gly Thr Leu 1 5 10 15 Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala 20 25 30 Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val 35 40 <210> 170 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 60 ctgga 65 <210> 171 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 tctagagggt atataatggg ggcca 25 <210> 172 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 ttcgcatatt aaggtgacgc gtgtggcctc gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct 60 taa 63 <210> 173 <211> 659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 173 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420 cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480 tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540 gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600 cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 659 <210> 174 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 174 tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60 gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120 tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180 cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240 ggacagtgaa t 251 <210> 175 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 175 Phe Asn Val Leu Met Val His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Gln Cys Glu Ile Cys Gly Phe Thr Cys Arg Gln Lys Gly Asn Leu 20 25 30 Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His 35 40 45 Leu Cys Asn Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Asp Ala Leu 50 55 60 <210> 176 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 176 Pro Arg Ala Glu 1 <210> 177 <211> 3 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 177 Lys Gly Gly 1 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> A, Y, P, S, or F <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L, S, I, Y, or T <400> 178 Pro Arg Ala Glu Xaa Xaa Lys Gly Gly 1 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 179 Pro Arg Ala Glu Ala Val Lys Gly Gly 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 180 Pro Arg Ala Glu Ala Leu Lys Gly Gly 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 181 Pro Arg Ala Glu Tyr Ser Lys Gly Gly 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 182 Pro Arg Ala Glu Pro Ile Lys Gly Gly 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 183 Pro Arg Ala Glu Ala Tyr Lys Gly Gly 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 184 Pro Arg Ala Glu Ser Ser Lys Gly Gly 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 185 Pro Arg Ala Glu Phe Thr Lys Gly Gly 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 186 Pro Arg Ala Glu Ala Ala Lys Gly Gly 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 187 Asp Glu Pro His Tyr Ser Gln Arg Arg 1 5 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 188 Pro Pro Leu Gly Pro Ile Phe Asn Pro Gly 1 5 10 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 189 Pro Leu Ala Gln Ala Tyr Arg Ser Ser 1 5 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 190 Thr Pro Ile Asp Ser Ser Phe Asn Pro Asp 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 191 Val Thr Pro Glu Pro Ile Phe Ser Leu Ile 1 5 10 <210> 192 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: NKG2D sequence <400> 192 Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe 1 5 10 15 Ile Ile Met Val Ala 20 <210> 193 <211> 63 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: NKG2D sequence <400> 193 cccttcttct tctgttgctt tatcgccgtg gccatgggca tccgcttcat cattatggtg 60 gcc 63 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 195 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln 20 25 <210> 196 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 196 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 197 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 197 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln 1 5 10 15 <210> 198 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <400> 198 Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 1 5 10 <210> 199 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Met Val Leu Gly Thr Ile Asp Leu Cys Ser Cys Phe Ser Ala Gly Leu 1 5 10 15 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys 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Ser 180 185 190 Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp 195 200 205 Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg 210 215 <210> 203 <211> 541 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IL-12 (IL-12p70) sequence <400> 203 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 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65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Glu Pro His Tyr Ser Gln Arg Arg 130 135 140 Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe 145 150 155 160 Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg 165 170 175 Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 180 185 190 <210> 211 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Val Thr Pro Glu Pro Ile Phe Ser Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile 145 150 155 160 Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu 165 170 175 Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 180 185 190 <210> 212 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 212 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Glu Pro His Tyr Ser Gln Arg Arg 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Leu Leu Pro Ser Trp 165 170 175 Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu 180 185 190 Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg 195 200 205 Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 213 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Val Thr Pro Glu Pro Ile Phe Ser Leu 130 135 140 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Leu Leu Pro Ser 165 170 175 Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys 180 185 190 Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu 195 200 205 Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 214 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Asp Glu Pro His Tyr Ser Gln Arg Arg Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Leu Leu Pro Ser Trp 165 170 175 Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu 180 185 190 Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg 195 200 205 Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 215 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 215 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Val Thr Pro Glu Pro Ile Phe Ser Leu Ile Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Leu Leu Pro Ser 165 170 175 Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys 180 185 190 Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu 195 200 205 Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 216 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 216 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Gln Asp Glu Pro His Tyr Ser Gln Arg Arg Leu Leu Pro Ser Trp 165 170 175 Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu 180 185 190 Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg 195 200 205 Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 217 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Gln Val Thr Pro Glu Pro Ile Phe Ser Leu Ile Leu Leu Pro Ser 165 170 175 Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys 180 185 190 Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu 195 200 205 Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 210 215 <210> 218 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 218 gggactttcc actggggact ttccactggg gactttccac tggggacttt ccactgggga 60 ctttccactc ctgcaggagc tggcgcgcca gacgctagcg gggggctata aaagggggtg 120 ggggcgttcg tcctcactct 140 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> A, Y, P, S, or F <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L, S, I, Y, T, or A <400> 219 Pro Arg Ala Glu Xaa Xaa Lys Gly Gly 1 5 <210> 220 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 220 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 221 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 221 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala <210> 222 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 222 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 223 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 223 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 224 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: hairy-related basic helix-loop-helix repressor domain motif <400> 224 Trp Arg Pro Trp 1 <210> 225 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> G or A <400> 225 Gly Xaa Glu Leu Arg 1 5 <210> 226 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: cleavage site sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Abz <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Lys(Dnp) <400> 226 Xaa His Pro Phe His Leu Lys 1 5

Claims

N-말단에서 C-말단으로 배향된, 다음의 식을 갖는 막 절단 가능 키메라 단백질:
S - C - MT 또는 MT - C - S
(식에서
S는 분비성 효과기 분자를 포함하고,
C는 프로테아제 절단 부위를 포함하고,
MT는 세포막 테더링 도메인을 포함하되,
S - C - MT 또는 MT - C - S는 단일 폴리펩티드로서 발현되도록 구성됨).
제1항에 있어서, 상기 분비성 효과기 분자는 신호 펩티드 또는 신호-앵커 서열을 포함하고, 선택적으로, 상기 신호 펩티드는 상기 분비성 효과기 분자에 고유한 천연 신호 펩티드를 포함하거나 상기 신호 펩티드가 비천연 신호 펩티드를 포함하거나 상기 신호-앵커 서열이 상기 분비성 효과기 분자에 고유하지 않은 비천연 신호-앵커 서열을 포함하고, 선택적으로, 상기 비천연 신호 펩티드 또는 비천연 신호-앵커 서열은 IL-12, IL-2, 최적화된 IL-2, 트립시노겐-2, 가우시아 루시퍼라제, CD5, 인간 IgKVII, 쥣과 IgKVII, VSV-G, 프로락틴, 혈청 알부민 전구단백질, 아주로시딘 전구단백질, 오스테오넥틴, CD33, IL-6, IL-8, CCL2, TIMP2, VEGFB, 오스테오프로테게린, 세르핀 E1, GRO알파, CXCL12, IL-21, CD8, NKG2D, TNFR2, 및 GMCSF로 이루어진 군으로부터 선택되는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분비성 효과기 분자는 치료적 클래스로부터 선택되되, 상기 치료적 클래스는 사이토카인, 케모카인, 귀소 분자, 성장 인자, 공동 활성화 분자, 종양 미세환경 개질 인자, 리간드, 항체, 펩티드, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 사이토카인은 IL-1-베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-12p70 융합 단백질, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, I형 인터페론, 인터페론-감마, 및 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 케모카인은 CCL21a, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL10-CXCL11 융합 단백질, CCL19, CXCL9, 및 XCL1로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로 상기 귀소 분자는 항-인테그린 알파4,베타7; 항-MAdCAM; SDF1; 및 MMP-2로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 성장인자는 FLT3L 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 공동 활성화 분자는 4-1BBL 및 CD40L으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 종양 미세환경 개질 인자는 아데노신 탈아미노효소, TGF베타 억제제, 면역 관문 억제제, VEGF 억제제, 및 HPGE2로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 TGF베타 억제제는 항-TGF베타 펩티드, 항-TGF베타 항체, TGFb-TRAP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로, 상기 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-GAL9 항체, 항-A2AR 항체, 항-포스파티딜세린 항체, 항-CD27 항체, 항-TNFa 항체, 항-TREMl 항체, 및 항-TREM2 항체로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 선택적으로 상기 VEGF 억제제는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 펩티드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비성 효과기 분자는 IL-15, IL-12, 또는 IL-12p70 융합 단백질을 포함하는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, MMP9 프로테아제, 및 NS3 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단 가능한, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위는 ADAM17 프로테아제에 의해 절단 가능하고, 선택적으로 상기 프로테아제 절단 부위는 PRAE(서열번호 176)의 아미노산 서열을 갖는 제1 영역 및/또는 KGG(서열번호 177)의 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하고, 선택적으로, 상기 제1 영역은 상기 제2 영역에 대해 N-말단에 위치하는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위는 PRAEX₁X₂KGG(서열번호 178)의 아미노산 서열을 포함하되,
X₁은 A, Y, P, S, 또는 F이고,
X₂는 V, L, S, I, Y, 또는 T인, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하거나;
b. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEALKGG(서열번호 180)의 아미노산 서열을 포함하거나;
c. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEYSKGG(서열번호 181)의 아미노산 서열을 포함하거나;
d. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEPIKGG(서열번호 182)의 아미노산 서열을 포함하거나;
e. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEAYKGG(서열번호 183)의 아미노산 서열을 포함하거나;
f. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAESSKGG(서열번호 184)의 아미노산 서열을 포함하거나;
g. 상기 프로테아제 절단 부위가 PRAEFTKGG(서열번호 185)의 아미노산 서열을 포함하거나;
h. 상기 프로테아제 절단 부위가 DEPHYSQRR(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함하거나;
i. 상기 프로테아제 절단 부위가 PPLGPIFNPG(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하거나;
j. 상기 프로테아제 절단 부위가 PLAQAYRSS(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하거나;
k. 상기 프로테아제 절단 부위가 TPIDSSFNPD(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하거나;
l. 상기 프로테아제 절단 부위가 VTPEPIFSLI(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하거나;
m. 상기 프로테아제 절단 부위가 ITQGLAVSTISSFF(서열번호 198)의 아미노산 서열을 포함하는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포막 테더링 도메인은 막관통 세포내 도메인 또는 막관통 도메인을 포함하되, 선택적으로, 상기 막관통 세포내 도메인 및/또는 막관통 도메인은 PDGFR-베타, CD8, CD28, CD3제타-쇄, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, LNGFR, NKG2D, EpoR, TNFR2, B7-1, 또는 BTLA로부터 유래하고, 선택적으로, 상기 세포막 테더링 도메인은 세포 표면 수용체, 또는 이의 세포막 결합 부분을 포함하는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포막 테더링 도메인은 번역 후 변형 태그, 또는 번역 후 변형 태그를 포함하도록 키메라 단백질을 변형시키는 변역 후 변형을 가능하게 하는 모티프를 포함하되, 상기 번역 후 변형 태그는 세포막과 결합할 수 있고, 선택적으로, 상기 번역 후 변형 태그는 지질-앵커 도메인을 포함하고, 선택적으로, 지질-앵커 도메인은 GPI 지질-앵커, 미리스토일화 태그, 및 팔미토일화 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 세포에서 발현될 때, 상기 분비성 효과기 분자는 세포의 세포막에 테더링되고/되거나;
b. 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포에서 발현될 때, 상기 분비성 효과기 분자는 세포막으로부터 방출되고/되거나;
c. 상기 세포막 상에 발현된 프로테아제는 상기 세포에 내인성이고/이거나;
d. 상기 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 막 절단 가능 키메라 단백질.
프로모터 및 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 막 절단 가능 키메라 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 조작된 핵산으로서, 선택적으로, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 및 합성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 핵산.
제12항의 조작된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 막 절단 가능 키메라 단백질, 제12항의 조작된 핵산, 또는 제13항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
제14항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 세포는 상기 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 더 포함하고/하거나, 선택적으로, 상기 프로테아제는 내인성 프로테아제이고/이거나 선택적으로, 상기 내인성 프로테아제는 1형 막관통 프로테아제, II형 막관통 프로테아제, GPI 고정 프로테아제, ADAM8 프로테아제, ADAM9 프로테아제, ADAM10 프로테아제, ADAM12 프로테아제, ADAM15 프로테아제, ADAM17 프로테아제, ADAM19 프로테아제, ADAM20 프로테아제, ADAM21 프로테아제, ADAM28 프로테아제, ADAM30 프로테아제, ADAM33 프로테아제, BACE1 프로테아제, BACE2 프로테아제, SIP 프로테아제, MT1-MMP 프로테아제, MT3-MMP 프로테아제, MT5-MMP 프로테아제, 퓨린 프로테아제, PCSK7 프로테아제, 마트립타아제 프로테아제, 마트립타아제-2 프로테아제, 및 MMP9 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 세포.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 항원 인식 수용체를 더 포함하되, 선택적으로, 상기 항원 인식 수용체는 CAR인, 단리된 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 막 절단 가능 키메라 단백질, 제12항의 조작된 핵산, 제13항의 발현 벡터, 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 단리된 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 이의 조합을 포함하는, 조성물.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 단리된 세포 또는 제18항의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
막 테더링된 효과기 분자의 방출을 유도하는 방법으로서,
a) 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 세포를 제공하는 단계; 및
b) 상기 막 결합 프로테아제 및 막 절단 가능 키메라 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하되,
발현 시, 상기 막 절단 가능 키메라 단백질은 상기 세포의 세포막에 테더링되고,
발현 시, 상기 막 결합 프로테아제는 상기 막 절단 가능 키메라 단백질의 동족 막 결합 프로테아제 절단 부위를 절단하여, 상기 분비성 효과기 분자를 상기 세포막으로부터 방출하는, 방법.