CN117897163A

CN117897163A - 武装嵌合受体及其使用方法

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Publication number: CN117897163A
Application number: CN202280053644.XA
Authority: CN
Inventors: M·古兹曼·阿亚拉; R·M·戈德莱; M·E·鸿; G·李; T·K-T·卢
Original assignee: Senti Biosciences Inc
Current assignee: Senti Biosciences Inc
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2024-04-16

Abstract

本文描述了经工程化以表达细胞因子、嵌合受体和合成转录因子系统的免疫应答细胞。本文还描述了核酸、细胞和涉及到它们的方法。

Description

武装嵌合受体及其使用方法

相关申请交叉引用

本申请要求2021年6月16日提交的美国临时专利申请第63/211,468号和2022年1月31日提交的美国临时专利申请第63/305,155号的权益，以上申请都据此出于所有目的通过引用以其整体并入。

背景技术

基于细胞的疗法平台为治疗多种疾病提供了有前景的途径。一种此类有前景的平台是癌症治疗中基于CAR-T的疗法。考虑到它们的前景，需要改进基于细胞的疗法。一个活跃的探索领域是基于细胞的工程化疗法以产生和/或分泌可增强基于细胞的疗法的效应分子，诸如细胞因子，这一过程被称为武装。例如，未武装的CAR-T疗法对实体瘤的疗效很差，并且武装可以影响整个癌症免疫循环并增强CAR-T的活性。然而，未受控制或未受调节的武装策略可以对治疗产生负面影响，诸如脱靶效应和受试者的毒性。因此，需要控制和调节基于细胞的疗法的武装(诸如调节有效载荷效应分子的产生和/或分泌)的额外方法。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供了一种基于细胞的疗法平台，其涉及基于细胞的疗法的受调节的武装，诸如有效载荷效应分子的受调节的分泌。在一些实施方案中，本文还提供了一种基于细胞的组合免疫疗法，其涉及癌症(诸如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌)的靶向治疗的受调节的武装。

然而，本文提供的疗法可以限制武装的全身毒性。例如，本文提供的免疫疗法可以是肿瘤特异性的和有效的，同时限制因武装引起的全身毒性和/或其他脱靶效应。这些疗法以受调节的方式递送感兴趣的蛋白质，诸如免疫调节效应分子，包括调节分泌动力学、细胞状态特异性和细胞或组织特异性。递送媒剂的设计被优化以改善基于细胞的疗法(诸如癌症疗法)的总体功能，包括但不限于膜切割位点、启动子、接头、信号肽、递送方法、免疫调节效应分子的组合、调节和顺序的优化。

本公开所涵盖的效应分子的非限制性实例包括细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和溶瘤病毒。例如，可以对细胞进行工程化以便以受调节的方式表达和分泌至少一种、两种、三种或更多种下列效应分子：IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40配体、CD40L、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TGFβ抗体、抗TNFR2、MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、CCL21、CpG寡脱氧核苷酸和抗肿瘤肽(例如，具有抗肿瘤活性的抗微生物肽，参见例如Gaspar,D.等人,Front Microbiol.2013；4:294；Chu,H.等人,PLoS One.2015；10(5):e0126390以及网站：aps.unmc.edu/AP/main.php)。

本文提供了一种免疫应答细胞，其包含：(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子；和(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含第三表达盒和第四表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第四表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第四启动子，其中所述ACP包含有包含DNA结合结构域和转录效应子结构域的合成转录因子，其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第三外源性多核苷酸序列的表达，其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S-C-MT或MT-C-S其中S包含有包含所述第一细胞因子和/或第二细胞因子的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S-C-MT或MT-C-C被配置为表达为单一多肽。

在一些方面，本文提供了经工程化的核酸，其包含：第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL15的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子，其中第一外源性多核苷酸序列编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S–C–MT或MT–C–S，其中S包含有包含IL15的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置为表达为单一多肽。

在另一方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包括：第一表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL12p70融合蛋白的第一外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，以及第二表达盒，所述第二表达盒包含第二启动子，所述第二启动子可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第二外源性多核苷酸序列，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第一外源性多核苷酸序列的表达，其中所述第一外源性多核苷酸序列编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S–C–MT或MT–C–S

其中S包含有包含IL12p70融合蛋白的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置为表达为单一多肽。

在一些方面，所述第一表达盒被配置为相对于所述第二表达盒的转录以相反取向转录。在一些方面，在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向。在一些方面，所述第一表达盒被配置为相对于所述第二表达盒的所述转录以相同的取向转录。在一些方面，在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对尾的方向性定向。

在另一方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包含：(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列和编码第一细胞因子的第二外源性多核苷酸序列；以及(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第三启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第三外源性多核苷酸序列的表达，其中所述第二外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S–C–MT或MT–C–S，其中S包含有包含第一细胞因子和/或第二细胞因子的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置为表达为单一多肽。在一些方面，在第一经工程化的核酸内第二表达盒的转录相对于第三表达盒的逆转录定向在相反的方向上。在一些方面，在第二经工程化的核酸内第二表达盒和第三表达盒以头对头的方向性定向。

在一些方面，第一启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。在一些方面，第一启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

在一些方面，第二启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。在一些方面，第二启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

在一些方面，第三表达盒被配置为在第二经工程化的核酸内以相对于第四表达盒的转录相反的方向被转录。在一些方面，在第二经工程化的核酸内第三表达盒和第四表达盒以头对头的方向性定向。在一些方面，第三表达盒和第四表达盒在第二经工程化的核酸内以尾对尾的方向性定向。

在一些方面，第四启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。在一些方面，第四启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

本文还提供了免疫应答细胞，其包含：第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列和编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子；和第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含第三表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第三启动子，其中ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第三外源性多核苷酸序列的表达，其中ACP包含合成转录因子，其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S-C-MT或MT-C-S，其中S包含有包含第一细胞因子和/或第二细胞因子的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S-C-MT或MT-C-C被配置为表达为单一多肽。

在一些方面，在第一经工程化的核酸内第一表达盒的转录相对于第二表达盒的转录被定向在相反的方向上。在一些方面，在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向。在一些方面，第一表达盒被配置为相对于第二表达盒的转录以相同的方向被转录。在一些方面，在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对尾的方向性定向。

在一些方面，所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由接头多核苷酸序列分开。在一些方面，接头多核苷酸序列与作为单独的多肽的第一细胞因子和CAR的翻译可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码一个或多个2A核糖体跳跃元件。在一些方面，一个或多个2A核糖体跳跃元件各自选自由以下组成的群组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，一个或多个2A核糖体跳跃元件包含E2A/T2A。在一些实施方案中，E2A/T2A包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可切割多肽。在一些方面，可切割多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。

在一些实施方案中，第三启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。在一些方面，第三启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

在一些方面，所述第一细胞因子是IL-15。在一些实施方案中，IL-15包含SEQ IDNO:285的氨基酸序列。

在一些方面，所述第二细胞因子选自由以下组成的群组：IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21。在一些方面，所述第二细胞因子是IL12p70融合蛋白。在一些实施方案中，IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列。

在一些方面，所述第一细胞因子是IL12或IL12p70融合蛋白。在一些方面，所述第二细胞因子选自由以下组成的群组：IL15、IL18和IL21。

在一些方面，蛋白酶切割位点选自由以下组成的群组：1型跨膜蛋白酶切割位点、II型跨膜蛋白酶切割位点、GPI锚定蛋白酶切割位点、ADAM8蛋白酶切割位点、ADAM9蛋白酶切割位点、ADAM10蛋白酶切割位点、ADAM12蛋白酶切割位点、ADAM15蛋白酶切割位点、ADAM17蛋白酶切割位点、ADAM19蛋白酶切割位点、ADAM20蛋白酶切割位点、ADAM21蛋白酶切割位点、ADAM28蛋白酶切割位点、ADAM30蛋白酶切割位点、ADAM33蛋白酶切割位点、BACE1蛋白酶切割位点、BACE2蛋白酶切割位点、SIP蛋白酶切割位点、MT1-MMP蛋白酶切割位点、MT3-MMP蛋白酶切割位点、MT5-MMP蛋白酶切割位点、弗林蛋白酶切割位点、PCSK7蛋白酶切割位点、蛋白裂解酶蛋白酶切割位点、蛋白裂解酶-2蛋白酶切割位点、MMP9蛋白酶切割位点和NS3蛋白酶切割位点。在一些方面，蛋白酶切割位点可由选自由以下组成的群组的蛋白酶切割：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶、MMP9蛋白酶和NS3蛋白酶。

在一些方面，蛋白酶切割位点可由ADAM17蛋白酶切割。在一些方面，蛋白酶切割位点包含具有PRAE(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列的第一区域。在一些方面，蛋白酶切割位点包含具有KGG(SEQ ID NO:177)的氨基酸序列的第二区域。在一些方面，第一区域位于第二区域的N末端。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEX1X2KGG(SEQ ID NO:178)的氨基酸序列，其中X1是A、Y、P、S或F，并且其中X2是V、L、S、I、Y、T或A。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEAVKGG(SEQ ID NO:179)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEALKGG(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEYSKGG(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEPIKGG(SEQ ID NO:182)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEAYKGG(SEQ ID NO:183)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAESSKGG(SEQ ID NO:184)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEFTKGG(SEQ ID NO:185的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PRAEAAKGG(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含DEPHYSQRR(SEQ ID NO:187)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PPLGPIFNPG(SEQ IDNO:188)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含PLAQAYRSS(SEQ ID NO:189)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含TPIDSSFNPD(SEQ ID NO:190)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含VTPEPIFSLI(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含ITQGLAVSTISSFF(SEQ ID NO:198)的氨基酸序列。在一些方面，蛋白酶切割位点包含在肽接头内。在一些方面，蛋白酶切割位点在肽接头的N末端。在一些实施方案中，肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。

在一些方面，细胞膜栓系结构域包含跨膜-胞内结构域或跨膜结构域。在一些方面，跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ链、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1或BTLA。在一些方面，跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自B7-1。在一些实施方案中，跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列。在一些方面，所述细胞膜栓系结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合的部分。

在一些方面，细胞膜栓系结构域包含翻译后修饰标签或能够翻译后修饰来修饰嵌合蛋白以包含翻译后修饰标签的基序，其中翻译后修饰标签能够与细胞膜缔合。在一些方面，翻译后修饰标签包含脂质锚结构域，任选地其中脂质锚结构域选自由以下组成的群组：GPI脂质锚、豆蔻酰化标签和棕榈酰化标签。

在一些方面，当在细胞中表达时，可分泌效应分子(例如，本文所述的任何细胞因子)被栓系在细胞的细胞膜上。在一些方面，当在表达能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶的细胞中表达时，可分泌效应分子从细胞膜释放。在一些方面，所述蛋白酶在所述细胞的所述细胞膜上表达。

在一些方面，细胞膜上表达的蛋白酶对于细胞是内源的。在一些方面，蛋白酶选自由以下组成的群组：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶和MMP9蛋白酶。在一些方面，蛋白酶是ADAM17蛋白酶。

在一些方面，细胞膜上表达的蛋白酶对于细胞是异源的。在一些方面，所述蛋白酶是丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)。在一些方面，所述蛋白酶切割位点包含NS3蛋白酶切割位点。在一些方面，所述NS3蛋白酶切割位点包含NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B接合切割位点。在一些方面，所述蛋白酶可以被蛋白酶抑制剂阻遏。在一些方面，所述蛋白酶抑制剂选自由以下组成的群组：西美瑞韦、达诺瑞韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利瑞韦、替拉瑞韦、格拉瑞韦、格卡瑞韦和伏西瑞韦。在一些方面，蛋白酶的表达和/或定位能够调节。在一些方面，表达和/或定位由细胞的细胞状态调节。

在一些方面，所述第一外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。在一些方面，第一外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。在一些方面，所述第二外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。在一些方面，第二外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。在一些方面，分泌信号肽衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：IL-12、胰蛋白酶原-2、Gaussia荧光素酶、CD5、IgKVII、VSV-G、催乳素、血清白蛋白前原蛋白、天青杀素前原蛋白、骨粘连蛋白(BM40)、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、serpin-E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、GMCSFRa、NKG2D和IgE。在一些方面，分泌信号肽来源于GMCSFRa。在一些方面，分泌信号肽包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。在一些方面，其中分泌信号肽衍生自IgE。在一些实施方案中，分泌信号肽包含SEQ IDNO:218的氨基酸序列。在一些方面，第三外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。在一些方面，分泌信号肽与第二细胞因子可操作地相关联。在一些方面，分泌信号肽对于第二细胞因子是天然的。在一些方面，分泌信号肽对于第二细胞因子是非天然的。

在一些方面，第三外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。在一些方面，第一表达盒进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。在一些方面，分泌信号肽与第一细胞因子可操作地相关联。在一些方面，分泌信号肽对于第一细胞因子是天然的。在一些方面，分泌信号肽对于第一细胞因子是非天然的。

在一些方面，第一外源性多核苷酸序列编码第一膜可切割嵌合蛋白，并且第三外源性多核苷酸序列编码第二膜可切割嵌合蛋白。在一些方面，第二外源性多核苷酸序列编码第一膜可切割嵌合蛋白，并且第三外源性多核苷酸序列编码第二膜可切割嵌合蛋白。

在一些方面，经工程化的核酸是选自由以下组成的群组的单链或双链核酸：DNA、cDNA、RNA、mRNA和裸质粒。

在一些方面，由表达盒编码的外源性多核苷酸序列进一步包含3’非翻译区(UTR)，其包含可操作地连接至外源性多核苷酸序列的mRNA去稳定化元件。在一些方面，mRNA去稳定化元件包括富含AU的元件和/或茎-环去稳定化元件(SLDE)。在一些方面，mRNA去稳定化元件包括富含AU的元件。在一些方面，富含AU的元件包括序列ATTTA(SEQ ID NO:209)的至少两个重叠基序。在一些方面，富含AU的元件包括ATTTATTTATTTATTTA TTTA(SEQ ID NO:210)。在一些方面，mRNA去稳定化元件包括茎-环去稳定化元件(SLDE)。在一些方面，SLDE包括CTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:211)。在一些方面，mRNA去稳定化元件包括至少一种富含AU的元件和至少一种SLDE。在一些方面，AuSLDE序列包含ATTTATTTATTTA TTTATTTAacatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:212)。在一些方面，mRNA去稳定化元件包含2XAuSLDE。在一些方面，2X AuSLDE序列被提供为ATTTATTTATTTATTTATTTAacatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAGtgcggtaagcATTTATTTATTTATTTATTTAacatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:213)。

在一些方面，CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包括：具有KNAMN(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)，具有RIRNKTNNYATYYADSVKA(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)，以及具有GNSFAY(SEQ ID NO:201)的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3),并且其中VL包括：具有KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1),具有WASSRES(SEQ ID NO:203)的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2),以及具有QQYYNYPLT(SEQ ID NO:204)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。

在一些方面，VH区包括与EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA(SEQID NO:205)或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:206)的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述VH区包括与SEQID NO:206的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL区包括与如下氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列：DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:207)或DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:208)。在一些方面，所述VL区包括与SEQ ID NO:2NO:208的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些方面，所述抗原结合域包括单链可变片段(scFv)。在一些方面，所述VH和所述VL由肽接头分开。在一些方面，所述scFv包括结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为所述重链可变结构域，L为所述肽接头，并且VL为所述轻链可变结构域。在一些方面，肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。在一些实施方案中，GS接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:223)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且一个或多个细胞内信号传导结构域中的每一者选自由以下组成的群组：CD3ζ-链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域、MyD88细胞内信号传导结构域、2B4细胞内信号传导结构域、CD16a细胞内信号传导结构域、DNAM-1细胞内信号传导结构域、KIR2DS1细胞内信号传导结构域、KIR3DS1细胞内信号传导结构域、NKp44细胞内信号传导结构域、NKp46细胞内信号传导结构域、FceRlg细胞内信号传导结构域、NKG2D细胞内信号传导结构域和EAT-2细胞内信号传导结构域。在一些方面，一个或多个细胞内信号传导结构域包含OX40细胞内信号传导结构域。在一些方面，OX40细胞内信号结构域包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列。在一些方面，一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD28细胞内信号传导结构域。在一些方面，CD28细胞内信号结构域包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列。在一些方面，一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD3z细胞内信号传导结构域。在一些方面，CD3z细胞内信号结构域包含SEQ IDNO:277或SEQ ID NO:279的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包括跨膜结构域，并且跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域、BTLA跨膜结构域、OX40跨膜结构域、DAP10跨膜结构域、DAP12跨膜结构域、CD16a跨膜结构域、DNAM-1跨膜结构域、KIR2DS1跨膜结构域、KIR3DS1跨膜结构域、NKp44跨膜结构域、NKp46跨膜结构域、FceRlg跨膜结构域和NKG2D跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域是OX40跨膜结构域。在一些方面，OX40跨膜结构域包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列。在一些方面，跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一些方面，CD8跨膜结构域包含SEQ IDNO:236或SEQ ID NO:242的氨基酸序列。

在一些方面，所述CAR包括在抗原结合域与跨膜结构域之间的间隔区。在一些方面，间隔区衍生自选自由以下组成的群组的蛋白：CD8、CD28、IgG4、IgG1、LNGFR、PDGFR-β和MAG。在一些方面，间隔区是CD8铰链。在一些方面，CD8铰链包含SEQ ID NO:226或SEQ IDNO:228的氨基酸序列。

在一些方面，ACP包括DNA结合结构域和转录效应子结构域。在一些方面，转录效应子结构域包含转录激活因子结构域。在一些方面，转录激活因子结构域选自由以下组成的群组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr)R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三联激活因子；和人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)。在一些方面，转录激活因子结构域包含VPR激活结构域。在一些方面，VPR激活域包含SEQ IDNO:325的氨基酸序列。在一些方面，转录效应子结构域包含转录阻遏因子结构域。在一些方面，转录阻遏因子结构域选自由以下组成的群组：Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；截短的Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏因子元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛发相关的基本螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序，所述基序被称为WRPW阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；和HP1α染色体阴影阻遏结构域。

在一些方面，DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域。在一些方面，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的并且由锌指基序的阵列组成。在一些方面，ZF蛋白结构域包含一至十个锌指基序的阵列。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。

在一些方面，ACP还包含阻遏型蛋白酶和阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点。在一些方面，阻遏型蛋白酶是丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)。在一些方面，NS3蛋白酶包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列。在一些方面，阻遏型蛋白酶的同源切割位点包含NS3蛋白酶切割位点。在一些方面，所述NS3蛋白酶切割位点包含NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B接合切割位点。在一些方面，NS3蛋白酶可由蛋白酶抑制剂阻遏。在一些方面，所述蛋白酶抑制剂选自由以下组成的群组：西美瑞韦、达诺瑞韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利瑞韦、替拉瑞韦、格拉瑞韦、格卡瑞韦和伏西瑞韦。在一些方面，蛋白酶抑制剂是格拉瑞韦(GRZ)。在一些方面，ACP进一步包括核定位信号(NLS)。在一些方面，NLS包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列。在一些方面，阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点位于DNA结合结构域和转录效应子结构域之间。

在一些方面，ACP进一步包含雌激素受体变体ERT2的激素结合结构域。

在一些方面，ACP应答启动子是合成启动子。在一些方面，ACP应答启动子包含ACP结合结构域序列和最小启动子序列。在一些方面，ACP结合结构域序列包括一个或多个锌指结合位点。

在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第一经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第二经工程化的核酸包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，第二经工程化的核酸包括与SEQ IDNO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在另一方面，本文提供了一种免疫应答细胞，其包含：(a)包含SEQ ID NO:310的核苷酸序列的第一经工程化的核酸；和(b)包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列的第二经工程化的核酸。

在另一方面，本文提供了一种免疫应答细胞，其包含：(a)包含SEQ ID NO:327的核苷酸序列的第一经工程化的核酸；和(b)包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列的第二经工程化的核酸。在一些方面，细胞选自由以下组成的群组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC衍生细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC衍生细胞。在一些方面，细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些方面，所述细胞是自体的。在一些方面，所述细胞是同种异体的。

在一些方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包含：第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL15的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子，其中第一外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白，从N末端到C末端取向，具有下式：S–C–MT或MT–C–S，其中S包含有包含IL15的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置为表达为单一多肽。

在一些方面，

a.在第一经工程化的核酸内第一表达盒和第二表达盒以头对尾的方向性定向，

b.所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由包含E2A/T2A核糖体跳跃元件的接头多核苷酸序列分开，并且

c.结合至GPC3的CAR包括CD28细胞内信号传导结构域或OX40细胞内信号传导结构域。

在另一方面，本文提供了经工程化的核酸，其包含：第一表达盒，所述第一表达盒包括第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列和编码IL15的第二外源性多核苷酸序列，其中第一外源性多核苷酸序列编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S–C–MT或MT–C–S，其中S包含有包含IL15的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置为表达为单一多肽。在一些方面，a.第一外源性多核苷酸序列和第二外源性多核苷酸序列由包含E2A/T2A核糖体跳跃元件的接头多核苷酸序列分开，b.结合至GPC3的CAR包括CD28细胞内信号传导结构域或OX40细胞内信号传导结构域。

在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在另一方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包含SEQ ID NO:310的核苷酸序列。

在另一方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包含SEQ ID NO:327的核苷酸序列。

在另一方面，本文提供了一种经工程化的核酸，其包含：第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL12p70融合蛋白的第一外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第一外源性多核苷酸序列的表达，其中所述第一外源性多核苷酸序列编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S–C–MT或MT–C–S，其中

S–C–MT–D，其中S包含有包含IL12p70融合蛋白的可分泌效应分子，C包含蛋白酶切割位点，并且MT包含细胞膜栓系结构域，并且其中S–C–MT或MT–C–S被配置成表达为单一多肽。

在一些方面，

a.在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向，并且

b.ACP包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中转录激活因子结构域包含VPR激活结构域。

在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些方面，经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在另一方面，本文提供了包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列的经工程化的核酸。

在另一方面，本文提供了一种表达载体，其包含本文所述的任何一种经工程化的核酸。

在一些方面，本文提供了一种免疫应答细胞，其包含上述方面中任一者的经工程化的核酸或表达载体。

本文还提供了一种药物组合物，其包含本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸和/或本文所述的任何一种表达载体以及药学上可接受的载剂、药学上可接受的赋形剂或其组合。

本文还提供了治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸、本文所述的任何一种表达载体和/或本文所述的药物组合物。

本文还提供了一种在受试者中刺激针对肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸、本文所述的任何一种表达载体和/或本文所述的药物组合物。

本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用组合物，所述组合物包含本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸、本文所述的任何一种表达载体和/或本文所述的药物组合物。

本文还提供了一种在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸、本文所述的任何一种表达载体和/或本文所述的药物组合物。

在一些方面，肿瘤包括表达GPC3的肿瘤。在一些方面，肿瘤选自由以下组成的群组：肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤。

一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的本文所述的免疫应答细胞中的任一者、本文所述的任何一种经工程化的核酸、本文所述的任何一种表达载体和/或本文所述的药物组合物。在一些方面，癌症包括表达GPC3的癌症。在一些方面，所述癌症选自由以下组成的群组：肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤

在一些方面，所述施用包括全身施用。在一些方面，所述施用包括肿瘤内施用。在一些方面，免疫应答细胞来自受试者。在一些方面，免疫应答细胞相对于受试者是同种异体的。

附图说明

图1示出了在头对头的方向性(图1A)、头对尾的方向性(图1B)、尾对尾的方向性(图1C)的细胞因子-CAR双向构建体和示例性的抗GPC3 CAR+IL15双向构建体(图1D)的示意图。

图2提供了通过流式细胞术对用编码CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的细胞和用仅编码CAR的慢病毒转导的细胞评估的CAR表达图(第7天)。

图3提供了通过流式细胞术对用编码CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的细胞和用仅编码CAR的逆转录病毒转导的细胞评估的CAR表达图(第7天)。

图4提供了通过流式细胞术对用编码CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的细胞和用仅编码CAR的慢病毒转导的细胞评估的CAR表达图(第15天)。

图5提供了通过流式细胞术对用编码CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的细胞和用仅编码CAR的逆转录病毒转导的细胞评估的CAR表达图(第15天)。

图6提供了通过免疫测定对用编码CAR+IL15双向构建体的慢病毒(“Lenti”)或编码CAR+IL15双向构建体的γ-逆转录病毒(“SinVec”)转导的NK细胞评估的IL15水平。

图7提供了由用编码仅CAR或CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的NK细胞进行的杀伤，如通过共培养杀伤测定所评估的。

图8提供了由用编码仅CAR或CAR+IL15双向构建体的γ逆转录病毒转导的NK细胞进行的杀伤，如通过共培养杀伤测定所评估的。

图9示出了双向取向的构建体的示意图，所述构建体包括在3’非翻译区中具有mRNA不稳定元件的IL12表达盒。

图10提供了通过免疫测定对用双向构建体转导的NK细胞评估的IL12水平，所述双向构建体包括诱导型IL12表达盒和编码合成转录因子的表达盒。

图11示出了编码可切割释放IL15的双向构建体的示意图。

图12提供了在功能测定中测试的IL15双顺反子构建体和性能的总结。

图13A和图13B提供了如通过流式细胞术评估的用SB06251、SB06257和SB06254转导的NK细胞的GPC3 CAR和IL15的表达图。示出了两个独立的重复(图13A和图13B)。

图14A和图14B提供了分泌的IL15水平，如通过免疫测定针对SB06251、SB06257和SB06254转导的NK细胞所评估的。示出了两个独立的重复(图14A和图14B)。

图15A和图15B提供了与用SB06251、SB06257和SB06254诱导的NK细胞共培养后靶细胞群体的细胞生长。示出了两个独立的重复(图15A和图15B)。

图16提供了当与用SB06251、SB06257SB06254转导的NK细胞共培养时的系列杀伤测定中的靶细胞计数。

图17A和图17B提供了如通过流式细胞术评估的用SB06252、SB06258和SB06255转导的NK细胞的GPC3 CAR和IL15的表达图。示出了两个独立的重复(图17A和图17B)。

图18A和图18B提供了分泌的IL15水平，如通过免疫测定针对用SB06252、SB06258和SB06255转导的NK细胞所评估的。示出了两个独立的重复(图18A和图18B)。

图19A和图19B提供了在与用SB06252、SB06258和SB06255转导的NK细胞共培养后的靶细胞群体的细胞生长。示出了两个独立的重复(图19A和图19B)。

图20提供了当与用SB06252、SB06258和SB06255转导的NK细胞共培养时的系列杀伤测定中的靶细胞计数。

图21A和图21B提供了如通过流式细胞术评估的用双顺反子构建体SB06261、SB6294和SB6298转导的NK细胞的GPC3 CAR和IL15的表达图。示出了两个独立的重复((图21A和图21B)。

图22A和图22B提供了分泌的IL15水平，如通过免疫测定针对用SB06261、SB6294和SB6298转导的NK细胞所评估的。示出了两个独立的重复(图22A和图22B)。

图23A和图23B提供了在与用SB06252、SB06258和SB06255转导的NK细胞共培养后的靶细胞群体的细胞生长。示出了两个独立的重复(图23A和图23B)。

图24A和图24B提供了可切割释放IL15双反子构建体SB06691、SB06692和SB06693的表征。如通过流式细胞术评估的用SB06691、SB06692和SB06693转导的NK细胞的GPC3 CAR和IL15的表达图在图24A中示出。如通过免疫测定评估的用SB06691、SB06692和SB06693诱导的NK细胞的分泌IL15水平显示在图24B中示出。

图25示出了编码可切割释放IL12的双向构建体的示意图。

图26提供了在用格拉瑞韦(GRZ)处理后NK细胞的IL12分泌的剂量响应曲线。

图27A和图27B提供了体内小鼠数据，其证实在注射用SB04599、SB05042和SB05058转导的NK细胞后小鼠血液中的IL12水平。IL12水平在图27A中示出，并且IL12变化倍数在图27B中示出。

图28A-C提供了用表达GPC3 CAR和IL15的不同构建体转导的细胞的表征。图28A示出了流式细胞术图，其证实了用不同的GPC3 CAR/IL15表达构建体转导的NK细胞上的GPC3CAR、膜结合的IL15的表达和相应的拷贝数。图28B示出了分泌的IL-15的测量。图28C示出了如通过系列杀伤测定所评估的HepG2的细胞杀伤。

图29A和图29B提供了使用转导的NK细胞的系列杀伤的额外数据。图29A示出了HepG2细胞的系列杀伤。图29B示出了HuH-7细胞的系列杀伤。

图30A和图30B提供了使用快速扩增(G-Rex)评估转导的NK细胞功能的数据。图30A示出了GPC3 CAR、膜结合的IL 15(mIL15)和分泌的IL15(sIL15)的表达。图30B示出了转导的NK细胞的系列杀伤。

图31提供了如通过生物发光成像测量的来自异种移植肿瘤模型的结果，其中小鼠被注射NK细胞。

图32A和图32B提供了在注射NK细胞的小鼠中的异种移植肿瘤模型的结果和总结。图32A提供了用NK细胞处理的小鼠的存活曲线。图32B提供了用NK细胞处理的小鼠的中值存活期的总结。

图33提供了BLI实验的结果，以评估注射NK细胞的小鼠中的肿瘤减少。

图34提供了关于相对于第10天归一化的BLI测量的每个条件的定量。

图35A和图35B提供了来自异种移植肿瘤(HepG2)小鼠模型的结果，其中小鼠在研究期间用NK细胞注射三次。图35A提供了使用BLI成像的小鼠的结果。图35B提供了在研究期间BLI的变化倍数的时间过程。

图36A和图36B提供了注射有转导的NK细胞的小鼠中的BLI变化倍数。图36A提供了与在肿瘤植入后13天进行的测量相对应的结果。图36B提供了与在肿瘤植入后20天进行的测量相对应的结果。

图37A和图37B提供了异种移植模型中的肿瘤减少的结果。图37A示出了两个不同体内实验中的BLI变化倍数的总结。图37B示出了两个不同体内实验中的归一化的平均BLI变化倍数的总结，但分离处理组，并且单独跟踪动物。

图38A和图38B提供了来自异种移植肿瘤模型的结果，其中NK细胞在肿瘤内注射。图38A提供了肿瘤体积的测量值。图38B示出了存活曲线。

图39A和图39B提供了在存在或不存在格拉瑞韦的情况下IL-12的表达的结果。图39A提供了在用格拉瑞韦诱导后24小时的浓度和变化倍数的测量值。图39B提供了在诱导后72小时的浓度和变化倍数的测量值。

图40提供了来自在整个实验中以不同浓度注射了表达受调节的IL12的NK细胞的小鼠的结果。

图41提供了与IL-12和GPC3 CAR/IL15构建体共转导到NK细胞中的表达(GPC3 CAR和IL15)结果。

图42A和图42B提供了在存在或不存在格拉瑞韦的情况下分泌的IL15和分泌的IL12表达的结果。图42A提供了分泌的IL15浓度的测量值。图42B提供了分泌的IL12表达的测量值。

图43提供了在系列杀伤测定期间NK细胞的分泌的IL15和分泌的IL12的测量值。

图44A-D提供了用于Huh-7和HepG2细胞的细胞杀伤的NK细胞中不同共转导的系列杀伤测定的结果。图44A提供了与SB05042+SB06258共转导的NK细胞的系列杀伤结果。图44B提供了与SB05042+SB06257共转导的NK细胞的系列杀伤结果。图44C提供了与SB05042+SB06294共转导的NK细胞的系列杀伤结果。图44D提供了FIGs.44A-C中的结果的组合。

图45A-C提供了来自对表达GPC3 CAR的NK细胞的克隆选择的评估的结果。图45A提供每个细胞拷贝的结果。图45B提供了GCP3 CAR表达的结果。图45C提供了IL15表达的结果。图45D提供了对分泌的IL15的测量。

图46A和图46B提供了用SB06258转导的所选克隆上的GPC3 CAR和IL15表达的流式细胞术数据。图46A提供了所选克隆的结果。图46B提供了用SB05042(IL12)进一步转导的所选克隆的结果。

具体实施方式

本文提供了免疫应答细胞。

在第一实例中，对免疫应答细胞进行工程化为具有以下：

(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子；和

(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含

第三表达盒和第四表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第四表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第四启动子，其中ACP包括包含DNA结合结构域和转录效应子结构域的合成转录因子，

其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第三外源性多核苷酸序列的表达，

其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：S-C-MT或MT-C-S，其被配置为表达为单一多肽。

在第二实例中，免疫应答细胞被工程化为具有以下：

(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含

第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列和编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子；和

(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含

第三表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第三启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，

其中ACP能够通过结合至ACP应答启动子来诱导第三外源性多核苷酸序列的表达，其中ACP包含合成转录因子，

S是指可分泌效应分子。C是指蛋白酶切割位点。MT是指细胞膜栓系结构域。

免疫应答细胞的ACP包括合成转录因子。合成转录因子是一种非天然存在的蛋白质，其包括DNA结合结构域和转录效应子结构域，并且能够通过结合至由DNA结合结构域识别的同源启动子(ACP应答启动子)来调节(即激活或抑制)转录。在一些实施方案中，ACP是转录阻遏因子。在一些实施方案中，ACP是转录激活因子。

对膜可切割嵌合蛋白进行工程化，使得可以以蛋白酶依赖性方式调节效应分子的分泌。具体而言，对膜可切割嵌合蛋白进行工程化，使得效应分子的分泌可以作为“膜可切割”系统的一部分而受到调节，其中蛋白酶切割位点(“C”)和细胞膜栓系结构域(“MT”)的掺入允许以蛋白酶依赖性方式调节效应分子的分泌。不希望受理论束缚，存在于膜可切割嵌合蛋白中的膜可切割系统的组分通常通过以下细胞过程来调节分泌：

-MT：细胞膜栓系结构域包含跨膜结构域(或跨膜-胞内结构域)，其指导嵌合蛋白的细胞运输，使得该蛋白插入细胞膜中或以其他方式与细胞膜相连(“栓系”)

-C：在嵌合蛋白表达并定位于细胞膜后，蛋白酶切割位点指导嵌合蛋白的切割，使得将效应分子释放(“分泌”)到细胞外间隙。一般而言，蛋白酶切割位点是蛋白酶特异性的，包括经工程化为蛋白酶特异性的位点。可以对蛋白酶切割位点进行选择或工程化，以实现最佳的蛋白质表达、细胞类型特异性切割、细胞状态特异性切割和/或按期望的动力学(例如，膜结合嵌合蛋白水平与分泌嵌合蛋白水平的比率)切割和释放有效载荷。

在一些方面，本文提供了膜可切割嵌合蛋白(或编码膜可切割嵌合蛋白的经工程化的核酸)，所述膜可切割嵌合蛋白具有感兴趣的蛋白(例如，本文所述的任何效应分子)、蛋白酶切割位点和细胞膜栓系结构域。

“效应分子”是指这样的分子(例如，核酸诸如DNA或RNA，或蛋白质(多肽)或肽)，其结合于另一种分子并调节所结合分子的生物活性。例如，效应分子可以充当用于提高或降低酶促活性、基因表达或细胞信号传导的配体。因此，在一些实施方案中，效应分子调节(激活或抑制)不同的免疫调节机制。通过与分子直接结合并调节分子，效应分子还可以间接调节第二下游分子。

一般而言，对于本文所述的所有膜可切割嵌合蛋白，效应分子是细胞因子或其活性片段(在式S-C-MT或MT-C-S中称为“S”的可分泌效应分子)，其包括细胞因子或其活性片段。

术语“调节”涵盖维持生物活性、抑制(部分或完全)生物活性和刺激/激活(部分或完全)生物活性。该术语还涵盖降低或增加(例如，增强)生物活性。当一种效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如，刺激T细胞信号传导)不同于由另一种效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如，刺激抗原递呈和/或加工)时，两种不同的效应分子被认为“调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制”。

效应分子进行的调节可以是直接的或间接的。当效应分子结合于另一种分子并调节该分子的活性时，发生直接调节。当效应分子结合于另一种分子，调节该分子的活性，并且作为该调节的结果，调节又一种分子(效应分子不与之结合)的活性时，发生间接调节。

在一些实施方案中，至少一种效应分子调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如，全身性或在肿瘤微环境中)增加至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。例如，调节肿瘤介导的免疫抑制机制可使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20％-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应当理解，例如全身性或肿瘤微环境中的免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答的“增加”，是相对于在没有效应分子的情况下原本会发生的免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答而言的。

在一些实施方案中，至少一种效应分子调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如，全身性或在肿瘤微环境中)增加至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。例如，调节肿瘤介导的免疫抑制机制可使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。

免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的非限制性实例包含T细胞信号传导、活性和/或募集、抗原递呈和/或加工、自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集、树突细胞分化和/或成熟、免疫细胞募集、促炎巨噬细胞信号传导、活性和/或募集、基质降解、免疫刺激代谢物产生、干扰素基因刺激因子(STING)信号传导(其增加IFN分泌和Th1极化，促进了抗肿瘤免疫应答)和/或I型干扰素信号传导。效应分子可以刺激至少一种(一种或多种)前述免疫刺激机制，从而使得免疫刺激应答增加。可以例如使用用于T细胞增殖或细胞毒性的体外测定法、体外抗原递呈测定法、(例如，特定标记物的)表达测定法和/或(例如，细胞因子的)细胞分泌测定法来评估前述免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的变化。

在一些实施方案中，至少一种效应分子调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫抑制应答(例如，全身性或在肿瘤微环境中)减少至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。例如，调节肿瘤介导的免疫抑制机制可使得免疫抑制应答减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫抑制应答减少10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20％-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应当理解，例如全身性或肿瘤微环境中的免疫抑制应答的“减少”，是相对于在没有效应分子的情况下原本会发生的免疫抑制应答而言的。

在一些实施方案中，至少一种效应分子调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫抑制应答(例如，全身性或在肿瘤微环境中)减少至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。例如，调节肿瘤介导的免疫抑制机制可使得免疫抑制应答减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，调节肿瘤介导的免疫抑制机制使得免疫抑制应答减少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。

免疫抑制机制的非限制性实例包含负性共刺激信号传导、细胞毒性细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的促凋亡信号传导、T调节(Treg)细胞信号传导、肿瘤检查点分子产生/维持、骨髓源性抑制细胞信号传导、活性和/或募集、免疫抑制因子/代谢物产生和/或血管内皮生长因子信号传导。效应分子可以抑制至少一种(一种或多种)前述免疫抑制机制，从而使得免疫抑制应答减少。可以例如通过以下方式评估前述免疫抑制机制的变化：测定T细胞增殖的增加和/或IFNγ产生的增加(负性共刺激信号传导、T_reg细胞信号传导和/或MDSC)；膜联蛋白V/PI流式染色(促凋亡信号传导)；对表达的流式染色，例如PDL1表达(肿瘤检查点分子产生/维持)；ELISA、通过qPCR的RNA、酶学测定法例如IDO色氨酸分解代谢(免疫抑制因子/代谢物产生)；以及PI3K、Akt、p38的磷酸化(VEGF信号传导)。

在一些实施方案中，效应分子是加性地起作用的：两种效应分子的效应例如可以等于两种效应分子分别起作用时的效应的总和。在其他实施方案中，效应分子是协同地起作用的：两种效应分子的效应例如可以大于两种效应分子的组合功能。

调节肿瘤介导的免疫抑制机制和/或改变肿瘤微环境的效应分子可以是本文所述的任何细胞因子。

在一些实施方案中，至少一种效应分子刺激肿瘤微环境中的免疫刺激机制和/或抑制肿瘤微环境中的免疫抑制机制。

在一些实施方案中，至少一种效应分子(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原递呈和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集或抑制抗炎巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激代谢物产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负性共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导，(l)抑制T调节(T_reg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激因子(STING)信号传导，(o)抑制骨髓源性抑制细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导，和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。

细胞因子的非限制性实例列于表1，并且编码示例性效应分子的特定序列列于表2。效应分子可以是人的，如表1或表2中列出的那些，或者表1或表2中列出的鼠类效应分子的人等效物。效应分子可以是人源性的，如内源性人效应分子或者经功能修饰和/或优化(例如，经密码子优化以改进表达，经修饰以改进稳定性，或在其信号序列处修饰)的效应分子(参见下文)。用于优化功能的各种程序和算法是本领域技术人员已知的，并且可以基于期望的改进来选择，如针对特定物种(例如，人、小鼠、细菌等)的密码子优化。

表1：示例性的效应分子

效应子名称	类别	功能
			IFNβ	细胞因子	T细胞应答、肿瘤细胞杀死
IFNγ	细胞因子	T细胞应答、肿瘤细胞杀死
			IL-12(例如，IL12p70融合体)	细胞因子	T细胞、NK细胞
IL-1β	细胞因子	T细胞、NK细胞
			IL-15	细胞因子	刺激T细胞和NK
IL-2	细胞因子	刺激T细胞和NK
			IL-21	细胞因子	刺激T细胞
IL-24	细胞因子	刺激T细胞
			IL36-γ	细胞因子	刺激T细胞
IL-7	细胞因子	刺激T细胞
			IL-22	细胞因子	刺激T细胞
IL-18	细胞因子	刺激T细胞

表2：编码示例性效应分子的序列

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第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:309中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:326中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:314中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:315中所示的序列的核苷酸序列。

第二经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第二经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

第二经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。第二经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:318中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列；并且(b)第二经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列；并且(b)第二经工程化的核酸可以包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；并且(b)第二经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

第一经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；并且(b)第二经工程化的核酸可以包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括本文所述的任何一种经工程化的核酸。本文提供的免疫应答细胞可以包括本文所述的任何一种经工程化的核酸的组合。本文提供的免疫应答细胞可以包括两种或更多种本文所述的任何一种经工程化的核酸。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:309中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:326中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:314中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:315中所示序的列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括与SEQ ID NO:318具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。本文提供的免疫应答细胞可以包括具有SEQ ID NO:318中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括第一经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括第一经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括第一经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

本文提供的免疫应答细胞可以包括第一经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括本文所述的任何一种经工程化的核酸。本文提供的表达载体可以包括本文描述的任何一种经工程化的核酸的组合。本文提供的表达载体可以包括两种或更多种本文所述的任何一种经工程化的核酸。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:309中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:326中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:314中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:315中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括与SEQ ID NO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。本文提供的表达载体可以包括具有SEQ ID NO:318中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括第一经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:310中所示的序列的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括第一经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:327中所示的序列的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括具有SEQ ID NO:317中所示的序列的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括第一经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

本文提供的表达载体可以包括第一经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列；和(b)第二经工程化的核酸，其包括与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

分泌信号和信号锚

本文提供的膜可切割嵌合蛋白的一种或多种效应分子(例如，本文所述的任何细胞因子)通常是在嵌合蛋白的N末端(例如，S-C-MT的效应分子的N末端)具有分泌信号肽(也称为信号肽或信号序列)的可分泌效应分子，其将新合成的用于分泌或膜定位(也称为膜插入)的蛋白引导至适当的蛋白加工途径。对于具有式MT-C-S的嵌合蛋白，膜栓系结构域通常具有信号锚序列(例如，II型跨膜蛋白的信号锚序列)，该信号锚序列将新合成的注定要进行膜定位的蛋白引导至适当的蛋白加工途径。对于具有式S-C-MT的嵌合蛋白，可以使用具有反向信号锚序列(例如，某些III型跨膜蛋白的信号锚序列)的膜栓系结构域(通常没有单独的分泌信号肽)，该反向信号锚序列将新合成的注定要进行膜定位的蛋白引导至适当的蛋白加工途径。

一般而言，对于本文所述的所有膜可切割嵌合蛋白，一种或多种效应分子是可分泌效应分子(在式S-C-MT或MT-C-S中称为“S”)。在具有两种或更多种嵌合蛋白的实施方案中，每种嵌合蛋白可以包含分泌信号。在具有两种或更多种嵌合蛋白的实施方案中，每种嵌合蛋白可以包含分泌信号，使得每种效应分子能够在蛋白酶切割位点切割后从工程化细胞中分泌。

与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可以是天然分泌信号肽(例如，通常与给定效应分子内源性缔合的分泌信号肽，例如细胞因子的内源性分泌信号肽)。与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可以是非天然分泌信号肽。非天然分泌信号肽可以促进改善的表达和功能，诸如在特定环境(如肿瘤微环境)中维持分泌。表3中示出了非天然分泌信号肽的非限制性实例。

表3.示例性信号分泌肽

/>

蛋白酶切割位点

一般来说，本文所述的所有膜可切割嵌合蛋白含有蛋白酶切割位点(在式S-C-MT或MT-C-S中称为“C”)。一般而言，蛋白酶切割位点可以是能够被蛋白酶切割的任何氨基酸序列基序。蛋白酶切割位点的实例包括但不限于1型跨膜蛋白酶切割位点、II型跨膜蛋白酶切割位点、GPI锚定蛋白酶切割位点、ADAM8蛋白酶切割位点、ADAM9蛋白酶切割位点、ADAM10蛋白酶切割位点、ADAM12蛋白酶切割位点、ADAM15蛋白酶切割位点、ADAM17蛋白酶切割位点、ADAM19蛋白酶切割位点、ADAM20蛋白酶切割位点、ADAM21蛋白酶切割位点、ADAM28蛋白酶切割位点、ADAM30蛋白酶切割位点、ADAM33蛋白酶切割位点、BACE1蛋白酶切割位点、BACE2蛋白酶切割位点、SIP蛋白酶切割位点、MT1-MMP蛋白酶切割位点、MT3-MMP蛋白酶切割位点、MT5-MMP蛋白酶切割位点、弗林蛋白酶切割位点、PCSK7蛋白酶切割位点、蛋白裂解酶蛋白酶切割位点、蛋白裂解酶-2蛋白酶切割位点、MMP9蛋白酶切割位点或NS3蛋白酶切割位点。

蛋白酶切割位点的一个实例是丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)蛋白酶切割位点，包括但不限于NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B切割位点。关于各种HCV株的NS3蛋白酶及其切割位点的代表性序列的描述，参见例如，“丙型肝炎病毒：基因组和分子生物学(Hepatitis C Viruses:Genomes and Molecular Biology)”(S.L.Tan编辑,Taylor&Francis,2006),第6章,第163-206页；所述文献全文以引用方式并入本文。例如，提供了HCV NS4A/4B蛋白酶切割位点、HCV NS5A/5B蛋白酶切割位点、具有NS4A/4B蛋白酶切割位点的C末端降解决定子、具有HCV NS5A/5B蛋白酶切割位点的N末端降解决定子的序列。代表性NS3序列列于国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中。参见例如NCBI条目：登录号YP_001491553、YP_001469631、YP_001469632、NP_803144、NP_671491、YP_001469634、YP_001469630、YP_001469633、ADA68311、ADA68307、AFP99000、AFP98987、ADA68322、AFP99033、ADA68330、AFP99056、AFP99041、CBF60982、CBF60817、AHH29575、AIZ00747、AIZ00744、ABI36969、ABN05226、KF516075、KF516074、KF516056、AB826684、AB826683、JX171009、JX171008、JX171000、EU847455、EF154714、GU085487、JX171065、JX171063；所有所述序列(截止本申请的提交日为止输入的序列)均以引用方式并入本文。

蛋白酶切割位点的另一个实例是ADAM17特异性蛋白酶(也称为肿瘤坏死因子-α转化酶[TACE])切割位点。ADAM17特异性蛋白酶切割位点可以是被ADAM17天然切割的底物的内源序列。ADAM17特异性蛋白酶切割位点可以是能够被ADAM17切割的工程化序列。工程化的ADAM17特异性蛋白酶切割位点可以经工程化以获得特定的期望特性，包括但不限于嵌合蛋白的最佳表达、对ADAM17的特异性、ADAM17的切割速率、分泌嵌合蛋白水平和膜结合嵌合蛋白水平的比率以及在不同细胞状态下的切割。可以针对ADAM17的特异性切割来选择蛋白酶切割位点。例如，能够被ADAM17切割的某些蛋白酶切割位点也能够被另外的ADAM家族蛋白酶诸如ADAM10切割。因此，可以对ADAM17特异性蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得减少或消除其他蛋白酶诸如ADAM10的切割。可以针对ADAM17的切割速率来选择蛋白酶切割位点。例如，可能希望选择展示ADAM17的特定切割速率(诸如相对于被ADAM17天然切割的底物的内源序列降低的切割动力学)的蛋白酶切割位点。在此类情况下，一般而言，可以选择特定切割速率来调节嵌合蛋白的加工速率，继而调节有效载荷效应分子的释放/分泌速率。因此，可以对ADAM17特异性蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得该序列展现出期望的ADAM17切割速率。可以针对ADAM17的特异性切割和ADAM17的切割速率两者来选择蛋白酶切割位点。示例性的ADAM17特异性蛋白酶切割位点(包括展现出特定特异性和切割速率动力学的那些位点)示于下表4A中，其中提及了切割位点(P5-P1：N末端；P1'-P5'：C末端)。ADAM17和ADAM10的更多细节(包括表达和蛋白酶切割位点)在Sharma等人(J Immunol2017年10月15日,199(8)2865-2872),Pham等人(Anticancer Res.2017年10月；37(10):5507-5513),Caescu等人(Biochem J.2009年10月23日；424(1):79–88)和Tucher等人(J.Proteome Res.2014,13,4,2205–2214)中有所描述，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文以用于各目的。

表4A-潜在的ADAM17蛋白酶切割位点序列

P5

P4

P3

P2

P1

P1'

P2'

P3'

P4'

P5'

全序列

SEQ ID NO:

P

R

A

E

A

V

K

G

PRAEAVKGG

179

P

R

A

E

A

L

K

G

PRAEALKGG

180

P

R

A

E

Y

S

K

G

PRAEYSKGG

181

P

R

A

E

P

I

K

G

PRAEPIKGG

182

P

R

A

E

A

Y

K

G

PRAEAYKGG

183

P

R

A

E

S

K

G

PRAESSKGG

184

P

R

A

E

F

T

K

G

PRAEFTKGG

185

D

E

P

H

Y

S

Q

R

DEPHYSQRR

187

P

L

G

P

I

F

N

P

G

PPLGPIFNPG

188

P

L

A

Q

A

Y

R

S

PLAQAYRSS

189

T

P

I

D

S

F

N

P

D

TPIDSSFNPD

190

V

T

P

E

P

I

F

S

L

I

VTPEPIFSLI

191

P

R

A

E

A

K

G

PRAEAAKGG

186

在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含具有PRAE(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列的第一区域。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含具有KGG(SEQ ID NO:177)的氨基酸序列的第二区域。在一些实施方案中，第一区域位于第二区域的N末端。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEX₁X₂KGG(SEQ ID NO:178)的氨基酸序列，其中X₁是A、Y、P、S或F，并且其中X₂是V、L、S、I、Y、T或A。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEAVKGG(SEQID NO:179)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含P PRAEALKGG(SEQ IDNO:180)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEYSKGG(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEPIKGG(SEQ ID NO:182)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEAYKGG(SEQ ID NO:183)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAESSKGG(SEQ ID NO:184)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEFTKGG(SEQ ID NO:185)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PRAEAAKGG(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含DEPHYSQRR(SEQ ID NO:187)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PPLGPIFNPG(SEQ ID NO:188)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含PLAQAYRSS(SEQ ID NO:189)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含TPIDSSFNPD(SEQ ID NO:190)的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含VTPEPIFSLI(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列。

在某些实施方案中，切割位点包含接头序列。切割位点可以通过接头序列侧接在N末端侧和/或C末端侧上。例如但不限于，切割位点可以通过部分甘氨酸-丝氨酸(GS)接头序列侧接在N末端侧和C末端侧。在切割时，N末端部分GS接头和C末端部分GS接头连接以形成GS接头序列，如SEQ ID NO:215。

在某些实施方案中，切割位点和接头包含SGGGGSGGGGSGVTPEPIFSLIGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:287)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:287的示例性核酸序列是TCTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGTTACACCCGA GCCTATCTTCAGCCTGATCGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGAAGTG GTGGCGGATCTCTGCAA(SEQ ID NO:288)。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:287的核酸可以包含SEQ ID NO:288，或与SEQ ID NO:288至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。

在某些实施方案中，蛋白酶切割位点在接头的N末端。在某些实施方案中，蛋白酶切割位点和接头包含PRAEALKGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:289)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:289的示例性核酸序列是CCCAGAGCCGAGGCTCTGAAAGGCGGATCAGGCGGCGGTGGTAGTGGAGGCGGAGGCTCAGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGT GGCGGTTCCGGCGGAGGATCTCTTCAAT(SEQ ID NO:292)。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:289的核酸可以包含SEQ ID NO:292，或与SEQ ID NO:292至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。

在一些实施方案中，蛋白酶切割位点包含ITQGLAVSTISSFF(SEQ ID NO:198)的氨基酸序列，其是对于CD16天然并可由ADAM17切割的切割位点。在某些实施方案中，SEQ IDNO:198包含在接头内。在某些实施方案中，接头包含SGGGGSGGGGSGITQGLAVSTISSFFGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:290)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:290的示例性核酸序列是AGCGGCGGAGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGAATTACACAGGGACTCGCCGTGTCTACAATCTCCAGCTTCTTTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGTGGATCTCTTCAA(SEQ ID NO:291)。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:290的核酸可以包含SEQ ID NO:291，或与SEQ ID NO:291至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。

蛋白酶切割位点可以位于可分泌效应分子的C末端。蛋白酶切割位点可以是可分泌效应分子的N末端。一般而言，对于本文所述的所有膜可切割嵌合蛋白，蛋白酶切割位点是如下任一者：(1)可分泌效应分子的C末端和细胞膜栓系结构域的N末端(换句话讲，蛋白酶切割位点在可分泌效应分子与细胞膜栓系结构域之间)；或(2)可分泌效应分子的N末端和细胞膜栓系结构域的C末端(也在可分泌效应分子与细胞膜栓系结构域之间，但结构域取向反向)。蛋白酶切割位点可以通过多肽接头(即，通常不被认为是效应分子或蛋白酶切割位点的一部分的多肽序列)连接到可分泌效应分子。蛋白酶切割位点可以通过多肽接头(即，通常不被认为是细胞膜栓系结构域或蛋白酶切割位点的一部分的多肽序列)与细胞膜栓系结构域连接。多肽接头可以是连接第一多肽序列和第二多肽序列的任何氨基酸序列。多肽接头可以是柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽接头的实例包括但不限于GSG接头(例如，[GS]₄GG[SEQ ID NO:182])、A(EAAAK)₃A(SEQ ID NO:183)和Whitlow接头(例如，“KEGS”接头诸如氨基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:184)、eGK接头诸如氨基酸序列EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:185)、LR1接头诸如氨基酸序列SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:215)以及所公布的美国专利第5,990,275号中更详细描述的接头，该专利通过引用方式并入本文)。另外的示例性多肽接头包括SGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:194)、TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQID NO:196)和GGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:197)。其他多肽接头可以基于期望的性质(例如，长度、柔性、氨基酸组成等)进行选择并且是本领域技术人员已知的。编码SEQ ID NO:196的示例性核酸序列是ACCACCACACCAGCTCCTCGGCCACCAACTCCAGCTCCAACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCAGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC(SEQ ID NO:337)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:196的核酸包含与SEQ ID NO:337至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在膜可切割系统中，在嵌合蛋白表达并定位于细胞膜后，蛋白酶切割位点指导嵌合蛋白的切割，使得将效应分子释放(“分泌”)到细胞的细胞外间隙。

一般而言，切割蛋白酶切割位点的蛋白酶是对该特定蛋白酶切割位点具有特异性的蛋白酶。例如，在去整合素-金属蛋白酶(“ADAM”)家族蛋白酶的情况下，切割特定ADAM蛋白酶切割位点的蛋白酶通常限于特异性识别特定ADAM蛋白酶切割位点基序的ADAM蛋白酶。可以对蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得减少或消除非期望的蛋白酶的切割。蛋白酶可以是膜结合的或膜相连的。蛋白酶可以被分泌，例如在特定的细胞环境如肿瘤微环境(“TME”)中分泌。

切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶可以在表达嵌合蛋白的相同细胞中表达。切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶对于表达嵌合蛋白的细胞可以是内源的。换句话讲，经工程化以表达嵌合蛋白的细胞可以内源性表达对嵌合蛋白中存在的蛋白酶切割位点具有特异性的蛋白酶。蛋白酶的内源性表达既指在一般稳态条件下的表达(例如，通常被认为是健康的细胞)，也指在非稳态条件下的差异表达(例如，肿瘤细胞中上调的表达)。蛋白酶切割位点可以基于由期望的细胞群体内源表达的已知蛋白酶来选择。在此类情况下，一般而言，蛋白酶切割位点的切割(以及因此有效载荷的释放/分泌)可以仅限于那些感兴趣的细胞，因为细胞限制性蛋白酶需要与在相同细胞中表达的嵌合蛋白的蛋白酶切割位点接触。例如，不希望受理论束缚，ADAM17被认为其内源性表达限于NK细胞和T细胞。因此，ADAM17特异性蛋白酶切割位点的选择可以将蛋白酶切割位点的切割限于共表达嵌合蛋白的NK细胞和T细胞。在其他实例中，可以为已知在感兴趣的特定肿瘤群体中(例如，在经工程化以表达嵌合蛋白的特定肿瘤细胞中)表达的特定肿瘤相关蛋白酶选择蛋白酶切割位点。蛋白酶和/或表达数据库可以用于选择适当的蛋白酶切割位点，诸如通过咨询Oncomine(www.oncomine.org)、欧洲生物信息研究所(European Bioinformatic Institute)(www.ebi.ac.uk)(特别是(www.ebi.ac.uk/gxa))、PMAP(www.proteolysis.org)、ExPASyPeptide Cutter(ca.expasy.org/tools/peptide cutter)和PMAP.Cut DB(cutdb.burnham.org)来选择被肿瘤相关蛋白酶切割的蛋白酶切割位点，这些文献中的每一篇均以引用方式并入以用于所有目的。

切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶对于表达嵌合蛋白的细胞可以是异源的。例如，经工程化以表达嵌合蛋白的细胞也可以经工程化以表达通常不由该细胞表达的蛋白酶，该蛋白酶对嵌合蛋白中存在的蛋白酶切割位点具有特异性。经工程化以表达嵌合蛋白和蛋白酶两者的细胞可以经工程化以由单独的经工程化的核酸或由多顺反子系统(多顺反子和多启动子系统在本文标题为“多顺反子和多启动子系统”的部分中有更详细的描述)表达每一种。异源蛋白酶及其对应蛋白酶切割位点可以如上文参考内源蛋白酶所述的那样进行选择。

切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶可以在与表达嵌合蛋白的细胞不同的单独细胞上表达。例如，蛋白酶通常可以在特定的细胞环境(如肿瘤微环境)中表达。在此类情况下，一般而言，蛋白酶切割位点的切割可以仅限于那些所关注细胞环境(例如，肿瘤微环境)，因为环境限制性蛋白酶需要与蛋白酶切割位点接触。在具有膜可切割嵌合蛋白的实施方案中，一般而言，效应分子的分泌可以仅限于那些所关注细胞环境(例如，肿瘤微环境)，因为环境限制性蛋白酶需要与蛋白酶切割位点接触。切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶对于不同的单独细胞可以是内源的。切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的蛋白酶对于不同的单独细胞可以是异源的。例如，可以对不同的单独细胞进行工程化以表达通常不由不同的单独细胞表达的蛋白酶。

蛋白酶包括但不限于1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶和MMP9蛋白酶。蛋白酶可以是NS3蛋白酶。蛋白酶可以是ADAM17蛋白酶。

蛋白酶可以是肿瘤相关蛋白酶，诸如组织蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。肿瘤相关蛋白酶的具体实例包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活物、金属蛋白酶1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP4、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP20、MMP21、MMP23、MMP24、MMP25、MMP26、MMP28、ADAM、ADAMTS、CD10(CALLA)或前列腺特异性抗原。蛋白酶还可以包括但不限于下表4B中列出的蛋白酶。某些蛋白酶的示例性同源蛋白酶切割位点也列于表4B中。

表4B：示例性蛋白酶与同源切割位点和抑制剂

/>

蛋白酶可以是任何下述人蛋白酶(括号中提供了MEROPS肽酶数据库编号；Rawlings N.D.,Morton F.R.,Kok,C.Y.,Kong、J.&Barrett A.J.(2008)MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the肽酶database.)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》36数据库特辑、D320-325；该文献以引用方式并入本文以用于所有目的)：胃蛋白酶A(MER000885)、胃亚蛋白酶(MER000894)、膜天冬氨酸蛋白酶-2(MER005870)、肾素(MER000917)、组织蛋白酶D(MER000911)、组织蛋白酶E(MER000944)、膜天冬氨酸蛋白酶-1(MER005534)、新天冬氨酸蛋白酶A(MER004981)、Mername-AA034肽酶(MER014038)、胃蛋白酶A4(MER037290)、胃蛋白酶A5(智人)(MER037291)、hCG1733572(智人)型推定肽酶(MER107386)、新天冬氨酸蛋白酶B假基因(MER004982)、CYMP g.p.(智人)(MER002929)、亚家族A1A未指定肽酶(MER181559)、小鼠乳腺肿瘤病毒反胃蛋白酶(MER048030)、兔内源性逆转录病毒内肽酶(MER043650)、S71相关的人内源性反胃蛋白酶(MER001812)、RTVL-H型推定肽酶(MER047117)、RTVL-H型推定肽酶(MER047133)、RTVL-H型推定肽酶(MER047160)、RTVL-H型推定肽酶(MER047206)、RTVL-H型推定肽酶(MER047253)、RTVL-H型推定肽酶(MER047260)、RTVL-H型推定肽酶(MER047291)、RTVL-H型推定肽酶(MER047418)、RTVL-H型推定肽酶(MER047440)、RTVL-H型推定肽酶(MER047479)、RTVL-H型推定肽酶(MER047559)、RTVL-H型推定肽酶(MER047583)、RTVL-H型推定肽酶(MER015446)、人内源性逆转录病毒反胃蛋白酶同源物1(MER015479)、人内源性逆转录病毒反胃蛋白酶同源物2(MER015481)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因1(智人染色体14)(MER029977)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因2(智人染色体8)(MER029665)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER002660)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER030286)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER047144)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因5(智人染色体12)(MER029664)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因6(智人染色体7)(MER002094)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因7(智人染色体6)(MER029776)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因8(智人染色体Y)(MER030291)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因9(智人染色体19)(MER029680)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因10(智人染色体12)(MER002848)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因11(智人染色体17)(MER004378)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因12(智人染色体11)(MER003344)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因13(智人染色体2和类似物)(MER029779)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因14(智人染色体2)(MER029778)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER047158)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER047332)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER003182)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER047165)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER047178)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER047200)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER047315)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER047405)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因16(MER030292)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因17(智人染色体8)(MER005305)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因18(智人染色体4)(MER030288)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因19(智人染色体16)(MER001740)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047222)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047454)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047477)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因21(智人)(MER004403)、内源性逆转录病毒反胃蛋白酶假基因22(智人染色体X)(MER030287)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047046)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047052)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047076)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047080)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047088)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047089)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047091)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047092)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047093)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047094)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047097)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047099)、亚家族A2A非肽酶同源物MER047101)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047102)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047107)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047108)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047109)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047110)、亚家族A2A非肽酶同源物MER047111)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047114)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047118)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047121)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047122)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047126)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047129)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047130)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047134)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047135)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047137)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047140)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047141)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047142)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047148)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047149)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047151)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047154)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047155)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047156)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047157)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047159)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047161)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047163)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047166)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047171)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047173)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047174)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047179)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047183)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047186)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047190)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047191)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047196)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047198)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047199)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047201)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047202)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047203)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047204)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047205)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047207)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047208)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047210)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047211)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047212)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047213)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047215)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047216)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047218)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047219)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047221)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047224)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047225)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047226)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047227)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047230)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047232)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047233)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047234)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047236)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047238)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047239)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047240)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047242)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047243)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047249)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047251)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047252)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047254)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047255)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047263)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047265)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047266)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047267)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047268)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047269)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047272)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047273)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047274)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047275)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047276)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047279)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047280)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047281)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047282)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047284)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047285)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047289)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047290)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047294)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047295)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047298)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047300)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047302)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047304)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047305)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047306)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047307)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047310)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047311)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047314)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047318)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047320)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047321)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047322)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047326)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047327)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047330)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047333)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047362)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047366)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047369)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047370)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047371)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047375)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047376)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047381)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047383)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047384)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047385)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047388)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047389)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047391)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047394)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047396)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047400)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047401)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047403)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047406)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047407)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047410)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047411)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047413)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047414)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047416)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047417)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047420)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047423)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047424)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047428)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047429)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047431)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047434)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047439)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047442)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047445)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047449)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047450)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047452)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047455)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047457)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047458)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047459)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047463)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047468)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047469)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047470)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047476)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047478)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047483)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047488)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047489)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047490)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047493)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047494)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047495)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047496)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047497)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047499)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047502)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047504)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047511)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047513)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047514)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047515)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047516)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047520)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047533)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047537)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047569)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047570)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047584)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047603)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047604)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047606)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047609)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047616)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047619)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047648)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047649)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER047662)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER048004)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER048018)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER048019)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER048023)、亚家族A2A非肽酶同源物(MER048037)、亚家族A2A未指定肽酶(MER047164)、亚家族A2A未指定肽酶(MER047231)、亚家族A2A未指定肽酶(MER047386)、皮肤天冬氨酸蛋白酶(MER057097)、早老蛋白1(MER005221)、早老蛋白2(MER005223)、impas 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A蛋白(MER004227)、二肽基肽酶8(MER013484)、二肽基肽酶9(MER004923)、FLJ1推定肽酶(MER017240)、Mername-AA194推定肽酶(MER017353)、Mername-AA195推定肽酶(MER017367)、Mername-AA196推定肽酶(MER017368)、Mername-AA197推定肽酶(MER017371)、C14orf29蛋白(MER033244)、假设的蛋白质(MER033245)、假设的酯酶/脂肪酶/硫酯酶(MER047309)、蛋白bat5(MER037840)、假设的蛋白质flj40219(MER033212)、假设的蛋白质flj37464(MER033240)、假设的蛋白质flj33678(MER033241)、二肽基肽酶同源物DPP6(MER000403)、二肽基肽酶同源物DPP10(MER005988)、类似于小家鼠染色体20开放阅读框135的蛋白(MER037845)、犬尿氨酸甲酰胺酶(MER046020)、甲状腺球蛋白前体(MER011604)、乙酰胆碱酯酶(MER033188)、胆碱脂酶(MER033198)、羧酸酯酶D1(MER033213)、肝羧酸酯酶(MER033220)、羧酸酯酶3(MER033224)、羧酸酯酶2(MER033226)、胆盐依赖性脂肪酶(MER033227)、羧酸酯酶相关蛋白(MER033231)、神经连接蛋白3(MER033232)、神经连接蛋白4、X连锁(MER033235)、神经连接蛋白4、Y连锁(MER033236)、酯酶D(MER043126)、芳基乙酰胺脱乙酰酶(MER033237)、KIAA1363样蛋白(MER033242)、激素敏感脂肪酶(MER033274)、神经连接蛋白1(MER033280)、神经连接蛋白2(MER033283)、家族S9非肽酶同源物(MER212939)、家族S9非肽酶同源物(MER211490)、亚家族S9C未指定肽酶(MER192341)、家族S9未指定肽酶(MER209181)、家族S9未指定肽酶(MER200434)、家族S9未指定肽酶(MER209507)、家族S9未指定肽酶(MER209142)、丝氨酸羧肽酶A(MER000430)、卵黄羧肽酶样蛋白(MER005492)、RISC肽酶(MER010960)、家族S15未指定肽酶(MER199442)、家族S15未指定肽酶(MER200437)、家族S15未指定肽酶(MER212825)、溶酶体Pro-Xaa羧肽酶(MER000446)、二肽基肽酶II(MER004952)、胸腺特异性丝氨酸肽酶(MER005538)、环氧化物水解酶样推定肽酶(MER031614)、Loc328574样蛋白(MER033246)、含脱水酶结构域的蛋白4(MER031616)、环氧化物水解酶(MER000432)、中胚层特异性转录物蛋白(MER199890)、中胚层特异性转录物蛋白(MER017123)、胞质环氧化物水解酶(MER029997)、胞质环氧化物水解酶(MER213866)、类似于假设的蛋白质FLJ22408(MER031608)、CGI-58推定肽酶(MER030163)、Williams-Beuren综合症关键区蛋白21环氧化物水解酶(MER031610)、环氧化物水解酶(MER031612)、假设的蛋白质922408(环氧化物水解酶)(MER031617)、甘油单酯脂肪酶(MER033247)、假设的蛋白质(MER033249)、伐昔洛韦水解酶(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)、糖基天冬酰胺酶前体(MER003299)、异天冬氨酰二肽酶(苏氨酸型)(MER031622)、taspase-1(MER016969)、γ-谷氨酰转移酶5(哺乳动物型)(MER001977)、γ-谷氨酰转移酶1(哺乳动物型)(MER001629)、γ-谷氨酰转移酶2(智人)(MER001976)、γ-谷氨酰转移酶样蛋白4(MER002721)、γ-谷氨酰转移酶样蛋白3(MER016970)、类似于γ-谷氨酰转移酶1前体(智人)(MER026204)、类似于γ-谷氨酰转移酶1前体(智人)(MER026205)。Mername-AA211推定肽酶(MER026207)、γ-谷氨酰转移酶6(MER159283)、γ-谷氨酰转肽酶同源物(染色体2，智人)(MER037241)、多囊蛋白-1(MER126824)、KIAA1879蛋白(MER159329)、多囊肾病1样3(MER172554)、γ-谷氨酰水解酶(MER002963)、鸟嘌呤5″单磷酸合成酶(MER043387)、氨甲酰磷酸合成酶(智人型)(MER078640)、二氢乳清酸酶(N-末端单元)(智人型)(MER060647)、DJ-1推定肽酶(MER003390)、Mername-AA100推定肽酶(MER014802)、Mername-AA101非肽酶同源物(MER014803)、KIAA0361蛋白(智人型)(MER042827)、F1134283蛋白(智人)(MER044553)、非肽酶同源物染色体21开放阅读框33(智人)(MER160094)、家族C56非肽酶同源物(MER177016)、家族C56非肽酶同源物(MER176613)、家族C56非肽酶同源物(MER176918)、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(MER037230)、CD97抗原(人型)(MER037286)、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样3(MER037288)、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样1(MER037278)、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样4(MER037294)、钙粘蛋白EGF LAG七通G型受体2前体(智人)(MER045397)、Gpr64(小家鼠)型蛋白(MER123205)、GPR56(智人)型蛋白(MER122057)、蛛毒素受体2(MER122199)、蛛毒素受体-1(MER126380)、蛛毒素受体3(MER124612)、原钙粘蛋白Flamingo 2(MER124239)、ETL蛋白(MER126267)、G蛋白偶联受体112(MER126114)、七次跨膜螺旋受体(MER125448)、Gpr114蛋白(MER159320)、GPR126血管诱导型G蛋白偶联受体(MER140015)、GPR125(智人)型蛋白(MER159279)、GPR116(智人)型G蛋白偶联受体(MER159280)、GPR128(智人)型G蛋白偶联受体(MER162015)、GPR133(智人)型蛋白(MER159334)、GPR110 G蛋白偶联受体(MER159277)、GPR97蛋白(MER159322)、KPG_006蛋白(MER161773)、KPG_008蛋白(MER161835)、KPG_009蛋白(MER159335)、未指定同源物(MER166269)、GPR113蛋白(MER159352)、脑特异性血管生成抑制剂2(MER159746)、PIDD自体加工蛋白单元1(MER020001)、PIDD自体加工蛋白单元2(MER063690)、MUC1自切割粘蛋白(MER074260)、肌营养不良蛋白聚糖(MER054741)、原蛋白转换酶9(MER022416)、位点-1肽酶(MER001948)、弗林蛋白酶(MER000375)、原蛋白转换酶转换酶1(MER000376)、原蛋白转换酶2(MER000377)、原蛋白转换酶4(MER028255)、PACE4原蛋白转换酶(MER000383)、原蛋白转换酶5(MER002578)、原蛋白转换酶7(MER002984)、三肽基肽酶II(MER000355)、亚家族S8A非肽酶同源物(MER201339)、亚家族S8A非肽酶同源物(MER191613)、亚家族S8A未指定肽酶(MER191611)、亚家族S8A未指定肽酶(MER191612)、亚家族S8A未指定肽酶(MER191614)、三肽基肽酶I(MER003575)、脯氨酰寡肽酶(MER000393)、二肽基肽酶IV(真核细胞)(MER000401)、酰基氨酰基肽酶(MER000408)、成纤维细胞活化蛋白α亚基(MER000399)、PREPL A蛋白(MER004227)、二肽基肽酶8(MER013484)、二肽基肽酶9(MER004923)、FLJ1推定肽酶(MER017240)、Mername-AA194推定肽酶(MER017353)、Mername-AA195推定肽酶(MER017367)、Mername-AA196推定肽酶(MER017368)、Mername-AA197推定肽酶(MER017371)、C14orf29蛋白(MER033244)、假定蛋白(MER033245)、假定酯酶/脂肪酶/硫酯酶(MER047309)、蛋白bat5(MER037840)、假定蛋白flj40219(MER033212)、假定蛋白flj37464(MER033240)、假定蛋白flj33678(MER033241)、二肽基肽酶同源物DPP6(MER000403)、二肽基肽酶同源物DPP10(MER005988)、与小家鼠染色体20开放阅读框135类似的蛋白(MER037845)、犬尿氨酸甲酰胺酶(MER046020)、甲状腺球蛋白前体(MER011604)、乙酰胆碱酯酶(MER033188)、胆碱酯酶(MER033198)、羧酸酯酶D1(MER033213)、肝羧酸酯酶(MER033220)、羧酸酯酶3(MER033224)、羧酸酯酶2(MER033226)、胆盐依赖性脂肪酶(MER033227)、羧酸酯酶相关蛋白(MER033231)、神经连接蛋白3(MER033232)、神经连接蛋白4X连锁(MER033235)、神经连接蛋白4Y连锁(MER033236)、酯酶D(MER043126)、芳基乙酰胺脱乙酰酶(MER033237)、KIAA1363样蛋白(MER033242)、激素敏感性脂肪酶(MER033274)、神经连接蛋白1(MER033280)、神经连接蛋白2(MER033283)、家族S9非肽酶同源物(MER212939)、家族S9非肽酶同源物(MER211490)、亚家族S9C未指定肽酶(MER192341)、家族S9未指定肽酶(MER209181)、家族S9未指定肽酶(MER200434)、家族S9未指定肽酶(MER209507)、家族S9未指定肽酶(MER209142)、丝氨酸羧肽酶A(MER000430)、卵黄羧肽酶样蛋白(MER005492)、RISC肽酶(MER010960)、家族S15未指定肽酶(MER199442)、家族S15未指定肽酶(MER200437)、家族S15未指定肽酶(MER212825)、溶酶体Pro-Xaa羧肽酶(MER000446)、二肽基肽酶II(MER004952)、胸腺特异性丝氨酸肽酶(MER005538)、环氧化物水解酶样推定肽酶(MER031614)、Loc328574样蛋白(MER033246)、含自水解酶结构域蛋白4(MER031616)、环氧化物水解酶(MER000432)、中胚层特异性转录蛋白(MER199890)、中胚层特异性转录蛋白(MER017123)、胞质环氧化物水解酶(MER029997)、胞质环氧化物水解酶(MER213866)、类似于假定蛋白FLJ22408(MER031608)、CGI-58推定肽酶(MER030163)、Williams-Beuren综合症关键区蛋白21环氧化物水解酶(MER031610)、环氧化物水解酶(MER031612)、假定蛋白flj22408(环氧化物水解酶)(MER031617)、甘油单酯脂肪酶(MER033247)、假定蛋白(MER033249)、伐昔洛韦水解酶(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)。

可以调节蛋白酶的酶活性。例如，某些蛋白酶可以因特定试剂(例如，与蛋白酶结合的试剂，诸如特定的小分子抑制剂)的存在或不存在而失活。此类蛋白酶可以称为“阻遏型蛋白酶”。某些蛋白酶的示例性抑制剂列于表4B中。例如，NS3蛋白酶可以由包括但不限于以下的蛋白酶抑制剂阻遏：西美瑞韦、达诺瑞韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利瑞韦、替拉瑞韦、格拉瑞韦、格卡瑞韦和伏西瑞韦。在另一实例中，蛋白酶促活性可以通过调节蛋白酶本身的表达来调节，如对细胞进行工程化以使用诱导型启动子系统(例如，Tet On/Off系统)或细胞特异性启动子(可用于表达异源蛋白酶的启动子在本文标题为“启动子”的部分中有更详细的描述)表达蛋白酶。蛋白酶也可以包含降解决定子，诸如本文所述的任何降解决定子，并且可以使用本文所述的任何降解决定子系统进行调节。

蛋白酶的酶活性也可以通过选择特定的蛋白酶切割位点来调节。例如，可以对蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得该序列展现出被期望的蛋白酶切割的期望速率，诸如相对于被期望的蛋白酶天然切割的底物的内源序列降低的切割动力学。作为另一个实例，可以对蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得该序列以细胞状态特异性方式展现出期望的切割速率。例如，各种细胞状态(例如，在细胞信号传导诸如免疫细胞激活之后)可以影响某些蛋白酶的表达和/或定位。作为说明性的实例，已知ADAM17蛋白水平和定位受信号传导的影响，例如通过蛋白激酶C(PKC)信号传导途径(例如，由PKC激活剂佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯[PMA]进行的激活)。因此，可以对蛋白酶切割位点进行选择和/或工程化，使得根据需要增加或减少蛋白酶切割位点的切割和随后效应分子的释放，这取决于特定细胞状态下的蛋白酶特性(例如，表达和/或定位)。作为另一个实例，可以对蛋白酶切割位点(特别是与特定的膜栓系结构域组合)进行选择和/或工程化，以实现嵌合蛋白的最佳蛋白表达。

细胞膜栓系结构域

本文提供的膜可切割嵌合蛋白包含细胞膜栓系结构域(在式S-C-MT或MT-C-S中称为“MT”)。一般而言，细胞膜栓系结构域可以是能够指导嵌合蛋白定位于表达嵌合蛋白的细胞的细胞膜(例如，插入细胞膜中)或以其他方式与之缔合的任何氨基酸序列基序。细胞膜栓系结构域可以是跨膜-胞内结构域。细胞膜栓系结构域可以是跨膜结构域。细胞膜栓系结构域可以是完整膜蛋白结构域(例如，跨膜结构域)。细胞膜栓系结构域可以衍生自I型、II型或III型跨膜蛋白。细胞膜栓系结构域可以包含翻译后修饰标签或能够通过翻译后修饰来修饰嵌合蛋白以包含翻译后修饰标签的基序，其中翻译后修饰标签允许与细胞膜相连。翻译后修饰标签的实例包括但不限于脂质锚结构域(例如，GPI脂质锚、豆蔻酰化标签或棕榈酰化标签)。细胞膜栓系结构域的实例包括但不限于衍生自PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ链、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1或BTLA的跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域。细胞膜栓系结构域可以是细胞表面受体或其细胞膜结合部分。示例性的细胞膜栓系结构域的序列在表4C中提供。

表4C.

一般而言，对于本文所述的所有膜可切割嵌合蛋白，细胞膜栓系结构域是如下任一者：(1)蛋白酶切割位点的C末端和任何胞内结构域(如果存在的话)的N末端(换句话讲，细胞膜栓系结构域在蛋白酶切割位点和胞内结构域(如果存在的话)之间)；或(2)蛋白酶切割位点的N末端和任何胞内结构域(如果存在的话)的C末端(也在蛋白酶切割位点和胞内结构域(如果存在的话)之间，但结构域取向反向)。在以与嵌合蛋白相关的降解决定子为特征的实施方案中，降解决定子结构域是末端胞质定向结构域，特别是相对于细胞膜栓系(换句话讲，细胞膜栓系结构域位于蛋白酶切割位点和降解决定子之间)。细胞膜栓系结构域可以通过多肽接头(即，通常不被认为是细胞膜栓系结构域或蛋白酶切割位点的一部分的多肽序列)连接到蛋白酶切割位点。细胞膜栓系结构域可以通过多肽接头(即，通常不被认为是细胞膜栓系结构域或胞内结构域的一部分的多肽序列)连接到胞内结构域(如果存在的话)。细胞膜栓系结构域可以通过多肽接头(即，通常不被认为是细胞膜栓系结构域或降解决定子的一部分的多肽序列)连接到降解决定子(如果存在的话)。多肽接头可以是连接第一多肽序列和第二多肽序列的任何氨基酸序列。多肽接头可以是柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽接头的实例包括但不限于GSG接头例如、[GS]₄GG[SEQ ID NO:182])、A(EAAAK)₃A(SEQ ID NO:183)和Whitlow接头(例如，“KEGS”接头诸如氨基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:184)、eGK接头诸如氨基酸序列EGKSSGSGSESKST(SEQ IDNO:185)、LR1接头诸如氨基酸序列SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:215)以及所公布的美国专利第5,990,275号中更详细描述的接头，该专利通过引用方式并入本文)。另外的多肽接头包含SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197。其他多肽接头可以根据期望的特性(例如，长度、柔性、氨基酸组成等)进行选择并且为本领域技术人员所知。

一般而言，细胞膜栓系结构域被定向，使得分泌的效应分子和蛋白酶切割位点在插入细胞膜中或与细胞膜相连后暴露在细胞外，从而蛋白酶切割位点能够被其相应蛋白酶切割并将效应分子释放(“分泌”)到细胞外间隙。

降解决定子系统和结构域

在一些实施方案中，本文所述的任何蛋白质可以包含降解决定子结构域，包括但不限于细胞因子、CAR、蛋白酶、转录因子、启动子或启动子系统的成分(例如，ACP)和/或本文所述的任何膜可切割嵌合蛋白。一般而言，降解决定子结构域可以是能够指导受调节的降解(诸如通过泛素介导的途径的受调节的降解)的任何氨基酸序列基序。在存在免疫调节药物(IMiD)的情况下，降解决定子结构域指导泛素介导的降解决定子-融合蛋白的降解。

降解决定子结构域可以是能够对免疫调节药物(IMiD)作出应答而结合羟脑苷脂(CRBN)的CRBN多肽底物结构域，包括但不限于能够药物诱导型结合CRBN的IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787和ZN827或其片段。CRBN多肽底物结构域可以是天然CRBN多肽序列的嵌合融合产物，诸如具有FNVLMVHKRSHTGERPLQCEICGFTCRQKGNLLRHIKLH TGEKPFKCHLCNYACQRRDAL(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列的IKZF3/ZFP91/IKZF3嵌合融合产物。降解决定子结构域，特别是CRBN降解决定子系统，在国际申请公开号WO2019/089592Al中有更详细的描述，该申请以引用方式并入本文以用于所有目的。降解决定子结构域的其他实例包括但不限于HCV NS4降解决定子、PEST(人IκBα的残基277-307的两个拷贝；SEQ ID NO:161)、GRR(人p105的残基352-408；SEQID NO:162)、DRR(酵母Cdc34的残基210-295；SEQ ID NO:163)、SNS(SP2和NB的串联重复序列(甲型流感病毒或乙型流感病毒的SP2-NB-SP2；例如SEQ ID NO:164)、RPB(酵母RPB的残基1688-1702的四个拷贝；SEQ ID NO:165)、SPmix(SP1和SP2的串联重复序列(甲型流感病毒M2蛋白的SP2-SP1-SP2-SP1-SP2；SEQ ID NO:166)、NS2(甲型流感病毒NS蛋白的残基79-93的三个拷贝；SEQ ID NO:167)、ODC(鸟氨酸脱羧酶的残基106-142；SEQ ID NO:168)、Nek2A、小鼠ODC(残基422–461；SEQ ID NO:169)、小鼠ODC_DA(包含D433A和D434A点突变的mODC的残基422-461)、APC/C降解决定子、COP1 E3连接酶结合降解决定子基序、CRL4-Cdt2结合PIP降解决定子、肌动丝蛋白结合降解决定子、KEAP1结合降解决定子、KLHL2和KLHL3结合降解决定子、MDM2结合基序、N-降解决定子、低氧信号传导中的羟脯氨酸修饰、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、SCF泛素连接酶结合磷酸化降解决定子、植物激素依赖性SCF-LRR结合降解决定子、DSGxxS磷酸化依赖性降解决定子、Siah结合基序、SPOP SBC对接基序或PCNA结合PIP盒。

受调节的降解可以是药物诱导型的。能够介导/调节降解的药物可以是小分子化合物。能够介导/调节降解的药物可以包含“免疫调节药物”(IMiD)。一般而言，如本文所用，IMiD是指一类含有酰亚胺基团的小分子免疫调节药物。羟脑苷脂(CRBN)是已知的IMiD靶标，并且IMiD与CRBN或CRBN多肽底物结构域的结合改变了CRBN E3泛素连接酶复合物的底物特异性，导致具有CRBN多肽底物结构域的蛋白质(例如，本文所述的任何可分泌效应分子或其他感兴趣的蛋白)降解。对于具有CRBN多肽底物结构域的降解决定子结构域，含酰亚胺的IMiD的实例包括但不限于沙利度胺、来那度胺或泊马度胺。IMiD可以是经FDA批准的药物。

本文所述的蛋白可以包含降解决定子结构域(例如，在本文所述膜可切割嵌合蛋白的式S-C-MT-D或D-MT-C-S中称为“D”)。在不存在IMiD的情况下，不会发生降解决定子/泛素介导的嵌合蛋白的降解。在嵌合蛋白表达并定位于细胞膜后，蛋白酶切割位点指导嵌合蛋白的切割，使得将效应分子释放(“分泌”)到细胞外间隙。在存在免疫调节药物(IMiD)的情况下，降解决定子结构域指导泛素介导的嵌合蛋白的降解，使得减少或消除效应分子的分泌。通常，对于融合到降解决定子结构域的膜可切割嵌合蛋白，降解决定子结构域是末端细胞质定向结构域，特别是相对于细胞膜栓系结构域，例如式S-C-MT-D中的最C末端结构域或式D-MT-C-S中的最N末端结构域。降解决定子结构域可以通过多肽接头，即，通常不被视为是细胞膜栓系结构域或降解决定子结构域的一部分的多肽序列被连接至细胞膜栓系结构域。多肽接头可以是连接第一多肽序列和第二多肽序列的任何氨基酸序列。多肽接头可以是柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽接头的实例包括但不限于GSG接头(例如，[GS]₄GG[SEQ ID NO:182])、A(EAAAK)₃A(SEQ ID NO:183)和Whitlow接头(例如，“KEGS”接头诸如氨基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:184)、eGK接头诸如氨基酸序列EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:185)、LR1接头诸如氨基酸序列SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:215)以及所公布的美国专利第5,990,275号中更详细描述的接头，该专利以引用方式并入本文)。另外的多肽接头包含SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197。其他多肽接头可以根据期望的特性(例如，长度、柔性、氨基酸组成等)进行选择并且为本领域技术人员所知。一般而言，降解决定子相对于细胞膜栓系结构域定向，使得降解决定子在定位于细胞膜后暴露于细胞质，使得降解决定子结构域能够介导降解(例如，暴露于细胞质和细胞质)并且能够介导泛素介导的降解。

对于降解决定子-融合蛋白，降解决定子结构域可以是感兴趣的蛋白(例如，效应分子)的N末端或C末端。降解决定子结构域可以通过多肽接头(即，通常不被认为是感兴趣的蛋白或降解决定子结构域的一部分的多肽序列)连接到感兴趣的蛋白。多肽接头可以是连接第一多肽序列和第二多肽序列的任何氨基酸序列。多肽接头可以是柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。多肽接头的实例包括但不限于GSG接头(例如，[GS]₄GG[SEQ ID NO:182])、A(EAAAK)₃A(SEQ ID NO:183)和Whitlow接头(例如，“KEGS”接头诸如氨基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:184)、eGK接头诸如氨基酸序列EGKSSGSGSESKST(SEQ IDNO:185)、LR1接头诸如氨基酸序列SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:215)以及所公布的美国专利第5,990,275号中更详细描述的接头，该专利通过引用方式并入本文)。另外的多肽接头包含SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197。其他多肽接头可以根据期望的特性(例如，长度、柔性、氨基酸组成等)进行选择并且为本领域技术人员所知。多肽接头可以是可切割的，例如本文所述的任何蛋白酶切割位点。

经工程化的核酸

本文提供了编码本公开的至少一种蛋白质的经工程化的核酸(例如，表达盒)，所述蛋白质例如细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白。本文提供了编码两种或更多种蛋白质的经工程化的核酸(例如，表达盒)，所述蛋白质例如细胞因子、CAR、ACP中的两种或更多种和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白。

在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和外源性多核苷酸序列的表达盒，所述外源性多核苷酸序列编码细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白，从N末端到C末端取向，具有下式：S-C-MT或MT-C-S。S是指可分泌效应分子。C是指蛋白酶切割位点。MT是指细胞膜栓系结构域。启动子可操作地连接至外源性多核苷酸序列并且S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和编码细胞因子的外源性多核苷酸序列的表达盒。在本文描述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和编码CAR的外源性多核苷酸序列的表达盒。在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码表达盒，该表达盒包含启动子和编码膜可切割嵌合蛋白的外源性多核苷酸序列，该膜可切割嵌合蛋白具有感兴趣的蛋白(例如，本文所述的任何效应分子)。启动子可操作地连接至外源性多核苷酸序列并且膜可切割嵌合蛋白被配置为表达为单一多肽。

在本文描述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和外源性多核苷酸序列的表达盒，所述外源性多核苷酸序列编码本文描述的细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白的组合。在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和编码细胞因子和CAR的外源性多核苷酸序列的表达盒。在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码含有启动子和编码细胞因子和ACP的外源性多核苷酸序列的表达盒。

在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码两个或更多个表达盒，每个表达盒含有启动子和编码细胞因子、CAR、ACP和/或本文所述的膜可切割嵌合蛋白的外源性多核苷酸序列。在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码两个或更多个表达盒，每个表达盒包含启动子，并且每个表达盒分别单独地编码编码细胞因子和CAR的外源性多核苷酸序列。在本文所述的某些实施方案中，经工程化的核酸编码两个或更多个表达盒，每个表达盒含有启动子，并且每个表达盒分别单独地编码编码细胞因子和ACP的外源性多核苷酸序列。在某些实施方案中，两个或更多个表达盒以头对尾的方向性定向。在某些实施方案中，两个或更多个表达盒以头对头的方向性定向。在某些实施方案中，两个或更多个表达盒以尾对尾的方向性定向。在一些情况下，每个表达盒包含其自身的启动子，以驱动编码细胞因子和/或CAR的多核苷酸序列的表达。在某些实施方案中，细胞因子和CAR被组织如下:5’-细胞因子-CAR-3’或5’-CAR-细胞因子-3’。

“经工程化的核酸”是自然界中不存在的核酸。然而，应当理解，虽然经工程化的核酸作为一个整体不是天然存在的，但它可以包含自然界中存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，经工程化的核酸包含来自不同生物体(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，经工程化的核酸包含鼠类核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“经工程化的核酸”包含重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过连接核酸分子来构建并且在一些实施方案中可以在活细胞中复制的分子。“合成核酸”是指扩增的或化学合成的或通过其他方式合成的分子。合成核酸包含那些经过化学修饰或其他方式修饰，但可以与天然存在的核酸分子进行碱基配对的核酸。修饰包括但不限于一个或多个修饰的核苷酸间键和非天然核酸。修饰更详细描述于美国专利第6,673,611号和美国申请公开2004/0019001中，这些文献中的每一个通过引用以其整体并入。经修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键。非天然核酸可以是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO或“吗啉代”)和苏糖核酸(TNA)。非天然核酸进一步详细描述于国际申请WO 1998/039352、美国申请公开第2013/0156849号和美国专利第6,670,461号；第5,539,082号；第5,185,444号中，所述文献中的每一个通过引用以其整体在此并入。重组核酸和合成核酸也包含由前述任一者复制产生的那些分子。本公开的经工程化的核酸可以由单个分子(例如，包含在同一质粒或其他载体中)或由多个不同的分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。经工程化的核酸可以是分离的核酸。分离的核酸包括但不限于cDNA多核苷酸、RNA多核苷酸、RNAi寡核苷酸(例如，siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、shRNA等)、mRNA多核苷酸、环状质粒、线性DNA片段、载体、微环、ssDNA、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及寡核苷酸。

可以使用标准分子生物学方法产生本公开的经工程化的核酸(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，使用GIBSON克隆产生经工程化的核酸构建体(参见例如，Gibson,D.G.等人《自然方法(Nature Methods)》,343-345,2009；以及Gibson,D.G.等人《自然方法》,901-903,2010，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文)。GIBSON/>通常在单管反应中使用三种酶促活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶的Y延伸活性和DNA连接酶促活性。5'核酸外切酶促活性回切5'端序列并暴露互补序列以用于退火。然后聚合酶促活性填补退火区域上的空位。随后DNA连接酶封闭切口并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的序列长得多，因此获得更高百分比的正确组装。在一些实施方案中，使用IN-/>克隆(Clontech)产生经工程化的核酸构建体。

启动子

通常，在本文所述的所有实施方案中，编码本文蛋白质(例如，本文所述的细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白)的经工程化的核酸编码含有启动子和编码蛋白质的外源性多核苷酸序列的表达盒。在一些实施方案中，经工程化的核酸(例如，包含表达盒的经工程化的核酸)包含可操作地连接至编码至少2种不同蛋白质的核苷酸序列(例如，外源性多核苷酸序列)的启动子。例如，经工程化的核酸可以包含可操作地连接至编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种不同蛋白质的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，经工程化的核酸包含可操作地连接至编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同蛋白质的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，经工程化的核酸(例如，包含表达盒的经工程化的核酸)包含可操作地连接至编码至少2种细胞因子的核苷酸序列(例如，外源性多核苷酸序列)的启动子。例如，经工程化的核酸可以包含可操作地连接至编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种细胞因子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，经工程化的核酸包含可操作地连接至编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种细胞因子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，经工程化的核酸(例如，包含表达盒的经工程化的核酸)包含可操作地连接至编码至少2种膜可切割嵌合蛋白的核苷酸序列(例如，外源性多核苷酸序列)的启动子。例如，经工程化的核酸可以包含可操作地连接至编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种膜可切割嵌合蛋白的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，经工程化的核酸包含可操作地连接至编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种膜可切割嵌合蛋白的核苷酸序列的启动子。

“启动子”是指核酸序列的控制区，在该控制区，核酸序列剩余部分的转录起始和速率受到控制。启动子还可以含有调节蛋白和分子可以结合的亚区，如RNA聚合酶和其他转录因子。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或它们的任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。在本文中，当启动子相对于其调节以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达的核酸序列处于正确的功能位置和取向时，该启动子被认为是“可操作地连接的”。

启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码片段上游的5'非编码序列来获得。这种启动子可以称为“内源性的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，所述启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列缔合的启动子。此类启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，例如通过本领域已知的遗传工程方法来包含改变表达的不同转录调节区的不同元件和/或突变的启动子或增强子。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见例如，美国专利第4,683,202号和美国专利第5,928,906号)。

经工程化的核酸的启动子可以是“诱导型启动子”，其是指以在存在信号、受信号影响或被信号接触时调节(例如，引发或激活)转录活性为特征的启动子。信号可以是内源性的或正常的外源性条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质(例如，细胞因子)，其以一定方式与诱导型启动子接触，由此活跃调节诱导型启动子的转录活性。转录的激活可牵涉直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏因子灭活来间接作用于启动子。相反，转录失活可牵涉直接作用于启动子以阻止转录或通过激活然后作用于启动子的阻遏因子间接作用于启动子。

启动子对局部肿瘤状态(例如，炎症或缺氧)或信号“有应答”或“受其调节”，这是如果在该状态或信号的存在下，从启动子的转录被激活、失活、增加或减少时。在一些实施方案中，启动子包含应答元件。“应答元件”是启动子区域内结合特定分子(例如，转录因子)的一段短DNA序列，该序列调节(调控)从启动子的基因表达。根据本公开可使用的应答元件包括但不限于根皮素可调节控制元件(PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ激活序列(GAS)(Decker,T.等人《干扰素与细胞因子研究杂志(JInterferon Cytokine Res)》.1997年3月；17(3):121-34，其通过引用并入)、干扰素刺激应答元件(ISRE)(Han,K.J.等人《生物化学杂志(J Biol Chem)》2004年4月9日；279(15):15652-61，其通过引用并入)、NF-κB应答元件(Wang,V.等人《细胞报告(Cell Reports.)》2012；2(4):824-839，其通过引用并入)以及STAT3应答元件(Zhang,D.等人《生物化学杂志》1996；271:9503-9509，其通过引用并入)。其他应答元件涵盖在本文中。应答元件还可以含有串联重复序列(例如，编码应答元件的相同核苷酸序列的连续重复序列)以通常增加应答元件对其同源结合分子的敏感性。串联重复序列可以被标记为2X、3X、4X、5X等以表示所存在的重复序列的数量。

应答启动子(也称为“诱导型启动子”)(例如，TGF-β应答启动子)的非限制性实例列于表5A中，该表示出了启动子和转录因子的设计，以及示出了诱导物分子对转录因子(TF)和转基因转录(T)的影响(B，结合；D，解离；n.d.，未确定)(A，激活；DA，失活；DR，去阻遏)(参见Horner,M.和Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m，以及其中引用的参考文献)。诱导型启动子的组分的非限制性实例包括表5B中呈现的那些。

表5A.应答启动子的实例

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表5B.诱导型启动子的示例性组分

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启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子(参见表5C)。

表5C.示例性的组成型启动子

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启动子可以是组织特异性启动子。一般而言，组织特异性启动子指导核酸的转录(例如，编码本文蛋白质的经工程化的核酸(例如，本文所述的细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白)，使得表达限于特定细胞类型、细胞器或组织。组织特异性启动子包括但不限于白蛋白(肝脏特异性，Pinkert等人，(1987))，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988)，T细胞受体的特定启动子(Winoto和Baltimore，(1989))和免疫球蛋白；Banerji等人(1983)；Queen和Baltimore，1983)，神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989)，胰腺特异性启动子(Edlund等人，(1985))或乳腺特异性启动子(乳乳清启动子，美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开号264,166)以及发育调节的启动子，如鼠hox启动子Kessel和Gruss,Science 249:374-379(1990))或甲胎蛋白启动子Campes和Tilghman,Genes Dev.3:537-546(1989))，其中每篇文献的内容全部通过引用并入本文。启动子在相应的特定细胞类型、细胞器或组织中可以是组成型的。组织特异性启动子和/或调节元件还可以包含对结肠上皮细胞具有特异性的来自肝型脂肪酸结合(FAB)蛋白基因的启动子；对胰腺细胞具有特异性的胰岛素基因；对肝细胞具有特异性的转甲状腺素蛋白(transphyretin)、α1-抗胰蛋白酶、1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-I)、载脂蛋白AI和LDL受体基因；对少突胶质细胞具有特异性的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因；对胶质细胞具有特异性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因；专门靶向眼睛的OPSIN；以及对神经细胞具有特异性的神经特异性烯醇酶(NSE)启动子。组织特异性启动子的实例包括但不限于用于指导肌肉和心脏组织中的表达的肌酸激酶启动子以及用于B细胞中的表达的免疫球蛋白重链或轻链启动子。其他组织特异性启动子包含人平滑肌α-肌动蛋白启动子。肝脏的示例性组织特异性表达元件包括但不限于HMG-COA还原酶启动子、固醇调节元件1、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子、人C反应蛋白(CRP)启动子、人葡萄糖激酶启动子、胆固醇L 7-α羟化酶(CYP-7)启动子、β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸转移酶启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-I)启动子、醛缩酶B启动子、人转铁蛋白启动子和I型胶原启动子。前列腺的示例性组织特异性表达元件包括但不限于前列腺酸性磷酸酶(PAP)启动子、前列腺分泌蛋白94(PSP 94)启动子、前列腺特异性抗原复合物启动子和人腺体激肽释放酶基因启动子(hgt-1)。胃组织的示例性组织特异性表达元件包括但不限于人H+/K+-ATP酶α亚基启动子。胰腺的示例性组织特异性表达元件包括但不限于胰腺炎相关蛋白启动子(PAP)、弹性蛋白酶1转录增强子、胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强子启动子和胰胆固醇酯酶基因启动子。子宫内膜的示例性组织特异性表达元件包括但不限于子宫珠蛋白启动子。肾上腺细胞的示例性组织特异性表达元件包括但不限于胆固醇侧链切割(SCC)启动子。一般神经系统的示例性组织特异性表达元件包括但不限于γ-烯醇酶(神经元特异性烯醇酶，NSE)启动子。脑的示例性组织特异性表达元件包括但不限于神经丝重链(NF-H)启动子。淋巴细胞的示例性组织特异性表达元件包括但不限于人CGL-1/颗粒酶B启动子、末端脱氧转移酶(TdT)、λ5、VpreB和lck(淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶p561ck)启动子、人CD2启动子及其3’转录增强子，以及人NK和T细胞特异性激活(NKG5)启动子。结肠的示例性组织特异性表达元件包括但不限于pp60c-src酪氨酸激酶启动子、器官特异性新抗原(OSN)启动子和结肠特异性抗原-P启动子。乳腺细胞的组织特异性表达元件例如但不限于人α-乳白蛋白启动子。肺的示例性组织特异性表达元件包括但不限于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因启动子。

在一些实施方案中，本公开的启动子受肿瘤微环境内的信号调节。如果在存在肿瘤微环境的情况下，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低至少10％，则认为肿瘤微环境调节启动子。在一些实施方案中，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20％-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。

在一些实施方案中，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，相对于不存在肿瘤微环境时启动子的活性，启动子的活性增加或降低2至10倍、2至20倍、2至30倍、2至40倍、2至50倍、2至60倍、2至70倍、2至80倍、2至90倍或2至100倍。

在一些实施方案中，本公开的启动子在低氧条件下激活。“低氧条件”是身体或身体的一个区域在组织水平上缺乏足够的氧气供应的条件。低氧条件可以导致炎症(例如，炎性细胞因子水平在低氧条件下增加)。在一些实施方案中，在低氧条件下激活的启动子可操作地连接至编码蛋白的核苷酸，所述蛋白降低炎性细胞因子活性的表达，从而减少由低氧条件引起的炎症。在一些实施方案中，在低氧条件下激活的启动子包含低氧应答元件(HRE)。“低氧应答元件(HRE)”是对低氧诱导因子(HIF)作出应答的应答元件。在一些实施方案中，HRE包含共有基序NCGTG(其中N是A或G)。

有条件激活控制多肽(ACP)启动子系统

在一些实施方案中，合成启动子是包含有条件激活控制多肽(ACP)结合结构域序列和启动子序列的启动子系统。这种系统在本文中也称为“ACP应答启动子”。一般而言，ACP启动子系统包括编码有条件激活控制多肽(ACP)的第一表达盒和编码可操作地连接至外源性多核苷酸序列的ACP应答启动子的第二表达盒，该外源性多核苷酸序列诸如为编码本文所述的细胞因子，包括细胞因子的膜可切割嵌合蛋白版本或任何其他感兴趣的蛋白(例如，蛋白酶或CAR)的外源性多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒各自由单独的经工程化的核酸编码。在其他实施方案中，第一表达盒和第二表达盒由相同的经工程化的核酸编码。ACP应答启动子可以可操作地连接至编码单一感兴趣的蛋白或多种感兴趣的蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，合成启动子包含AATTAACGGGTTTCGTAACAATCGCATGAGGATTCGCAACGCCTTTGAAGCAGTCGACGCCGAAGTCCCGTCTCAGTAAAGGTTGAAGCAGTCGACGCCGAAGAATCGGACTGCCTTCGTATGAAGCAGTCGACGCCGAAGGTATCAGTCGCCTCGGAATGAAGCAGTCGACGCCGAAGATTCGTAAGAGGCTCACTCTCCCTTACACGGAGTGGATAACTAGTTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCAACGCGTACCGGTGTC(SEQ ID NO:298)的核酸序列。在一些实施方案中，合成启动子包含与SEQID NO:298至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，合成启动子包含CGGGTTTCGTAACAATCGCATGAGGATTCGCAACGCCTTCGGCGTAGCCGATGTCGCGCTCCCGTCTCAGTAAAGGTCGGCGTAGCCGATGTCGCGCAATCGGACTGCCTTCGTACGGCGTAGCCGATGTCGCGCGTATCAGTCGCCTCGGAACGGCGTAGCCGATGTCGCGCATTCGTAAGAGGCTCACTCTCCCTTACACGGAGTGGATAACTAGTTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCA(SEQ ID NO:299)的核酸序列。在一些实施方案中，合成启动子包含与SEQ ID NO:299至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

ACP启动子系统的启动子(例如，驱动ACP表达的启动子或ACP应答启动子的启动子序列)可以包含本文所述的任何启动子序列(参见上文“启动子”)。ACP应答启动子可以衍生自minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合体、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、minCMV、YB_TATA、minTK、诱导物分子应答启动子以及它们的串联重复序列。在一些实施方案中，ACP应答启动子包含最小启动子。

在一些实施方案中，ACP结合结构域包含一个或多个锌指结合位点。在一些实施方案中，ACP应答启动子包含最小启动子并且ACP结合结构域包含一个或多个锌指结合位点。ACP结合结构域可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个锌指结合位点。在一些实施方案中，转录因子是含锌指的转录因子。在一些实施方案中，含锌指的转录因子是合成转录因子。在一些实施方案中，ACP结合结构域包含一个或多个锌指结合位点并且ACP具有DNA结合锌指蛋白结构域(ZF蛋白结构域)。在一些实施方案中，ACP具有DNA结合锌指蛋白结构域(ZF蛋白结构域)和效应结构域。在一些实施方案中，ACP结合结构域包含一个或多个锌指结合位点并且ACP具有DNA结合锌指蛋白结构域(ZF蛋白结构域)和效应结构域。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且由锌指阵列(ZFA)构成。锌指阵列包含多个连接在一起的锌指蛋白基序。每个锌指基序结合于不同核酸基序。这产生对任何期望核酸序列具有特异性的ZFA，例如对具有特定锌指结合位点组成和/或构型的ACP结合结构域具有期望特异性的ZFA。ZF基序可以彼此直接相邻，或者由柔性接头序列分开。在一些实施方案中，ZFA是串联排列的ZF基序的阵列、串或链。ZFA可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个锌指基序。ZFA可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10或5-15个锌指基序。ZF蛋白结构域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个ZFA。ZF结构域可以具有1-10、1-15、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10或5-15个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含一至十个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少一个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少两个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少三个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少四个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少五个ZFA。在一些实施方案中，ZF蛋白结构域包含至少十个ZFA。

在一些实施方案中，DNA结合结构域包含四环素(或其衍生物)阻遏因子(TetR)结构域。

ACP还可以进一步包含效应结构域，诸如转录效应子结构域。例如，转录效应子结构域可以是转录因子的效应结构域或激活结构域。转录因子激活结构域也称为反式激活结构域，并充当蛋白质的支架结构域，诸如用于激活或阻遏基因的转录的转录共调节因子。可以在ACP中使用任何合适的转录效应子结构域，包括但不限于单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；由VP16的四个串联拷贝组成的激活结构域，即VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域的三联激活因子，该三联激活因子称为VPR激活结构域；人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域，称为p300 HAT核心激活结构域；Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛状相关碱性螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序，该基序称为WRPW阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；以及HP1α染色体阴影阻遏结构域或它们的任何组合。

在一些实施方案中，效应结构域是选自以下的转录效应子结构域：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；由VP16的四个串联拷贝组成的激活结构域，即VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域的三联激活因子，该三联激活因子称为VPR激活结构域；人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域，称为p300 HAT核心激活结构域；Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛状相关碱性螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序，该基序称为WRPW阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；以及HP1α染色体阴影阻遏结构域。

在一些实施方案中，ACP是小分子(例如，药物)诱导型多肽。例如，在一些实施方案中，ACP可以由四环素(或其衍生物)诱导，并且包含TetR结构域和VP16效应结构域。在一些实施方案中，ACP包括雌激素受体变体，诸如ERT2，并且可以通过他莫昔芬控制的核定位，而由他莫昔芬或其代谢物(诸如4-羟基-他莫昔芬[4-OHT]、N-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-N-氧化物或因多昔芬)调节。在一些实施方案中，ACP包含核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，NLS包含MPKKKRKV(SEQ ID NO:296)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:296的示例性核酸序列是ATGCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTT(SEQ ID NO:297)或ATGCCCAAGAAAAAGCGGAAGGTG(SEQ IDNO:340)。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:296的核酸序列可以包含SEQ ID NO:297或SEQ ID NO:340，或包含与SEQ ID NO:297或SEQ ID NO:340至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在一些实施方案中，ACP是小分子(例如，药物)诱导型多肽，其包含阻遏型蛋白酶和阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点。在一些实施方案中，阻遏型蛋白酶在不存在特定试剂的情况下有活性(切割同源切割位点)，而在存在特定试剂的情况下无活性(不切割同源切割位点)。在一些实施方案中，特定试剂是蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂特异性地抑制本公开的给定阻遏型蛋白酶。阻遏型蛋白酶可以是能够通过特定试剂的存在或不存在而失活的本文所述的任何蛋白酶(关于示例性阻遏型蛋白酶、同源切割位点和蛋白酶抑制剂，参见上文“蛋白酶切割位点”)。

在一些实施方案中，ACP具有降解决定子结构域(关于示例性降解决定子序列，参见“降解决定子系统和结构域”)。相对于ACP的单独结构域，降解决定子结构域可以处于任何顺序或位置。例如，降解决定子结构域可以是阻遏型蛋白酶的N末端、阻遏型蛋白酶的C末端、ZF蛋白结构域的N末端、ZF蛋白结构域的C末端、效应结构域的N末端或效应结构域的C末端。

本公开的ACP和示例性ACP的组分的示例性序列在表5D中提供。在一些实施方案中，核酸可以包含5D表中的序列，或者与5D表中的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。

表5D.

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多顺反子和多启动子系统

在一些实施方案中，经工程化的核酸(例如，包含表达盒的经工程化的核酸)被配置成产生多种蛋白质(例如，细胞因子、CAR、ACP、膜可切割嵌合蛋白，和/或其组合)。例如，核酸可以被配置成产生2-20种不同蛋白。在一些实施方案中，核酸被配置成产生2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-19、4-18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-20、5-19、5-18、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-20、6-19、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-20、7-19、7-18、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-20、8-19、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-20、9-19、9-18、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-20、11-19、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-20、14-19、14-18、14-17、14-16、14-15、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-20、16-19、16-18、16-17、17-20、17-19、17-18、18-20、18-19或19-20种蛋白。在一些实施方案中，核酸被配置成产生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种蛋白。

在一些实施方案中，经工程化的核酸可以是多顺反子的，即，可以从单个mRNA转录物产生多于一种的单独的多肽(例如，多种蛋白质，例如本文所述的细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白)。通过使用各种接头，经工程化的核酸可以是多顺反子的，例如编码第一蛋白的多核苷酸序列可以连接至编码第二蛋白的核苷酸序列，如呈第一基因:接头:第二基因5'至3'取向。接头可以编码2A核糖体跳跃元件，如T2A。其他2A核糖体跳跃元件包括但不限于E2A、P2A和F2A。2A核糖体跳跃元件允许在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码可切割接头多肽序列，如弗林蛋白酶切割位点或TEV切割位点，其中在表达后可切割接头多肽被切割，从而产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。可切割的接头可以包含进一步促进切割的多肽序列，如这种柔性接头(例如，Gly-Ser-Gly序列)。在一些实施方案中，本文公开的经工程化的核酸包含E2A/T2A核糖体跳跃元件。在某些实施方案中，E2A/T2A核糖体跳跃元件包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:281)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:281的示例性核酸是GGTAGCGGCCAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:282)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:281的核酸包含与SEQ ID NO:282至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文公开的经工程化的核酸包含E2A/T2A核糖体跳跃元件。在某些实施方案中，E2A/T2A核糖体跳跃元件包含QCTNYALLKLAGDVESNPGPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ IDNO:283)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:283的示例性核酸是CAGTGTACCAACTACGCCCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAATCTAATCCTGGACCTGGATCTGGCGAGGGACGCGGGAGTCTACTGACGTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:284)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:283的核酸包含与SEQ ID NO:284至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

接头可以编码内部核糖体进入位点(IRES)，使得在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的单独多肽。接头可以编码剪接受体，如病毒剪接受体。

接头可以是接头的组合，诸如弗林蛋白酶-2A接头，其可以通过2A核糖体跳跃，然后进一步切割弗林蛋白酶位点以允许完全去除2A残基来产生单独的多肽。在一些实施方案中，接头的组合可以包含弗林蛋白酶序列、柔性接头和2A接头。因此，在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些实施方案中，本公开的接头是弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。

一般而言，多顺反子系统可以使用任何数量的接头或接头的组合来表达任何数量的基因或其部分(例如，经工程化的核酸可以编码各自由接头分开的第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白，使得产生由第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白编码的单独的多肽)。

经工程化的核酸可以使用多个启动子由多个ORF来表达基因，即，可以由单一经工程化的核酸产生超过一种单独的mRNA转录物。例如，第一启动子可以可操作地连接至编码第一蛋白的多核苷酸序列，并且第二启动子可以可操作地连接至编码第二蛋白的多核苷酸序列。一般而言，可以使用任何数量的启动子来表达任何数量的蛋白。在一些实施方案中，由多个启动子表达的至少一个ORF可以是多顺反子。

在相同的经工程化的核酸上编码的表达盒可以以任何适于编码的外源性多核苷酸序列表达的方式定向。在相同的经工程化的核酸上编码的表达盒可以以相同的方向定向，即，单独的表达盒的转录以相同的方向进行。以相同方向性定向的构建体可以以头对尾的形式组织，是指第一基因的5’端(头)与上游基因的3’端(尾)相邻。在相同的经工程化的核酸上编码的表达盒可以以相反的方向定向，即，单独的表达盒的转录以相反的方向进行(本文也称为“双向”)。在以相反方向定向的相同的经工程化的核酸上编码的表达盒可以以“头对头”的方向性定向。如本文所用，头对头是指双向构建体的第一基因的5’端(头)与双向构建体的上游基因的5’端(头)相邻。在以相反方向定向的相同的经工程化的核酸上编码的表达盒可以以“尾对尾”的方向性定向。如本文所用，尾对尾是指双向构建体的第一基因的3’端(尾)与双向构建体的上游基因的3’端(尾)相邻。例如，但不限于，图1示意性地描绘了头对头的方向性(图1A)、头对尾的方向性(图1B)和尾对尾的方向性(图1C)的细胞因子-CAR双向构建体。

如本文所用，“接头”可指连接第一多肽序列和第二多肽序列的多肽、上述多顺反子接头或可操作地连接至上述额外ORF的额外启动子。

由表达盒编码的外源性多核苷酸序列可以包括3’非翻译区(UTR)，其包含可操作地连接至外源性多核苷酸序列(例如编码细胞因子(例如IL12或IL12p70)的外源性多核苷酸序列)的mRNA去稳定化元件。在一些实施方案中，mRNA去稳定化元件包含富含AU的元件和/或茎-环去稳定化元件(SLDE)。在一些实施方案中，mRNA去稳定元素包含富含AU的元件。在一些实施方案中，富含AU的元件包括序列ATTTA(SEQ ID NO:209)的至少两个重叠基序。在一些实施方案中，富含AU的元件包含ATTTATTTATTTATTTATTTA(SEQ ID NO:210)。在一些实施方案中，mRNA去稳定化元件包括茎-环去稳定化元件(SLDE)。在一些实施方案中，SLDE包含CTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:211)。在一些实施方案中，mRNA去稳定化元件包含至少一个富含AU的元件和至少一个SLDE。如本文所用的“AuSLIDE”是指可操作地连接至茎-环去稳定化元件(SLDE)的富含AU的元件。示例性的AuSLDE序列包含ATTTATTTATTTATTTATTTA acatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:212)。在一些实施方案中，mRNA去稳定化元件包含2X AuSLIDE。示例性的AuSLDE序列提供为ATTTATTTATTTATTTATTTAacatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAGtgcggtaa gcATTTATTTATTTATTTATTTAacatcggttccCTGTTTAATATTTAAACAG(SEQ ID NO:213)。

在某些实施方案中，本文所述的经工程化的核酸包含绝缘子序列。此类绝缘子序列用于防止构建体的相邻区域之间的不当相互作用。在某些实施方案中，绝缘子序列包含ACAATGGCTGGCCCATAGTAAATGCCGTGTTAG TGTGTTAGTTGCTGTTCTTCCACGTCAGAAGAGGCACAGACAAATTACCACCAGGTGGCGCTCAGAGTCTGCGGAGGCATCACAACAGCCCTGAATTTGAATCCTGCTCTGCCACTGCCTAGTTGAGACCTTTTACTACCTGACTAGCTGAGACATTTACGACATTTACTGGCTCTAGGACTCATTTTATTCATTTCATTACTTTTTTTTTCTTTGAGACGGAATCTCGCTCT(SEQ ID NO:300)的核酸序列。在某些实施方案中，绝缘子序列包含与SEQ ID NO:300至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

工程化的细胞

本文提供了工程化的免疫应答细胞和产生工程化的免疫应答细胞的方法，所述经工程化的免疫应答细胞产生本文所述的蛋白质(例如，本文所述的细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白)。一般而言，本公开的工程化的免疫应答细胞可以被工程化以表达本文提供的蛋白，诸如细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白。这些细胞在本文中被称为“经工程化的细胞”。这些通常含有经工程化的核酸的细胞在自然界中不存在。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以包括包含启动子的核酸，所述启动子可操作地连接至编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白例如细胞因子、CAR、ACP和/或膜可切割嵌合蛋白。经工程化的细胞可以包含整合到细胞基因组中的经工程化的核酸。经工程化的细胞可以包含能够在不整合到细胞基因组中的情况下表达的经工程化的核酸，例如，用瞬时表达系统(如质粒或mRNA)工程化的核酸。

本公开还涵盖蛋白和产生它们的经工程化的细胞之间的相加作用和协同作用。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少两种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)蛋白，例如细胞因子、CAR、ACP和膜可切割嵌合蛋白中的至少每一种。一般而言，对本文提供的免疫应答细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其具有不是由细胞天然产生的细胞因子效应分子、CAR和ACP。一般而言，对本文提供的免疫应答细胞进行工程化以产生至少两种细胞因子，其中至少一种是具有细胞因子效应分子、CAR和ACP的膜可切割嵌合蛋白。这种效应分子可以例如补充细胞天然产生的效应分子的功能。

在一些实施方案中，细胞(例如，免疫细胞)被工程化以产生多种蛋白。例如，细胞可以被工程化以产生2-20种不同的蛋白，诸如2-20种不同的膜可切割嵌合蛋白。在一些实施方案中，对细胞(例如，免疫应答细胞)进行工程化以产生对细胞外源性的至少4种不同蛋白质。在一些实施方案中，对细胞(例如，免疫应答细胞)进行工程化以产生对细胞外源性的4种不同蛋白质。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-19、4-18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-20、5-19、5-18、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-20、6-19、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-20、7-19、7-18、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-20、8-19、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-20、9-19、9-18、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-20、11-19、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-20、14-19、14-18、14-17、14-16、14-15、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-20、16-19、16-18、16-17、17-20、17-19、17-18、18-20、18-19或19-20种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种蛋白。

在一些实施方案中，经工程化的细胞包含一种或多种经工程化的核酸，该一种或多种经工程化的核酸编码可操作地连接至编码蛋白(例如，表达盒)的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以包括多种经工程化的核酸，例如至少两种经工程化的核酸，每种经工程化的核酸编码可操作地连接至编码至少一种(例如，1、2或3种)蛋白的核苷酸序列的启动子。例如，可以对细胞进行工程化以包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种经工程化的核酸，每种经工程化的核酸编码可操作地连接至编码至少一种(例如，1、2或3种)蛋白的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，对细胞进行工程化为包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种经工程化的核酸，每种经工程化的核酸编码可操作地连接至编码至少一种(例如，1、2或3种)蛋白的核苷酸序列的启动子。经工程化的细胞可以包含经工程化的核酸，该经工程化的核酸编码至少一种上述接头，如连接第一多肽序列和第二多肽序列的多肽、一种或多种上述多顺反子接头、一种或多种与额外ORF可操作地连接的额外启动子或其组合。

在一些实施方案中，可以对细胞(例如，免疫细胞)进行工程化以表达蛋白酶。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以表达对于细胞异源的蛋白酶。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以表达对于表达嵌合蛋白的细胞异源的蛋白酶，诸如切割膜可切割嵌合蛋白的蛋白酶切割位点的异源蛋白酶。在一些实施方案中，经工程化的细胞包含一种或多种经工程化的核酸，该一种或多种经工程化的核酸编码可操作地连接至编码蛋白酶(诸如异源蛋白酶)的核苷酸序列的启动子。蛋白酶和蛋白酶切割位点在本文标题为“蛋白酶切割位点”的部分中被更详细地描述。

本文还提供了经工程化的细胞，其被工程化以产生多种蛋白，其中至少两种蛋白包含调节不同肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。在一些实施方案中，至少一种(例如，1、2、3、4、5种或更多种)蛋白包含刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制或抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制的效应分子。在一些实施方案中，至少一种(例如，1、2、3、4、5种或更多种)蛋白包含抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制的效应分子，并且至少一种蛋白(例如，1、2、3、4、5种或更多种)抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。在又其他实施方案中，至少两种(例如，2、3、4、5种或更多种)蛋白是效应分子，效应分子各自刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制。在又其他实施方案中，至少两种(例如，1、2、3、4、5种或更多种)蛋白是效应分子，效应分子各自抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。

在一些实施方案中，对细胞(例如，免疫细胞)进行工程化以产生包含刺激T细胞或NK细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激抗原递呈和/或加工的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激树突细胞分化和/或成熟的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激免疫细胞募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激M1巨噬细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激Th1极化的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激基质降解的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激免疫刺激代谢物产生的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含刺激I型干扰素信号传导的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制负性共刺激信号传导的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制抗肿瘤免疫细胞的促凋亡信号传导(例如，经由TRAIL)的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制调节性T(T_reg)细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制肿瘤检查点分子的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含激活干扰素基因刺激因子(STING)信号传导的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制髓源性抑制细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含降解免疫抑制因子/代谢物的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含抑制血管内皮生长因子信号传导的效应分子的至少一种蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生包含直接杀死肿瘤细胞的效应分子(例如，颗粒酶、穿孔素、溶瘤病毒、溶细胞肽和酶、抗肿瘤抗体，例如其触发ADCC)的至少一种蛋白。

在一些实施方案中，包含效应分子的至少一种蛋白，其刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，刺激抗原呈递和/或加工，刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，刺激树突细胞分化和/或成熟，刺激免疫细胞募集，刺激巨噬细胞信号传导，刺激基质降解，刺激免疫刺激代谢物产生，或刺激I型干扰素信号传导；以及包含效应分子的至少一种蛋白，其抑制负共刺激信号传导，抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导，抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，抑制肿瘤检查点分子，活化干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导，抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集，降解免疫抑制因子/代谢物，抑制血管内皮生长因子信号传导或直接杀死肿瘤细胞。

在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少一种选自IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21的效应分子细胞因子。在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少两种选自IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21的效应分子细胞因子。在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少两种选自IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21的效应分子细胞因子。在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少效应分子细胞因子IL15和IL12p70融合蛋白。在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其包括选自IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21的效应分子细胞因子。在一些实施方案中，对免疫应答细胞进行工程化以产生至少两种膜可切割嵌合蛋白，包括选自IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21的效应分子细胞因子。

在某些实施方案中，IL15包含NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNG NVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQID NO:285)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:285的示例性核酸序列是AATTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGTAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAAAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACCGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAATATCAAAGAGTTCCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACAAGC(SEQ ID NO:286)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:285的核酸包含与SEQ ID NO:286至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在某些实施方案中，IL12p70包含MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWE LKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:293)的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:293的示例性核酸序列是ATGTGTCACCAGCAGCTGGTCATCAGCTGGTTCAGCCTGGTGTTCCTGGCCTCTCCTCTGGTGGCCATCTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTGGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCTGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGATACCCCTGAAGAGGACGGCATCACCTGGACACTGGATCAGTCTAGCGAGGTGCTCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCCAAGTGAAAGAGTTTGGCGACGCCGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGCGGAGAAGTGCTGAGCCACAGCCTGCTGCTGCTCCACAAGAAAGAGGATGGCATTTGGAGCACCGACATCCTGAAGGACCAGAAAGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGCGAGGCCAAGAACTACAGCGGCCGGTTCACATGTTGGTGGCTGACCACCATCAGCACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCCAGCAGAGGCAGCAGTGATCCTCAGGGCGTTACATGTGGCGCCGCTACACTGTCTGCCGAAAGAGTGCGGGGCGACAACAAAGAATACGAGTACAGCGTGGAATGCCAAGAGGACAGCGCCTGTCCAGCCGCCGAAGAGTCTCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCTCCAAAGAACCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAGAACAGCAGACAGGTGGAAGTGTCCTGGGAGTACCCCGACACCTGGTCTACACCCCACAGCTACTTCAGCCTGACCTTTTGCGTGCAAGTGCAGGGCAAGTCCAAGCGCGAGAAAAAGGACCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGCGCCACCGTGATCTGCAGAAAGAACGCCAGCATCAGCGTCAGAGCCCAGGACCGGTACTACAGCAGCTCTTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCATGTTCTGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGATCAGGTGGTGGATCTGGCGGCGGATCTAGAAACCTGCCTGTGGCCACTCCTGATCCTGGCATGTTCCCTTGTCTGCACCACAGCCAGAACCTGCTGAGAGCCGTGTCCAACATGCTGCAGAAGGCCAGACAGACCCTGGAATTCTACCCCTGCACCAGCGAGGAAATCGACCACGAGGACATCACCAAGGATAAGACCAGCACCGTGGAAGCCTGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAACGAGAGCTGCCTGAACAGCCGGGAAACCAGCTTCATCACCAACGGCTCTTGCCTGGCCAGCAGAAAGACCTCCTTCATGATGGCCCTGTGCCTGAGCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAATTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAACAGCGAGACAGTGCCCCAGAAGTCTAGCCTGGAAGAACCCGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACAGAGTGATGAGCTACCTGAACGCCTCT(SEQ ID NO:294)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:293的核酸包含与SEQ ID NO:294至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

通常，对细胞(例如，免疫细胞或干细胞)进行工程化以产生两种或更多种细胞因子，包括至少一种细胞因子为膜可切割嵌合蛋白形式(例如，式S-C-MT or MT-C-S中的“S”)。

在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL15、IL12、IL12p70融合蛋白、IL18或IL21。

在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL-15。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的细胞分子。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生IL12、IL12p70融合蛋白、IL18或IL21。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生IL-12。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生IL12p70融合蛋白。

在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白，包括IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL-15，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白，包括IL12p70。

在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL12p70。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的细胞因子。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生IL15、IL18或IL21。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生IL15。

在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白，包括IL15、IL18和IL21。在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生至少一种膜可切割嵌合蛋白，其中可分泌效应分子(例如，式S-C-MT或MT-C-S中的“S”)是IL12p70，并且进一步对细胞进行工程化以产生一种或多种额外的膜可切割嵌合蛋白，包括IL15。

还可以进一步对细胞进行工程化以表达除了本文所述的细胞因子和/或具有式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白之外的额外的蛋白。如本文所提供的，对免疫应答细胞进行工程化以表达结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)。还如本文所提供的，对免疫应答细胞进行工程化以表达包括合成转录因子的ACP。

CAR可以包括抗原结合结构域，例如抗体、抗体的抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。抗原识别受体可以包括scFv。scFv可以包括可由肽接头分开的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。例如，scFv可以包括结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH是重链可变结构域，L是肽接头，并且VL是轻链可变结构域。在某些实施方案中，肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在某些实施方案中，肽接头是包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:223)的序列的(GGGGS)3接头。编码SEQ ID NO:223的示例性核酸序列是GGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCT(SEQ ID NO:224)或GGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGAT CCGGTGGTGGTGGATCT(SEQ ID NO:332)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:223的核酸包含与SEQ ID NO:224或SEQ ID NO:332至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

CAR可以具有一个或多个细胞内信号传导结构域，例如a CD3ζ链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域、MyD88细胞内信号传导结构域、2B4细胞内信号传导结构域、CD16a细胞内信号传导结构域、DNAM-1细胞内信号传导结构域、KIR2DS1细胞内信号传导结构域、KIR3DS1细胞内信号传导结构域、NKp44细胞内信号传导结构域、NKp46细胞内信号传导结构域、FceRlg细胞内信号传导结构域、NKG2D细胞内信号传导结构域、EAT-2细胞内信号传导结构域、其片段、其组合或其片段的组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含来自表6A的序列。

表6A.

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在一些实施方案中，CAR还可以包含将细胞外抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区。间隔区的柔性可能足以允许所述抗原结合域定向在不同的方向上以促进抗原识别。在一些实施方案中，间隔区可以是来自人蛋白质的铰链。例如，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，包括但不限于IgG4铰链、IgG2铰链、CD8a铰链或IgD铰链。在一些实施方案中，间隔区可以包含IgG4铰链、IgG2铰链、IgD铰链、CD28铰链、KIR2DS2铰链、LNGFR铰链或PDGFR-β细胞外接头。在一些实施方案中，间隔区包含来自表6B的序列。

表6B.

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CAR可以具有跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域、BTLA跨膜结构域、OX40跨膜结构域、DAP10跨膜结构域、DAP12跨膜结构域、CD16a跨膜结构域、DNAM-1跨膜结构域、KIR2DS1跨膜结构域、KIR3DS1跨膜结构域、NKp44跨膜结构域、NKp46跨膜结构域、FceRlg跨膜结构域、NKG2D跨膜结构域、其片段、其组合或其片段的组合。CAR可以具有抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区。表6C中提供了示例性的跨膜结构域序列。

表6C.

在一些实施方案中，结合至GPC3的CAR抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包括：具有KNAMN(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)，具有RIRNKTNNYATYYADSVKA(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)，以及具有GNSFAY(SEQ ID NO:201)的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，并且其中VL包括：具有KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)，具有WASSRES(SEQ ID NO:203)的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)和具有QQYYNYPLT(SEQ ID NO:204)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有KNAMN(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有RIRNKTNNYATYYADSVKA(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有GNSFAY(SEQ ID NO:201)的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)。在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有WASSRES(SEQ ID NO:203)的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含具有QQYYNYPLT(SEQ ID NO:204)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。

在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含VH区，所述VH区具有与

EVQLVETGGGMVQPEGSLKLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSQSMLYLQMNNLKIEDTAMYYCVAGNSFA YWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:205)或

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGL EWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAV YYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:206)的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:206的示例性核酸序列是GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGG AGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAAGAACGCCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGGACGGATCCGGAACAAGACCAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGCCAGGTTCACCATCTCCAGAGATGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGTGGCCGGCAATAGCTTTGCCTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTTACAGTTTCTGCT(SEQ ID NO:222)或

GAAGTGCAGCTGGTTGAATCAGGTGGCGGCCTGGTTCAACCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAAGAACGCCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGGACGGATCCGGAACAAGACCAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGCCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGTGGCCGGCAACAGCTTTGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCTGCC(SEQ ID NO:330)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:206的核酸包含与SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:330至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在一些实施方案中，结合至GPC3的抗原结合结构域包含VL区，所述VL区具有与

DIVMSQSPSSLVVSIGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYNYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:207)或

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。编码SEQ ID NO:208的示例性核酸序列是

GACATCGTGATGACACAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAAAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCCAGCTCCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAAGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:221)或

GACATCGTGATGACACAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAAAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCCAGCTCCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAAGCCGAGGACGTGGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:333)或

GACATCGTGATGACACAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAAAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCCAGCTCCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAAGCCGAGGACGTGGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ ID NO:336)。在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:208的核酸包含与SEQ ID NO:221或SEQ ID NO:336至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

一般而言，本文所述的免疫应答细胞的ACP包括合成转录因子。合成转录因子是一种非天然存在的蛋白质，其包括DNA结合结构域和转录效应子结构域，并且能够通过结合至由DNA结合结构域识别的同源启动子来调节(即激活或抑制)转录。在一些实施方案中，ACP是转录阻遏因子。在一些实施方案中，ACP是转录激活因子。

工程化的细胞类型

本文还提供了经工程化的免疫应答细胞。免疫应答细胞可以被工程化以包含本文所述的任何经工程化的核酸(例如，编码本文所述的细胞因子、膜可切割嵌合蛋白和/或CAR的任何经工程化的核酸)。细胞可以被工程化为具有本文所述的任何经工程化的细胞的任何特征。在一个特定方面，本文提供了被工程化以产生两种细胞因子和CAR的细胞，其中细胞因子中的至少一种是具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白。

经工程化的免疫应答细胞包括但不限于：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC衍生细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC衍生细胞。

可以使用本领域技术人员已知的方法对细胞进行工程化以产生本文所述的蛋白。例如，可以转导细胞以对肿瘤进行工程化。在一个实施方案中，使用病毒转导细胞。

在一个具体实施方案中，使用溶瘤病毒转导细胞。溶瘤病毒的实例包括但不限于溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安纳水泡病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制性逆转录病毒、溶瘤弹状病毒、溶瘤塞尼卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。

病毒，包括本文所述的任何溶瘤病毒，可以是编码一种或多种转基因，如本文所述的任何经工程化的核酸的重组病毒，所述一种或多种转基因编码一种或多种蛋白。病毒，包括本文所述的任何溶瘤病毒，可以是编码一种或多种转基因，如本文所述的任何经工程化的核酸的重组病毒，所述一种或多种转基因编码两种或更多种蛋白中的一种或多种。

本文还提供了经工程化的细菌细胞。可以对细菌细胞进行工程化以包含本文所述的任何经工程化的核酸。可以对细菌细胞进行工程化以具有本文所述的任何经工程化的细胞的任何特征。在一个特定方面中，本文提供了被工程化为产生本文所述的两种或更多种蛋白的细菌细胞。可以对细菌细胞进行工程化以产生一种或多种哺乳动物源性蛋白。可以对细菌细胞进行工程化以产生两种或更多种哺乳动物源性蛋白。细菌细胞的实例包括但不限于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、诺氏梭菌Clostridium novyi)、大肠杆菌Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)。

经工程化的细胞可以是人细胞。经工程化的细胞可以是人原代细胞。经工程化的原代细胞可以是肿瘤浸润性原代细胞。经工程化的原代细胞可以是原代T细胞。工程化的原代细胞可以是造血干细胞(HSC)。工程化的原代细胞可以是自然杀伤(NK)细胞。工程化的原代细胞可以是任何体细胞。经工程化的原代细胞可以是MSC。可以对人细胞(例如，免疫细胞)进行工程化以包含本文所述的任何经工程化的核酸。可以对人细胞(例如，免疫细胞)进行工程化以具有本文所述的任何经工程化的细胞的任何特征。在一个特定的方面中，本文提供了被工程化以产生本文所述的一种或多种蛋白的人细胞(例如，免疫细胞)。在一个特定的方面中，本文提供了被工程化以产生本文所述的两种或更多种蛋白的人细胞(例如，免疫细胞)。

经工程化的细胞可以从受试者中分离(自体同源的)，所述受试者如为已知或疑似患有癌症的受试者。细胞分离方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于基于细胞表面标记物表达的分选技术，如FACS分选、阳性分离技术和阴性分离、磁性分离和其组合。

对于接受治疗的受试者而言，经工程化的细胞可以是同种异体的。同种异体修饰的细胞可以与接受治疗的受试者HLA匹配。经工程化的细胞可以是培养的细胞，如离体培养的细胞。经工程化的细胞可以是离体培养的细胞，如从受试者分离的原代细胞。培养的细胞可以与一种或多种细胞因子一起培养。

本文还提供了包含培养本公开的经工程化的细胞的方法。培养本文所述的经工程化的细胞的方法是已知的。本领域技术人员将认识到培养条件将取决于特定的目标经工程化的细胞。本领域技术人员将认识到，培养条件将取决于经工程化的细胞的特定下游用途，例如，用于后续将经工程化的细胞施用于受试者的特定培养条件。

对细胞进行工程改造的方法

本文还提供了用于对免疫应答细胞进行工程化以产生一种或多种感兴趣的蛋白(例如，细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白)的组合物和方法。

一般而言，通过将编码一种或多种感兴趣的蛋白或效应分子(例如，本文所述的嵌合蛋白，包括感兴趣的蛋白或效应分子)的多核苷酸引入(即，递送)到细胞的细胞质和/或细胞核中，对细胞进行工程化以产生感兴趣的蛋白。例如，编码一种或多种嵌合蛋白的多核苷酸可以是编码细胞因子、CAR或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的任何经工程化的核酸。递送方法包括但不限于病毒介导的递送、脂质介导的转染、纳米颗粒递送、电穿孔、超声处理和通过物理手段的细胞膜变形。本领域技术人员将理解，递送方法的选择可以取决于待工程化的特定细胞类型。

病毒介导的递送

基于病毒载体的递送平台可用于对细胞进行工程改造。一般而言，基于病毒载体的递送平台通过引入(即，递送)到宿主细胞中来对细胞进行工程化。例如，基于病毒载体的递送平台可以通过引入本文所述的任何经工程化的核酸(例如，编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的任何外源性多核苷酸序列，和/或本文所述的含有启动子和编码蛋白质的外源性多核苷酸序列的任何表达盒，所述蛋白从N末端到C末端取向)来工程化细胞。基于病毒载体的递送平台可以是核酸，因此，经工程化的核酸也可以涵盖工程化的病毒来源的核酸。此类工程化的病毒来源的核酸也可以称为重组病毒或经工程化的病毒。

基于病毒载体的递送平台可以在同一核酸内编码超过一种经工程化的核酸、基因或转基因。例如，经工程化的病毒来源的核酸(例如，重组病毒或经工程化的病毒)可以编码一种或多种转基因，包括但不限于编码本文所述的一种或多种蛋白的本文所述的任何经工程化的核酸。编码一种或多种嵌合蛋白的一种或多种转基因可以被配置成表达一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白。除了一种或多种转基因(例如，编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的转基因)之外，基于病毒载体的递送平台还可以编码一种或多种基因，如病毒感染性和/或病毒生产所需的病毒基因(例如，衣壳蛋白、包膜蛋白、病毒聚合酶、病毒转录酶等)，称为顺式作用元件或基因。

基于病毒载体的递送平台可包含多于一种病毒载体，诸如编码本文所述的经工程化的核酸、基因或转基因并且称为反式作用元件或基因的单独病毒载体。例如，除了编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的载体之外，基于辅助细胞依赖性病毒载体的递送平台还可以在一种或多种额外的单独载体上提供病毒感染性和/或病毒生产所需的额外基因。一种病毒载体可以递送多于一种的经工程化的核酸，如一种载体递送被配置成产生两种或更多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的经工程化的核酸。多于一种病毒载体可以递送多于一种经工程化的核酸，如多于一种载体递送被配置成产生一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的一种或多种经工程化的核酸。所用病毒载体的数量可以取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装容量，并且本领域技术人员可以选择适当数量的病毒载体。

一般而言，任何基于病毒载体的系统可以用于体外产生分子，诸如本文所述的蛋白、效应分子和/或其他感兴趣的蛋白，或用于体内和离体基因疗法程序，例如用于体内递送编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的经工程化的核酸。选择适当的基于病毒载体的系统将取决于多种因素，诸如货物/有效载荷大小、病毒系统的免疫原性、目标靶细胞、基因表达强度和时间，以及本领域技术人员了解的其他因素。

基于病毒载体的递送平台可以是基于RNA的病毒或基于DNA的病毒。示例性基于病毒载体的递送平台包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒(measles virus)、流感病毒、印第安纳水泡病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、马拉巴病毒、狂犬病毒、轮状病毒、肝炎病毒、风疹病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、麻疹病毒(morbillivirus)、慢病毒、复制型逆转录病毒、弹状病毒、塞尼卡谷病毒、辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。本领域中描述了其他示例性基于病毒载体的递送平台，诸如牛痘病毒、鸡痘病毒、自我复制型甲病毒、马拉巴病毒、腺病毒(参见例如Tatsis等人,Adenoviruses,MolecularTherapy(2004)10,616—629)或慢病毒，包括但不限于第二代、第三代或杂交第二代/第三代慢病毒以及被设计为靶向特定细胞类型或受体的任何代重组慢病毒(参见例如Hu等人,“慢病毒载体对癌症和传染病的免疫(Immunization Delivered by Lentiviral Vectorsfor Cancer and Infectious Diseases)”,《免疫学评论(Immunol Rev.)》(2011)239(1):45-61，Sakuman等人,“慢病毒载体：翻译的基础(Lentiviral vectors:basic totranslational)”,《生物化学期刊(Biochem J.)》(2012)443(3):603-18，Cooper等人,“修复剪接介导的内含子缺失使含有人泛素C促进因子的慢病毒载体中的表达最大化(Rescueof splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectorscontaining the human ubiquitin C promoter)”,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》(2015)43(1):682-690，Zufferey等人,“用于安全高效体内基因递送的自灭活慢病毒载体(Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In vivo GeneDelivery)”,《病毒学杂志(J.Virol.)》(1998)72(12):9873-9880)。

这些序列前面可以有一个或多个靶向亚细胞区室的序列。在引入(即，递送)到宿主细胞中时，感染的细胞(即，经工程化的细胞)可以表达蛋白和/或其他感兴趣的蛋白。可用于免疫方案的牛痘载体和方法描述于例如美国专利号4,722,848中。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等人(Nature 351:456-460(1991))中。根据本文的描述，可用于引入(即，递送)经工程化的核酸的多种其他载体(例如，伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)载体等)对于本领域技术人员将是显而易见的。

基于病毒载体的递送平台可以是靶向细胞的病毒，本文称为溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括但不限于溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒(oncolytic measlesvirus)、溶瘤流感病毒、溶瘤印第安纳水泡病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒(oncolyticmorbillivirus)、溶瘤慢病毒、溶瘤复制性逆转录病毒、溶瘤弹状病毒、溶瘤塞尼卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。本文所述的任何溶瘤病毒可以是重组溶瘤病毒，其包含编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的一种或多种转基因(例如，经工程化的核酸)。编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的转基因可以被配置成表达蛋白和/或其他感兴趣的蛋白。

基于病毒载体的递送平台可以是基于逆转录病毒的。一般而言，逆转录病毒载体由顺式作用的长末端重复序列组成，其包装能力高达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后这些载体用于将一种或多种经工程化的核酸(例如，编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的转基因)整合到靶细胞中以提供永久的转基因表达。基于逆转录病毒的递送系统包括但不限于基于鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及其组合的那些(参见例如，Buchscher等人《病毒学杂志》66:2731-2739(1992)；Johann等人,《病毒学杂志》66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人《病毒学(Virol.)》176:58-59(1990)；Wilson等人,《病毒学杂志》63:2374-2378(1989)；Miller等人,《病毒学杂志》65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。其他逆转录病毒系统包含Phoenix逆转录病毒系统。

基于病毒载体的递送平台可以是基于慢病毒的。一般而言，慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。基于慢病毒的递送平台可以是基于HIV的，诸如ViraPower系统(ThermoFisher)或pLenti系统(Cell Biolabs)。基于慢病毒的递送平台可以是基于SIV或FIV的。其他示例性基于慢病毒的递送平台在美国专利号7,311,907、7,262,049、7,250,299、7,226,780、7,220,578、7,211,247、7,160,721、7,078,031、7,070,993、7,056,699、6,955,919中有更详细的描述，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。

基于病毒载体的递送平台可以是基于腺病毒的。一般而言，基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，不需要细胞分裂，实现高的滴度和表达水平，并且可以在相对简单的系统中大量生产。一般而言，腺病毒可用于在受感染的细胞内瞬时表达转基因，因为腺病毒通常不会整合到宿主的基因组中。基于腺病毒的递送平台在Li等人、Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549、1994；Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704、1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097、1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655中有更详细的描述，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。其他示例性基于腺病毒的递送平台在美国专利号5585362、6,083,716、7,371,570、7,348,178、7,323,177、7,319,033、7,318,919和7,306,793以及国际专利申请WO96/13597中有更详细的描述，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。

基于病毒载体的递送平台可以是基于腺相关病毒(AAV)的。腺相关病毒(“AAV”)载体可以用于用经工程化的核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)转导细胞。AAV系统可以用于体外产生感兴趣的蛋白，诸如本文所述的蛋白和/或效应分子，或用于体内和离体基因疗法程序，例如用于体内递送编码一种或多种蛋白和/或其他感兴趣的蛋白的经工程化的核酸(参见例如West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；5,436,146；6,632,670；6,642,051；7,078,387；7,314,912；6,498,244；7,906,111；美国专利公开US2003-0138772、US2007/0036760和US2009/0197338；Gao等人,J.Virol,78(12):6381-6388(2004年6月)；Gao等人,Proc Natl Acad Sci USA、100(10):6081-6086(2003年5月13日)；以及国际专利申请WO 2010/138263和WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)，每一篇均通过引用并入本文以用于所有目的)。用于构建重组AAV载体的示例性方法在美国专利第5,173,414号；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人，Mol.细胞生物学》4:2072-2081(1984)；Hermonat&amp；Muzyczka,PNAS 81:64666470(1984)；以及Samuiski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)，所述文献各自出于所有目的通过引用在此并入。一般而言，基于AAV的载体包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白具有对应于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及其变体中任一种的氨基酸序列。在具体实例中，基于AAV的载体具有衣壳蛋白，该衣壳蛋白具有对应于AAV2的氨基酸序列。在具体实例中，基于AAV的载体具有衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有对应于AAV8的氨基酸序列。

可以对AAV载体进行工程化以具有编码本文所述的蛋白质的任何外源性多核苷酸序列，所述蛋白质例如细胞因子、CAR、ACP和/或本文所述的具有下式的膜可切割嵌合蛋白：S-C-MT或MT-C-S。

基于病毒载体的递送平台可以是病毒样颗粒(VLP)平台。一般而言，VLP是通过产生病毒结构蛋白并纯化所得病毒颗粒而构造的。然后，纯化后，将货物/有效载荷(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)离体包封在纯化的颗粒内。因此，VLP的产生保持编码病毒结构蛋白的核酸与编码货物/有效载荷的核酸分开。用于VLP生产的病毒结构蛋白可以在多种表达系统中生产，包括哺乳动物、酵母、昆虫、细菌或体内翻译表达系统。使用本领域技术人员已知的方法，可以使纯化的病毒颗粒在存在期望的货物的情况下变性和改造以产生VLP。VLP的生产更详细描述于Seow等人(《分子疗法》2009年5月；17(5):767–777)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文。

可以对基于病毒载体的递送平台进行工程化以靶向(即，感染)一系列细胞，靶向细胞的狭窄子集，或靶向特定细胞。一般而言，针对基于病毒载体的递送平台选择的包膜蛋白将决定病毒嗜性。基于病毒载体的递送平台中使用的病毒可以假型化以靶向特定的目标细胞。基于病毒载体的递送平台可以是泛嗜性的并且感染一系列细胞。例如，基于泛嗜性病毒载体的递送平台可以包括VSV-G包膜。基于病毒载体的递送平台可以是兼嗜性的并且感染哺乳动物细胞。因此，本领域技术人员可以选择适当的嗜性、假型和/或包膜蛋白以靶向期望的细胞类型。

脂质结构递送系统

可以使用脂质介导的递送系统将经工程化的核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)引入细胞中。一般而言，脂质介导的递送系统使用由包封内部隔室的外部脂质膜构成的结构。基于脂质的结构的实例包括但不限于基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、囊泡、胞外囊泡、细胞或组织。脂质结构递送系统可以体外、体内或离体递送货物/有效载荷(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)。

基于脂质的纳米颗粒可包括但不限于单层脂质体、多层脂质体和脂质制剂。如本文所用，“脂质体”是一个通用术语，其涵盖通过将期望的货物(例如经工程化的核酸，如本文所述的任何经工程化的核酸)包封在脂质壳或脂质聚集体内而形成的脂质媒剂的体外制剂。脂质体的特征可以是具有带双层膜的囊泡结构，通常包含磷脂，以及通常包含水性组合物的内部介质。脂质体包括但不限于乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。脂质体可以是单层脂质体。脂质体可以是多层脂质体。脂质体可以是多泡脂质体。脂质体可以带正电荷、带负电荷或不带电荷。在某些实施方案中，脂质体电荷是中性的。脂质体可以由标准的囊泡形成脂质形成，这些脂质通常包含中性和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。通常通过考虑期望的目的(例如，体内递送的标准，诸如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性来指导脂质的选择。多种方法可用于制备脂质体，如例如Szokan等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)》9；467(1980)、美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号中所述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。

当包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中使得多个脂质层被水性介质隔开时，自发生成多层脂质体。在脂质组分经历自我重排后，水和溶解的溶质被截留在脂质双层之间的封闭结构中。期望的货物(例如，多肽、核酸、小分子药物、经工程化的核酸，如本文所述的任何经工程化的核酸、病毒载体、基于病毒的递送系统等)可以被包封在脂质体的水性内部，通过与脂质体和多肽/核酸都相连的连接分子与脂质体缔合，散布在脂质体的脂质双层内，被截留在脂质体中，与脂质体复合，或者以其他方式与脂质体缔合，使得可以将其递送到靶实体。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可以溶解在脂质双层中或与脂质双层缔合。

根据本实施方案使用的脂质体可以通过不同的方法制备，如本领域的普通技术人员所知。脂质体的制备在WO 2016/201323、国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040以及美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706中有更详细的描述；各自通过引用并入本文用于所有目的。

脂质体可以是阳离子脂质体。阳离子脂质体的实例在美国专利号5,962,016、5,030,453、6,680,068、美国申请2004/0208921以及国际专利申请WO03/015757A1、WO04029213A2和WO02/100435A1中有更详细的描述，这些文献中的每一篇据此全文以引用方式并入。

脂质介导的基因递送方法例如在WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988)；美国专利第5,279,833号、Rose美国专利第5,279,833号；WO91/06309；以及Felgner等人,Proc.国家科学院院刊》USA 84:7413-7414(1987)中有描述，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。

外来体是内吞来源的小膜囊泡，在多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的大小在30nm与100nm直径之间的范围内。它们的表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，并且它们包含来自产生外泌体的细胞的细胞质，并在表面上展示来自亲代细胞的膜蛋白。用于递送核酸的外泌体是本领域技术人员已知的，例如，美国专利第9,889,210号中更详细描述的外泌体，该专利以引用方式并入本文以用于所有目的。

如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指包含包裹内部空间的膜的细胞来源的囊泡。一般而言，细胞外囊泡包含所有膜结合囊泡，这些囊泡的直径小于它们所来源的细胞。通常细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可以包含处于内部空间内，展示在细胞外囊泡的外表面上，和/或跨越膜的各种大分子货物。货物可以包含核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为实例而非限制，胞外囊泡包含凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)而衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞(例如，通过直接细胞质膜出芽或晚期内体与细胞质膜的融合)产生的囊泡。细胞外囊泡可衍生自活的或死的生物体、外植组织或器官和/或培养的细胞。

如本文所用，术语“外来体”是指细胞来源的小(直径在20-300nm之间，更优选直径在40-200nm之间)囊泡，该囊泡包含包裹内部空间的膜，并且该囊泡通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合从细胞生成。外泌体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。外来体可衍生自生产细胞，并基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。外来体是一种细胞外囊泡。通常，外来体的产生/生物发生不会导致生产细胞的破坏。外来体和外来体的制备在WO 2016/201323中有更详细的描述，其特此通过引用整体并入。

如本文所用，术语“纳米囊泡”(也称为“微囊泡”)是指细胞来源的小(直径在20-250nm之间，更优选直径在30-150nm之间)囊泡，该囊泡包含包裹内部空间的膜，并且该囊泡通过直接或间接操纵从细胞产生，使得在没有所述操纵的情况下所述生产细胞不会产生所述纳米囊泡。一般而言，纳米囊泡是细胞外囊泡的亚种。对生产细胞的适当操纵包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡群基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期核内体与质膜融合而从生产细胞得到的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如，治疗剂)、受体(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸、RNA或DNA，如本文所述的任何经工程化的核酸)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其他分子。纳米囊泡一旦根据所述操纵从生产细胞中得到，就可以基于其大小、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞分离。

一般而言，脂质纳米颗粒(LNP)是合成脂质结构，依赖于脂质的两亲性形成膜和囊泡样结构(Riley 2017)。一般而言，这些囊泡通过吸收到靶细胞的膜中并将货物释放到胞质溶胶中来递送货物/有效载荷，如本文所述的任何经工程化的核酸或病毒系统。LNP形成中使用的脂质可以是阳离子、阴离子或中性的。脂质可以是合成的或天然来源的，并且在一些情况下是可生物降解的。脂质可以包含脂肪、胆固醇、磷脂、脂质缀合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)缀合物(PEG化脂质)、蜡、油、甘油酯和脂溶性维生素。脂质组合物通常包含限定的材料混合物，如阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和两亲性脂质。在一些情况下，包含特定脂质以防止LNP聚集、防止脂质氧化或提供促进附加部分附接的功能性化学基团。脂质组合物可影响整体LNP大小和稳定性。在一个实例中，脂质组合物包含二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)或MC3样分子。可以将MC3和MC3样脂质组合物配制成包含一种或多种其他脂质，如PEG或PEG缀合脂质、固醇或中性脂质。另外，LNP可进一步设计或功能化，以促进特定细胞类型的靶向。LNP设计中的另一个考虑因素是靶向效率和细胞毒性之间的平衡。

一般来说，胶束是使用单链脂质形成的球形合成脂质结构，其中单链脂质的亲水头部形成外层或膜，并且单链脂质的疏水尾部形成胶束中心。胶束通常是指仅含脂质单层的脂质结构。胶束更详细描述于Quader等人(Mol Ther.2017年7月5日；25(7):1501-1513)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文。

直接暴露于血清的核酸载体，如表达载体，可能有几种不良后果，包括血清核酸酶对核酸的降解或游离核酸对免疫系统的脱靶刺激。类似地，直接暴露于血清的病毒递送系统可以触发不期望的免疫应答和/或病毒递送系统的中和。因此，经工程化的核酸和/或病毒递送系统的封装可用于避免降解，同时也避免潜在的脱靶影响。在某些实例中，经工程化的核酸和/或病毒递送系统被完全封装在递送媒剂内，如在LNP的水性内部。可以通过本领域技术人员熟知的技术，如在微流体液滴生成装置上进行的微流体混合和液滴生成，将经工程化的核酸和/或病毒递送系统封装在LNP内。此类装置包括但不限于标准T形接头装置或流量聚焦装置。在一个实例中，将所需的脂质制剂，如含有MC3或MC3样组合物，与经工程化的核酸或病毒递送系统和任何其他所需的试剂并行地提供给液滴生成装置，使得递送载体和所需的试剂完全封装在基于MC3或MC3样的LNP内部。在一个实例中，液滴生成装置可以控制所产生的LNP的大小范围和大小分布。例如，LNP的大小可以在直径为1至1000纳米的范围内，例如1、10、50、100、500或1000纳米。液滴产生后，可以进一步对包封货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸和/或病毒递送系统)的递送媒剂进行处理或工程化，以使其作好施用的准备。

纳米颗粒递送

纳米材料可以用于递送经工程化的核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)。重要的是，纳米材料媒剂可以由非免疫原性材料制成并且通常可以避免对递送载体本身产生免疫力。这些材料可包括但不限于脂质(如前所述)、无机纳米材料和其他聚合材料。纳米材料颗粒更详细描述于Riley等人(Recent Advances in Nanomaterials for GeneDelivery—A Review.Nanomaterials 2017,7(5),94)中有更详细的描述，该文献以引用方式并入本文以用于所有目的。

基因组编辑系统

基因组编辑系统可以用于工程化宿主基因组以编码经工程化的核酸，例如编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的经工程化的核酸。一般而言，“基因组编辑系统”是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中的任何系统。基因组编辑系统包括但不限于转座子系统、核酸酶基因组编辑系统和基于病毒载体的递送平台。

转座子系统可以用于将经工程化的核酸(如细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白)整合到宿主基因组中。转座子通常包含位于货物/有效载荷核酸和转座酶两侧的末端反向重复序列(TIR)。转座子系统可以提供与侧接TIR的货物处于顺式或反式位置的转座子。转座子系统可以是逆转录转座子系统或DNA转座子系统。一般而言，转座子系统将货物/有效载荷(例如，经工程化的核酸)随机整合到宿主基因组中。转座子系统的实例包含使用Tc1/mariner转座子超家族的转座子的系统，如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统，这更详细描述于Hudecek等人(Crit Rev Biochem MolBiol.2017年8月；52(4):355-380)和美国专利第6,489,458号、第6,613,752号和第7,985,739号中，所述文献各自出于所有目的通过引用并入本文。转座子系统的另一个实例包含PiggyBac转座子系统，这在美国专利号6,218,185和6,962,810中有更详细的描述，这些专利中的每一篇均以引用方式并入本文以用于所有目的。

核酸酶基因组编辑系统可以用于工程化宿主基因组以编码经工程化的核酸，例如编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的经工程化的核酸。不希望受理论束缚，一般而言，用于引入外源基因的核酸酶介导的基因编辑系统利用了细胞的天然DNA修复机制，特别是同源重组(HR)修复途径。简而言之，在基因组DNA受损(通常为双链断裂)后，细胞可以通过在DNA合成期间使用另一种在其5'和3'端具有相同或基本上相同的序列的DNA源作为模板来修复损伤，从而消解该受损。在自然情况下，HDR可以使用细胞中存在的其他染色体作为模板。在基因编辑系统中，将外源性多核苷酸引入细胞中，用作同源重组模板(HRT或HR模板)。一般而言，在模板化HDR期间，可以将在HRT内5’和3’互补端之间包含有损伤的染色体中最初未发现的任何额外外源序列(例如，基因或基因的一部分)掺入(即，“整合”)到给定的基因组座位中。因此，给定基因组基因座的典型HR模板具有与内源性基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列、与内源性基因组靶基因座的第二区域相同的核酸序列，和编码货物/有效载荷核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸，例如编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的任何经工程化的核酸)的核苷酸序列。

在一些实例中，HR模板可以是线性的。线性HR模板的实例包括但不限于线性化质粒载体、ssDNA、合成DNA和PCR扩增DNA。在特定实例中，HR模板可以是环状的，如质粒。环状模板可以包含超螺旋模板。

相对于要引入的外源序列，在HR模板的5'和3'端发现的相同或基本上相同的序列通常称为臂(HR臂)。HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域相同(即，100％相同)。一些实例中的HR臂可以与内源基因组靶基因座的区域基本上相同。虽然可以使用基本上相同的HR臂，但HR臂相同可能是有利的，因为HDR通路的效率可能受到具有小于100％同一性的HR臂的影响。

每个HR臂即，5'和3'HR臂可以是相同的大小或不同的大小。每条HR臂的长度可以各自大于或等于50、100、200、300、400或500个碱基。尽管HR臂通常可以是任意长度，但是也可以考虑实际因素，如HR臂长度和整体模板大小对整体编辑效率的影响。HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与紧邻切割位点的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同。每条HR臂可以与切割位点一定距离内的内源基因组靶基因座的区域相同或基本上相同，该距离如彼此相距1个碱基对、小于或等于10个碱基对、小于或等于50个碱基对，或小于或等于100个碱基对。

核酸酶基因组编辑系统可以使用多种核酸酶切割靶基因组基因座，包括但不限于成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物，以及归巢核酸内切酶(HE)或其衍生物。

CRISPR介导的基因编辑系统可以用于工程化宿主基因组以编码经工程化的核酸，例如编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的经工程化的核酸。CRISPR系统在M.Adli(“用于基因组编辑和其他领域的CRISPR工具包(The CRISPR tool kit for genome editing and beyond)”《自然通讯(NatureCommunications)》；第9期(2018),文章号：1911)中有更详细的描述，其教导的所有内容通过引用并入本文。一般而言，CRISPR介导的基因编辑系统包含CRISPR相关(Cas)核酸酶和指导对特定靶序列的切割的RNA。示例性的CRISPR介导的基因编辑系统是包含Cas9核酸酶和具有CRISPR RNA(crRNA)结构域和反式激活CRISPR(tracrRNA)结构域的RNA的CRISPR/Cas9系统。crRNA通常具有两个RNA结构域：通过与靶序列(“确定的核苷酸序列”例如，基因组序列)的碱基对杂交来指导特异性的向导RNA序列(gRNA)；和与tracrRNA杂交的RNA结构域。tracrRNA可以与核酸酶(例如，Cas9)相互作用，从而促进核酸酶向基因组座位的募集。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单独的多核苷酸。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单一的多核苷酸，也称为单向导RNA(sgRNA)。虽然这里示出了Cas9系统，但是也可以使用其他CRISPR系统，诸如Cpf1/Cas12或Cas13系统。核酸酶可以包括其衍生物，诸如Cas9功能突变体，例如Cas9“切口酶”突变体，其通常仅介导确定的核苷酸序列的单链的切割，而不是通常由Cas9酶产生的完全双链断裂。

一般而言，CRISPR系统的组分彼此相互作用形成核糖核蛋白(RNP)复合物以介导序列特异性切割。在一些CRISPR系统中，每个组分都可以单独产生并用于形成RNP复合物。在一些CRISPR系统中，每种组分可以在体外单独产生并在体外彼此接触(即，“复合”)以形成RNP复合物。然后可以将体外产生的RNP引入(即，“递送”)到细胞的细胞质和/或细胞核例如，T细胞的细胞质和/或细胞核中。体外产生的RNP复合物可以通过多种方式递送至细胞，包括但不限于电穿孔、脂质介导的转染、通过物理方式的细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和超声处理。在一个具体实例中，可以使用Nucleofactor/基于电穿孔的递送系统/>将体外产生的RNP复合物递送至细胞。其他电穿孔系统包括但不限于MaxCyte电穿孔系统、Miltenyi CliniMACS电穿孔系统、Neon电穿孔系统和BTX电穿孔系统。可以使用本领域技术人员已知的多种蛋白质生产技术在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR核酸酶(例如，Cas9)。可以使用本领域技术人员已知的多种RNA生产技术(如体外转录或化学合成)在体外产生(即，合成和纯化)CRISPR系统RNA(例如，sgRNA)。

体外产生的RNP复合物可以按不同的核酸酶与gRNA的比率复合。体外产生的RNP复合物也可以以不同的量用于CRISPR介导的编辑系统中。例如，根据需要编辑的细胞数目，可以调整添加的RNP总量，如在反应中编辑大量细胞时减少添加的RNP复合物的量。

在一些CRISPR系统中，每种组分(例如，Cas9和sgRNA)可以由多核苷酸单独编码，其中每种多核苷酸一起或单独引入细胞中。在一些CRISPR系统中，每种组分可以由单一多核苷酸(即，多启动子或多顺反子载体，参见下文关于示例性多顺反子系统的描述)编码并引入细胞中。在每种多核苷酸编码的CRISPR组分在细胞内表达(例如，核酸酶的翻译和CRISPR RNA的转录)后，RNP复合物可以在细胞内形成，然后可以指导位点特异性切割。

一些RNP可以工程改造成具有促进RNP递送到细胞核中的部分。例如，Cas9核酸酶可以具有核定位信号(NLS)结构域，使得如果将Cas9 RNP复合物递送到细胞的胞质溶胶中或在Cas9翻译和后续RNP形成之后，NLS可以促进Cas9 RNP进一步运输到细胞核中。

本文所述的经工程化的细胞可以使用非病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用非病毒方法递送至细胞。本文所述的经工程化的细胞可以使用病毒方法进行工程化，例如，本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可以使用病毒方法如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或本文所述的任何其他基于病毒的递送方法递送至细胞。

在一些CRISPR系统中，可以提供一种以上的CRISPR组合物，使得每种组合物单独靶向相同基因或一般基因组基因座的多于靶核苷酸序列。例如，可以提供两种单独的CRISPR组合物以指导在彼此一定距离内的两个不同靶核苷酸序列处切割。在一些CRISPR系统中，可以提供一种以上CRISPR组合物，使得每个组合物单独靶向相同基因或一般基因组基因座的相反链。例如，可以提供两种单独的CRISPR“切口酶”组合物以指导在相同基因或一般基因组基因座的相反链处切割。

一般而言，本文所述的CRISPR介导的编辑系统的特征可以应用于其他基于核酸酶的基因组编辑系统。TALEN是经工程化的位点特异性核酸酶，其由TALE(转录激活因子样效应物)的DNA结合结构域和限制性内切核酸酶Fokl的催化结构域构成。通过改变DNA结合结构域的单体的高度可变残基区中存在的氨基酸，可以形成不同的人工TALEN来靶向各种核苷酸序列。DNA结合结构域随后将核酸酶指导至靶序列并产生双链断裂。基于TALEN的系统更详细描述于美国序列号12/965,590；美国专利第8,450,471号；美国专利第8,440,431号；美国专利第8,440,432号；美国专利第10,172,880号；以及美国序列号13/738,381中，所有这些都通过引用以其整体并入本文。基于ZFN的编辑系统更详细描述于美国专利第6,453,242号、第6,534,261号、第6,599,692号、第6,503,717号、第6,689,558号、第7,030,215号、第6,794,136号、第7,067,317号、第7,262,054号、第7,070,934号、第7,361,635号、第7,253,273号；和美国专利公布第2005/0064474号、第2007/0218528号、第2005/0267061号中；所述文献全部出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

其他工程化的送系统

将经工程化的核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)引入细胞或其他靶受体实体(如本文所述的任何脂质结构)中的各种额外方式。

电穿孔可用于将多核苷酸递送至受者实体。电穿孔是一种通过施加电场以使靶细胞或实体的外膜或外壳瞬时透化，将货物/有效载荷内化到靶细胞或实体的内部区室的方法。一般而言，该方法涉及将细胞或靶实体置于含有所关注货物(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)的溶液中的两个电极之间。然后，通过施加允许货物进入实体内部(如细胞的细胞质)的瞬时设定电压来破坏(即，透化)细胞的脂质膜。在细胞的实例中，即使不是大多数，也至少有一些细胞保持活力。可以在体外、体内或离体对细胞和其他实体进行电穿孔。电穿孔条件(例如，细胞数量、货物浓度、恢复条件、电压、时间、电容、脉冲类型、脉冲长度、体积、电转杯长度、电穿孔溶液组成等)根据若干因素而变化，这些因素包括但不限于细胞或其他受体实体的类型、待递送的货物、期望的内化效率和期望的活力。此类标准的优化在本领域技术人员的范围内。多种装置和方案可用于电穿孔。实例包括但不限于转染系统、/>Flow Electroporation^TM、/>Nucleofector^TM系统和Bio-/>电穿孔系统。

用于将经工程化的核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸)引入细胞或其他靶受体实体中的其他方式包括但不限于超声处理、基因枪、流体动力学注射和通过物理方式的细胞膜变形。

用于在体内递送工程化mRNA(如裸质粒或mRNA)的组合物和方法详细描述于Kowalski等人(《分子疗法》2019年4月10日；27(4):710–728)以及Kaczmarek等人(《基因组医学(Genome Med.)》2017；9:60)中，所述文献各自出于所有目的通过引用在此并入。

递送媒剂

本文还提供了用于递送货物/有效载荷的组合物(“递送媒剂”)。

货物可以包含核酸(例如，本文所述的任何经工程化的核酸，如本文所述的编码细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白的任何经工程化的核酸)，如上所述。货物可以包含蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。

递送媒剂可以包含任何适用于递送货物的组合物。递送媒剂可以包含任何适用于递送蛋白质(例如，本文所述的任何蛋白)的组合物。递送媒剂可以是本文所述的任何脂质结构递送系统。例如，递送媒剂可以是基于脂质的结构，包括但不限于基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、囊泡、胞外囊泡、细胞或组织。递送媒剂可以是本文所述的任何纳米颗粒，如包含脂质(如前所述)、无机纳米材料和其他聚合物材料的纳米颗粒。

递送媒剂能够将货物递送至细胞，例如将本文所述的任何蛋白递送至细胞。递送媒剂能够将货物递送至细胞，例如将本文所述的任何蛋白递送至细胞。递送媒剂可以被配置成靶向特定细胞，例如被配置成用重定向抗体靶向特定细胞。递送媒剂能够将货物递送至体内细胞。

递送媒剂能够将货物递送至组织或组织环境(例如，肿瘤微环境)，如将本文所述的任何蛋白递送至体内组织或组织环境。递送货物可以包括分泌货物，如分泌本文所述的任何蛋白。因此，递送媒剂能够分泌货物，如分泌本文所述的任何蛋白。递送媒剂能够将货物分泌到组织或组织环境(例如，肿瘤微环境)，如将本文所述的任何蛋白分泌到组织或组织环境中。递送媒剂可以被配置成靶向特定组织或组织环境(例如，肿瘤微环境)，如被配置成用重定向抗体靶向特定组织或组织环境。

治疗方法

本文进一步提供了方法，所述方法包括向受试者(例如，人受试者)递送或施用如本文提供的工程化的细胞，以在体内产生至少一种由工程化的细胞产生的感兴趣的蛋白(例如，任何细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白，或在嵌合蛋白的蛋白酶切割后本文提供的分泌的效应分子)。本文进一步提供了方法，所述方法包括向受试者(例如，人受试者)递送或施用如本文提供的工程化的细胞，以在体内产生至少两种感兴趣的蛋白，例如，由工程化的细胞产生的细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白中的至少两种。

本文进一步提供了方法，所述方法包括向受试者(例如，人受试者)递送或施用本文所述的任何递送媒剂，诸如本文所述的任何递送媒剂，其包含本文所述的任何感兴趣的蛋白，例如，细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白中的任何一种。本文进一步提供了方法，所述方法包括向受试者(例如，人受试者)递送或施用本文所述的任何递送媒剂，诸如本文所述的任何递送媒剂，其包含细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白中的两种或更多种蛋白，例如，其中的至少一种蛋白。

在一些实施方案中，经工程化的细胞或递送媒剂通过静脉内、腹膜内、气管内、皮下、肿瘤内、口服、肛门、鼻内(例如，包装在递送颗粒中)或动脉(例如，颈内动脉)途径施用。因此，经工程化的细胞或递送媒剂可以全身或局部施用(例如，至TME或通过肿瘤内施用)。经工程化的细胞可以从受试者中分离，该受试者如为已知或疑似患有癌症的受试者。对于接受治疗的受试者而言，经工程化的细胞可以是同种异体的。同种异体修饰的细胞可以与接受治疗的受试者HLA匹配。递送媒剂可以是本文所述的任何脂质结构递送系统。递送媒剂可以是本文所述的任何纳米颗粒。

经工程化的细胞或递送媒剂可以单独施用或与其他治疗组合施用，根据待治疗的病症同时或依次施用。例如，经工程化的细胞或递送媒剂可以与本文所述的一种或多种IMiD联合施用。FDA批准的IMiD可以以它们获批的方式施用。在另一个实例中，工程化细胞或递送媒剂可以与检查点抑制剂疗法联合施用。示例性检查点抑制剂包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体和抗TREM2抗体。说明性免疫检查点抑制剂包括帕博利珠单抗(抗PD-1；MK-3475/-Merck)、纳武利尤单抗(抗PD-1；/>-BMS)、匹地利珠单抗(抗PD-1抗体；CT-011–Teva/CureTech)、AMP224(抗PD-1；NCI)、阿维鲁单抗(抗PD-L1；/>-Pfizer)、度伐利尤单抗(抗PD-L1；MEDI4736//>-Medimmune/AstraZeneca)、阿替利珠单抗(抗PD-L1；-Roche/Genentech)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、曲美木单抗(抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、伊匹木单抗(抗CTLA-4；/> -BMS)、利瑞鲁单抗(抗KIR；BMS)、莫那利珠单抗(抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)。在其他实例中，经工程化的细胞或递送媒剂可以与TGFβ抑制剂、VEGF抑制剂或HPGE2联合施用。在另一个实例中，经工程化的细胞或递送媒剂可以与抗CD40抗体联合施用。

一些方法包括选择患有肿瘤(或癌症)的受试者(或患者群体)并用调节肿瘤介导的免疫抑制机制的经工程化的细胞或递送媒剂治疗所述受试者。

在一些情况下，本公开的经工程化的细胞或递送媒剂可以用于治疗癌症，如卵巢癌。本文描述了其他癌症。例如，经工程化的细胞可以用于治疗膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和/或子宫肿瘤。本公开的经工程化的细胞或递送媒剂可以用于治疗肿瘤位于受试者腹膜间隙的癌症。

本文提供的方法还包含递送经工程化的细胞或递送媒剂的制剂。在一些实施方案中，制剂是基本上纯的制剂，其包含例如少于5％(例如，少于4％、3％、2％或1％)经工程化的细胞以外的细胞。制剂可以包含1x10⁵个细胞/kg至1x10⁷个细胞/kg细胞。经工程化的细胞或递送媒剂的制剂可以包含具有一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。例如，经工程化的细胞或递送媒剂的制剂可以包含本文所述的任何经工程化的病毒，如经工程化的AAV病毒或任何经工程化的病毒载体，如AAV载体。

体内表达

本文提供的方法还包括体内递送组合物，所述组合物能够产生本文所述的经工程化的细胞，例如，能够将本文所述的任何经工程化的核酸递送至体内细胞。此类组合物包含任何病毒介导的递送平台、任何脂质结构递送系统、任何纳米颗粒递送系统、任何基因组编辑系统或本文描述的能够对体内细胞进行工程改造的任何其他工程改造递送系统。

本文提供的方法还包括在体内递送组合物，所述组合物能够产生本文所述的任何感兴趣的蛋白，例如，细胞因子、CAR、ACP和/或具有本文所述的式S-C-MT或MT-C-S的膜可切割嵌合蛋白中的任何一种。本文提供的方法还包括体内递送能够产生本文所述的两种或更多种所关注蛋白质的组合物。能够体内产生所关注蛋白质的组合物包括但不限于本文所述的任何经工程化的核酸。能够体内产生所关注蛋白质的组合物可以是裸mRNA或裸质粒。

另外的实施方案

下面提供了描述本发明的具体实施方案的列举实施方案：

实施方案1：一种免疫应答细胞，其包含：

(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含

第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子；和

(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含

第三表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，和

第四表达盒，所述第四表达盒包含与编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列可操作连接的第四启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，

其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含所述第一细胞因子和/或所述第二细胞因子的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案2：根据实施方案1所述的免疫应答细胞，其中所述第一表达盒被配置为相对于所述第二表达盒的转录以相反取向转录。

实施方案3：根据实施方案2所述的免疫应答细胞，其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向。

实施方案4：根据实施方案1所述的免疫应答细胞，其中所述第一表达盒被配置为相对于所述第二表达盒的转录以相同的取向被转录。

实施方案5：根据实施方案4所述的免疫应答细胞，其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对尾的方向性定向。

实施方案6：根据实施方案1至5中任一项的免疫应答细胞，其中所述第一启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。

实施方案7：根据实施方案6所述的免疫应答细胞，其中所述第一启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

实施方案8：根据实施方案1至7中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。

实施方案9：根据实施方案8所述的免疫应答细胞，其中所述第二启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

实施方案10：根据实施方案1至9中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第三表达盒被配置为在所述第二经工程化的核酸内以相对于第四表达盒的转录相反的方向被转录。

实施方案11：根据实施方案1至10中任一项所述的免疫应答细胞，其中在第二经工程化的核酸内所述第三表达盒和所述第四表达盒以头对头的方向性定向。

实施方案12：根据实施方案1至11中任一项所述的免疫应答细胞，其中在第二经工程化的核酸内所述第三表达盒和所述第四表达盒以尾对尾的方向性定向。

实施方案13：根据实施方案1至11中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第四启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。

实施方案14：根据实施方案13所述的免疫应答细胞，其中所述第四启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

实施方案15：一种免疫应答细胞，其包含：

(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含

第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码第一细胞因子的第一外源性多核苷酸序列和编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸序列，

所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子；和

(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含

S-C-MT或MT-C-S

其中

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案16：根据实施方案15所述的免疫应答细胞，其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒的转录相对于所述第二表达盒的转录定向在相反的方向上。

实施方案17：根据实施方案16所述的免疫应答细胞，其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向。

实施方案18：根据实施方案15所述的免疫应答细胞，其中所述第一表达盒被配置为以相对于所述第二表达盒的转录相同的取向被转录。

实施方案19：根据实施方案18所述的免疫应答细胞，其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对尾的方向性定向。

实施方案20：一种免疫应答细胞，其包含：

(a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含

第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列和编码第一细胞因子的第二外源性多核苷酸序列；和

(b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含

第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第三启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，

其中所述第二外源性多核苷酸序列和所述第三外源性多核苷酸序列中的至少一者编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：

S-C-MT或MT-C-S

其中

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案21：根据实施方案20所述的免疫应答细胞，其中在第一经工程化的核酸内所述第二表达盒的转录相对于第三表达盒的转录定向在相反的方向上。

实施方案22：根据实施方案20或实施方案21所述的免疫应答细胞，其中在所述第二经工程化的核酸内所述第二表达盒和所述第三表达盒以头对头的方向性定向。

实施方案23：根据实施方案15至22中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。

实施方案24：根据实施方案23所述的免疫应答细胞，其中所述第一启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

实施方案25：根据实施方案15至24中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由接头多核苷酸序列分开。

实施方案26：根据实施方案25所述的免疫应答细胞，其中所述接头多核苷酸序列与作为单独的多肽的所述第一细胞因子和所述CAR的翻译可操作地相关联。

实施方案27：根据实施方案26所述的免疫应答细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码一个或多个2A核糖体跳跃元件。

实施方案28：根据实施方案27所述的免疫应答细胞，其中所述一个或多个2A核糖体跳跃元件各自选自由以下组成的群组：P2A、T2A、E2A、F2A及其组合。

实施方案29：根据实施方案28所述的免疫应答细胞，其中所述一个或多个2A核糖体跳跃元件包含E2A/T2A组合。

实施方案30：根据实施方案29所述的免疫应答细胞，其中所述E2A/T2A组合包含SEQ ID NO:：281的氨基酸序列。

实施方案31：根据实施方案25或实施方案26所述的免疫应答细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。

实施方案32：根据实施方案25-31中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码可切割多肽。

实施方案33：根据实施方案32所述的免疫应答细胞，其中所述可切割多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。

实施方案34：根据实施方案15至33中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第三启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子。

实施方案35：根据实施方案34所述的免疫应答细胞，其中所述第三个启动是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。

实施方案36：根据实施方案1至35中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞因子是IL-15。

实施方案37：根据实施方案36所述的免疫应答细胞，其中所述IL-15包含SEQ IDNO：285的氨基酸序列。

实施方案38：根据实施方案1至36中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二细胞因子选自由以下组成的群组：IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21。

实施方案39：根据实施方案38所述的免疫应答细胞，其中所述第二细胞因子是IL12p70融合蛋白。

实施方案40：根据实施方案39所述的免疫应答细胞，其中所述IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO：293的氨基酸序列。

实施方案41：根据实施方案1至35中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞因子是IL12或IL12p70融合蛋白。

实施方案42：根据实施方案1至36中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二细胞因子选自由以下组成的群组：IL15、IL18和IL21。

实施方案43：根据实施方案1至42中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点可由选自由以下组成的群组的蛋白酶切割：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶、MMP9蛋白酶和NS3蛋白酶。

实施方案44：根据实施方案43所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点可由ADAM17蛋白酶切割。

实施方案45：根据实施方案1至44中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含具有PRAE(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列的第一区域。

实施方案46：根据实施方案1至45中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含具有KGG(SEQ ID NO:177)的氨基酸序列的第二区域。

实施方案47：根据实施方案46所述的免疫应答细胞，其中所述第一区域位于所述第二区域的N末端。

实施方案48：根据实施方案1至47中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEX₁X₂KGG(SEQ ID NO:178)的氨基酸序列，

其中X₁是A、Y、P、S或F，并且

其中X₂是V、L、S、I、Y、T或A。

实施方案49：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEAVKGG(SEQ ID NO:179)的氨基酸序列。

实施方案50：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEALKGG(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列。

实施方案51：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEYSKGG(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列。

实施方案52：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEPIKGG(SEQ ID NO:182)的氨基酸序列。

实施方案53：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEAYKGG(SEQ ID NO:183)的氨基酸序列。

实施方案54：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAESSKGG(SEQ ID NO:184)的氨基酸序列。

实施方案55：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEFTKGG(SEQ ID NO:185)的氨基酸序列。

实施方案56：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PRAEAAKGG(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列。

实施方案57：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含DEPHYSQRR(SEQ ID NO:187)的氨基酸序列。

实施方案58：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PPLGPIFNPG(SEQ ID NO:188)的氨基酸序列。

实施方案59：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含PLAQAYRSS(SEQ ID NO:189)的氨基酸序列。

实施方案60：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含TPIDSSFNPD(SEQ ID NO:190)的氨基酸序列。

实施方案61：根据实施方案48所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含VTPEPIFSLI(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列。

实施方案62：根据实施方案1至44中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含ITQGLAVSTISSFF(SEQ ID NO:198)的氨基酸序列。

实施方案63：根据实施方案1至62中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点包含在肽接头内。

实施方案64：根据实施方案1至62中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点在肽接头的N末端。

实施方案65：根据实施方案63或实施方案64所述的免疫应答细胞，其中所述肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。

实施方案66：根据实施方案1至62中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞膜栓系结构域包含跨膜-胞内结构域或跨膜结构域。

实施方案67：根据实施方案66所述的免疫应答细胞，其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ链、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1,或BTLA。

实施方案68：根据实施方案67所述的免疫应答细胞，其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自B7-1。

实施方案69：根据实施方案68所述的免疫应答细胞，其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列。

实施方案70：根据实施方案1至67中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞膜栓系结构域包含翻译后修饰标签，或能够翻译后修饰以修饰所述嵌合蛋白以包括翻译后修饰标签的基序，其中所述翻译后修饰标签能够与细胞膜缔合。

实施方案71：根据实施方案70所述的免疫应答细胞，其中所述翻译后修饰标签包含脂质锚结构域，任选地其中所述脂质锚结构域选自由以下组成的群组：GPI脂质锚定、豆蔻酰化标签和棕榈酰化标签。

实施方案72：根据实施方案1至71中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞膜栓系结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分。

实施方案73：根据实施方案1至72中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述膜可切割嵌合蛋白的细胞因子被栓系到所述细胞的细胞膜上。

实施方案74：根据实施方案1至73中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞进一步包含能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶。

实施方案75：根据实施方案74所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶对于细胞是内源性的。

实施方案76：根据实施方案74所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶选自由以下组成的群组：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶和MMP9蛋白酶。

实施方案77：根据实施方案76所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶是ADAM17蛋白酶。

实施方案78：根据实施方案74至77中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶在细胞的细胞膜上表达。

实施方案79：根据实施方案78所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶能够切割所述蛋白酶切割位点。

实施方案80：根据实施方案79所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶切割位点的切割从所述细胞的细胞膜释放所述膜可切割嵌合蛋白的细胞因子。

实施方案81：根据实施方案1至19和23至80中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。

实施方案82：根据实施方案15至81中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。

实施方案83：根据实施方案20至80中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。

实施方案84：根据实施方案15至83中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。

实施方案85：根据实施方案82或实施方案84所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：IL-12、胰蛋白酶原-2、Gaussia荧光素酶、CD5、IgKVII、VSV-G、催乳素、血清白蛋白前原蛋白、天青杀素前原蛋白、骨粘连蛋白(BM40)、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、serpin-E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、GMCSFRa、NKG2D和IgE。

实施方案86：根据实施方案82所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽衍生自GMCSFRa。

实施方案87：根据实施方案86所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽包含SEQID NO:216的氨基酸序列。

实施方案88：根据实施方案84所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽衍生自IgE。

实施方案89：根据实施方案88所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽包含SEQID NO:218的氨基酸序列。

实施方案90：根据实施方案15至89中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第三外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。

实施方案91：根据实施方案90所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽与所述第二细胞因子可操作地相关联。

实施方案92：根据实施方案82或实施方案91所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽对所述第二细胞因子是天然的。

实施方案93：根据实施方案82或实施方案91所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽对所述第二细胞因子是非天然的。

实施方案94：根据实施方案20至93中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第三外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白。

实施方案95：根据实施方案94所述的免疫应答细胞，其中所述第二表达盒进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列。

实施方案96：根据实施方案15至95中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽与所述第一细胞因子可操作地相关联。

实施方案97：根据实施方案96所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽对所述第一细胞因子是天然的。

实施方案98：根据实施方案96所述的免疫应答细胞，其中所述分泌信号肽对所述第一细胞因子是非天然的。

实施方案99：根据实施方案15至98中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一外源性多核苷酸序列编码第一膜可切割嵌合蛋白，并且所述第三外源性多核苷酸序列编码第二膜可切割嵌合蛋白。

实施方案100：根据实施方案20至98中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二外源性多核苷酸序列编码第一膜可切割嵌合蛋白，并且所述第三外源性多核苷酸序列编码第二膜可切割嵌合蛋白。

实施方案101：根据实施方案1至100中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，

其中所述VH包含：

具有KNAMN(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)、

具有RIRNKTNNYATYYADSVKA(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)和

具有GNSFAY(SEQ ID NO:201)的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)，并且

其中所述VL包含：

具有KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)，

具有WASSRES(SEQ ID NO:203)的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和

具有QQYYNYPLT(SEQ ID NO:204)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)。

实施方案102：根据实施方案101所述的免疫应答细胞，其中所述VH区包含与

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:206)的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案103：根据实施方案101所述的免疫应答细胞，其中所述VH区包含与SEQID NO:206的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案104：根据实施方案101至103中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述VL区包含与

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案105：根据实施方案104所述的免疫应答细胞，其中所述VL区包含与SEQID NO:208的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案106：根据实施方案101至98中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。

实施方案107：根据实施方案101至106中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述VH和VL由肽接头分开。

实施方案108：根据实施方案107所述的免疫应答细胞，其中所述肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。

实施方案109：根据实施例108所述的免疫应答细胞，其中所述GS接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:223)的氨基酸序列。

实施方案110：根据实施方案107所述的免疫应答细胞，其中所述scFv包含结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH是重链可变结构域，L是肽接头，并且VL是轻链可变结构域。

实施方案111：根据实施方案1至110中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且所述一个或多个细胞内信号传导结构域中的每一个选自由以下组成的群组：CD3ζ链细胞内信号传导结构域、a CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域、MyD88细胞内信号传导结构域、2B4细胞内信号传导结构域、CD16a细胞内信号传导结构域、DNAM-1细胞内信号传导结构域、KIR2DS1细胞内信号传导结构域、KIR3DS1细胞内信号传导结构域、NKp44细胞内信号传导结构域、NKp46细胞内信号传导结构域、FceRlg细胞内信号传导结构域、NKG2D细胞内信号传导结构域和EAT-2细胞内信号传导结构域。

实施方案112：根据实施方案111所述的免疫应答细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含OX40细胞内信号传导结构域。

实施方案113：根据实施方案112所述的免疫应答细胞，其中所述OX40细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列。

实施方案114：根据实施方案111所述的免疫应答细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD28细胞内信号传导结构域。

实施方案115：根据实施方案114所述的免疫应答细胞，其中所述CD28细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列。

实施方案116：根据实施方案111所述的免疫应答细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD3z细胞内信号传导结构域。

实施方案117：根据实施方案116所述的免疫应答细胞，其中所述CD3z细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:277或SEQ ID NO:279的氨基酸序列。

实施方案118：根据实施方案1至117中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR包含跨膜结构域，并且所述跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域、BTLA跨膜结构域、OX40跨膜结构域、DAP10跨膜结构域、DAP12跨膜结构域、CD16a跨膜结构域、DNAM-1跨膜结构域、KIR2DS1跨膜结构域、KIR3DS1跨膜结构域、NKp44跨膜结构域、NKp46跨膜结构域、FceRlg跨膜结构域和NKG2D跨膜结构域。

实施方案119：根据实施方案118所述的免疫应答细胞，其中所述跨膜结构域是OX40跨膜结构域。

实施方案120：根据实施方案119所述的免疫应答细胞，其中所述OX40跨膜结构域包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列。

实施方案121：根据实施方案118所述的免疫应答细胞，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。

实施方案122：根据实施方案121所述的免疫应答细胞，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:236或SEQ ID NO:242的氨基酸序列。

实施方案123：根据实施方案118至122中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区。

实施方案124：根据实施方案123所述的免疫应答细胞，其中所述间隔区衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：CD8、CD28、IgG4、IgG1、LNGFR、PDGFR-β和MAG。

实施方案125：根据实施方案124所述的免疫应答细胞，其中所述间隔区是CD8铰链。

实施方案126：根据实施方案125所述的免疫应答细胞，其中所述CD8铰链包含SEQID NO:226或SEQ ID NO:228的氨基酸序列。

实施方案127：根据实施方案1至123中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述ACP包含DNA结合结构域和转录效应子结构域。

实施方案128：根据实施方案127所述的免疫应答细胞，其中所述转录效应子结构域包含转录激活因子结构域。

实施方案129：根据实施方案128所述的免疫应答细胞，其中所述转录激活因子结构域选自由以下组成的群组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三联激活因子；人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域(p300HAT核心激活结构域)。

实施方案130：根据实施方案129所述的免疫应答细胞，其中所述转录激活因子结构域包含VPR激活结构域。

实施方案131：根据实施方案131所述的免疫应答细胞，其中所述VPR激活结构域包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列。

实施方案132：根据实施方案128所述的免疫应答细胞，其中所述转录效应子结构域包含转录阻遏因子结构域。

实施方案133：根据实施方案132所述的免疫应答细胞，其中所述转录阻遏因子结构域选自由以下组成的群组：Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；截短的Krüppel相关盒(KRAB)阻遏结构域；阻遏因子元件沉默转录因子(REST)阻遏结构域；毛发相关的基本螺旋-环-螺旋阻遏蛋白的WRPW基序，所述基序被称为WRPW阻遏结构域；DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3B(DNMT3B)阻遏结构域；和HP1α染色体阴影阻遏结构域。

实施方案134：根据实施方案127至133中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域。

实施方案135：根据实施方案134所述的免疫应答细胞，其中所述ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且包含锌指基序的阵列。

实施方案136：根据实施方案134所述的免疫应答细胞，其中ZF蛋白结构域包含一至十个锌指基序的阵列。

实施方案137：根据实施方案136所述的免疫应答细胞，其中所述ZF蛋白结构域包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。

实施方案138：根据实施方案1至136中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述ACP进一步包含阻遏型蛋白酶和所述阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点。

实施方案139：根据实施方案138所述的免疫应答细胞，其中所述阻遏型蛋白酶是丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)。

实施方案140：根据实施方案139所述的免疫应答细胞，其中所述NS3蛋白酶包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列。

实施方案141：根据实施方案138或实施方案139所述的免疫应答细胞，其中所述阻遏型蛋白酶的所述同源切割位点包含NS3蛋白酶切割位点。

实施方案142：根据实施方案141所述的免疫应答细胞，其中所述NS3蛋白酶切割位点包含NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B接合切割位点。

实施方案143：根据实施方案139至142中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述NS3蛋白酶可被蛋白酶抑制剂阻抑。

实施方案144：根据实施方案143所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶抑制剂选自由以下组成的群组：西美瑞韦、达诺瑞韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利瑞韦、替拉瑞韦、格拉瑞韦、格卡瑞韦和伏西瑞韦。

实施方案145：根据实施方案144所述的免疫应答细胞，其中所述蛋白酶抑制剂是格拉瑞韦(GRZ)。

实施方案146：根据实施方案1至145中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述ACP进一步包含核定位信号(NLS)。

实施方案147：根据实施方案146所述的免疫应答细胞，其中所述NLS包含SEQ IDNO:296的氨基酸序列。

实施方案148：根据实施方案138-144中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点位于所述DNA结合结构域和所述转录效应子结构域之间。

实施方案149：根据实施方案1-148中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述ACP进一步包含雌激素受体变体ERT2的激素结合结构域。

实施方案150：根据实施方案1-149中任一项所述的免疫应答细胞，其中ACP应答启动子是合成启动子。

实施方案151：根据实施方案1-150中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述ACP应答启动子包含ACP结合结构域序列和最小启动子序列。

实施方案152：根据实施方案151所述的免疫应答细胞，其中所述ACP结合结构域序列包含一个或多个锌指结合位点。

实施方案153：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案154：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案155：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案156：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案157：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案158：根据实施方案1、15或20中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案159：根据实施方案1至11或20至152中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案160：根据实施方案1至11或20至152中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案161：一种免疫应答细胞，其包含：

a)包含SEQ ID NO:310的核苷酸序列的第一经工程化的核酸；和

b)包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列的第二经工程化的核酸。

实施方案162：一种免疫应答细胞，其包含：

a)包含SEQ ID NO:327的核苷酸序列的第一经工程化的核酸；和

c)包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列的第二经工程化的核酸。

实施方案163：根据实施方案1至162中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞选自由以下组成的群组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC衍生细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC衍生细胞。

实施方案164：根据实施方案1至162中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。

实施方案165：根据实施方案163或实施方案164所述的免疫应答细胞，其中所述细胞是自体的。

实施方案166：根据实施方案163或实施方案164所述的免疫应答细胞，其中所述细胞是同种异体的。

实施方案167：一种经工程化的核酸，其包含：

第一表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL15的第一外源性多核苷酸序列的第一启动子，和

第二表达盒，所述第二表达盒包含可操作地连接至第二外源性多核苷酸序列的第二启动子，所述第二外源性多核苷酸序列编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)，

其中所述第一外源性多核苷酸序列编码从N末端到C末端取向的膜可切割嵌合蛋白，所述膜可切割嵌合蛋白具有下式：

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含IL15的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案168：根据实施方案167所述的经工程化的核酸，其中

a)在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对尾的方向性定向，

b)所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由包含E2A/T2A核糖体跳跃元件的接头多核苷酸序列分开，并且

c)结合至GPC3的CAR包含CD28细胞内信号传导结构域或OX40细胞内信号传导结构域。

实施方案169：一种经工程化的核酸，其包含：

第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列的和编码IL15的第二外源性多核苷酸序列，

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含IL15的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案170：根据实施方案169所述的经工程化的核酸，其中

a)所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由包含E2A/T2A核糖体跳跃元件的接头多核苷酸序列分开，并且

b)结合至GPC3的CAR包含CD28细胞内信号传导结构域或OX40细胞内信号传导结构域。

实施方案171：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:309至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案172：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:326至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案173：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:310至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案174：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:327至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案175：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:314至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案176：根据实施方案167至170中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:315至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案177：一种经工程化的核酸，其包含SEQ ID NO:310的核苷酸序列。

实施方案178：一种经工程化的核酸，其包含SEQ ID NO:327的核苷酸序列。

实施方案179：一种经工程化的核酸，其包含：

第一表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL12p70融合蛋白的第一外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，以及

第二表达盒，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第二外源性多核苷酸序列的第二启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，

其中所述ACP能够通过结合至所述ACP应答启动子来诱导所述第一外源性多核苷酸序列的表达，

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含IL12p70融合蛋白的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽。

实施方案180：根据实施方案179所述的经工程化的核酸，其中

a)在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向，并且

b)所述ACP包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中转录激活因子结构域包含VPR激活结构域。

实施方案181：根据实施方案179或180所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:317至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案182：根据实施方案179或180所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸包含与SEQ ID NO:318至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

实施方案183：一种经工程化的核酸，其包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列。

实施方案184：一种表达载体，其包含根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸。

实施方案185：一种免疫应答细胞，其包含根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸或根据实施方案184所述的表达载体。

实施方案186：一种药物组合物，其包含根据实施方案1至166或185中任一项所述的免疫应答细胞、根据实施方案167-183中任一项所述的经工程化的核酸或根据实施方案184所述的表达载体，以及药学上可接受的载剂、药学上可接受的赋形剂或其组合。

实施方案187：一种治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的根据实施方案1至166或185中任一项所述的免疫应答细胞中的任一者、根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸、根据实施方案184所述的表达载体或根据实施方案186所述的药物组合物。

实施方案188：一种在受试者中刺激针对肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的根据实施方案1至166或185中任一项所述的免疫应答细胞中的任一者、根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸、根据实施方案184所述的表达载体或根据实施方案186所述的药物组合物。

实施方案189：一种减小受试者中肿瘤体积的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用包含根据实施方案1至166或185中任一项所述的免疫应答细胞中的任一者、根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸、根据实施方案184所述的表达载体或根据实施方案186所述的药物组合物的组合物。

实施方案190：一种在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效剂量的根据实施方案1至166或185中任一项所述的免疫应答细胞中的任一者、根据实施方案167至183中任一项所述的经工程化的核酸、根据实施方案184所述的表达载体或根据实施方案186所述的药物组合物。

实施方案191：根据实施方案188至190中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包含表达GPC3的肿瘤。

实施方案192：根据实施方案188至191中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的群组：肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤。

实施方案193：一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的根据实施方案1至166或185中任一项的免疫应答细胞中的任一者、根据实施方案167至183中任一项的经工程化的核酸、根据实施方案184的表达载体或根据实施方案186的药物组合物。

实施方案194：根据实施方案193所述的方法，其中所述癌症包含表达GPC3的癌症。

实施方案195：根据实施方案193或实施方案194所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤。

实施方案196：根据实施方案187至195中任一项所述的方法，其中所述施用包括全身性施用。

实施方案197：根据实施方案187至195中任一项所述的方法，其中所述施用包括肿瘤内施用。

实施方案198：根据实施方案187至197中任一项所述的方法，其中免疫应答细胞来自受试者。

实施方案199：根据实施方案187至198中任一项所述的方法，其中免疫应答细胞相对于受试者是同种异体的。

实施例

下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例仅是出于说明目的而提供的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。例如，下面描述和进行的实验证明了对细胞进行工程化以分泌有效载荷(例如，效应分子)并递送这些细胞以诱导抗肿瘤的免疫原性应答的一般用途。

已经努力确保所用的数字的准确性(例如，数量，温度等)，但是当然应允许一些实验误差和偏差。

实施例1：抗GPC3 CAR+IL15双向构建体的表达和功能

评估了用抗GPC3 CAR+IL15双向构建体转导的细胞的蛋白表达、细胞活化和杀伤活性。在图1中示出了构建体的双向取向的卡通图。

材料和方法

在用编码构建体的慢病毒(感染复数MOI为40)或逆转录病毒(SinVec，每种约400μl)的非TC处理的retronectin包被的板中转导(50,000至100,000个细胞/转导)原代供体来源的NK细胞，所述构建体具有编码抗GPC3 CAR的第一表达盒和编码IL15的第二表达盒，其中两个表达盒呈头对头的双向取向。构建体在CAR的细胞内结构域中变化，具有4-1BB和CD3-ζ信号传导结构域(41BBz)、CD28和CD3-ζ信号传导结构域(CD28z)、OX40和CD3-ζ信号传导结构域(OX40z)或KIR3DS1信号传导结构域(KIR3DS1)，并且对每种构建体使用慢病毒或逆转录病毒系统的转导进行比较。作为对照，也用编码每种相同CAR的逆转录病毒和慢病毒进行转导，但没有IL15表达盒(“仅CAR”)。在转导后，在转移到24孔非贴壁细胞优化板之前，NK细胞在相同板中静置3天。将NK细胞扩增至总共5ml，在转导后第7天第一细胞因子掺加(spike-in)，并且在第15天第二次细胞因子掺加(每次掺加包括用于CAR+IL15转导和仅CAR转导的500IU/ml IL12，以及用于仅CAR构建体的10ng/ml IL15)。

在转导后的第五天和第七天，通过流式细胞术评估每种构建体的CAR表达。在图2中示出了来自用编码双向CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的细胞和用编码仅CAR的慢病毒转导的细胞的第七天CAR表达。在图3中示出了来自用编码双向CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的细胞和用编码仅CAR的逆转录病毒转导的细胞的第七天CAR表达。在图4中示出了来自用编码双向CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的细胞和用编码仅CAR的慢病毒转导的细胞的第十五天CAR表达。在图5中示出了来自用编码双向CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的细胞和用编码仅CAR的逆转录病毒转导的细胞的第十五天CAR表达。

在转导后的第七天，进行有效载荷测定以评估每种构建体的IL15水平。将每孔200,000个细胞铺板在96孔板中的200μl培养基(含IL2的NK MACs完全培养基)中。将NK细胞温育48小时，然后通过免疫测定来评估IL15水平。在图6中示出了IL15的表达。

然后进行共培养杀伤测定。将每孔25,000个靶细胞(Huh7 mKate细胞系或HepG2mKate细胞系)铺板在96孔板中。将效应细胞(表达每种构建体的NK细胞)以1:1或0.5:1的效应细胞与靶细胞(E与T)的比率加入到板中，并且用总体积为200μl的不含细胞因子的NKMACs完全培养基培养细胞。在共培养后的两到三天，进行实时的基于荧光的测定来测量mKate水平，以评估靶细胞杀伤。表达每种构建体的慢病毒转导的NK细胞的杀伤在图7中示出，并且表达每种构建体的逆转录病毒转导的NK细胞的杀伤在图8中示出。

结果

评估来自用每种构建体转导的NK细胞的CAR表达。如图2所示，在第七天，转导的NK细胞对于每种构建体具有可测量的CAR表达，其中每个转导群体中至少10％的细胞对于CAR表达是阳性的。如图3所示，在第十五天，慢病毒转导的NK细胞对每种构建体具有可测量的CAR表达(上图)，其中每个转导群体中至少20％的细胞对于CAR表达是阳性的。此外，如图3,所示，表达28z CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的NK细胞具有可测量的CAR表达，其中转导群体中至少42％的细胞对于CAR表达是阳性的。

还评估了用每种构建体转导的NK细胞的IL15表达。通过非转导的细胞和Ox40z仅CAR细胞的IL15表达的测定作为阴性对照进行。如图6所示，表达双向CAR+IL15的逆转录病毒转导的NK细胞在IL15产量上比相应的慢病毒转导的NK细胞具有统计学上显著的增加。

然后评估用每种构建体转导的NK细胞的杀伤作用。如图7所示，表达CAR+IL15双向构建体的慢病毒转导的NK细胞比单独表达CAR(没有IL15表达盒)的慢病毒转导的NK细胞具有统计学上显著增加的杀伤。如图8所示，表达CAR+IL15双向构建体的逆转录病毒转导的NK细胞比单独表达CAR(没有IL15表达盒)的逆转录病毒转导的NK细胞具有统计学上显著增加的杀伤。

实施例2：从编码可调节IL12和合成转录因子的双向构建体表达IL12

从被转导以表达双向构建体的NK细胞评估IL12表达，所述双向构建体包括编码可调节的IL12的第一表达盒和编码合成转录因子的第二表达盒。可调节的IL12被可操作地连接至合成转录因子应答启动子，该启动子包含ZF-10-1结合位点和最小启动子序列(YBTATA)。合成转录因子包括DNA结合结构域(六个锌指基序的阵列，称为ZF-10-1)和转录激活结构域(Vpr)。在DNA结合结构域和转录激活结构域之间是蛋白酶结构域(NS3)和蛋白酶的同源切割位点。在不存在蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶在切割位点处诱导切割，从而导致非功能性合成转录因子。在存在蛋白酶抑制剂的情况下，合成转录因子未被切割，因此能够调节IL12的表达。测试的构建体包括在3’非翻译区中具有mRNA去稳定化元件的IL12表达盒。在图9中示出了构建体的双向取向的卡通图。

材料和方法

产生了包括两个表达盒的双向构建体，第一表达盒编码可调节的IL12，并且第二表达盒编码小分子可调节的合成转录因子。第一构建体缺乏mRNA去稳定化元件(“WT”)，并且四个构建体各自包括添加到5’非编码区的不同mRNA去稳定化元件。所使用的四种去稳定化元件是：1)富含AU的基序(“AU”或“1XAU”)；2)茎-环去稳定化元件(“SLDE”或“1XSLDE”)；3)串联的AU基序和SLDE基序(“AuSLDE”或“1X AuSLDE”)；以及4)两个重复的AuSLDE基序(2XAuSLDE)。添加去稳定化元件以试图在合成启动子的小分子调节剂(例如，格拉瑞韦)不存在的情况下减少IL12表达的泄漏。

原代供体来源的NK细胞被扩增10天，并且在IL21和IL15中与K562饲养细胞一起生长，然后在Bx795预处理后，在retronectin包被的24孔板中以40的感染复数(MOI)(如通过感染单位滴度确定的)进行转导。以800g在32℃下用旋转接种法进行转导2小时。

在转导后的第三天，对NK细胞进行计数，并且以1e6个细胞/mL接种无药物或0.1uM格拉瑞韦(GRZ)持续24小时。

在转导后的第四天(用药物处理24小时)，收获上清液并且通过免疫测定分析IL12水平。在图10中示出了每种细胞类型和条件下的IL12浓度。

结果

如图10所示，与不存在药物相比，用每种构建体转导的NK细胞在用格拉瑞韦处理后表现出增加的IL12表达。用缺乏去稳定化元件(“WT”)的IL12转导的NK细胞在用格拉瑞韦处理后具有超过19倍的IL12表达的诱导。然而，用包括去稳定化标签的构建体转导的NK细胞在用格拉瑞韦处理2XAuSLDE、1X AuSLDE、1X AU和1X SLDE后，分别表现出IL12的约457倍、58倍、50倍和89倍诱导。此外，每种去稳定化标签在不存在格拉瑞韦的情况下降低基线IL12表达。此外，编码具有2X AuSLDE去稳定化元件的IL12的构建体导致在不存在格拉瑞韦的情况下IL12表达水平不可检测。

实施例3：抗GPC3 CAR+IL15双向构建体的表达和功能

评估了用抗GPC3 CAR+可切割释放IL15双向构建体转导的细胞的蛋白表达、细胞活化和杀伤活性。编码可切割释放IL15的表达盒包括包含IL15和跨膜结构域的嵌合多肽。在IL15和跨膜结构域之间是蛋白酶切割结构域，其可由对NK细胞内源性的蛋白酶切割。在图11中示出了编码可切割释放IL15的双向构建体的卡通图。

简而言之，用编码构建体的病毒载体转导原代供体来源的NK细胞，所述构建体具有编码抗GPC3 CAR的第一表达盒和编码可切割释放IL15表达盒的第二表达盒，其中两个表达盒呈头对头双向取向。

培养上清液：进行NK细胞的接种(第0天)。在第1、2和6天进行部分培养基交换。在第8天收获细胞培养上清液。

流式细胞术：在转导后第10天，通过流式细胞术来评估每种构建体的CAR和mbIL15表达。NK细胞用IL-15初级抗体和PE二级抗体以及rhGPC3-FITC和Sytox蓝色(活力染色)染色。在Cytoflex上运行细胞，并且使用Flowjo分析CAR/mbIL15表达。

有效载荷测定：在转导后第7天或第8天，进行有效载荷测定以评估每种构建体的IL15水平。将每孔200,000个细胞铺板在96孔板中的200μl培养基(仅含有IL2的NK MACs完全培养基)中，一式两份运行。将细胞温育48小时，然后通过Luminex免疫测定来评估切割的IL15水平。

系列杀伤测定：进行共培养杀伤测定。将每孔约25,000个靶细胞(Huh7mKate细胞系或HepG2 mKate细胞系)接种在96孔板中。将效应细胞(表达每种构建体的NK细胞)以1:1的效应物与靶(E与T)细胞比率添加到板中，一式三份，并且将细胞用NK MAC完全培养基(无细胞因子)以200μl的总体积培养。使用实时的基于荧光的测定来测量mKate，以评估在37℃下进行的系列杀伤测定中的靶细胞杀伤；初始杀伤在转导后第9天，系列一在转导后第11天，并且系列2在转导后第14天。

设计了超过150个IL15可切割释放(crIL15)构建体，并且选择33个构建体用于实验测试。(参见表7A)。在两个病毒主链(例如，SB06250和SB06256，如表7A中所示)中测试每种构建体。在表7B中示出了表达双顺反子构建体的子集的细胞的表达和杀伤活性的总结。构建体的子集的全长序列示于表7C中。在图12中提供了测试的双顺反子构建体及其功能活性的总结。

表7A.

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表7C.

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如上所述，评估包含CAR的NK细胞的构建体的表达，所述CAR包含OX40跨膜(TM)和共刺激(co-stim)结构域SB06251、SB06257和SB06254。如通过流式细胞术确定的结果在图13A和图13B中示出。如上所述测量分泌的IL-15；结果总结于图14A和图14B中。为了评估靶细胞群体的杀伤，如上所述确定细胞生长(图15A和图15B)。

还评估了包含SB06257的NK细胞的系列杀伤。在第0、2和5天添加靶细胞，并且使用Incucyte计算Huh7靶细胞计数。结果显示于图16中。

如上所述，评估包含CAR的NK细胞的构建体的表达，所述CAR包含CD28共刺激(co-stim)结构域SB06252、SB06258和SB06255。如通过流式细胞术FACS确定的结果在图17A和图17B中示出。如上所述测量分泌的IL-15；结果总结于图18A和图18B中。为了评估靶细胞群体的杀伤，如上所述确定细胞生长(图19A和图19B)。

还评估了包含SB06252和SB06258的NK细胞的系列杀伤。在第0、2和5天添加靶细胞，并且使用Incucyte计算Huh7靶细胞计数。结果显示于图20中。

双顺反子构建体的筛选

将0.5e6个NK供体7B细胞在存在新鲜照射的mbIL21/IL15 K562饲养细胞的情况下在retronectin包被的非TC 24孔板上扩增。以800g在32℃下离心接种2小时。对于病毒转导，添加300μl的病毒，总转导体积为500μl。

将细胞在同一板中以2ml最终体积培养持续整个扩增期。在评估表达并在功能测定中使用细胞之前，如上所述进行三次部分培养基交换。针对靶细胞的表达和细胞毒性的结果示于表8中。如所示出的，SB06261、SB6294和SB6298显示出良好的CAR和IL-15表达水平，如通过系列杀伤测定(n＝2)中的流动和良好的细胞毒性所确定的。流式细胞术表达数据在图21A和图21B中示出，IL-15水平在图22A和图22B中示出，并且靶细胞群体的细胞生长(作为通过NK细胞的细胞杀伤的量度)在图23A和图23B中示出。

由于其在功能测定中的高CAR和IL-15表达和性能，选择具有crIL15 2AOX40 CAR设计的逆转录病毒载体SBSB06294用于进一步研究。

TACE-OPT构建体的分析

如上所述，分析包括TACE10切割位点的双顺反子TACE-OPT构建体的CAR和IL-15表达、CNA测定和分泌的细胞因子的有效载荷测定。修饰TACE10切割位点以增加切割动力学，导致“TACE-OPT”，这与亲本TACE10相比导致更高的细胞因子分泌水平。分析三顺反子构建体的CAR和IL-15表达以及IL-12诱导。

简而言之，0.5e6个NK供体7B细胞在存在新鲜照射的mbIL21/IL15K562饲养细胞的情况下在retronectin包被的非TC 24孔板上扩增。以800g在32℃下离心接种2小时。对于病毒转导，添加300μl的病毒，总转导体积为500μl。

通过流式细胞术来评估双顺反子构建体SB6691(包含41BB共刺激结构域)、SB6692(包含OX40共刺激结构域)和SB6693(包含CD28共刺激结构域)的CAR和IL-15表达(图24A)。在表9中示出了每个细胞的每种构建体的拷贝数。如上所述在转导后48小时和24周定量IL-15分泌(图24B)。虽然所测试的TACE-OPT构建体具有相似的表达水平和细胞因子分泌，但SB06692(包含OX40共刺激结构域)具有最高的CAR表达。

表9.

拷贝数	YP7[CAR](拷贝/细胞)	IL-15(拷贝/细胞)	WPRE(拷贝/细胞)
				SB06691	116.6	120.2	147.2
SB06692	308.3	318.3	313.0
				SB06693	48.8	49.4	57.6

SB06258、SB06257、SB06294和SB06692在体外表现出高CAR表达、高crIL-15表达(膜结合和分泌两者)和高系列杀伤功能。

实施例4：IL12从编码可调节的可切割释放型IL12和合成转录因子的双向构建体中的表达

评估用编码可调节的可切割释放型IL12和合成转录因子的双向构建体转导的NK细胞的IL12表达，其中转导如上文实施例3中所述进行。可调节的可切割IL12可操作地连接至合成转录因子应答启动子，其包括ZF-10-1结合位点和最小启动子序列。合成转录因子包括DNA结合结构域和转录激活结构域。在DNA结合结构域和转录激活结构域之间是蛋白酶结构域，其可由蛋白酶抑制剂和蛋白酶的同源切割位点调节。在不存在蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶在切割位点处诱导切割，从而导致非功能性合成转录因子。在蛋白酶抑制剂的存在下，合成转录因子未被切割，并且因此能够调节可切割IL12的表达。编码可切割释放IL12的表达盒包括嵌合多肽，所述嵌合多肽包括IL12和跨膜结构域。在IL12和跨膜结构域之间是可由对NK细胞内源性的蛋白酶切割的蛋白酶切割结构域。在图25中示出了编码可切割释放12的双向构建体的卡通图。本文测试的构建体的参数总结于表10中。所测试的设计包括：可切割释放IL12(crIL12)调节的构建体(所测试的32个构建体)、可溶性IL12(sIL12)调节的和/或WPRE和polyA+不同的去稳定化结构域(所测试的32个构建体)、去稳定化结构域和/或WPRE和polyA(所测试的26个构建体)。初始研究表明，毒性通常是由于IL-12的泄漏表达，导致在转导后不良的NK细胞活力和扩增(数据未示出)。通过修改表10中的参数，设计了筛选来发现可以克服或降低IL-12相关毒性的构建体。筛选标准的总结在表11A中示出。鉴定合适的候选物SB05058和SB05042(两者都是γ逆转录病毒载体)和SB04599(慢病毒载体)。这些候选物的总结在表11B中提供。

表10.

表11A.

表11B.

进行γ逆转录病毒载体和慢病毒载体的评估。测量IL12分泌的格拉瑞韦(GRZ)剂量应答测定表明，与慢病毒构建体相比，两种γ逆转录病毒构建体均显示出对GRZ更高的敏感性(图26和表12A)。

表12A.

[GRZ]μM	SB04599	SB05042	SB05058
				2	1762.68	10629.99	7167.37
0.6	1387.37	8722.87	10922.93
				0.16	514.02	2031.82	1470.22
0.05	112.14	173.44	151.69
				0.013	4.80	31.57	29.72
0.004	u.d	28.48	35.83
				0.001	u.d	28.48	14.83
0	u.d	11.27	17.56

ud＝<5pg/ml，不可检测

在NK细胞转导后10天确定构建体表达和细胞活力。结果示于表12B中，并且证实在中等规模板中的超过10倍的细胞扩增、高于85％的活力以及大于2个拷贝/细胞。与慢病毒载体相比，γ逆转录病毒载体显示出NK细胞的更高的转导效率，特别是对于所测试的双向载体。

表12B.

病毒载体	SB#	MOI	活力(％)	扩增倍数	CNA(平均拷贝/细胞)
							NV	不适用	88	29.9	不适用
慢病毒	4599	29.7	89	19.6	1.0
						γ逆转录病毒	5042	83.5	89	15.1	1.6
γ逆转录病毒	5058	0.8	86	11.6	1.8

另外，在体内评估IL12诱导。简而言之，以200μL体积向小鼠静脉内注射15e6个细胞的剂量的转导的NK细胞。在注射后24小时收集血液，并且测定IL12表达水平。SB05042和SB05058显示出最高的IL12诱导倍数。在10mg/kg剂量组中未观察到诱导(数据未示出)。对于所有构建体，确定小鼠血液中的％hNK的百分比小于2％。结果总结于表12C中。IL12水平在图27A中示出，并且变化倍数在图27B中示出。

表12C.

病毒载体	SB#	-GRZ(pg/ml)	+GRZ(pg/ml)	变化倍数
						NV	0.6	1.35	1.35
慢病毒	4599	1.35	14.16	9.30
					γ逆转录病毒	5042	0.71	49.0	48.99
γ逆转录病毒	5058	1.0	117.62	118.12

与慢病毒载体(SB04599)相比，γ逆转录病毒载体(SB05042和SB05058)在体外表现出优异的IL12诱导，同时在转导后维持良好的活力和细胞生长。重要的是，两种测试的γ逆转录病毒载体在体内NK细胞中显示出IL12诱导。

本实施例中所描述的构建体的全长序列示于表13中。

表13.

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实施例5：GPC3 CAR/IL15表达构建体的筛选

对NK细胞中GPC3 CAR/IL15表达构建体的表达和功能进行评估。将2e6个NK细胞铺板到6孔非TC处理的retronectin包被的板中。在铺板的NK细胞上进行经由离心接种的单个病毒转导(MOI＝15)。使用含有表达构建体的慢病毒或逆转录病毒来转导NK细胞。评估CAR和膜IL15的表达，如图28A所示。用构建体SB06257、SB06258、SB06294和SB06692转导的NK细胞在门控群体中表现出大于65％的细胞的表达。另外，图28A示出了每个转导的NK细胞群体的YP7和IL15的测量的拷贝数。

除了评估CAR表达之外，还使用相同的表达构建体测量分泌的IL-15。为了测量分泌的IL-15的水平，在IL2的存在下将200,000个转导的NK细胞悬浮在200μL的MACS培养基中。在转导后48小时测量分泌的IL-15。针对每种构建体测量分泌的IL-15的浓度，并且结果显示于图28B中。

还评估了用构建体转导的NK细胞的系列杀伤。在第0、2和5天添加靶细胞，并且在研究期间测量靶细胞杀伤。HepG2靶细胞的连续NK细胞杀伤的结果在图28C和图29A中示出。图29B示出了HuH-7靶细胞的连续NK细胞杀伤的结果。

表14示出了用于本研究的示例性构建体及其组分。

表14

构建体	基础载体	共刺激	取向
				SB06257	SinVec	OX40	CAR 2A crIL15(T10)
SB06258	SinVec	CD28	CAR 2A crIL15(T10)
				SB06294	RetroVec	OX40	crIL15 2A CAR(T10)
SB06692	SinVec	OX40	crIL15 2A CAR(T-OPT)

实施例6：测量扩增的NK细胞中的GPC3 CAR/IL15表达和功能

在该研究中，对于使用G-Rex(Gas快速扩增)系统扩增的NK细胞，测量GPC3 CAR/IL15的表达和功能。

在两种不同的G-Rex实验方法中转导和扩增7天龄的供体衍生的7B NK细胞(mbIL21/IL15 K562饲养细胞)。实验1在G-Rex 6M培养容器中转导7天供体7B NK细胞(mbIL21/IL15 K562饲养细胞)持续11天，并且在转导后11天收获。实验2在G-Rex 1L培养容器中转导7天供体7B NK细胞(mbIL21/IL15 K562饲养细胞)持续7天，并且在转导后10天收获。图30A证实了不同扩增条件对工程化的NK细胞中不同目的蛋白质的表达的影响。图30B示出了来自衍生自不同实验的NK细胞的系列杀伤测定测量结果。

表15示出了在实施例6中进行的研究的总结。顶部数字对应于从使用实验1的方法扩增的NK细胞获得的结果。底部数字对应于从使用实验2的方法扩增的NK细胞获得的结果。

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实施例7：在异种移植肿瘤模型中GPC3 CAR/IL15双顺反子构建体的评估

使用HepG2异种移植肿瘤模型来评估所选的工程化的NK细胞的体内功能。进行了两项研究：双重NK剂量和三倍NK剂量。

双重NK剂量体内异种移植肿瘤模型

在第0天将肿瘤植入NSG小鼠中。在第9天随机化小鼠。在整个研究过程中，在第10天和第17天注射NK细胞两次。表16总结了研究设置。

表16：在体内异种移植肿瘤模型中双重NK给药的总结

*由于细胞#限制，第二剂量为约15e6

对于该存活研究，杰克逊实验室(Jackson Labs)NSG小鼠也每周两次注射50,000IU rhIL2/小鼠。每周两次进行生物发光成像(BLI)、体重和总体健康测量。在对小鼠实施安乐死后，收集肿瘤、称重和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)以用于组织学。从IP空间收集IP流体和细胞，并且通过流式细胞术评估NK细胞％。图31总结了HepG2异种移植肿瘤模型中归一化的平均BLI测量值的变化倍数的结果。与其他处理组相比，SB06258显示出最低的归一化的平均BLI，并且发现与无病毒(NV)组相比具有统计学显著性。图32A示出了动物的存活曲线，并且图32B示出了每个处理组的中值存活期的总结。发现与未工程化的NK细胞相比，所测试的不同CAR构建体中的每一种具有统计学显著性。

图33示出了用不同的CAR-NK细胞处理的小鼠的时程，如通过生物发光成像(BLI)测量和观察到的。在处理后3天、10天、34天、48天和69天对此处所示的动物进行成像。在图34中，将BLI测量值相对于第10天(第一剂量)进行归一化。

三重给药-体内HepG2异种移植肿瘤模型

使用HepG2异种移植肿瘤模型来评估所选的工程化的NK细胞的体内功能。在另一体内实验中，在第0天将肿瘤植入NSG小鼠中。在第9天和第20天对小鼠进行随机化。在研究期间，在第10、15和22天注射(IP)30e6个NK细胞三次。表17总结了研究设置。在第21天，一半小鼠被实施安乐死。另一半在研究的第50天处死。在对小鼠实施安乐死后，收集肿瘤、称重和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)以用于组织学。

表17：HepG2异种移植模型的研究设计

对于该存活研究，杰克逊实验室NSG小鼠也每周两次注射50,000IU rhIL2/小鼠。每周两次进行生物发光成像(BLI)、体重和总体健康测量。从IP空间收集IP流体和细胞，并且通过流式细胞术评估NK细胞％。图35A示出了在研究的第23天的代表性BLI图像。图35B总结了HepG2异种移植肿瘤模型中归一化的平均BLI测量值的变化倍数的结果。

在实验的不同阶段评估BLI测量值的变化倍数，以评估单剂量或双倍剂量的经工程化的NK细胞的效果。图36A示出了第13天BLI测量值的变化倍数，其中小鼠已经经历了一剂工程化的NK细胞。图36B示出了在第20天BLI测量值的变化倍数，其中小鼠已经经历了两剂经工程化的NK细胞。

来自两个体内实验的结果的比较呈现于图37A和图37B。在图37A，在异种移植模型中测试不同的CAR构建体，绘制在研究过程中BLI的变化倍数。如图37A和图37B所示，两个体内实验在SB06257和SB06258的抗肿瘤功能方面表现出差异。在IP HCC(HepG2+荧光素酶)异种移植模型中，与未工程化的NK细胞相比，GPC3 CAR-crIL-15NK细胞疗法显示出静态显著的体内抗肿瘤功效。用GPC3 CAR-crIL-15工程化的NK细胞处理的所有3个组显示出比未经处理(PBS)和未经工程化的NK细胞处理组显著增加的存活率。

体内异种移植模型-NK细胞的瘤内注射

使用另一种实验方法来证明HepG2(HCC)皮下异种移植肿瘤模型的NK介导的抗肿瘤杀伤。在此存活研究中，小鼠在第20、25和32天被注射3e6个NK细胞三次。图38A证实在不存在或存在注射的工程化的NK细胞的情况下小鼠中的肿瘤生长。与在皮下HCC(HepG2+荧光素酶)异种移植模型中瘤内(IT)注射的未工程化的NK细胞相比，GPC3 CAR-crIL-15NK细胞疗法显示出显著的体内抗肿瘤功效。用SB05605转导的NK细胞显示出比未经处理(PBS)和未经工程化的NK细胞处理组显著增加的存活率。表18提供了用于NK细胞的瘤内注射的构建体。SB05009和SB06205含有分离的IL15和GPC3 CAR，并且它们的表达由单独的启动子(SV40启动子＝GPC3 CAR，hPGK启动子＝IL15)驱动。另外，这些构建体被定向成使得阅读框被定向在相反方向上。

表18

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实施例8：在天然杀伤细胞中评估IL12的格拉瑞韦诱导

对于这项研究，在存在和不存在格拉瑞韦(一种HCV NS3蛋白酶的抑制剂)的情况下测量IL12的诱导。用于本研究的构建体先前已经在实施例2中描述。两种可调节的IL-12构建体以剂量响应方式证实GRZ控制crIL-12表达，并且显示出低供体间变异性。

在不存在GRZ(小于100pg/ml)的情况下，测试的构建体候选物导致低IL-12基础水平，并且通过0.1μM的GRZ(p＝<0.0001)诱导大于100倍的IL-12。图39A至39B示出了在将GRZ添加到表达SB05042和SB05058构建体的NK细胞中之后的两个不同时间点(分别为24小时和72小时)。

为了评估格拉瑞韦是否可以用于在小鼠模型中将处于接通状态的回路转变为断开状态的回路或者将断开状态的回路转变为接通状态的回路，设计了以下研究。在第0天，在存在格拉瑞韦或媒剂的情况下注射(IV)NK细胞。在第1天、第9天和第10天，注射另一剂量的格拉瑞韦或媒剂。在第2、9和11天使小鼠放血以评估IL-12的表达。图40示出了研究的结果。在第2天，与对照相比，IL12表达在20、50和100mg/kg GRZ的存在下增加。在第9天(其中8天未发生GRZ施用)，与第2天的采样相比，IL12的表达降低。在第11天，表达相对于对照再次增加。

实施例9：GPC3 CAR/IL15和调节的IL12构建体的共转导的评估

在与GPC/IL15构建体和调节的IL12构建体共转导的NK细胞中评估GPC3 CAR、IL15和IL12的功能和表达。

GPC3 CAR/IL15的表达

测试了三种构建体组合：1)SB05042+SB0257，2)SB05042+SB06258，以及3)SB05042和SB06294。与SB05042+SB06257或SB05042+SB06258共转导的NK细胞表达GPC3 CAR和IL15群体，并且每个细胞具有相似的拷贝。与SB06294共转导的NK细胞表现出更高的双重阳性(GPC+/IL15+)群体，仅CAR群体略微减少，并且每个细胞具有相似的拷贝(图41)

分泌的IL12和IL15的表达

在存在或不存在格拉瑞韦的情况下，在NK细胞中测量分泌的IL12和IL15的表达。将200,000个转导的NK细胞悬浮在补充有IL-2的200μL的NK MACS培养基中。以0.1μM的摩尔浓度将格拉瑞韦添加到“+”条件中。在测量上清液的IL15(图42A)和IL12(图42B)浓度之前，将NK细胞在37C下温育48小时。IL15表达在存在格拉瑞韦的情况下略微增加，其中共转导的NK细胞在存在GRZ的情况下显示出统计学上显著的IL15表达。与在不存在格拉瑞韦的情况下的12pg/mL(1100倍诱导)相比，在存在格拉瑞韦的情况下，与SB05042+SB06257共转导的NK细胞表达2201pg/mL IL12。SB05042+SB06258共转导在存在格拉瑞韦的情况下表现出1003倍的诱导。SB05042+SB06294共转导表现出736倍的诱导。与用单独的SB05042转导的NK细胞相比，三种共转导组合具有统计学显著性。在评估IL12表达时，用单独的SB05042转导的NK细胞在存在格拉瑞韦的情况下显示出IL12的诱导，显示出表达增加390倍。

在系列杀伤期间的细胞因子分泌(Huh7)

如先前所述，使用NK细胞进行靶细胞的系列杀伤，所述NK细胞与GPC3 CAR/IL15(SB06257、SB06258、SB06294)和/或IL12构建体(SB05042)单独转导或共转导。

共转导的样品在GRZ的存在下维持低量的IL12诱导进入第3轮。在IL12和IL15两者中总体细胞因子分泌随时间推移而减少(图43)。在存在格拉瑞韦的情况下，SB05042和SB05042+SB06257转导在第一轮杀伤中显示出IL12表达的显著诱导。在第二轮中，与不同的表达GPC3 CAR的构建体(SB06257、SB06258、SB06294)和SB05042的三种共转导显示出IL12的统计学显著诱导。在第三轮中，仅SB05042+SB06257和SB05042+SB06294显示出显著的IL12诱导。

具有共转导的NK细胞的系列杀伤测定

使用系列杀伤测定来评估与GPC3 CAR/IL15(SB06257、SB06258、SB06294)和/或IL12构建体(SB05042)共转导的NK细胞的细胞杀伤效应。与SB05042+SB06258(图44A)、SB05042+SB06257(图44B)和SB05042+SB06294(图44C)共转导的NK细胞用于系列杀伤测定中，其中在第一轮和第三轮细胞杀伤时添加GRZ。当与HepG2共培养时，与huh7相比，我们看到+/-GRZ(诱导的IL12或不诱导的IL12)之间的差异更大。图44D示出了图44A-44C中所示的数据的组合。

实施例10：GPC3 CAR/IL15克隆的选择

通过转导稳定地整合表达构建体的NK细胞来进行克隆的选择。使用较低的MOI(MOI＝3)用于SB06258的克隆选择。在SB06258和SB07273(与SB06258相同，但含有卡那霉素抗性标志物而不是氨苄青霉素抗性标志物)中也进行了对照瞬时转导(MOI＝15)。转导后8天，评估细胞。与使用SB06258的瞬时转导相比，在PCB克隆中每个细胞的拷贝更低(图45A)。CAR表达在不同的PCB克隆(图45B)以及IL15+群体(图45C)中相对恒定。测量PCB克隆的分泌的IL15大于30pg/mL(图45D)。

流式细胞术还用于评估GPC3 CAR和IL15在PCM克隆中的表达。作为对照，SB07473用于以MOI＝15转导NK细胞。PCB克隆以3.0的MOI转导。对于所有PCR克隆，GPC3 CAR表达大于20％(图46A)。

对于选定的克隆，还共转导SB05042以评估转导后9天GPC3 CAR、膜结合的IL15和膜结合的IL12的表达。将克隆3(MOI＝3.0)和克隆4(MOI＝3.0)与SB05042(MOI＝0.05)共转导。在共转导期间，存在相似的GPC3 CAR和膜结合的IL12的表达(图46B)。表19示出了用SB06258转导的PCB克隆的表达水平的总结。

表19

表20

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Claims

1.一种免疫应答细胞，其包含：

a)第一经工程化的核酸，所述第一经工程化的核酸包含第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列和编码第一细胞因子的第二外源性多核苷酸序列；和

b)第二经工程化的核酸，所述第二经工程化的核酸包含第二表达盒和第三表达盒，所述第二表达盒包含可操作地连接至编码第二细胞因子的第三外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子，所述第三表达盒包含可操作地连接至编码有条件激活控制多肽(ACP)的第四外源性多核苷酸序列的第三启动子，其中所述ACP包含合成转录因子，所述合成转录因子包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，

S-C-MT或MT-C-S

其中

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽，

任选地其中在所述第一经工程化的核酸内所述第二表达盒的转录相对于所述第三表达盒的转录定向在相反的方向上，并且任选地其中在所述第二经工程化的核酸内所述第二表达盒和所述第三表达盒以头对头的方向性定向。

2.根据权利要求1所述的免疫应答细胞，其中：

a)所述第一启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子，任选地其中所述第一启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb；和/或

b)所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由接头多核苷酸序列分开，任选地其中所述接头多核苷酸序列与作为单独多肽的所述第一细胞因子和所述CAR的翻译可操作地相关联，任选地其中所述接头多核苷酸序列编码一种或多种2A核糖体跳跃元件，任选地其中所述一个或多个2A核糖体跳跃元件各自选自由以下组成的群组：P2A、T2A、E2A、F2A及其组合，任选地其中所述一个或多个2A核糖体跳跃元件包括E2A/T2A组合，任选地其中所述E2A/T2A组合包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列；和/或

c)所述第三启动子包含组成型启动子、诱导型启动子或合成启动子，任选地其中所述第三启动子是选自由以下组成的群组的组成型启动子：CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb；和/或

d)所述第一细胞因子是IL-15，任选地其中所述IL-15包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列，并且所述第二细胞因子选自由以下组成的群组：IL12、IL12p70融合蛋白、IL18和IL21，任选地其中所述第二细胞因子是IL12p70融合蛋白，任选地其中所述IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫应答细胞，其中：

a)所述蛋白酶切割位点可由选自由以下组成的群组的蛋白酶切割：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶、MMP9蛋白酶和NS3蛋白酶；或者

b)所述蛋白酶切割位点可由ADAM17蛋白酶切割；或者

c)所述蛋白酶切割位点包含具有PRAE(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列的第一区域，和/或所述蛋白酶切割位点包含具有KGG(SEQ ID NO:177)的氨基酸序列的第二区域，

任选地其中所述第一区域位于所述第二区域的N末端；或者

d)所述蛋白酶切割位点包含PRAEX1X2KGG(SEQ ID NO:178)的氨基酸序列，

其中X1是A、Y、P、S或F，并且

其中X2是V、L、S、I、Y、T或A；或者

e)所述蛋白酶切割位点包含PRAEAVKGG(SEQ ID NO:179)的氨基酸序列；或者

f)所述蛋白酶切割位点包含PRAEALKGG(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列；或者

g)所述蛋白酶切割位点包含PRAEYSKGG(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列；或者

h)所述蛋白酶切割位点包含PRAEPIKGG(SEQ ID NO:182)的氨基酸序列；或者

i)所述蛋白酶切割位点包含PRAEAYKGG(SEQ ID NO:183)的氨基酸序列；或者

j)所述蛋白酶切割位点包含PRAESSKGG(SEQ ID NO:184)的氨基酸序列；或者

k)所述蛋白酶切割位点包含PRAEFTKGG(SEQ ID NO:185)的氨基酸序列；或者

l)所述蛋白酶切割位点包含PRAEAAKGG(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列；或者

m)所述蛋白酶切割位点包含DEPHYSQRR(SEQ ID NO:187)的氨基酸序列；或者

n)所述蛋白酶切割位点包含PPLGPIFNPG(SEQ ID NO:188)的氨基酸序列；或者

o)所述蛋白酶切割位点包含PLAQAYRSS(SEQ ID NO:189)的氨基酸序列；或者

p)所述蛋白酶切割位点包含TPIDSSFNPD(SEQ ID NO:190)的氨基酸序列；或者

q)所述蛋白酶切割位点包含VTPEPIFSLI(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列；或者

r)所述蛋白酶切割位点包含ITQGLAVSTISSFF(SEQ ID NO:198)的氨基酸序列，

任选地其中所述蛋白酶切割位点包含在肽接头内，

任选地其中所述蛋白酶切割位点在肽接头的N末端，和/或

任选地其中所述肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫应答细胞，其中：

a)所述细胞膜栓系结构域包含跨膜-胞内结构域或跨膜结构域，任选地其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自PDGFR-β、CD8、CD28、CD3ζ链、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、NKG2D、EpoR、TNFR2、B7-1或BTLA，任选地其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域衍生自B7-1，任选地其中所述跨膜-胞内结构域和/或跨膜结构域包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列；和/或

b)所述细胞膜栓系结构域包含翻译后修饰标签或能够进行翻译后修饰以将所述嵌合蛋白修饰成包括翻译后修饰标签的基序，其中所述翻译后修饰标签能够与细胞膜缔合，任选地其中所述翻译后修饰标签包含脂质锚结构域，任选地其中所述脂质锚结构域选自由以下组成的群组：GPI脂质锚、豆蔻酰化标签和棕榈酰化标签；和/或

c)所述细胞膜栓系结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分；和/或

d)所述膜可切割嵌合蛋白的所述细胞因子被栓系在所述细胞的细胞膜上；和/或

e)其中所述细胞进一步包含能够切割所述蛋白酶切割位点的蛋白酶，任选地其中所述蛋白酶对所述细胞是内源性的，任选地其中所述蛋白酶选自由以下组成的群组：1型跨膜蛋白酶、II型跨膜蛋白酶、GPI锚定蛋白酶、ADAM8蛋白酶、ADAM9蛋白酶、ADAM10蛋白酶、ADAM12蛋白酶、ADAM15蛋白酶、ADAM17蛋白酶、ADAM19蛋白酶、ADAM20蛋白酶、ADAM21蛋白酶、ADAM28蛋白酶、ADAM30蛋白酶、ADAM33蛋白酶、BACE1蛋白酶、BACE2蛋白酶、SIP蛋白酶、MT1-MMP蛋白酶、MT3-MMP蛋白酶、MT5-MMP蛋白酶、弗林蛋白酶、PCSK7蛋白酶、蛋白裂解酶蛋白酶、蛋白裂解酶-2蛋白酶和MMP9蛋白酶，任选地其中所述蛋白酶是ADAM17蛋白酶，任选地其中所述蛋白酶在所述细胞的所述细胞膜上表达，任选地其中所述蛋白酶能够切割所述蛋白酶切割位点，任选地其中所述蛋白酶切割位点的切割从所述细胞的所述细胞膜释放所述膜可切割嵌合蛋白的所述细胞因子；和/或

f)所述第一外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白；和/或

g)所述第一外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列，任选地其中所述分泌信号肽衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：IL-12、胰蛋白酶原-2、Gaussia荧光素酶、CD5、IgKVII、VSV-G、催乳素、血清白蛋白前原蛋白、天青杀素前原蛋白、骨粘连蛋白(BM40)、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、serpin-E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、GMCSFRa、NKG2D和IgE，任选地其中所述分泌信号肽衍生自GMCSFRa，任选地其中所述分泌信号肽包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列，任选地其中所述分泌信号肽与所述CAR可操作地相关联；和/或

h)所述第二外源性多核苷酸序列进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列，任选地其中所述分泌信号肽衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：IL-12、胰蛋白酶原-2、Gaussia荧光素酶、CD5、IgKVII、VSV-G、催乳素、血清白蛋白前原蛋白、天青杀素前原蛋白、骨粘连蛋白(BM40)、CD33、IL-6、IL-8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、serpin-E1、GROα、CXCL12、IL-21、CD8、GMCSFRa、NKG2D和IgE，任选地其中所述分泌信号肽衍生自IgE，任选地其中所述分泌信号肽包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列，任选地其中所述分泌信号肽与所述第一细胞因子可操作地相关联；和/或

i)所述第三外源性多核苷酸序列编码膜可切割嵌合蛋白；和/或

j)所述第二外源性多核苷酸序列编码第一膜可切割嵌合蛋白，并且所述第三外源性多核苷酸序列编码第二膜可切割嵌合蛋白。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫应答细胞，其中:

a)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，

其中所述VH包含：

具有KNAMN(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)，

其中所述VL包含：

具有QQYYNYPLT(SEQ ID NO:204)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；和/或

b)所述VH区包含

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:206)的氨基酸序列；和/或

c)所述VH区包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列；和/或

d)所述VL区域包含

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列；和/或

e)所述VL区包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列，

任选地其中所述抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)，

任选地其中所述VH和VL由肽接头分开，

任选地其中所述肽接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头，

任选地其中所述GS接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:223)的氨基酸序列，

任选地其中所述scFv包括结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为所述重链可变结构域，L为所述肽接头，并且VL为所述轻链可变结构域，

任选地其中所述CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且所述一个或多个细胞内信号传导结构域中的每一者选自由以下组成的群组：CD3ζ-链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域、MyD88细胞内信号传导结构域、2B4细胞内信号传导结构域、CD16a细胞内信号传导结构域、DNAM-1细胞内信号传导结构域、KIR2DS1细胞内信号传导结构域、KIR3DS1细胞内信号传导结构域、NKp44细胞内信号传导结构域、NKp46细胞内信号传导结构域、FceRlg细胞内信号传导结构域、NKG2D细胞内信号传导结构域和EAT-2细胞内信号传导结构域，

任选地其中所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD28细胞内信号传导结构域，其中所述CD28细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，

任选地其中所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含CD3z细胞内信号传导结构域，其中所述CD3z细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:277或SEQ ID NO:279的氨基酸序列，

任选地其中所述CAR包含跨膜结构域，并且所述跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域CD3ζ-链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域、BTLA跨膜结构域、OX40跨膜结构域、DAP10跨膜结构域、DAP12跨膜结构域、CD16a跨膜结构域、DNAM-1跨膜结构域、KIR2DS1跨膜结构域、KIR3DS1跨膜结构域、NKp44跨膜结构域、NKp46跨膜结构域、FceRlg跨膜结构域和NKG2D跨膜结构域，

任选地其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ IDNO:236或SEQ ID NO:242的氨基酸序列，

任选地其中所述CAR包含所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区，其中所述间隔区衍生自选自由以下组成的群组的蛋白质：CD8、CD28、IgG4、IgG1、LNGFR、PDGFR-β和MAG，任选地其中所述间隔区是包含SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:228的氨基酸序列的CD8铰链。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫应答细胞，其中：

a)所述ACP包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述转录效应子结构域包含转录激活因子结构域，任选地其中所述转录激活因子结构域选自由以下组成的群组：单纯疱疹病毒蛋白16(VP16)激活结构域；包含VP16的四个串联拷贝的激活结构域；VP64激活结构域；NFκB的p65激活结构域；爱泼斯坦-巴尔病毒R反式激活因子(Rta)激活结构域；包含VP64、p65和Rta激活结构域(VPR激活结构域)的三联激活因子；人E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域(p300 HAT核心激活结构域)，任选地其中所述转录激活因子结构域包含VPR激活结构域，所述VPR激活结构域包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列；和/或

b)所述DNA结合结构域包含锌指(ZF)蛋白结构域，其中所述ZF蛋白结构域在设计上是模块化的，并且包含锌指基序的阵列，任选地其中所述ZF蛋白结构域包含一至十个锌指基序的阵列，任选地其中所述ZF蛋白结构域包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列；和/或

c)所述ACP进一步包含阻遏型蛋白酶和所述阻遏型蛋白酶的一个或多个同源切割位点，任选地其中所述阻遏型蛋白酶是包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)，任选地其中所述阻遏型蛋白酶的所述同源切割位点包含NS3蛋白酶切割位点，所述NS3蛋白酶切割位点包含NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A或NS5A/NS5B接合切割位点，任选地其中所述NS3蛋白酶能够被选自由以下组成的群组的蛋白酶抑制剂阻遏：西美瑞韦、达诺瑞韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利瑞韦、替拉瑞韦、格拉瑞韦、格卡瑞韦和伏西瑞韦，任选地其中所述阻遏型蛋白酶的所述一个或多个同源切割位点位于所述DNA结合结构域和所述转录效应子结构域之间；和/或

d)所述ACP进一步包含核定位信号(NLS)，所述核定位信号包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列；和/或

e)所述ACP进一步包含雌激素受体变体ERT2的激素结合结构域；和/或

f)所述ACP应答启动子是包含ACP结合结构域序列和最小启动子序列的合成启动子，任选地其中所述ACP结合结构域序列包含一个或多个锌指结合位点。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫应答细胞，其中：

a)所述第一经工程化的核酸包含SEQ ID NO:309的核苷酸序列、SEQ ID NO:326的核苷酸序列、SEQ ID NO:310的核苷酸序列、SEQ ID NO:327的核苷酸序列、SEQ ID NO:314的核苷酸序列或SEQ ID NO:315的核苷酸序列；并且

b)所述第二经工程化的核酸包含SEQ ID NO:317的核苷酸序列或SEQ ID NO:318的核苷酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞选自由以下组成的群组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、红细胞、血小板细胞、人胚胎干细胞(ESC)、ESC衍生细胞、多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和iPSC衍生细胞，

任选地其中所述细胞是自体的，或者所述细胞是同种异体的。

9.一种经工程化的核酸，其包含：

第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至编码结合至GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸序列和编码IL15的第二外源性多核苷酸序列，

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含IL15的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽，

任选地其中所述第一外源性多核苷酸序列和所述第二外源性多核苷酸序列由包含E2A/T2A核糖体跳跃元件的接头多核苷酸序列分开，

任选地其中结合至GPC3的CAR包含CD28细胞内信号传导结构域，

任选地其中所述经工程化的核酸包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列：SEQ IDNO:：309、326、310、327、314和315。

10.一种经工程化的核酸，其包含：

第一表达盒，所述第一表达盒包含可操作地连接至编码IL12p70融合蛋白的第一外源性多核苷酸序列的合成转录因子应答启动子；和

S-C-MT或MT-C-S

其中

S包含有包含IL12p70融合蛋白的可分泌效应分子，

C包含蛋白酶切割位点，并且

MT包含细胞膜栓系结构域，并且

其中S-C-MT或MT-C-S被配置为表达为单一多肽，

任选地其中在所述第一经工程化的核酸内所述第一表达盒和所述第二表达盒以头对头的方向性定向，

任选地其中所述ACP包含DNA结合结构域和转录效应子结构域，其中所述转录激活因子结构域包含VPR激活结构域，

任选地其中所述经工程化的核酸包含选自由SEQ ID NO:317和318组成的群组的核苷酸序列。

11.一种表达载体，其包含根据权利要求9或权利要求10所述的经工程化的核酸。

12.一种免疫应答细胞，其包含根据权利要求9或权利要求10所述的经工程化的核酸，或根据权利要求11所述的表达载体。

13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8或12中任一项所述的免疫应答细胞、根据权利要求9或10所述的经工程化的核酸或根据权利要求11所述的表达载体，以及药学上可接受的载剂、药学上可接受的赋形剂或其组合。

14.一种在受试者中刺激针对肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答、减小肿瘤体积或提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效剂量的根据权利要求1至8或12中任一项所述的免疫应答细胞、根据权利要求9或10所述的经工程化的核酸、根据权利要求11所述的表达载体或根据权利要求13所述的药物组合物中的任一者，

任选地其中所述肿瘤包含表达GPC3的肿瘤，任选地其中所述肿瘤选自由以下组成的群组：肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤，

任选地其中所述施用包括全身性施用或肿瘤内施用，

任选地其中所述免疫应答细胞来自所述受试者或相对于所述受试者是同种异体的。

15.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的根据权利要求1至8或12中任一项所述的免疫应答细胞中的任一者、根据权利要求9或10所述的经工程化的核酸、根据权利要求11所述的表达载体或根据权利要求13所述的药物组合物，

任选地其中所述癌症包括表达GPC3的癌症，

任选地其中所述癌症选自由肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯氏瘤)和卵黄囊瘤组成的群组，

任选地其中所述施用包括全身性施用或肿瘤内施用，

任选地其中所述免疫应答细胞衍生自所述受试者或相对于所述受试者是同种异体的。