CN113164518A - 组合癌症免疫疗法 - Google Patents

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王敦弘
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Abstract

本文提供了用于动态控制和靶向癌症的多种免疫抑制机制的方法和组合物。一些方面提供了被工程化用于产生多种各自调节肿瘤的不同免疫抑制机制的效应分子的细胞，以及使用所述细胞治疗例如卵巢癌、乳腺癌或结肠癌的癌症的方法。

Description

组合癌症免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下各申请的权益：2018年10月17日提出的美国临时申请第62/747,109号；2018年10月17日提出的美国临时申请第62/747,114号；和2019年5月3日提出的美国临时申请第62/843,180号，各案在此以引用的方式整体并入。
序列表
本申请含有序列表，其已经由EFS-Web提交并在此以引用的方式整体并入本文中。所述ASCII拷贝于20XX年XX月创建，名称为XXXXXUS_序列表.txt，并且大小为X,XXX,XXX个字节。
背景技术
每年美国有超过22,000例新卵巢癌病例和超过14,000例死亡(Siegel RL等人(2016)CA Cancer J Clin 66(1):7-30)，据估计每年医疗负担超过$600M(Dizon D MJ(2010)Gynecol Oncol 116(3))。例如化学疗法(例如卡铂(carboplatin)/顺铂(cisplatin)和/或太平洋紫杉醇(paclitaxel))的常规方法常常无法治愈卵巢癌。大约70％患者在进行第一线化学疗法后未实现症状缓解，并且40％-50％症状缓解的患者会在三年内复发。
例如乳腺癌和结肠癌的其它癌症的治疗分别产生85％和65％的五年生存率。疗法常常包括侵入性手术与化学疗法的组合。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了一种基于细胞的组合免疫疗法，其用于靶向治疗癌症，例如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌。这种组合免疫疗法依赖于能够在肿瘤内和/或附近(“肿瘤微环境(TME)”)进行多因子调节的工程化细胞回路。尽管组合免疫疗法的进展令人兴奋，但部分因为以下挑战，其抗癌功效已受到限制。难以同时递送多种疗法来实现最大功效且不引起显著副作用。在临床试验中也难以确定多个全身施用和/或局部注射的疗法的适当给药和时间选择。
然而，本文提供的组合免疫疗法是肿瘤特异性且有效的，但限制全身毒性。这种组合免疫疗法将多个免疫调节效应分子从单一递送媒介物递送至肿瘤微环境。对递送媒介物的设计进行优化，以提高在癌症疗法中的整体功能，包括(但不限于)优化启动子、接头、信号肽以及多个免疫调节效应分子的次序。
有利地，本公开的细胞回路在间充质干细胞(MSC)中进行工程化，其能够选择性地归巢至肿瘤(包括癌转移)，能够产生促炎性/免疫刺激性分泌蛋白质组且在一定条件下产生消炎分泌蛋白质组，并且低免疫原性的。这些特征尤其能够使其用于例如同种异体细胞疗法，并且无显著的安全问题、副作用或排斥反应。
已经日益认识到，肿瘤是肿瘤细胞与周围基质之间复杂的相互作用，周围基质包括细胞外基质、癌症相关的基质细胞(MSC和成纤维细胞)、肿瘤血管和免疫系统。TME通过靶向患者的先天性和适应性免疫系统的多种机制抑制抗肿瘤免疫应答。举例来说，肿瘤可补充和诱导调节T细胞，调节T细胞通过加工例如CCL22的特定趋化因子而抑制常规T细胞的抗肿瘤活性。肿瘤还可以表达抑制T细胞和NK细胞活性的分子，例如免疫检查点，例如PD-L1。因此，靶向单一通路可能不足以实现稳固的针对实体瘤的功效。
本公开涵盖的效应分子的非限制性实例包括细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和溶瘤病毒。举例来说，MSC可被工程化用于表达(且通常分泌)以下效应分子中的至少一种、两种、三种或更多种：IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40-配体、CD40L、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TGFβ抗体、抗TNFR2、MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、CCL21、CpG寡脱氧核苷酸和抗肿瘤肽(例如具有抗肿瘤活性的抗微生物肽，参见例如Gaspar,D.等人Front Microbiol.2013；4:294；Chu,H.等人PLoS One.2015；10(5):e0126390，以及网站：aps.unmc.edu/AP/main.php)。
本文提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。在一些方面，所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
在一些方面，细胞为间充质干细胞(MSC)。在一些方面，细胞为干细胞。在一些方面，细胞为免疫细胞。在一些方面，细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些方面，细胞为NKT细胞。在一些方面，细胞为固有淋巴样细胞。在一些方面，细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些方面，细胞为肥大细胞。在一些方面，细胞为嗜酸性粒细胞。在一些方面，细胞为嗜碱性粒细胞。在一些方面，细胞为单核细胞。在一些方面，细胞为巨噬细胞。在一些方面，细胞为中性粒细胞。在一些方面，细胞为骨髓细胞。在一些方面，细胞为树突状细胞。在一些方面，细胞为T细胞。在一些方面，细胞为CD8+T细胞。在一些方面，细胞为CD4+T细胞。在一些方面，细胞为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些方面，细胞为病毒特异性T细胞。在一些方面，细胞为γ-δT细胞。在一些方面，细胞为调节T细胞。在一些方面，细胞为B细胞。
在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于表达盒，以使得多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸。在一些方面，接头多核苷酸序列与第一效应分子和第二效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码T2A核糖体跳跃标签。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶(Furin)识别多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列进一步编码包含Gly、包含Ser或包含Gly-Ser的多肽序列，例如Gly-Ser-Gly多肽序列Gly-Ser-Gly多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
在一些方面，接头多核苷酸序列编码第二启动子，其中所述启动子可操作地连接于表达盒，以使得包含式S1-E1的第一多核苷酸能够得以转录，其中所述第二启动子可操作地连接于表达盒，以使得包含式S2-E2的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和第二启动子是相同的。在一些方面，启动子和第二启动子是不同的。
在一些方面，所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。在一些方面，工程化细胞为人类细胞。在一些方面，人类细胞为从受试者，例如将接受细胞的受试者分离的细胞。在一些方面，分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。在一些方面，工程化的细胞为培养细胞。
在一些方面，工程化MSC包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。在一些方面，工程化MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
在一些方面，工程化细胞包含T细胞。在一些方面，工程化细胞包含NK细胞。在一些方面，工程化细胞包含NKT细胞。
在一些方面，细胞标志物表型还包含包括在工程化细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的同源受体或同源受体配体的细胞标志物。在一些方面，受体选自由以下组成的组：IL12RB1、IL12RB2、CCL7和它们的组合。
在一些方面，启动子和/或第二启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子包含SFFV启动子。在一些方面，启动子和/或第二启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，第一信号肽或第二信号肽分别包含相对于第一效应分子或第二效应分子来说为天然的天然信号肽。在一些方面，第一信号肽或第二信号肽分别包含相对于第一效应分子或第二效应分子来说为非天然的非天然信号肽。在一些方面，非天然信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶(Gaussialuciferase)、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白(azurocidin preprotein)、骨结合素(osteonectin)、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素(osteoprotegerin)、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(serpin E1)、GROα、CXCL12和IL21。
在一些方面，第一信号肽和第二信号肽是相同的。在一些方面，编码第一信号肽的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。在一些方面，第一分泌多肽为人IL12信号肽。
在一些方面，编码第二信号肽的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。在一些方面，第二分泌多肽为人IL21信号肽。
在一些方面，第一效应分子独立地选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。
在一些方面，第一效应分子和/或第二效应分子为修饰的效应分子。在一些方面，第一效应分子和/或第二效应分子被修饰成包含细胞膜系栓结构域。在一些方面，细胞膜系拴结构域包含跨膜-细胞内结构域或跨膜结构域。在一些方面，细胞膜系拴结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分。在一些方面，修饰的效应分子为包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分的融合蛋白。在一些方面，修饰的效应分子还包含介于效应分子与细胞膜系拴结构域之间的接头。在一些方面，当表达时，修饰的效应分子系拴至工程化细胞的细胞膜。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：Flt3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP和它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，第一效应分子和第二效应分子为人类来源效应分子。
在一些方面，第一效应分子包含白细胞介素12(IL12)，例如呈二聚体形式的p35和p40，在本领域中一般称为IL-12p70。在一些方面，第一效应分子包含IL12p70融合蛋白。在一些方面，IL12p70融合蛋白为人IL12p70融合蛋白。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12包含SEQ ID NO:137中所示的p35亚基。在一些方面，人IL12包含SEQ ID NO:137中所示的p40亚基。
在一些方面，第二效应分子包含CCL21a。在一些方面，CCL21a为人CCL21a。在一些方面，第二效应分子包含IL7。在一些方面，IL7为人IL7。在一些方面，第二效应分子包含IL21。在一些方面，IL21为人IL21。
在一些方面，表达盒还包含包括编码第三效应分子的多核苷酸序列的E3。在一些方面，第三效应分子包含Flt3L。在一些方面，第三效应分子包含抗PD1。举例来说，抗PD1可为抗PD1抗体。在一些方面，表达盒还包含包括编码第四效应分子的多核苷酸序列的E4。在一些方面，第四效应分子包含腺苷脱氨酶。在一些方面，第三效应分子包含腺苷脱氨酶。在一些方面，第三效应分子包含CD40L。在一些方面，第三效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些方面，第三效应分子包含XCL1。
在一些方面，第二效应分子包含Flt3L。在一些方面，第二效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些方面，第二效应分子包含抗PD1。在一些方面，第二效应分子包含CD40L。
在一些方面，第一效应分子包含干扰素-β并且第二效应分子包含Flt3L。
在一些方面，编码第一效应分子的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。在一些方面，编码第二效应分子的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
在一些方面，工程化细胞包含编码启动子和表达盒的多核苷酸序列。在一些方面，外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的序列。
在一些方面，外源性多核苷酸序列被整合至工程化细胞的基因组中。在一些方面，外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。在一些方面，表达盒在E2之后还包含额外外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包含下式，从5’至3’定向，所述式包含：
(L-S-E)X
其中S包含编码信号肽的多核苷酸序列，E包含编码效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，X＝1至20，其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，并且其中对于各X来说，对应的信号肽与所述效应分子可操作地相关联。
本文还提供了一种包含构建体的工程化细胞，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
本文还提供了一种包含构建体的工程化细胞，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞为间充质干细胞(MSC)。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
本文还提供了一种包含构建体的工程化细胞，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞为间充质干细胞(MSC)，其中MSC包含包括CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。在一些方面，细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
本文还提供了一种包含构建体的工程化MSC，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化MSC包含包括CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ IDNO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQID NO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。在一些方面，细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
本文还提供了一种包含构建体的工程化细胞，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。在一些方面，细胞为间充质干细胞(MSC)。在一些方面，细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些方面，细胞为NKT细胞。在一些方面，细胞为固有淋巴样细胞。在一些方面，细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些方面，细胞为肥大细胞。在一些方面，细胞为嗜酸性粒细胞。在一些方面，细胞为嗜碱性粒细胞。在一些方面，细胞为单核细胞。在一些方面，细胞为巨噬细胞。在一些方面，细胞为中性粒细胞。在一些方面，细胞为骨髓细胞。在一些方面，细胞为树突状细胞。在一些方面，细胞为T细胞。在一些方面，细胞为CD8+T细胞。在一些方面，细胞为CD4+T细胞。在一些方面，细胞为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些方面，细胞为病毒特异性T细胞。在一些方面，细胞为γ-δT细胞。在一些方面，细胞为调节T细胞。在一些方面，细胞为B细胞。在一些方面，细胞为人类细胞。
在一些方面，所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。在一些方面，工程化细胞为人类细胞。在一些方面，人类细胞为从受试者，例如将接受细胞的受试者分离的细胞。在一些方面，分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。在一些方面，工程化的细胞为培养细胞。
在一些方面，工程化MSC包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。在一些方面，工程化MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
在一些方面，工程化细胞包含T细胞。在一些方面，T细胞为CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞或调节T细胞。在一些方面，工程化细胞包含NK细胞。在一些方面，工程化细胞包含NKT细胞。在一些方面，工程化细胞包含单核细胞。在一些方面，工程化细胞包含巨噬细胞。在一些方面，工程化细胞包含TIL。
在一些方面，外源性多核苷酸序列被整合至工程化细胞的基因组中。在一些方面，外源性多核苷酸序列包含一种或多种病毒载体多核苷酸序列。在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
在一些方面，细胞分泌各效应分子。在一些方面，第一效应分子以相对于第二效应分子的分泌高10倍的比率分泌。
在一些方面，细胞还包含抗原识别受体。在一些方面，抗原识别受体识别选自由以下组成的组的抗原：5T4、ADAM9、ADGRE2、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、钙粘附蛋白(Cadherin)3、钙粘附蛋白6、CCR1、CCR4、CD117、CD123、CD131、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD244、CD30、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CD93、CEA、CEACAM5、紧密连接蛋白(Claudin)18.2、CLEC12A、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、EMB、ENPP3、EpCAM、EphA2、Ephrin A4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRα、FRb、FLT3、GAPT、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-1RAP、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、整合素aV、KIT、L1CAM、LAMP1、LAT2、Lewis Y、LeY、LILRA2、LILRB2、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、间皮素(Mesothelin)、MLC1、MS4A3、MUC1、MUC16、MUC1C、MYADM、NaPi2B、结合素(Nectin)4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、卵巢素(Ovarin)、P-钙粘附蛋白(P-cadherin)、pan-Erb2、PIEZO1、PRAM1、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、SAures、SCT、SLAMF7、SLC22A16、SLC17A9、SLITRK6、SPNS3、SSTR2、STEAP1、生存素(Survivin)、TDGF1、TIM1、TROP2、VSTM1和WT1。
在一些方面，抗原识别受体包含抗原结合结构域。在一些方面，抗原结合结构域包含抗体、抗体的抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。在一些方面，抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些方面，scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些方面，VH和VL通过肽接头相隔。在一些方面，scFv包含结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为重链可变结构域，L为肽接头，并且VL为轻链可变结构域。
在一些方面，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些方面，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且所述一个或多个细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域和MyD88细胞内信号传导结构域。在一些方面，CAR包含跨膜结构域，并且跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域和BTLA跨膜结构域。在一些方面，CAR包含介于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区。
本文还提供了一种细胞群体，所述细胞群体包含本文所述的任一工程化细胞。在一些方面，细胞群体富集所述工程化的细胞。
在一些方面，在工程化细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于群体中不表达第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的细胞增加。在一些方面，第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。在一些方面，富集工程化细胞的细胞群体表达IL12受体β1或增加其水平，表达IL12受体β2或增加其水平，或表达IL12受体β1和IL12受体β2或增加其水平。在一些方面，第二效应分子为IL21。在一些方面，第二效应分子为CCL21。在一些方面，富集工程化细胞的细胞群体表达CCL21受体或增加其水平。在一些方面，CCL21受体为CCR7。
本文还提供了一种刺激受试者中细胞介导的对肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的任何工程化细胞或细胞群体。
本文还提供了一种刺激(例如诱导)免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的任何工程化细胞或细胞群体。
本文还提供了一种为受试者提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的任何工程化细胞或细胞群体。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的任何工程化细胞或细胞群体。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的任何工程化细胞或细胞群体。
在一些方面，工程化细胞源自于受试者。在一些方面，工程化细胞相对于受试者系同种异体的。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为卵巢肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
本文还提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
(L-S-E)X
其中S包含编码信号肽的多核苷酸序列，E包含编码效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，X＝2至20，其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，其中对于(L-S-E)的第一次迭代来说，单元L缺乏，并且其中对于各X来说，对应的信号肽与所述效应分子可操作地相关联，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种包含一个或多个工程化细胞的细胞群体，其中所述一个或多个工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种包含一个或多个工程化细胞的细胞群体，其中所述一个或多个工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中在工程化细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于群体中不表达第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的细胞增加，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
在一些方面，一个或多个工程化细胞表达在所述工程化细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的同源受体或同源受体配体。在一些方面，第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。在一些方面，第二效应分子为IL21。在一些方面，第二效应分子为CCL21。
本文还提供了一种包含一个或多个工程化细胞的细胞群体，其中所述一个或多个工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种包含一个或多个工程化细胞的细胞群体，其中所述一个或多个工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中在工程化细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于群体中不表达第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的细胞增加，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ IDNO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
本文还提供了一种产生富集一种或多种受体或受体配体的细胞群体的方法，所述方法包括在使一个或多个细胞接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的条件下培养一个或多个细胞，其中接触的细胞表达第一个或多个效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的一种或多种同源受体或同源受体配体，并且其中第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子促进接触的细胞的生长、活力或生长和活力相对于缺乏第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子时培养的细胞增加。
在一些方面，第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子在一个或多个细胞中异源表达，并且所述一个或多个细胞以自分泌方式接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子。在一些方面，第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子在一个或多个额外细胞中表达，并且所述一个或多个细胞以旁分泌方式接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子。在一些方面，一个或多个额外细胞为饲养细胞。在一些方面，一个或多个细胞在培养基中培养。
在一些方面，通过添加可溶性第一效应分子、可溶性第二效应分子或可溶性第一效应分子和第二效应分子至培养基，使一个或多个细胞接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子。在一些方面，可溶性第一效应分子和/或可溶性第二效应分子为重组效应分子。
在一些方面，一个或多个细胞在附着条件下培养。在一些方面，一个或多个细胞附着至表面上。在一些方面，通过将一个或多个细胞暴露于第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子，使附着细胞接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子，固定在表面上。
在一些方面，第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。在一些方面，细胞群体富集IL12受体β1(IL12Rβ1)、富集IL12受体β2(IL12Rβ2)或富集IL12Rβ1和IL12Rβ2。在一些方面，MSC群体包含包括细胞标志物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+和IL12Rβ2+的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
在一些方面，细胞群体包含选自由以下组成的组的细胞：自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和调节T细胞和B细胞。在一些方面，细胞群体包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或骨髓来源细胞。
在一些方面，第二效应分子为IL21。在一些方面，第二效应分子为CCL21。在一些方面，细胞群体富集CCR7。
在一些方面，MSC群体包含包括细胞标志物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+、IL12Rβ2+和CCR7+的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
本文还提供了一种富集一种或多种受体或受体配体的细胞群体，其通过任一本文所述的方法产生。
本文还提供了通过多核苷酸序列表达的一种或多种蛋白质，其中所述多核苷酸序列包含启动子和以自5’至3’取向，包含以下的式描述的表达盒
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
本文还提供了通过多核苷酸序列表达的一种或多种蛋白质，其中所述多核苷酸序列包含以自5’至3’取向，包含以下的式描述的表达盒
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
本文还提供了一种分离的多核苷酸序列，其包含启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
本文还提供了一种分离的多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于表达盒，以使得多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸。
在一些方面，接头多核苷酸序列与第一效应分子和第二效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码T2A核糖体跳跃标签。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶识别多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列进一步编码包含Gly、包含Ser或包含Gly-Ser的多肽序列，例如Gly-Ser-Gly多肽序列Gly-Ser-Gly多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
在一些方面，接头多核苷酸序列编码第二启动子，其中所述启动子可操作地连接于表达盒，以使得包含式S1-E1的第一多核苷酸能够得以转录，其中所述第二启动子可操作地连接于表达盒，以使得包含式S2-E2的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和第二启动子是相同的。在一些方面，启动子和第二启动子是不同的。
在一些方面，启动子和/或第二启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子包含SFFV启动子。在一些方面，启动子和/或第二启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，第一信号肽或第二信号肽分别包含相对于第一效应分子或第二效应分子来说为天然的天然信号肽。在一些方面，第一信号肽或第二信号肽分别包含相对于第一效应分子或第二效应分子来说为非天然的非天然信号肽。在一些方面，非天然信号肽选自由以下组成的组：非天然信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα、CXCL12和IL21。在一些方面，第一信号肽和第二信号肽是相同的。在一些方面，编码第一信号肽的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
在一些方面，第一分泌多肽为人IL12信号肽。在一些方面，编码第二信号肽的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。在一些方面，第二分泌多肽为人IL21信号肽。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。在一些方面，第一效应分子和/或第二效应分子为修饰的效应分子。
在一些方面，第一效应分子和/或第二效应分子被修饰成包含细胞膜系栓结构域。在一些方面，细胞膜系拴结构域包含跨膜-细胞内结构域或跨膜结构域。在一些方面，细胞膜系拴结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分。在一些方面，修饰的效应分子为包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分的融合蛋白。在一些方面，修饰的效应分子还包含介于效应分子与细胞膜系拴结构域之间的接头。在一些方面，当在细胞中表达时，修饰的效应分子系拴至细胞的细胞膜。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：Flt3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP和它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，第一效应分子和第二效应分子为人类来源效应分子。
在一些方面，第一效应分子包含IL12。在一些方面，第一效应分子包含IL12p70融合蛋白。在一些方面，IL12p70融合蛋白为人IL12p70融合蛋白。
在一些方面，第二效应分子包含CCL21a。在一些方面，CCL21a为人CCL21a。在一些方面，第二效应分子包含IL7。在一些方面，IL7为人IL7。在一些方面，第二效应分子包含IL21。在一些方面，IL21为人IL21。
在一些方面，表达盒还包含包括编码第三效应分子的多核苷酸序列的E3。在一些方面，第三效应分子包含Flt3L。在一些方面，第三效应分子包含抗PD1。
在一些方面，表达盒还包含包括编码第四效应分子的多核苷酸序列的E4。在一些方面，第四效应分子包含腺苷脱氨酶。
在一些方面，第三效应分子包含腺苷脱氨酶。在一些方面，第三效应分子包含CD40L。在一些方面，第三效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些方面，第三效应分子包含XCL1。
在一些方面，第二效应分子包含Flt3L。在一些方面，第二效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些方面，第二效应分子包含抗PD1。在一些方面，第二效应分子包含CD40L。
在一些方面，第一效应分子包含干扰素-β并且第二效应分子包含Flt3L。
在一些方面，编码第一效应分子的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。在一些方面，编码第二效应分子的多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ IDNO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
本文还提供了一种外源性多核苷酸序列，其包含SFFV启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ IDNO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
本文还提供了一种外源性多核苷酸序列，其包含SFFV启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子；其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得所述多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸；并且其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
在一些方面，外源性多核苷酸序列由选自由以下组成的组的核酸编码：DNA、cDNA、RNA、mRNA和裸质粒。
本文还提供了一种表达载体，所述表达载体包含任何本文所述的外源性多核苷酸序列。在一些方面，表达载体为病毒载体。在一些方面，表达载体为慢病毒载体。
本文还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任何本文所述的外源性多核苷酸序列和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任何本文所述的工程化细胞和药学上可接受的载体。一种分离的细胞，所述分离的细胞包含任何本文所述的外源性多核苷酸序列、任何本文所述的表达载体或任何本文所述的药物组合物。
在一些方面，分离的细胞选自由以下组成的组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、红血球、血小板细胞、人类胚胎干细胞(ESC)、ESC来源细胞、多能干细胞、MSC、诱导性多能干细胞(iPSC)和iPSC来源细胞。
在一些方面，分离的细胞为MSC。
在一些方面，外源性多核苷酸序列被整合至细胞的基因组中。在一些方面，外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
在一些方面，所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。在一些方面，工程化细胞为人类细胞。在一些方面，人类细胞为从受试者，例如将接受细胞的受试者分离的细胞。在一些方面，分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。在一些方面，细胞为培养细胞。
在一些方面，MSC包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。在一些方面，MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。在一些方面，细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
在一些方面，细胞标志物表型还包含包括在细胞中表达的第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的同源受体或同源受体配体的细胞标志物。在一些方面，受体选自由以下组成的组：IL12RB1、IL12RB2、CCL7和它们的组合。
在一些方面，细胞分泌各效应分子。在一些方面，第一效应分子以相对于第二效应分子的分泌高10倍的比率分泌。
在一些方面，细胞还包含抗原识别受体。在一些方面，抗原识别受体包含抗原结合结构域。在一些方面，抗原结合结构域包含抗体、抗体的抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。在一些方面，抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些方面，scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些方面，VH和VL通过肽接头相隔。在一些方面，scFv包含结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为重链可变结构域，L为肽接头，并且VL为轻链可变结构域。
在一些方面，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些方面，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且所述一个或多个细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域和MyD88细胞内信号传导结构域。在一些方面，CAR包含跨膜结构域，并且所述跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域和BTLA跨膜结构域。在一些方面，CAR包含介于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区。
本文还提供了一种病毒，所述病毒包含任何本文所述的外源性多核苷酸序列或任何本文所述的表达载体。在一些方面，病毒选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子和腺病毒。在一些方面，病毒为慢病毒。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送包含被工程化用于产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送包含被工程化用于产生IL12和IL21的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种刺激(例如诱导)免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送包含被工程化用于产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种刺激(例如诱导)受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送包含被工程化用于产生IL12和IL21的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ IDNO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
在一些方面，所述方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体或抗CTLA-4抗体。在一些方面，所述方法还包括施用抗CD40抗体。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为卵巢肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
在一些方面，施用包含全身施用、腹膜内施用或肿瘤内施用。
在一些方面，相对于对照物，肿瘤体积减少了至少25％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。在一些方面，相对于对照物，肿瘤体积减少了至少50％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。在一些方面，相对于对照物，肿瘤体积减少了至少75％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送能够对细胞进行工程化以产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的组合物，其中各工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送能够对细胞进行工程化以产生IL12和IL21的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种刺激(例如诱导)受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送能够对细胞进行工程化以产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的组合物，其中所述工程化细胞包含：a)启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，L包含接头多核苷酸序列，S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
本文还提供了一种刺激(例如诱导)受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送能够对细胞进行工程化以产生IL12和IL21的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：a)SFFV启动子；和b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含
S1-E1-L-S2-E2
其中S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:137中所示的序列。在一些方面，人IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO:138中所示的序列。在一些方面，编码人IL12p70融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:142中所示的序列。在一些方面，人IL21包含SEQ ID NO:143中所示的序列。在一些方面，编码人IL21的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:141中所示的序列。在一些方面，接头包含SEQ IDNO:140中所示的序列。在一些方面，接头多核苷酸序列包含SEQ ID NO:139中所示的序列。在一些方面，构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
在一些方面，所述组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统，在一些方面，病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子和腺病毒。在一些方面，所述核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
在一些方面，施用包含全身施用、腹膜内施用或肿瘤内施用。
附图说明
图1展示在CT26模型中使用表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC进行的处理。
图2展示用先前在CT26模型中使用表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC处理的CT26肿瘤对无肿瘤小鼠再次激发。
图3展示表明腹膜内注射的鼠类BM来源MSC(BM-MSC)在体内归巢至4T1乳腺癌细胞的肿瘤部位的数据。将荧光标记的BM-MSC(治疗细胞)注射至负载4T1乳腺肿瘤细胞的小鼠中。乳腺肿瘤细胞表达荧光素酶报告体。左边顶部前两个图展示如所指示，在注射后第1天和第7天负载肿瘤的小鼠中的治疗细胞(BM-MSC)的成像。左边顶部第三个图展示在注射后第7天负载肿瘤的小鼠中的肿瘤细胞的成像。左边底部两个图展示如所指示，在注射后第1天和第7天未负载肿瘤的正常小鼠中的治疗细胞的成像。在最右边提供展示肿瘤对治疗细胞归巢的作用的示意图。
图4展示表明在原位乳腺癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著肿瘤生长延迟的数据。左图展示在小鼠(n＝8)中工程化MSC对4T1乳腺肿瘤生长的作用。图中的每条线表示在第0天和第7天接受对照MSC生长培养基或工程化MSC的腹膜内注射的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC的腹膜内注射。通过用测径规每隔一天测量来确定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右边示意图展示处理时间线和表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对所处理小鼠中的肿瘤负荷的作用。
图5A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IFN-β、IFN-γ、IL-12、CCL21a或它们的组合的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图5A的每条线表示个别的小鼠。图5B的左图展示在第14天，各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图5B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。
图6A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图6A的每条线表示个别的小鼠。图6B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图6B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的体重，表示为平均值±SEM。
图7A包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中的肿瘤生长的数据；然而，添加抗CD40抗体不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图7A的每条线表示个别的小鼠。图7B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。
图8A包括表明在皮下乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图8A的每条线表示个别的小鼠。图8B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图8B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的体重，表示为平均值±SEM。
图9A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。然而，一些测试的效应子组合可能引起毒性。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图9A的每条线表示个别的小鼠。图9B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。
图10A-10B包括来自针对毒性和筛选的GFP剂量扩大研究的数据。图10A展示表达GFP的工程化MSC未引起毒性。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图10A的每条线表示个别的小鼠。图10B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。
图11A展示工程化的人MSC未归巢至小鼠4T1肿瘤。图11B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
图12包括展示IL-12和CCL21a可减缓肿瘤扩大的数据。
图13A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21的工程化MSC充分抑制肿瘤生长，并且添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理，并且检查点抑制剂单独注射。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图13A的每条线表示个别的小鼠。图13B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。
图14展示表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著肿瘤生长延迟的数据。左图展示在小鼠(n＝8)中工程化MSC对CT26结肠直肠肿瘤生长的作用。图中的每条线表示在第0天和第7天接受对照MSC生长培养基或工程化MSC的腹膜内注射的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC的腹膜内注射。通过用测径规每隔一天测量来确定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右边示意图展示处理时间线和表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对所处理小鼠中的肿瘤负荷的作用。
图15为展示CT26小鼠模型中肿瘤生长动力学以确定给与工程化MSC细胞的最佳时间的图。
图16A-16B包括表明在结肠癌的同基因小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC与抗CD40或抗CTLA4抗体组合对平均肿瘤生长的作用的数据。负载CT26结肠肿瘤的小鼠用七种处理中的一种处理(每个处理组n＝5-6)。MSC-IL-12+MSC-CCL21a表示用表达IL-12的工程化细胞和表达CCL21a的工程化细胞(1:1比率)处理，用于组合处理。图16B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图16B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。
图17A-17B包括来自剂量依赖性长期生存研究的数据。图17A展示个别的组的肿瘤体积。图17B展示体重(顶部)、肿瘤体积(底部)和生存率(右边)。
图18A包括表明在小鼠结肠直肠癌模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26结肠直肠肿瘤的生长的作用。图18A的每条线表示个别的小鼠。图18B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图18C为肿瘤微环境内浸润免疫群体的代表图。图18D展示总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比。用工程化MSC-IL2和CCL21a处理的肿瘤微环境中Treg的数目显著下降。图18E使免疫浸润百分比与肿瘤重量相关。发现具有高淋巴细胞(CD3+)的样品与低肿瘤重量相关，而具有高骨髓(CD11b+)浸润的样品与较高肿瘤负荷相关。
图19展示各处理中个别的小鼠的肿瘤体积。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
图20展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
图21A-21B展示腹膜内间隙中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并且在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长动力学。利用IVIS成像器监测肿瘤负荷，图21A第一行测量小鼠体重和ROI。第二行监测每个组中个别的小鼠的肿瘤的肿瘤重量和ROI。第三行将肿瘤重量与整体ROI或肿瘤ROI相关。图21B展示第18天组中三(3)只小鼠的免疫概况以更好地表征肿瘤微环境。
图22A包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26结肠肿瘤的生长的作用。图22A的每条线表示个别的小鼠。图22B展示每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量。
图23A-23B包括来自由图22A-22B表示的实验的肿瘤免疫浸润统计数据。三只小鼠选自PBS、未处理MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(组合)组，以针对免疫概况肿瘤微环境进行流式细胞术。图23A展示与给与未处理MSC的组相比，组合组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体显著增加。图23B展示与用未处理MSC处理的组相比，组合组中粒细胞骨髓来源抑制性细胞(gMDSC)和巨噬细胞群体显著减少。
图24A-24B包括与由图22A-22B表示的实验相关的关于免疫百分比和肿瘤重量的数据。图24A和图24B展示具有更多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和中央图)与肿瘤重量下降强烈相关。这些图还展示具有较少CD11b骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和MDSC的样品显示较低肿瘤负荷(图24A的中下图和右图和图24B的上一行)。
图25A-25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试三批不同的经慢病毒转导的细胞系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号表示一批)。图25A展示在皮下与腹膜内模型中MSC-IL12+MSC-CCL21a所有三批均可降低肿瘤负荷(前5图来自SC模型并且后3图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25B展示来自每个组的平均肿瘤重量。
图26A包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中工程化的组合处理MSC-IL-12+MSC-CCL21a或MSC-CCL21a+MSC-IFN-β抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26肿瘤的生长的作用。图26A的每条线表示个别的小鼠。图26B展示每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量。MSC-IL12+MSC-CCL21a展示与注射未处理MSC的小鼠相比功效更佳。在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a处理的组中还观察到处理功效。
图27A-27B提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图27A-27B为展示用所指示的工程化MSC处理的每个组的免疫概况的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理之后观察到巨噬细胞群体一致下降(图27A)。相对于未处理MSC，与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比，还观察到CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总趋势(图27A和图27B)。
图28A-28B还提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图28A-28B展示免疫浸润与肿瘤重量相关。具有低巨噬细胞和树突状细胞的样品具有较低肿瘤负荷(图28B，中上和右上)。
图29展示将以上来自结肠直肠癌症模型的体内数据(图22A和图26A)组合的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据记录三组：仅仅肿瘤(PBS)、用未处理MSC处理和用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理。
图30A-30C还展示来自图22A和图26A的组合数据。所述图展示来自流式细胞术实验数据的免疫浸润平均数。从图30A观察到CD8+T的统计显著性，这证实MSC-IL12+MSC-CCL21a能够使肿瘤微环境恢复极化，并且允许更多细胞毒性T细胞浸润。此外，在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组中CD11b+骨髓群体浸润减少(图30B)。所收集的数据显示树突状细胞和巨噬细胞群体具有统计显著性。
图31展示pL17D的载体图。
图32展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低CT26肿瘤负荷的功效。
图33展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低B16F10肿瘤负荷的功效。
图34展示用于从单一慢病毒表达载体表达人IL12(p70)和人CCL21a的慢病毒表达载体图。
图35展示如通过细胞因子ELISA所评定，工程化的hMSC的hIL12(图35A)和hCCL21a(图35B)产生。
图36展示transwell测定法，如通过IFNγ产生所评定，所述测定法显示由MSC产生的hIL12对T细胞的功能性调节。
图37展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37A-D展示CT26肿瘤模型中的归巢(图37A中所示的影像、图37B中影像的定量概述)、定量实时PCR(图37C)和针对萤火虫荧光素酶的荧光显微术(图37D)。图37E展示B16F10肿瘤模型中的归巢(影像的定量概述)。
图38展示在CT26 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
图39展示在B16F10 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
图40展示在CT26 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。图40A展示如通过BLI所评定，PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(三角形)的平均肿瘤负荷。图40B展示如通过BLI所评定，个别的小鼠中PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(分别为左图、中图和右图)的平均肿瘤负荷。图40C展示用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长生存(100％生存超过90天)，而对照物处理的小鼠至第20天均死亡或处死。
图41展示用表达IL12p70的MSC处理延长生存。
图42展示三种不同的供体(图42A，供体1；图42B，供体2；图42C，供体3)中不同MOI(95000、9500、950或未感染)间基因工程化的MSC的相对生长。
图43展示来自2种不同供体的两种独立的人类BM-MSC细胞系(分别为顶行和底行)，所述细胞系经含有各种驱动EGFP表达的启动子的构建体转导。展示转导后第25天工程化细胞的GFP百分比(左图)和MFI(右图)。
图44展示来自2种不同供体的两种独立的人类BM-MSC细胞系，所述细胞系经含有各种驱动EGFP表达的启动子的构建体转导。展示针对两种独立的人类BM-MSC细胞系单独情况下(左图)或在来自两种独立人类BM-MSC细胞系组合的数据下(右图)，随时间追踪的EGFPMFI(转导后第7天至第28天)。
图45展示如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-12p70分泌。
图46展示如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-21分泌。
图47展示如通过ELISA所评定，工程化MSC分泌的IL-12p70与IL-21的比率。
图48展示利用STAT4-SEAP报告体，使用HEK-293T细胞，针对IL-12p70的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
图49展示在NK-92人类自然杀伤细胞中，使用细胞内磷酸流动定量磷酸化STAT1(左图)和磷酸化STAT3(右图)的针对IL-21的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
图50展示使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚报告体，针对IL-12的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
图51A展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低CT26肿瘤负荷的功效。
图51B展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低B16F10肿瘤负荷的功效。
图52展示如通过BLI(图52A左图)和通过肿瘤重量(图52A右图)所评定，在CT26模型中使用表达IL12p70的MSC、表达IL21的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合进行处理的功效。图52B显示个别的小鼠的BLI荧光素酶测量结果。
图53展示如通过BLI所评定，使用较低剂量的表达IL12p70的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合进行处理的功效。图53A；小鼠的个别的BLI测量结果-左图；BLI测量结果概述-右图)。图53B展示处理组的生存曲线。
图54展示如通过BLI(图54左图)和通过肿瘤重量(图54右图)所评定，在B16F10模型中使用表达IL12p70的MSC、表达IL21的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合进行处理的功效。
图55显示在B16F10模型中在使用表达IL12p70的MSC、表达IL21的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合进行处理后个别的小鼠的BLI荧光素酶测量结果。
图56展示接受表达IL12p70的MSC、表达IL21的MSC、表达IL12p70和IL21的MSC的组合、抗PD1或IL12p70与抗PD1的组合的处理组的生存曲线。
图57展示肿瘤再次激发后小鼠的生存曲线。图57A展示未处理小鼠。图57B展示先前接受单独的表达IL12的MSC的处理。图57C展示先前接受表达IL12的MSC和表达IL21的MSC的组合处理的小鼠。
图58展示在CT26肿瘤模型中使用被工程化用于从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21的mMSC进行处理的剂量依赖性功效。图58A展示第17天相对于第7天标准化的功效的BLI评定概述。图58B和图58C展示个别的小鼠随时间的BLI测量结果。图58D展示处理组的生存曲线。
图59展示在B16F10肿瘤模型中使用被工程化用于从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21的mMSC进行处理的剂量依赖性功效。图59A展示第17天相对于第7天标准化的功效的BLI评定概述。图59B和图59C展示个别的小鼠随时间的BLI测量结果。图59D展示多次施用较高剂量下个别的小鼠随时间的BLI测量结果。图59E展示处理组的生存曲线。
图60展示MC-38肿瘤模型中使用被工程化用于从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21的mMSC进行处理的剂量依赖性功效。图60A展示第18天相对于第9天标准化的功效的BLI评定概述。图60B展示个别的小鼠随时间的BLI测量结果。图60C展示处理组的生存曲线。
图61展示人MSC的优先归巢。图61A展示概述的荧光素酶定量。图61B展示器官中荧光素酶信号的代表性影像。
图62A展示在OVCAR8模型中腹膜液(每个相应时间点的左列)和血清(每个相应时间点的右列)中的人IL12(左图)和人IL21(右图)的产生。
图62B展示在CT26模型中腹膜液(每个相应时间点的左列)和血清(每个相应时间点的右列)中的鼠类IL12(左图)和鼠类IL21(右图)的短暂产生。
图63展示在CT26模型中用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理或者用重组细胞因子疗法处理的小鼠的功效。图63A展示MSC-IL12对比rIL12的生存曲线。图63B展示MSC-IL21对比rIL21的生存曲线。图63C展示MSC-IL12/IL21对比rIL12+rIL21的生存曲线。图63D和图63E展示用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理或者用重组细胞因子疗法处理的小鼠的肿瘤负荷的BLI评定。
图64展示在B16F10模型中用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理或者用重组细胞因子疗法处理的小鼠的功效。图63A展示用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理或者用重组细胞因子疗法处理的小鼠的肿瘤负荷的肿瘤重量评定。图64B展示处理组的生存曲线。
图65展示在CT26 IP肿瘤模型中在用产生IL12和IL21两者的MSC处理后小鼠的免疫概况。所示结果为用于表征对处理作出反应的免疫浸润的多色流式细胞术分析。图65A和图65B展示T细胞子集和活化标志物(CD3、CD4、CD8、CD8/CD38+、CD8/IFNg+、CD8/Gzmb+、NK/Gzmb+和比率CD8:Treg-FoxP3)。图65C展示例如树突状细胞的抗原呈递细胞的免疫概况。
具体实施方式
间充质干细胞(MSC)(又称间充质基质细胞、多能基质细胞、骨髓基质细胞或多能间充质基质细胞)是来源于中胚层的非造血成人干细胞的子集。其具有自我更新能力并且多向分化，不仅分化成中胚层谱系，例如软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞，还分化成外胚层细胞和内胚层细胞。MSC没有伦理问题和畸胎瘤形成，是用于细胞疗法以治疗免疫性疾病与非免疫性疾病的主要干细胞类型。其容易从骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺分离，并且可成功地在体外扩增。MSC可通过细胞表面标志物表型界定，包括包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；或包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型，如以引用的方式并入以达成所有目的的Dominici等人,(Cytotherapy.2006；8(4):315-7)中更详细论述。此外，当MSC外源性和全身性递送至人类和动物时，其往往归巢至(直接迁移至)具有炎症的受损组织部位，包括肿瘤微环境和转移区域。炎症指引的MSC归巢涉及几种与细胞运输相关的重要分子，所述分子包括趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)。
本文提供了对例如MSC的细胞进行工程化以产生调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子的方法。这些MSC在本文中称为“工程化MSC”。这些MSC通常含有工程化的核酸，在自然界中不存在。在一些实施方案中，MSC被工程化用于包括包含可操作地连接于编码效应分子(例如刺激免疫应答的效应分子)的核苷酸序列的启动子的核酸。
本文还提供了对例如免疫细胞的细胞进行工程化以产生效应分子的方法，所述细胞包括(但不限于)自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。包括MSC与免疫细胞的这些细胞在本文中称为“工程化细胞”。这些细胞通常含有工程化的核酸，在自然界中不存在。在一些实施方案中，细胞被工程化用于包括包含可操作地连接于编码效应分子(例如刺激免疫应答的效应分子)的核苷酸序列的启动子的核酸。
“效应分子”是指一种分子(例如核酸，例如DNA或RNA，或蛋白质(多肽)或肽)，其结合于另一分子并且调节其结合的这个分子的生物活性。举例来说，效应分子可充当配体以增加或减少酶活性、基因表达或细胞信号传导。因此，在一些实施方案中，效应分子调节(活化或抑制)不同免疫调节机制。通过直接结合于分子并且调节其，效应分子还可以间接地调节第二下游分子。在一些实施方案中，效应分子为分泌的分子，而在其它实施方案中，效应分子结合于细胞表面或保持在细胞内。举例来说，效应分子包括改变内部细胞状态以例如增强细胞的免疫调节活性、归巢特性或持久性的细胞内转录因子、微型RNA和shRNA。效应分子的非限制性实例包括细胞因子、趋化因子、调节代谢物水平的酶、调节细胞因子的抗体或诱饵分子(decoy molecule)、归巢分子和/或整合素。
术语“调节”涵盖生物活性的维持、生物活性的抑制(部分或完全)和生物活性的刺激/活化(部分或完全)。所述术语还涵盖降低或增加(例如增强)生物活性。当一种效应分子调节与另一效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如刺激抗原呈递和/或加工)不同的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如刺激T细胞信号传导)时，两种不同效应分子视为“调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制”。
效应分子进行的调节可以是直接或间接的。当效应分子结合于另一分子并且调节所述分子的活性时，发生直接调节。当效应分子结合于另一分子，调节所述分子的活性并且作为所述调节的结果，调节又一分子(效应分子未结合的分子)的活性时，发生间接调节。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如全身或肿瘤微环境中)增加至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应了解，例如全身或肿瘤微环境中免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答的“增加”是相对于缺少效应分子时将发生的免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答来说的。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如全身或肿瘤微环境中)增加至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的非限制性实例包括T细胞信号传导、活性和/或募集、抗原呈递和/或加工、自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集、树突状细胞分化和/或成熟、免疫细胞募集、促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集、基质降解、免疫刺激代谢物产生、干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene，STING)信号传导(其增加IFN的分泌和Th1极化，促进抗肿瘤免疫应答)和/或I型干扰素信号传导。效应分子可刺激上述免疫刺激机制中的至少一种(一种或多种)，因此引起免疫刺激反应增加。上述免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的变化可例如使用T细胞增殖或细胞毒性的体外测定法、体外抗原呈递测定法、表达测定法(例如特定标志物)和/或细胞分泌二测定法(例如细胞因子)评定。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应(例如全身或肿瘤微环境中)减少至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫抑制反应减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应减少10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应了解，例如全身或肿瘤微环境中免疫抑制反应的“减少”是相对于缺少效应分子时将发生的免疫抑制反应来说的。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应(例如全身或肿瘤微环境中)减少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫抑制反应减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应减少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫抑制机制的非限制性实例包括负共刺激信号传导、细胞毒细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的促细胞凋亡信号传导、调节T(Treg)细胞信号传导、肿瘤检查点分子产生/维持、骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集、免疫抑制因子/代谢物产生和/或血管内皮生长因子信号传导。效应分子可抑制上述免疫抑制机制中的至少一种(一种或多种)，因此引起免疫抑制反应减少。上述免疫抑制机制的变化可例如通过以下来评定：测定T细胞增殖的增加和/或IFNγ产生的增加(负共刺激信号传导、Treg细胞信号传导和/或MDSC)；膜联蛋白V/PI流动染色(促细胞凋亡信号传导)；表达、例如PDL1表达的流动染色(肿瘤检查点分子产生/维持)；ELISA、
Figure BDA0003092762570000531
经由qPCR的RNA、酶测定法，例如IDO色氨酸分解代谢(免疫抑制因子/代谢物产生)；和PI3K、Akt、p38的磷酸化(VEGF信号传导)。
在一些实施方案中，例如MSC的细胞被工程化用于表达膜系抗CD3和/或抗CD28激动剂细胞外结构域。
在一些实施方案中，例如MSC的细胞被工程化用于产生至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)效应分子，每一种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在其它实施方案中，细胞被工程化用于产生并非由所述细胞天然产生的至少一种效应分子。这类效应分子可例如补充所述细胞天然产生的效应分子的功能。
在一些实施方案中，效应分子以累加方式起作用：例如两种效应分子的作用可等于单独起作用的两种效应分子的作用的总和。在其它实施方案中，效应分子以协同方式起作用：例如两种效应分子的作用可超过两种效应分子的组合功能。本公开还涵盖效应分子与产生其的免疫细胞(例如MSC)之间的累加作用和协同作用。
调节肿瘤介导的免疫抑制机制和/或改变肿瘤微环境的效应分子可为例如分泌的因子(例如调节与免疫系统相关的细胞外机制的细胞因子、趋化因子、抗体和/或诱饵受体)、抑制剂(例如抗体、抗体片段、配体TRAP和/或小型阻断肽)、控制细胞状态的细胞内因子(例如调节细胞状态以增强促炎性的微型RNA和/或转录因子)、包装成外来体的因子(例如微型RNA、胞浆因子和/或细胞外因子)、表面展示因子(例如检查点抑制剂、TRAIL)和/或代谢基因(例如产生/调节或降解代谢物或氨基酸的酶)。
在一些实施方案中，效应分子可选自分子的以下非限制性类别：细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽和酶。上述类别效应分子的非限制性实例在表1中列出并且编码例示性效应分子的特定序列在表6中列出。效应分子可为人类效应分子，例如表1或表6中列出的那些人类效应分子，或表1或表6中列出的鼠类效应分子的人类同等物。效应分子可来源于人类效应分子，例如内源人类效应分子或进行修饰和/或功能优化，例如密码子优化以改善表达、进行修饰以提高稳定性或在其信号序列上进行修饰的效应分子(见下文)。本领域的技术人员已知用于优化功能的各种程序和算法，并且可基于所需改善，例如针对特定物种(例如人类、小鼠、细菌等)进行密码子优化来选择。
表1.例示性效应分子
Figure BDA0003092762570000541
Figure BDA0003092762570000551
在一些实施方案中，例如MSC的细胞包含工程化的核酸，所述工程化的核酸包含可操作地连接于编码效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，工程化的核酸包含可操作地连接于编码至少2种效应分子的核苷酸序列的启动子。举例来说，工程化的核酸可包含可操作地连接于编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，工程化的核酸包含可操作地连接于编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种效应分子的核苷酸序列的启动子。
在一些实施方案中，例如工程化MSC的工程化细胞被工程化用于包括至少两种工程化的核酸，各包含可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。举例来说，细胞可被工程化用于包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种工程化的核酸，各包含可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种工程化的核酸，各包含可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。
“工程化的核酸”是在自然界中不存在的核酸。然而，应了解虽然总体上工程化的核酸是非天然存在的，但其可以包括在自然界中存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化的核酸包含来自不同生物体(例如来自不同物种)的核苷酸序列。举例来说，在一些实施方案中，工程化的核酸包括鼠类核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人类核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化的核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过将核酸分子接合而构建的分子且在一些实施方案中，在活细胞中可重复。“合成核酸”是指被扩增或以化学方式或用其它方式合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其它方式修饰，但可以与天然存在的核酸分子进行碱基配对的核酸。重组核酸和合成核酸还包括由上述任一种核酸复制所产生的那些分子。本公开的工程化的核酸可以由单一分子(例如包括在相同质粒或其它载体中)或由多种不同分子(例如多种不同的独立复制的分子)编码。
本公开的工程化的核酸可以使用标准分子生物学方法产生(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，工程化的核酸构建体使用GIBSON
Figure BDA0003092762570000571
克隆产生(参见例如Gibson,D.G.等人Nature Methods,343-345,2009；和Gibson,D.G.等人NatureMethods,901-903,2010，各以引用的方式并入本文中)。GIBSON
Figure BDA0003092762570000572
通常在单管反应中使用三种酶活性：5'外切核酸酶、DNA聚合酶的'Y扩展活性和DNA连接酶活性。5'外切核酸酶活性咀嚼掉5'末端序列并暴露互补序列，以进行退火。接着聚合酶活性填充退火区域上的间隙中。接着DNA连接酶将切口密封并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比用于金门装配中的序列更长，因此产生更高百分比的恰当装配。在一些实施方案中，工程化的核酸构建体使用
Figure BDA0003092762570000573
克隆(Clontech)产生。
“启动子”是指控制核酸序列的其余部分转录的开始和速率的核酸序列控制区。启动子还可以含有例如RNA聚合酶和其它转录因子的调控蛋白和分子可结合的子区域。启动子可为组成型、诱导型、阻抑型、组织特异型或其任何组合。启动子驱动其调控的核酸序列的表达或驱动其转录。本文中，当启动子相对于其调控的核酸序列处于恰当功能位置和取向，从而控制(“驱动”)所述序列转录开始和/或表达时，认为所述启动子“可操作地连接”。
启动子可为与基因或序列天生相关的启动子，可通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5'非编码序列获得。这类启动子可称为“内源性的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可位于重组或异源启动子的控制下，重组或异源启动子是指通常在自然环境中不与编码序列相关的启动子。这类启动子可包括其它基因的启动子；从任何其它细胞分离的启动子；和非“天然存在”的合成启动子或强化子，例如含有不同转录调控区的不同元件和/或通过本领域中已知的基因工程方法改变表达的突变的启动子。除以合成方式产生启动子和强化子的核酸序列外，可使用包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列(参见例如美国专利第4,683,202号和美国专利第5,928,906号)。
工程化的核酸的启动子可为“诱导型启动子”，诱导型启动子是指特征在于当存在信号、受信号影响或接触信号时调控(例如起始或活化)转录活性的启动子。信号可为以有效调控从诱导型启动子转录的活性的方式接触诱导型启动子的内源性或通常外源性条件(例如光)、化合物(例如化学或非化学化合物)或蛋白质(例如细胞因子)。转录活化可涉及直接作用于启动子来驱动转录，或通过使防止启动子驱动转录的阻抑子失活而间接作用于启动子。相反地，转录失活可涉及直接作用于启动子来驱动转录，或通过使之后作用于启动子的阻抑子活化而间接作用于启动子。
如果在局部肿瘤状态(例如炎症或缺氧)或信号存在下从启动子转录得到活化、失活、增加或减少，则启动子对所述状态或信号“起反应”或通过所述状态或信号“调节”。在一些实施方案中，启动子包含应答元件。“应答元件”是启动子区域内结合调节(调控)基因从启动子的表达的特定分子(例如转录因子)的DNA短序列。可根据本公开使用的应答元件包括不限于根皮素可调的控制元件(phloretin-adjustable control element，PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ活化序列(interferon-gamma-activated sequence，GAS)(Decker,T.等人J Interferon Cytokine Res.1997年3月；17(3):121-34，以引用的方式并入本文中)、干扰素刺激的应答元件(ISRE)(Han,K.J.等人J Biol Chem.2004年4月9日；279(15):15652-61，以引用的方式并入本文中)、NF-κB应答元件(Wang,V.等人CellReports.2012；2(4):824-839，以引用的方式并入本文中)和STAT3应答元件(Zhang,D.等人J of Biol Chem.1996；271:9503-9509，以引用的方式并入本文中)。本文中涵盖其它应答元件。应答元件还可以含有串联重复序列(例如相同的编码应答元件的核苷酸序列的连续重复序列)以大体上增加应答元件对其同源结合分子的敏感性。串联重复序列可标记为2X、3X、4X、5X等，以表示存在的重复序列的数目。
反应启动子(又称“诱导型启动子”)(例如TGF-β反应启动子)的非限制性实例在表2中列出，其展示启动子和转录因子的设计，以及展示诱导分子对转录因子(TF)和转基因转录(T)的作用(B，结合；D，解离；n.d.，不确定)(A，活化；DA，失活；DR，去阻抑)(参见Horner,M.和Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m，和其中引用的参考文献)。诱导型启动子的其它非限制性实例包括表3中所呈现的启动子。
表2.反应启动子的实例
Figure BDA0003092762570000591
Figure BDA0003092762570000601
表3.例示性诱导型启动子
Figure BDA0003092762570000602
Figure BDA0003092762570000611
启动子的其它非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延长因子1-α(EF1a)启动子、延长因子(EFS)启动子、MND启动子(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒强化子的修饰MoMuLV LTR的U3区的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、形成脾脏病灶病毒(spleen focus-forming virus，SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子(参见表4)。
表4.例示性组成型启动子
Figure BDA0003092762570000612
Figure BDA0003092762570000621
Figure BDA0003092762570000631
Figure BDA0003092762570000641
Figure BDA0003092762570000651
Figure BDA0003092762570000661
Figure BDA0003092762570000671
Figure BDA0003092762570000681
Figure BDA0003092762570000691
Figure BDA0003092762570000701
在一些实施方案中，本公开的启动子通过肿瘤微环境内的信号调节。如果在肿瘤微环境存在下启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少10％，则认为肿瘤微环境调节启动子。在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。举例来说，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
在一些实施方案中，本公开的启动子在低氧状态下活化。“低氧状态”为在组织层面，身体或身体区域丧失适当供氧的状态。低氧状态可引起炎症(例如在低氧状态下炎性细胞因子的水平增加)。在一些实施方案中，在低氧状态下活化的启动子可操作地连接于编码减少炎性细胞因子活性的表达的效应分子的核苷酸，因此减少由低氧状态所引起的炎症。在一些实施方案中，在低氧状态下活化的启动子包含低氧应答元件(hypoxia responsiveelement，HRE)。“低氧应答元件(HRE)”为对低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)应答的应答元件。在一些实施方案中，HRE包含共有基序NCGTG(其中N为A或G)。
在一些实施方案中，工程化细胞产生多种效应分子。举例来说，细胞可被工程化用于产生2-20种不同效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生2-20种、2-19种、2-18种、2-17种、2-16种、2-15种、2-14种、2-13种、2-12种、2-11种、2-10种、2-9种、2-8种、2-7种、2-6种、2-5种、2-4种、2-3种、3-20种、3-19种、3-18种、3-17种、3-16种、3-15种、3-14种、3-13种、3-12种、3-11种、3-10种、3-9种、3-8种、3-7种、3-6种、3-5种、3-4种、4-20种、4-19种、4-18种、4-17种、4-16种、4-15种、4-14种、4-13种、4-12种、4-11种、4-10种、4-9种、4-8种、4-7种、4-6种、4-5种、5-20种、5-19种、5-18种、5-17种、5-16种、5-15种、5-14种、5-13种、5-12种、5-11种、5-10种、5-9种、5-8种、5-7种、5-6种、6-20种、6-19种、6-18种、6-17种、6-16种、6-15种、6-14种、6-13种、6-12种、6-11种、6-10种、6-9种、6-8种、6-7种、7-20种、7-19种、7-18种、7-17种、7-16种、7-15种、7-14种、7-13种、7-12种、7-11种、7-10种、7-9种、7-8种、8-20种、8-19种、8-18种、8-17种、8-16种、8-15种、8-14种、8-13种、8-12种、8-11种、8-10种、8-9种、9-20种、9-19种、9-18种、9-17种、9-16种、9-15种、9-14种、9-13种、9-12种、9-11种、9-10种、10-20种、10-19种、10-18种、10-17种、10-16种、10-15种、10-14种、10-13种、10-12种、10-11种、11-20种、11-19种、11-18种、11-17种、11-16种、11-15种、11-14种、11-13种、11-12种、12-20种、12-19种、12-18种、12-17种、12-16种、12-15种、12-14种、12-13种、13-20种、13-19种、13-18种、13-17种、13-16种、13-15种、13-14种、14-20种、14-19种、14-18种、14-17种、14-16种、14-15种、15-20种、15-19种、15-18种、15-17种、15-16种、16-20种、16-19种、16-18种、16-17种、17-20种、17-19种、17-18种、18-20种、18-19种或19-20种不同效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种不同效应分子。
在一些实施方案中，外源性序列可为多顺反子的，即可由单一mRNA转录本产生超过一个分开的多肽(例如多种效应分子)。经由使用各种接头，外源性序列可为多顺反子的，例如编码第一效应分子的多核苷酸序列可连接于编码第二效应分子的核苷酸序列，例如呈第一基因:第二基因5’至3’取向。接头可编码2A核糖体跳跃元件，例如T2A。其它2A核糖体跳跃元件包括(但不限于)E2A、P2A和F2A。2A核糖体跳跃元件允许产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽，在翻译期间产生。接头可编码可裂解的接头多肽序列，例如弗林蛋白酶裂解位点或TEV裂解位点，其中在表达之后，可裂解的接头多肽裂解，从而产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽。可裂解接头可包括多肽序列，例如进一步促进裂解的柔性接头(例如Gly-Ser-Gly序列)。
接头可编码内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)，从而在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽。接头可编码剪接接受体，例如病毒剪接接受体。
接头可以是接头组合，例如弗林蛋白酶-2A接头，其可通过2A核糖体跳跃产生分开的多肽，接着进一步裂解弗林蛋白酶位点，从而完全去除2A残余物。在一些实施方案中，接头组合可包括弗林蛋白酶序列、柔性接头和2A接头。因此，在一些实施方案中，接头为弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些实施方案中，本公开的接头为弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般来说，多顺反子系统可使用任何数目的接头或接头组合，以表达任何数目的基因或其部分(例如外源性序列可编码第一、第二和第三效应分子，各由接头分开，从而产生由第一、第二和第三效应分子编码的分开的多肽)。
外源性序列可使用多个启动子以从多个ORF表达基因，即可由外源性序列产生超过一个分开的mRNA转录本。举例来说，第一启动子可操作地连接于编码第一效应分子的多核苷酸序列，并且第二启动子可操作地连接于编码第二效应分子的多核苷酸序列。
如本文所用，“接头”可指连接第一多肽序列与第二多肽序列的多肽、上述多顺反子接头或上述可操作地连接于额外ORF的额外启动子。
本公开的工程化细胞，例如MSC通常产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，效应分子中的至少一种刺激肿瘤微环境中的炎性通路，并且效应分子中的至少一种抑制肿瘤微环境中的负炎症调节因子。
“肿瘤微环境”为其中存在肿瘤的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)(参见例如Pattabiraman,D.R.和Weinberg,R.A.Nature Reviews Drug Discovery13,497-512(2014)；Balkwill,F.R.等人J Cell Sci 125,5591-5596,2012；和Li,H.等人JCell Biochem 101(4),805-15,2007)。
在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种归巢分子。“归巢”是指细胞主动导航(迁移)至标靶位点(例如细胞、组织(例如肿瘤)或器官)。“归巢分子”是指将细胞引导至标靶位点的分子。在一些实施方案中，归巢分子用于识别和/或起始细胞与标靶位点的相互作用。归巢分子的非限制性实例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7和PDGFR。
在一些实施方案中，归巢分子是趋化因子受体(结合于趋化因子的细胞表面分子)。趋化因子是由细胞分泌的可诱导细胞中的定向趋化性的小细胞因子或信号传导蛋白。趋化因子可分为四个主要亚科：CXC、CC、CX3C和XC，均通过选择性地结合于位于标靶细胞表面的趋化因子受体来发挥生物效应。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCR4，CXCR4是一种允许细胞沿着趋化因子梯度归巢至表达基质细胞来源因子1(又称SDF1、C-X-C模体趋化因子12和CXCL12)的细胞、组织或肿瘤的趋化因子受体。可由本公开的工程化细胞产生的趋化因子受体的非限制性实例包括：CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7)、CC趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1，其结合于CX3CL1)和XC趋化因子受体(例如XCR1)。在一些实施方案中，趋化因子受体为G蛋白连接跨膜受体，或肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员(包括(但不限于)TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL8、CXCL9和/或CXCL10、CXCL11或涵盖CXCL10和CXCL11(促进T细胞募集)、CCL3和/或CXCL5、CCL21(Th1募集和极化)的融合蛋白。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL13以促进B细胞募集。
在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生检测含有N-甲酰化寡肽(包括(但不限于)FPR2和FPRL1)的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)。
在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生检测白细胞介素(包括(但不限于)IL6R)的受体。
在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生检测从其它细胞、组织或肿瘤分泌的生长因子的受体(包括(但不限于)FGFR、PDGFR、EGFR和VEGF家族受体，包括(但不限于)VEGF-C和VEGF-D)。
在一些实施方案中，归巢分子为整合素。整合素是促进细胞-细胞外基质(extracellular matrix，ECM)粘附的跨膜受体。整合素是具有两个亚基的专性异源二聚体：α(α)和β(β)。整合素的α亚基可为不限于：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整合素的β亚基可为不限于：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7和ITGB8。本公开的细胞可被工程化用于产生整合素α与β亚基的任何组合。
在一些实施方案中，归巢分子为基质金属蛋白酶(MMP)。MMP是使下伏在内皮细胞壁的基底膜的组分裂解的酶。MMP的非限制性实例包括MMP-2、MMP-9和MMP。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生抑制MMP的分子(例如蛋白质)的抑制剂。举例来说，细胞可被工程化用于表达膜1型MMP(MT1-MMP)的抑制剂(例如RNAi分子)或TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)。
在一些实施方案中，归巢分子为结合于例如标靶组织的内皮上的选择素(例如造血细胞E-/L-选择素配体(HCELL)，Dykstra等人,Stem Cells.2016年10月；34(10):2501-2511)的配体。
术语“归巢分子”还涵盖调控改善/增强细胞归巢的分子产生的转录因子。
在一些实施方案中，细胞归巢通过局部照射受试者中的肿瘤/癌细胞而增加。放射性组织损伤帮助细胞归巢，以及内源性T细胞归巢至所述损伤组织。
工程化细胞的实例
如本文提供的细胞(例如MSC)被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制，或抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制，并且至少一种效应分子(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。在其它实施方案中，至少两种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制。在其它实施方案中，至少两种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激T细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激抗原呈递和/或加工的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激树突状细胞分化和/或成熟的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激免疫细胞募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激M1巨噬细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激Th1极化的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激基质降解的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激免疫刺激代谢物产生的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种刺激I型干扰素信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制负共刺激信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导(例如经由TRAIL)的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制肿瘤检查点分子的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种活化干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种降解免疫抑制因子/代谢物的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种抑制血管内皮生长因子信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种直接杀死肿瘤细胞的效应分子(例如颗粒酶、穿孔素、溶瘤病毒、细胞溶解肽和酶、例如引起ADCC的抗肿瘤抗体)。
在一些实施方案中，至少一种效应分子：刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，刺激抗原呈递和/或加工，刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，刺激树突状细胞分化和/或成熟，刺激免疫细胞募集，刺激巨噬细胞信号传导，刺激基质降解，刺激免疫刺激代谢物产生，或刺激I型干扰素信号传导；且至少一种效应分子抑制负共刺激信号传导，抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导，抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，抑制肿瘤检查点分子，活化干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导，抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集，降解免疫抑制因子/代谢物，抑制血管内皮生长因子信号传导或直接杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生至少一种选自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和CD40L的效应分子；和/或至少一种选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗IL-35抗体的效应分子；和/或至少一种选自MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和CCL21的效应分子；和/或至少一种选自CpG寡脱氧核苷酸的效应分子和/或至少一种选自微生物肽的效应分子。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种选自细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和干扰素基因刺激蛋白(STING)的效应分子。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。
在一些实施方案中，细胞因子产生为与自我结合于细胞因子以诱导细胞特异性靶向结合的抗体、抗体-片段或受体的工程化的融合蛋白，例如IL-2与防止IL-2结合于Treg细胞并且优先结合于CD8和NK细胞的抗体片段融合。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗VEGF、抗TGF-β、抗IL-10、抗TNF-α和/或抗IL-35抗体)。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种趋化因子(MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和/或CCL21)。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种核苷酸(例如CpG寡脱氧核苷酸)。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种肽(例如抗肿瘤肽)。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种酶。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种STING活化剂。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和至少一种具有直接抗肿瘤活性的效应子(例如溶瘤病毒)。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生干扰素基因刺激蛋白(STING)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL9。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL10。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL11。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL10-11融合物、CXCL13和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生干扰素基因刺激蛋白(STING)和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-12。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-2。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-7。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-15。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和IL-18。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和CD40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生TRAIL和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生STING和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生MIP1-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL9和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL10和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CXCL11和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CCL21和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-12和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IFN-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-2和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-2和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-2和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-2和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-7和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-7和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-7和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-7和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-15和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-15和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-15和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-15和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-36-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-36-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-36-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-36-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-18和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-18和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-18和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生IL-18和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生41BB-L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生41BB-L和OX40L。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生41BB-L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞(例如MSC)被工程化用于产生41BB-L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
分泌信号
一般来说，一种或多种效应分子在效应分子的N端包含分泌信号肽(又称信号肽或信号序列)，其指导新合成的蛋白质进行分泌或膜插入至适当蛋白质加工通路。与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可为天然分泌信号肽天然分泌信号肽(例如一般与给定效应分子内源性相关的分泌信号肽)。与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可为非天然分泌信号肽天然分泌信号肽。非天然分泌信号肽可促进表达和功能改善，例如维持分泌，尤其环境，例如肿瘤微环境。非天然分泌信号肽的非限制性实例展示于表5中。
表5.例示性信号分泌肽
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细胞类型
本发明提及被工程化用于产生多种效应分子的间充质干细胞(MSC)(例如人MSC)。如本文提供的工程化细胞(被工程化用于产生效应分子)还可以选自自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞、T细胞(例如CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和调节T细胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))和B细胞。然而应了解，对MSC工程化的任何提及还可以应用于其它细胞类型(例如免疫系统的细胞类型)。
在一些实施方案中，工程化细胞(例如MSC)来自(例如获自或源自于)骨髓。在一些实施方案中，工程化的间充质干细胞来自(例如获自或源自于)脂肪组织。在一些实施方案中，工程化的间充质干细胞来自(例如获自或源自于)脐带。在一些实施方案中，工程化的间充质干细胞来自多能干细胞(例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。
因此，本发明提供了被工程化用于产生多种效应分子的T细胞(例如CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和调节T细胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，B细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，NK细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，NKT细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，固有淋巴样细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，肥大细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，嗜碱性粒细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，巨噬细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，中性粒细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，树突状细胞被工程化用于产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。
在一些实施方案中，效应分子中的至少一种刺激肿瘤微环境中的免疫刺激机制和/或抑制肿瘤微环境中的免疫抑制机制。
在一些实施方案中，效应分子中的至少一种(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原呈递和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突状细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集或抑制消炎巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激代谢物产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导，(l)抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导，(o)抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导，和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。
方法
本文还提供了包括培养本公开的工程化MSC(或其它工程化的免疫细胞)的方法。已知培养MSC的方法。在一些实施方案中，在生长培养基(例如MSCGM人类间充质干细胞生长BULLETKITTM培养基(含血清)、THERAPEAKTM MSCGM-CDTM间充质干细胞化学成分明确培养基(无血清)或RoosterBio无异源物种MSC培养基)中培养MSC。本领域的技术人员已知培养其它细胞，例如免疫细胞的方法。
本文进一步提供了包括向受试者(例如人类受试者)递送或施用如本文提供的工程化细胞以在体内产生至少一种由所述细胞产生的效应分子的方法。在一些实施方案中，细胞经由静脉内、腹膜内、气管内、皮下、肿瘤内、经口、肛门、鼻内(例如包装在递送粒子中)或动脉(例如颈内动脉)途径施用。因此，细胞可全身或局部施用(例如至TME)。
本文所述的工程化细胞或多核苷酸可以呈含有药学上可接受的载体、例如含水载体的组合物。可使用多种含水载体，例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术来灭菌，或可无菌过滤。所得水溶液可以包装原样使用，或冻干，冻干制剂在施用前与无菌溶液组合。根据需要组合物可含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH值调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
一些方法包括选择具有肿瘤(或癌症)的受试者(或患者群体)并且用工程化细胞治疗受试者。
在一些情况下，本发明的工程化细胞可用于治疗癌症，例如卵巢癌。本文描述其它癌症。举例来说，工程化细胞可用于治疗膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺瘤和/或子宫肿瘤。
本文提供的方法还包括递送工程化细胞的制剂，例如工程化细胞。在一些实施方案中，制剂为基本上纯的制剂，其含有例如少于5％(例如少于4％、3％、2％或1％)除细胞以外的细胞。制剂可包含1×105个细胞/公斤至1×107个细胞/公斤的例如工程化细胞。
本文提供的方法还包括体内递送能够产生本文描述的工程化细胞的组合物，例如体内递送慢病毒。还可以使用其它体内递送机制和系统，包括已知用于人类疗法中的递送机制和系统，例如病毒递送系统(例如逆转录病毒或腺病毒系统)、转座子(例如SleepingBeauty和PiggyBac转座子系统)，使用PhiC31整合至基因组假位点，或使用核酸酶，例如锌指(ZF)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat，CRISPR)或类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)。
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额外实施方案
以下提供了描述特定实施方案的列举段落：
1.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
2.段落1的工程化细胞，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
3.段落1的工程化细胞，其中所述启动子包含内源性启动子。
4.段落1-3中任一段落的工程化细胞，其中启动子可操作地连接于表达盒，以使得多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸。
5.段落4的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列与所述第一效应分子和所述第二效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
6.段落5的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
7.段落6的工程化细胞，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
8.段落5的工程化细胞，其中接头多核苷酸序列编码T2A核糖体跳跃标签。
9.段落5的工程化细胞，所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
10.段落5-9中任一段落的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
11.段落10的工程化细胞，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶识别多肽序列。
12.段落5-9中任一段落的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列进一步编码Gly-Ser-Gly多肽序列。
13.段落1-5中任一段落的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
14.段落1-3中任一段落的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码第二启动子，
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S1-E1的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述第二启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S2-E2的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
15.段落14的工程化细胞，其中所述启动子和所述第二启动子是相同的。
16.段落14的工程化细胞，其中所述启动子和所述第二启动子是不同的。
17.段落1-16中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。
18.段落1-17中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞为人类细胞。
19.段落18的工程化细胞，其中所述人类细胞为从受试者分离的细胞。
20.段落19的工程化细胞，其中分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。
21.段落1-20中任一段落的工程化细胞，其中工程化的细胞为培养细胞。
22.段落1-21中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化MSC包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。
23.段落22的工程化细胞，其中所述细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
24.段落1-21中任一段落的工程化细胞，其中工程化MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。
25.段落22-24中任一段落的工程化细胞，其中细胞标志物表型通过或已经通过流式细胞术来测定。
26.段落1-21中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含T细胞。
27.段落1-21中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含NK细胞。
28.段落1-21中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含NKT细胞。
29.段落22-28中任一段落的工程化细胞，其中所述细胞标志物表型还包含包括在所述工程化细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的同源受体或同源受体配体的细胞标志物。
30.段落29的工程化细胞，其中所述受体选自由以下组成的组：IL12RB1、IL12RB2、CCL7和它们的组合。
31.段落1-30中任一段落的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含组成型启动子。
32.段落31的工程化细胞，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
33.段落1-30中任一段落的工程化细胞，其中所述启动子包含SFFV启动子。
34.段落1-30中任一段落的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含诱导型启动子。
35.段落34的工程化细胞，其中诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
36.段落1-35中任一段落的工程化细胞，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含相对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说为天然的天然信号肽。
37.段落1-36中任一段落的工程化细胞，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含相对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说为非天然的非天然信号肽。
38.段落37的工程化细胞，其中所述非天然信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα、CXCL12和IL21。
39.段落1-38中任一段落的工程化细胞，其中所述第一信号肽和所述第二信号肽是相同的。
40.段落1-39中任一段落的工程化细胞，其中编码所述第一信号肽的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
41.段落1-40中任一段落的工程化细胞，其中所述第一分泌多肽为人IL12信号肽。
42.段落1-40中任一段落的工程化细胞，其中编码所述第二信号肽的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
43.段落1-42中任一段落的工程化细胞，其中所述第二分泌多肽为人IL21信号肽。
44.段落1-42中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
45.段落1-44中任一段落的工程化细胞，其中所述第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
46.段落45的工程化细胞，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的治疗类别是不同的。
47.段落1-46中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子和/或所述第二效应分子为修饰的效应分子。
48.段落47的工程化细胞，其中所述第一效应分子和/或所述第二效应分子被修饰成包含细胞膜系栓结构域。
49.段落48的工程化细胞，其中所述细胞膜系拴结构域包含跨膜-细胞内结构域或跨膜结构域。
50.段落48的工程化细胞，其中所述细胞膜系拴结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分。
51.段落50的工程化细胞，其中所述修饰的效应分子为包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分的融合蛋白。
52.段落48-51中任一段落的工程化细胞，其中所述修饰的效应分子还包含介于所述效应分子与所述细胞膜系拴结构域之间的接头。
53.段落47-52中任一段落的工程化细胞，其中当表达时，所述修饰的效应分子系拴至所述工程化细胞的细胞膜。
54.段落44-53中任一段落的工程化细胞，其中细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
55.段落54的工程化细胞，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
56.段落44-55中任一段落的工程化细胞，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9和XCL1。
57.段落44-56中任一段落的工程化细胞，其中所述生长因子选自由以下组成的组：Flt3L和GM-CSF。
58.段落44-57中任一段落的工程化细胞，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
59.段落34-41中任一段落的工程化细胞，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
60.段落59的工程化细胞，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP和它们的组合。
61.段落59的工程化细胞，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体。
62.段落59的工程化细胞，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
63.段落1-59中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子为人类来源效应分子。
64.段落1-63中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子包含IL12。
65.段落1-63中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子包含IL12p70融合蛋白。
66.段落65的工程化细胞，其中所述IL12p70融合蛋白为人IL12p70融合蛋白。
67.段落64-66中任一段落的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含CCL21a。
68.段落67的工程化细胞，其中所述CCL21a为人CCL21a。
69.段落64-66中任一段落的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含IL7。
70.段落69的工程化细胞，其中所述IL7为人IL7。
71.段落64-66中任一段落的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含IL21。
72.段落71的工程化细胞，其中所述IL21为人IL21。
73.段落1-72中任一段落的工程化细胞，其中所述表达盒还包含包括编码第三效应分子的多核苷酸序列的E3。
74.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含Flt3L。
75.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含抗PD1。
76.段落75的工程化细胞，其中所述表达盒还包含包括编码第四效应分子的多核苷酸序列的E4。
77.段落76的工程化细胞，其中所述第四效应分子包含腺苷脱氨酶。
78.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含腺苷脱氨酶。
79.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含CD40L。
80.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。
81.段落73的工程化细胞，其中所述第三效应分子包含XCL1。
82.段落64的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含Flt3L。
83.段落64的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。
84.段落64的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含抗PD1。
85.段落64的工程化细胞，其中所述第二效应分子包含CD40L。
86.段落1-63中任一段落的工程化细胞，其中所述第一效应分子包含干扰素-β并且所述第二效应分子包含Flt3L。
87.段落1-86中任一段落的工程化细胞，其中编码所述第一效应分子的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
88.段落1-87中任一段落的工程化细胞，其中编码所述第二效应分子的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
89.段落1-88中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含编码所述启动子和所述表达盒的多核苷酸序列。
90.段落89的工程化细胞，其中所述外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的序列。
91.段落1-90中任一段落的工程化细胞，其中所述外源性多核苷酸序列被整合至所述工程化细胞的基因组中。
92.段落1-91中任一段落的工程化细胞，其中外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
93.段落92的工程化细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。
94.段落1-93中任一段落的工程化细胞，其中所述表达盒在E2之后还包含额外外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包含下式，从5’至3’定向，所述式包含：
(L-S-E)X
其中
S包含编码信号肽的多核苷酸序列，
E包含编码效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
X＝1至20
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，并且其中对于各X，对应的所述信号肽与所述效应分子可操作地相关联。
95.一种包含构建体的工程化细胞，其中所述构建体包含：
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
96.段落95的工程化细胞，其中所述构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
97.段落95或段落96的工程化细胞，其中所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。
98.段落95-97中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞为人类细胞。
99.段落98的工程化细胞，其中所述人类细胞为从受试者分离的细胞。
100.段落99的工程化细胞，其中分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。
101.段落95-100中任一段落的工程化细胞，其中工程化的细胞为培养细胞。
102.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化MSC包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。
103.段落102的工程化细胞，其中所述细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
104.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中工程化MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。
105.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含T细胞。
106.段落105的工程化细胞，其中所述T细胞为CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞或调节T细胞。
107.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含NK细胞。
108.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含NKT细胞。
109.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含单核细胞。
110.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含巨噬细胞。
111.段落95-101中任一段落的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含TIL。
112.段落95-111中任一段落的工程化细胞，其中所述外源性多核苷酸序列被整合至所述工程化细胞的基因组中。
113.段落95-112中任一段落的工程化细胞，其中外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
114.段落113的工程化细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。
115.段落113的工程化细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
116.段落1-115中任一段落的工程化细胞，其中所述细胞分泌各效应分子。
117.段落116的工程化细胞，其中所述第一效应分子以相对于所述第二效应分子的分泌高10倍的比率分泌。
118.段落1-117中任一段落的工程化细胞，其中所述细胞还包含抗原识别受体。
119.段落118的工程化细胞，其中所述抗原识别受体识别选自由以下组成的组的抗原：5T4、ADAM9、ADGRE2、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、钙粘附蛋白3、钙粘附蛋白6、CCR1、CCR4、CD117、CD123、CD131、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD244、CD30、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CD93、CEA、CEACAM5、紧密连接蛋白18.2、CLEC12A、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、EMB、ENPP3、EpCAM、EphA2、Ephrin A4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRα、FRb、FLT3、GAPT、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-1RAP、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、整合素aV、KIT、L1CAM、LAMP1、LAT2、Lewis Y、LeY、LILRA2、LILRB2、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、间皮素、MLC1、MS4A3、MUC1、MUC16、MUC1C、MYADM、NaPi2B、结合素4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、卵巢素、P-钙粘附蛋白、pan-Erb2、PIEZO1、PRAM1、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLC22A16、SLC17A9、SLITRK6、SPNS3、SSTR2、STEAP1、生存素、TDGF1、TIM1、TROP2、VSTM1和WT1。
120.段落118或段落119的工程化细胞，其中所述抗原识别受体包含抗原结合结构域。
121.段落120的工程化细胞，其中所述抗原结合结构域包含抗体、抗体的抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。
122.段落120的工程化细胞，其中所述抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。
123.段落122的工程化细胞，其中所述scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
124.段落123的工程化细胞，其中所述VH和VL通过肽接头相隔。
125.段落124的工程化细胞，其中所述scFv包含结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为重链可变结构域，L为肽接头，并且VL为轻链可变结构域。
126.段落118-125中任一段落的工程化细胞，所述抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
127.段落118-125中任一段落的工程化细胞，所述抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。
128.段落127的工程化细胞，其中所述CAR包含一种或多种细胞内信号传导结构域，且所述一种或多种细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ链细胞内信号结构域、CD97细胞内信号结构域、CD11a-CD18细胞内信号结构域、CD2细胞内信号结构域、ICOS细胞内信号结构域、CD27细胞内信号结构域、CD154细胞内信号结构域、CD8细胞内信号结构域、OX40细胞内信号结构域、4-1BB细胞内信号结构域、CD28细胞内信号结构域、ZAP40细胞内信号结构域、CD30细胞内信号结构域、GITR细胞内信号结构域、HVEM细胞内信号结构域、DAP10细胞内信号结构域、DAP12细胞内信号结构域和MyD88细胞内信号结构域。
129.段落127或段落128的工程化细胞，其中所述CAR包含跨膜结构域，并且跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域和BTLA跨膜结构域。
130.段落127-129中任一段落的工程化细胞，其中所述CAR包含介于所述抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔区。
131.一种细胞群体，所述细胞群体包含段落1-130中任一段落的任何工程化细胞。
132.段落131的细胞群体，其中所述细胞群体富集所述工程化的细胞。
133.段落131或段落132的细胞群体，其中在所述工程化细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于所述群体中不表达所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的细胞增加。
134.段落133的细胞群体，其中所述第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。
135.段落134的细胞群体，其中富集所述工程化细胞的所述细胞群体表达IL12受体β1或增加其水平，表达IL12受体β2或增加其水平，或表达IL12受体β1和IL12受体β2或增加其水平。
136.段落133-135中任一段落的细胞群体，其中所述第二效应分子为IL21。
137.段落133-135中任一段落的细胞群体，其中所述第二效应分子为CCL21。
138.段落137的细胞群体，其中富集所述工程化细胞的所述细胞群体表达CCL21受体或增加其水平。
139.段落138的细胞群体，其中所述CCL21受体为CCR7。
140.一种刺激受试者中细胞介导的对肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的段落1-114中任一段落的任何工程化细胞或段落131-139中任一段落的细胞群体。
141.一种为受试者提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的段落1-114中任一段落的任何工程化细胞或段落131-139中任一段落的细胞群体。
142.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的段落1-114中任一段落的任何工程化细胞或段落131-139中任一段落的细胞群体。
143.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的段落1-114中任一段落的任何工程化细胞或段落131-139中任一段落的细胞群体。
144.段落140-143中任一段落的方法，其中所述工程化细胞源自于所述受试者。
145.段落140-143中任一段落的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者为同种异体的。
146.段落140-145中任一段落的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
147.段落140-145中任一段落的方法，其中所述肿瘤为卵巢肿瘤。
148.段落140-147中任一段落的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
149.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
(L-S-E)X
其中
S包含编码信号肽的多核苷酸序列，
E包含编码效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
X＝2至20，
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，其中对于(L-S-E)的第一次迭代来说，单元L缺乏，并且其中对于各X来说，对应的信号肽与所述效应分子可操作地相关联，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
150.一种细胞群体，所述细胞群体包含一个或多个工程化细胞，其中所述一个或多个工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
151.一种细胞群体，所述细胞群体包含一个或多个工程化细胞，其中所述一个或多个工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中在所述工程化细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于所述群体中不表达所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的细胞增加，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
152.段落151的细胞群体，其中所述一个或多个工程化细胞表达在所述工程化细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的同源受体或同源受体配体。
153.段落151或段落152的细胞群体，其中所述第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。
154.段落151-153中任一段落的细胞群体，其中所述第二效应分子为IL21。
155.段落151-153中任一段落的细胞群体，其中所述第二效应分子为CCL21。
156.一种细胞群体，所述细胞群体包含一个或多个工程化细胞，其中所述一个或多个工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
157.一种细胞群体，所述细胞群体包含一个或多个工程化细胞，其中所述一个或多个工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中在所述工程化细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子促进生长、活力或生长和活力相对于所述群体中不表达所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的细胞增加，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
158.段落156或段落157的细胞群体，其中构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
159.一种产生富集一种或多种受体或受体配体的细胞群体的方法，所述方法包括在使一个或多个细胞接触第一效应分子、第二效应分子或第一效应分子和第二效应分子的条件下培养所述一个或多个细胞，其中接触的细胞表达所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的一种或多种同源受体或同源受体配体，并且其中所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子促进接触的细胞的生长、活力或生长和活力相对于缺乏所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子时培养的细胞增加。
160.段落159的方法，其中所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子在一个或多个细胞中异源表达，并且所述一个或多个细胞以自分泌方式接触所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子。
161.段落159的方法，其中所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子在一个或多个额外细胞中表达，并且所述一个或多个细胞以旁分泌方式接触所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子。
162.段落161的方法，其中所述一个或多个额外细胞为饲养细胞。
163.段落159的方法，其中所述一个或多个细胞在培养基中培养。
164.段落163的方法，其中通过添加可溶性第一效应分子、可溶性第二效应分子或可溶性第一效应分子和第二效应分子至所述培养基，使所述一个或多个细胞接触所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子。
165.段落163或段落164的方法，其中所述可溶性第一效应分子和/或所述可溶性第二效应分子为重组效应分子。
166.段落159的方法，其中所述一个或多个细胞在附着条件下培养。
167.段落166的方法，其中所述一个或多个细胞附着至表面上。
168.段落167的方法，其中通过将所述一个或多个细胞暴露于所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子，使所述附着细胞接触所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子，固定在表面上。
169.段落159-168中任一段落的方法，其中所述第一效应分子为IL12或IL12p70融合蛋白。
170.段落169的方法，其中所述细胞群体富集IL12受体β1(IL12Rβ1)、富集IL12受体β2(IL12Rβ2)或富集IL12Rβ1和IL12Rβ2。
171.段落170的方法，其中所述MSC群体包含包括细胞标志物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+和IL12Rβ2+的细胞标志物表型。
172.段落171的方法，其中细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
173.段落159的方法，其中所述细胞群体包含选自由以下组成的组的细胞：自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和调节T细胞和B细胞。
174.段落173的方法，其中所述细胞群体包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或骨髓来源细胞。
175.段落159-174中任一段落的方法，其中所述第二效应分子为IL21。
176.段落159-174中任一段落的方法，其中所述第二效应分子为CCL21。
177.段落176的方法，其中所述细胞群体富集CCR7。
178.段落177的方法，其中所述MSC群体包含包括细胞标志物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+、IL12Rβ2+和CCR7+的细胞标志物表型。
179.段落178的方法，其中细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
180.一种细胞群体，其富集一种或多种受体或受体配体，通过段落159-179中任一段落的方法产生。
181.一种外源性多核苷酸序列，其包含启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
182.段落181的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
183.段落181的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子包含内源性启动子。
184.段落181-183中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中启动子可操作地连接于表达盒，以使得多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸。
185.段落184的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列与所述第一效应分子和所述第二效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
186.段落185的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
187.段落186的外源性多核苷酸序列，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
188.段落185的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码T2A核糖体跳跃标签。
189.段落185的外源性多核苷酸序列，所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
190.段落185-189中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
191.段落181的外源性多核苷酸序列，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶识别多肽序列。
192.段落185-189中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列进一步编码Gly-Ser-Gly多肽序列。
193.段落181-185中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
194.段落181-183中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码第二启动子，
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S1-E1的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述第二启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S2-E2的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
195.段落181的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子和所述第二启动子是相同的。
196.段落181的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子和所述第二启动子是不同的。
197.段落181-196中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含组成型启动子。
198.段落197的外源性多核苷酸序列，其中组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
199.段落181-196中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子包含SFFV启动子。
200.段落181-196中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含诱导型启动子。
201.段落200的外源性多核苷酸序列，其中诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
202.段落181-201中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含相对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说为天然的天然信号肽。
203.段落181-202中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含相对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说为非天然的非天然信号肽。
204.段落203的外源性多核苷酸序列，其中所述非天然信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα、CXCL12和IL21。
205.段落181-204中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一信号肽和所述第二信号肽是相同的。
206.段落181-205中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中编码所述第一信号肽的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
207.段落181-206中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一分泌多肽为人IL12信号肽。
208.段落181-206中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中编码所述第二信号肽的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
209.段落181-208中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第二分泌多肽为人IL21信号肽。
210.段落181-208中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
211.段落181-210中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
212.段落211的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的治疗类别是不同的。
213.段落181-212中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子和/或所述第二效应分子为修饰的效应分子。
214.段落213的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子和/或所述第二效应分子被修饰成包含细胞膜系栓结构域。
215.段落214的外源性多核苷酸序列，其中所述细胞膜系拴结构域包含跨膜-细胞内结构域或跨膜结构域。
216.段落214的外源性多核苷酸序列，其中所述细胞膜系拴结构域包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分。
217.段落216的外源性多核苷酸序列，其中所述修饰的效应分子为包含细胞表面受体或其细胞膜结合部分的融合蛋白。
218.段落214-217中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述修饰的效应分子还包含介于所述效应分子与所述细胞膜系拴结构域之间的接头。
219.段落213-218中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中当在细胞中表达时，修饰的效应分子系拴至细胞的细胞膜。
220.段落210-219中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
221.段落220的外源性多核苷酸序列，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
222.段落210-221中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9和XCL1。
223.段落210-222中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述生长因子选自由以下组成的组：Flt3L和GM-CSF。
224.段落210-223中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
225.段落210-224中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
226.段落225的外源性多核苷酸序列，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP和它们的组合。
227.段落225的外源性多核苷酸序列，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体。
228.段落225的外源性多核苷酸序列，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
229.段落181-225中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子为人类来源效应分子。
230.段落181-229中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子包含IL12。
231.段落181-229中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子包含IL12p70融合蛋白。
232.段落231的外源性多核苷酸序列，其中所述IL12p70融合蛋白为人IL12p70融合蛋白。
233.段落230-232中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含CCL21a。
234.段落233的外源性多核苷酸序列，其中所述CCL21a为人CCL21a。
235.段落230-232中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含IL7。
236.段落235的外源性多核苷酸序列，其中所述IL7为人IL7。
237.段落230-232中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含IL21。
238.段落237的外源性多核苷酸序列，其中所述IL21为人IL21。
239.段落181-238中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述表达盒还包含包括编码第三效应分子的多核苷酸序列的E3。
240.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含Flt3L。
241.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含抗PD1。
242.段落241的外源性多核苷酸序列，其中所述表达盒还包含包括编码第四效应分子的多核苷酸序列的E4。
243.段落242的外源性多核苷酸序列，其中所述第四效应分子包含腺苷脱氨酶。
244.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含腺苷脱氨酶。
245.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含CD40L。
246.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。
247.段落239的外源性多核苷酸序列，其中所述第三效应分子包含XCL1。
248.段落230的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含Flt3L。
249.段落230的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。
250.段落230的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含抗PD1。
251.段落230的外源性多核苷酸序列，其中所述第二效应分子包含CD40L。
252.段落181-229中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述第一效应分子包含干扰素-β并且所述第二效应分子包含Flt3L。
253.段落181-252中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中编码所述第一效应分子的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
254.段落181-253中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中编码所述第二效应分子的所述多核苷酸序列包含密码子优化的多核苷酸序列。
255.段落181-254中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
256.一种外源性多核苷酸序列，其包含SFFV启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
257.段落256的外源性多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
258.一种外源性多核苷酸序列，其包含SFFV启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子；
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得所述多核苷酸能够转录为包含式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸；并且
其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
259.段落181-258中任一段落的外源性多核苷酸序列，其中所述外源性多核苷酸序列由选自由以下组成的组的核酸编码：DNA、cDNA、RNA、mRNA和裸质粒。
260.一种表达载体，所述表达载体包含段落181-259中任一段落的外源性多核苷酸序列。
261.段落260的表达载体，其中所述表达载体为病毒载体。
262.段落261的表达载体，其中所述表达载体为慢病毒载体。
263.一种组合物，所述组合物包含段落181-259中任一段落的外源性多核苷酸序列和药学上可接受的载体。
264.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含段落181-259中任一段落的外源性多核苷酸序列、段落260-262中任一段落的表达载体或段落263的组合物。
265.段落264的分离的细胞，其中所述分离的细胞选自由以下组成的组：T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节T细胞、病毒特异性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、红血球、血小板细胞、人类胚胎干细胞(ESC)、ESC来源细胞、多能干细胞、MSC、诱导性多能干细胞(iPSC)和iPSC来源细胞。
266.段落264的分离的细胞，其中所述分离的细胞为MSC。
267.段落264-266中任一段落的分离的细胞，其中所述外源性多核苷酸序列被整合至所述细胞的基因组中。
268.段落264-267中任一段落的分离的细胞，其中所述外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
269.段落268的分离的细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。
270.段落268的分离的细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
271.段落264-270中任一段落的分离的细胞，其中所述工程化细胞相对于需要治疗性治疗的受试者来说为HLA型。
272.段落264-271中任一段落的分离的细胞，其中所述工程化细胞为人类细胞。
273.段落272的分离的细胞，其中所述人类细胞为从受试者分离的细胞。
274.段落273的分离的细胞，其中分离的细胞从由以下组成的群的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。
275.段落264-272中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞为培养细胞。
276.段落264-275中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞包含包括细胞标志物CD105+、CD73+和CD90+的细胞标志物表型。
277.段落276的分离的细胞，其中细胞标志物表型还包含缺乏或基本上缺乏选自由以下组成的组的一种或多种细胞标志物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II类HLA和它们的组合。
278.段落264-275中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。
279.段落264-278中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞标志物表型还包含包括在所述细胞中表达的所述第一效应分子、所述第二效应分子或所述第一效应分子和所述第二效应分子的同源受体或同源受体配体的细胞标志物。
280.段落279的分离的细胞，其中所述受体选自由以下组成的组：IL12RB1、IL12RB2、CCL7和它们的组合。
281.段落264-280中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞分泌各效应分子。
282.段落281的分离的细胞，其中所述第一效应分子以相对于所述第二效应分子的分泌高10倍的比率分泌。
283.段落264-282中任一段落的分离的细胞，其中所述细胞还包含抗原识别受体。
284.段落283的分离的细胞，其中所述抗原识别受体包含抗原结合结构域。
285.段落284的分离的细胞，其中所述抗原结合结构域包含抗体、抗体的抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。
286.段落284的分离的细胞，其中所述抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。
287.段落286的分离的细胞，其中所述scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
288.段落287的分离的细胞，其中所述VH和VL通过肽接头相隔。
289.段落288的分离的细胞，其中所述scFv包含结构VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH为重链可变结构域，L为肽接头，并且VL为轻链可变结构域。
290.段落283-289中任一段落的分离的细胞，所述抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
291.段落283-289中任一段落的分离的细胞，所述抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。
292.段落291的分离的细胞，其中所述CAR包含一个或多个细胞内信号传导结构域，并且所述一个或多个细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ链细胞内信号传导结构域、CD97细胞内信号传导结构域、CD11a-CD18细胞内信号传导结构域、CD2细胞内信号传导结构域、ICOS细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结构域、CD154细胞内信号传导结构域、CD8细胞内信号传导结构域、OX40细胞内信号传导结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、ZAP40细胞内信号传导结构域、CD30细胞内信号传导结构域、GITR细胞内信号传导结构域、HVEM细胞内信号传导结构域、DAP10细胞内信号传导结构域、DAP12细胞内信号传导结构域和MyD88细胞内信号传导结构域。
293.段落291或段落292的分离的细胞，其中所述CAR包含跨膜结构域，并且所述跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ链跨膜结构域、CD4跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、OX40跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、LAG-3跨膜结构域、2B4跨膜结构域和BTLA跨膜结构域。
294.段落291-293中任一段落的分离的细胞，其中所述CAR包含介于所述抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔区。
295.一种病毒，所述病毒包含段落181-259中任一段落的外源性多核苷酸序列或段落260-262中任一段落的表达载体。
296.段落295的病毒，其中所述病毒选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子和腺病毒。
297.段落295的病毒，其中所述病毒为慢病毒。
298.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送包含被工程化用于产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
299.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送包含被工程化用于产生IL12和IL21的细胞的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
300.段落299的方法，其中构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
301.段落298-300中任一段落的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂。
302.段落301的方法，其中所述检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体或抗CTLA-4抗体。
303.段落298-302中任一段落的方法，其中所述方法还包括施用抗CD40抗体。
304.段落298-303中任一段落的方法，其中肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
305.段落298-303中任一段落的方法，其中所述肿瘤为卵巢肿瘤。
306.段落298-303中任一段落的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
307.段落298-306中任一段落的方法，其中所述施用包含全身施用、腹膜内施用或肿瘤内施用。
308.段落298-307中任一段落的方法，其中相对于对照物，肿瘤体积减少了至少25％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。
309.段落307的方法，其中相对于对照物，肿瘤体积减少了至少50％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。
310.段落309的方法，其中相对于对照物，肿瘤体积减少了至少75％，任选地其中所述对照物为未修饰的细胞。
311.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送能够对细胞进行工程化以产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的组合物，其中各工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
312.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括以有效减小肿瘤体积的量向具有肿瘤的受试者递送能够对细胞进行工程化以产生IL12和IL21的组合物，其中所述工程化细胞包含构建体，其中所述构建体包含：
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
313.段落312的方法，其中构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
314.段落311-313中任一段落的方法，其中所述组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统，
315.段落314的方法，其中所述病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子和腺病毒。
316.段落314的方法，其中所述核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
317.段落311-316中任一段落的方法，其中肿瘤选自由以下组成的组：腺癌、急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性B细胞白血病(BALL)、急性成淋巴细胞性T细胞白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病(CML)、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、脊髓发育不良、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、浆细胞骨髓瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
318.段落311-317中任一段落的方法，其中所述施用包含全身施用、腹膜内施用或肿瘤内施用。
实施例
实施例1
本实施例描述了利用个别和组合免疫疗法有效载荷对MSC进行体外表征。首先测量表达免疫疗法的MSC对癌细胞的直接抗癌作用。然后测量表达免疫疗法的MSC对原代免疫细胞(集中在T细胞上)与癌细胞的共培养物的作用。基于小鼠和人类细胞系统中的炎性生物标志物组，将表达免疫疗法的MSC的免疫刺激特性排序。鉴定独自或与T细胞一起显著增强癌细胞杀死的表达免疫疗法的MSC，并且选择进展至体外测试的最佳候选者。
方法：表达免疫疗法的MSC被工程化用于表达表1中列出的效应分子，使用与癌症疗法有关的体外模型评估其功能作用。从循环PBMC分离的人类卵巢癌细胞(例如OVCAR8和SKOV3)和人类免疫细胞用于测试表达hIT的hMSC。小鼠卵巢癌细胞(例如ID8)和小鼠免疫细胞用于测试表达mIT的mMSC。
检查点抑制剂.细胞结合测定法用于证实所表达抗体的活性。虽然抗体的标靶CTLA4和PD1均负调控T细胞，但其在T细胞活化的不同阶段上调(Boutros C等人(2016)NatRev Clin Oncol 13(8):473-486；Valsecchi ME(2015)New Engl J Med 373(13):1270-1270)。CTLA4在启动期中暂时上调，而PD1在T细胞活化的效应期中始终表达(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人(2013)Front Immunol 4:455)。抗CTLA4抗体结合于T细胞表面上的CTLA4，阻断CTLA4在早期关闭T细胞活化，并且人类抗PD1抗体结合于PD1，阻止肿瘤细胞抑制T细胞活性。
使用EASYSEPTM磁性珠粒(STEMCELL Technologies)，通过阴性选择，从PBMC分离T细胞。通过人类T-活化剂CD3/28Dynabeads(Thermo Fisher)活化分离的T细胞，并且历经5天监测CTLA-4和PD-1的表达，以选择每种表面标志物的最佳表达时机。在适当天数，将来自表达CTLA-4或PD-1的抗体的MSC的条件培养基或来自无表达的MSC的对照条件培养基施加于活化T细胞，以验证这些抗体的直接细胞表面-受体结合。荧光染料标记的二次检测抗体将与流式细胞术一起证实结合。
趋化因子.使用细胞迁移测定法和表达对CCL21趋化性起反应的趋化因子受体CCR7的分离的未处理T细胞来证实CCL21趋化因子功能性。具体来说，将表达CCL21或对照MSC添加至trans-well的一个隔室，并接着通过分离的未处理T细胞评定从另一隔室的细胞迁移，接着计数迁移T细胞的数目(Justus CR等人(2014)J Vis Exp(88))。
细胞因子.测量IL2、IL12和IL15的活性。特定针对IL2、IL12和IL15的ELISA测定法用于检测这些细胞因子在MSC上清液中的水平。功能生物活性测定法采用CTLL-2细胞系评定IL2或IL15介导的增殖，或采用NKG细胞系评定IL12介导的MSC上清液的IFN-γ产生。使用
Figure BDA0003092762570001711
技术的多路细胞因子概况测定也可以用于评定细胞因子表达和对免疫细胞的作用。
STING通路.利用组成性STING突变体有效载荷测量STING通路活化。使用
Figure BDA0003092762570001712
珠粒，对MSC中I型干扰素(例如IFN-α2和IFN-β)的分泌与STING突变体的表达进行概况分析。
表达免疫疗法的MSC对卵巢癌细胞的直接作用.在体外测试MSC对卵巢癌细胞生长和活力的任何直接作用。举例来说，将候选mMSC或hMSC与小鼠卵巢癌细胞系(ID8)或人类卵巢癌细胞系(OVCAR8和SKOV3)共培养，并且通过良好表征的乳酸脱氢酶(LDH)测定法测量癌细胞的细胞毒性。在共培养24小时之后，收集上清液，并且经由酶促反应来测量与细胞死亡相关的LDH水平，所述酶促反应随后通过板式读数器上的特定吸光度定量。另外，通过台盼蓝拒染法(Trypan Blue exclusion)计数活细胞对比死细胞，并且通过流式细胞术，使用膜联蛋白-V和碘化丙啶染色计数活细胞对比细胞凋亡/死细胞来评定癌细胞数目。
表达免疫疗法的MSC对T细胞和卵巢癌细胞共培养系统的作用.测试确定表达免疫疗法的MSC是否可刺激例如T细胞的免疫细胞，以具有提高的针对体外卵巢癌细胞的抗癌活性。具体来说，将候选mMSC-mIT与小鼠脾细胞和ID8癌细胞系共培养，或候选hMSC-hIT与人类PBMC和OVCAR8或SKOV3细胞系共培养。共培养测定法需要使用PBMC/脾细胞与卵巢癌细胞，有或无MSC，并且用抗CD3/28珠粒刺激。为了评定癌细胞死亡，使用例如LDH细胞毒性测量的技术，将染料标记的卵巢癌细胞与未标记的效应PBMC/脾细胞以固定比率组合并且通过流式细胞术分析杀死，进行16小时杀死测定法(Jedema I等人(2004)Blood 103(7):2677-2682)，并且通过流式细胞术，使用膜联蛋白-V与碘化丙啶进行细胞凋亡读取。特别地，通过在3-5天的CFSE细胞分裂和1-3天的IFN-γ的细胞因子产生来测定T细胞活化/增殖。
产生表达CTLA-4和PD1的T细胞的替代策略是用植物血球凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)活化以表达细胞表面受体PD1和CTLA4。在第3天，约99％的活化T细胞将表达PD1，而约15％将表达CTLA4(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人(2013)Front Immunol 4:455)。在第10天，活化T细胞将处于效应期，此时CTLA4表达下调但PD1表达维持。评估这些抗体的直接细胞表面-受体结合。在诱导后第3天和第10天，将具有相应检查点抑制剂抗体表达构建体的MSC施加于T细胞培养物。将标记的检测抗体与流式细胞术一起使用来证实结合。商业抗体用作对照。
实施例2
本实施例描述了在同基因卵巢癌症模型中表达免疫疗法有效载荷的MSC的体内表征。使用同基因小鼠卵巢癌模型表征表达免疫疗法的MSC的抗肿瘤功效(具有小鼠免疫系统的mMSC-mIT)。测量同基因卵巢小鼠模型中工程化MSC的肿瘤归巢以及个别和组合免疫疗法的表达。还测量在工程化MSC处理下的卵巢肿瘤负荷和小鼠生存。本实施例将证明在卵巢肿瘤对比其它身体部位中工程化MSC选择性归巢至TME和局部产生免疫疗法因子。本实施例还将证明在表达免疫疗法的工程化MSC下肿瘤负荷显著减少，并且小鼠生存延长。
方法：来源于小鼠卵巢上皮表面细胞(mouse ovarian epithelial surfacecell，MOSE)的自发转化的小鼠ID8细胞系用于建立同基因卵巢肿瘤模型(Roby KF等人(2000)Carcinogenesis 21(4):585-591)。还使用ID8细胞系的衍生物(例如ID8-VEGF(ID8-Defb29/Vegf-a)、ID8-P53DN、ID8-P53KO-PTEN KO、ID8-P53KO-BRCA2 KO、ID8-P53KO-BRCA1KO、ID8-PD53KO-Nf1KO)。ID8细胞系感染表达海肾荧光素酶(rLuc)的慢病毒以允许进行体内生物发光成像，其与表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)的MSC呈正交关系。在小鼠中建立同基因卵巢癌症模型之前，在体外在ID8中证实成功的rLuc表达。对于同基因模型，将5×105个ID8细胞注射至6至8周龄之间的C57BL/6小鼠的腹膜腔中(36,54)。如实施例1中，与表达ffLuc的质粒一起，对MSC进行工程化。
在第25天(在注射肿瘤细胞之后)，以每只动物106MSC的剂量将候选mMSC-mIT引入同基因小鼠模型中，每周一次，历时5周(Dembinski JL等人(2013)Cytotherapy 15(1):20-32)。随着时间过去，分别通过rLuc和ffLuc生物发光成像以及终点时刻后的组织学分析，目测卵巢肿瘤负荷和候选mMSC-mIT。当小鼠显现痛苦迹象，例如体重减轻、毛皮起皱、身体姿势不佳、腹部扩大和黄疸时，将其处死。测量小鼠的生存曲线。通过生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)和在处死时通过尸检来定量肿瘤细胞的远处转移。测量不同时间点的免疫系统概况和活性，作为对疗法的反应的生物标志物。
为了评定MSC的预期抗肿瘤作用的变化性，变化用于建立模型的ID8细胞的剂量(例如细胞数目至5×106)，变化所用MSC的剂量，以及调节建立肿瘤后递送MSC时的时间。
即使在小鼠模型中mMSC已显示归巢至卵巢肿瘤，一些有效载荷也可能破坏此归巢活性。在这些情况下，这些有效载荷的表达可以被工程化成诱导性的。这可以例如用根皮素诱导系统来实现(Gitzinger M等人(2009)Proc Natl Acad Sci U S A 106(26):10638-10643)。可替代地，二聚系统可用于使用小分子将合成锌指DNA结合结构域与反式活化结构域连接(Clackson T等人(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10437-10442)。可替代地或另外，可构建诱导性有效载荷表达构建体，其是在肿瘤微环境中基于例如低O2的信号引起的。
慢病毒ffLuc构建体也可以用于感染MSC。
实施例3
本实施例描述了表达免疫疗法有效载荷的MSC在具有人类免疫细胞的小鼠中的人类卵巢癌的异种移植模型中的功效的体内表征。测试工程化MSC在经由CD34+细胞移植物(具有人源化免疫系统的hMSC-hIT)移植人类免疫细胞的免疫缺陷小鼠中的人类卵巢癌模型中的活性。测量具有人类免疫细胞的小鼠中的人类异种移植卵巢肿瘤中工程化MSC的肿瘤归巢以及个别和组合免疫疗法的表达。还测试在工程化MSC处理下的卵巢肿瘤负荷和小鼠生存。本实施例将证明在小鼠中人类异种移植卵巢肿瘤对比其它身体部位中工程化MSC的归巢增加和局部产生免疫疗法因子。本实施例还将证明在表达免疫疗法的工程化MSC下肿瘤负荷显著减少，并且小鼠生存延长，这与免疫系统组成的变化相关。
方法.为了能够将工程化MSC转化至人类临床试验，在人类癌症的人源化小鼠模型中测试hMSC-hIT构建体。通过在移植CD34+造血干细胞(HSC)的免疫缺陷小鼠(NSG)中使用人类卵巢癌细胞系的异种移植物来模拟表达免疫疗法的hMSC在小鼠中的作用。
对于人类卵巢癌细胞，使用OVCAR8和SKOV3细胞系。如实施例3中所述的类似分析用于研究随着时间过去的肿瘤负荷和小鼠生存。
还可以使用两种替代方法。(1)人类T细胞可输注至小鼠中。(2)人类PBMC可输注至小鼠中。
表达载体：pL+MCS
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCAAAATTTTATCTCGACATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCGATAAGCTTGATATCGCCTGCAGCCGAATTCCTTGACTTGGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCCTGCAGGCATGCGTGACTGACTGAGGCCGCGACTCTAGTTTAAACTGCGTGACTGACTCTAGAAGATCCGGCAGTGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG(SEQ ID NO:111)
实施例4. 4T1三阴性乳腺癌
在以下实验中，MSC被工程化用于表达以下效应分子中的一种，接着单独或组合施用于原位乳腺癌小鼠模型：IFNβ、IFNγ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、TRAIL、cGAS、CCL21a、OX40L、CD40L或HACv-PD1。在一些实例中，注射检查点抑制剂(抗CD40、抗PD1或抗CTLA-4抗体)与工程化MSC的施用组合。
MSC归巢
以下实验证明在原位小鼠乳腺癌模型中鼠类MSC归巢至肿瘤。将表达荧光素酶的4T1乳腺肿瘤细胞(5×105)原位植入雌性BALB/cJ小鼠的背部脂肪垫中。在5天之后，将小鼠经腹膜内注射1百万荧光标记(用XenoLight DiR(Caliper Life Sciences))的鼠类BM来源MSC(BM-MSC，治疗细胞)。在MSC注射后第1天和第7天，荧光分析用于使用Ami HT活动物成像器(Spectral Instruments)确定MSC定位。在第7天，使用Ami HT成像器，通过4T1细胞的荧光素酶生物发光报告体确定肿瘤定位和尺寸。如图3中所示，注射的MSC共同定位至肿瘤部位，这表明这些细胞实际上在体内特异性归巢至4T1乳腺肿瘤部位。注射的MSC在一天内归巢至肿瘤，并且持续7天。相比之下，在正常小鼠中缺少肿瘤时注射的MSC不归巢至背。这些结果表明，MSC可用作抗癌分子、蛋白质或化合物的递送媒介物。
为了确定工程化的人MSC是否可归巢至小鼠肿瘤，将表达GFP、IL2或CCL21a的工程化的人MSC的不同细胞系注射至具有4T1肿瘤的BALB/c小鼠中。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。图11A-11B展示人MSC未归巢至小鼠4T1肿瘤。
体内功效
以下实验证明表达免疫疗法效应子(有效载荷)的MSC在原位乳腺癌模型中的体内功效。将4T1-Neo-Fluc小鼠乳腺肿瘤细胞(Imanis Life Sciences，5×105个细胞)原位植入雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的背部脂肪垫中。接着在植入肿瘤之后5天将小鼠随机化至处理组。小鼠接受对照MSC生长培养基或表达不同免疫疗法效应子(有效载荷)的工程化MSC(2×106个细胞)的腹膜内注射，每周一次，历时两周。每种免疫疗法通过不同的MSC表达，并且将MSC(1:1比率)组合以进行组合处理。通过每隔一天用测径规测量来监测肿瘤生长，并且每周记录小鼠重量两次。在第一次MSC处理之后14天处死小鼠，并且收集组织以供进一步分析。
图4展示与用培养基处理的对照相比，在用表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC处理的小鼠中肿瘤生长延迟。
图5A-5C展示与用培养基处理的小鼠相比，表达单个免疫疗法效应子(例如IFN-β、IFN-γ、IL-12或CCL21a)的工程化MSC抑制同基因4T1小鼠肿瘤的生长。意外地，当免疫疗法效应子组合时，尤其IL-12与CCL21a组合以及IFN-β、IFN-γ、IL-12和CCL21a组合，观察到对肿瘤生长的协同效应(图5A-5C)。
图6A-6B展示表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或它们的组合的工程化MSC不抑制肿瘤生长。
图7A-7B展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，添加抗CD40抗体不减少肿瘤生长。
图8A-8B展示在皮下乳腺癌模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长。
图9A-9B展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。然而，一些测试的效应子组合可能引起毒性。
剂量扩大
进行剂量扩大研究。本实验确定表达GFP的工程化MSC细胞不引起毒性(图10A-10B)。
对大肿瘤的作用
本实验测试表达IL12和CCL21a的工程化的小鼠MSC是否可减少较大肿瘤(>800mm3)的肿瘤负荷。较大肿瘤比小肿瘤更难以治疗，并且本实验证明此效应子组合可减少肿瘤扩增(图12A-12B)。
检查点抑制剂
图13A展示表达IL-12和CCL21的工程化MSC足够抑制肿瘤生长，不过在皮下肿瘤模型中通过注射添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效。
实施例5.CT26结肠直肠癌
在以下实验中，MSC被工程化用于表达以下效应分子中的一种，接着单独或组合施用于结肠直肠癌小鼠模型：IFNβ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、CCL21a、HACv-PD1或41BB。在一些实例中，注射检查点抑制剂(抗CD40或抗CTLA-4抗体)与工程化MSC的施用组合。
图14展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著的肿瘤生长延迟。
图15展示CT26小鼠模型中的肿瘤生长动力学以确定给与工程化MSC细胞的最佳时间。
体内功效
以下实验证明表达免疫疗法效应子(有效载荷)的MSC在皮下小鼠结肠(结肠直肠)癌模型中的体内功效。将CT26-Neo-Fluc小鼠结肠癌细胞(Imanis Life Sciences，5×105个)皮下注射至雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的侧腹中。在植入肿瘤之后七天，接着将小鼠随机化至以下处理组：对照MSC生长培养基、工程化MSC(MSC-12+CCL21a)、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体(Bio X cell)、MSC-12+CCL21a与抗CD40抗体组合或MSC-12+CCL21a与抗CTLA4抗体组合。将工程化MSC(2×106个细胞)经腹膜内(ip)注射，每周一次，历时两周(第0天和第7天)。在第0天和第3天经腹膜内注射抗CD40抗体(100μg)。在第0天、第3天和第7天经腹膜内注射抗CTLA4抗体(100μg)。通过每隔一天用测径规测量来监测肿瘤生长，并且每周记录小鼠重量两次。在第一次MSC处理之后11天处死小鼠，并且收集肿瘤并称重。测量每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量，并且在图16B的左下图(左图)中展示结果。随着时间过去监测每个处理组的平均肿瘤体积(图16B，右图)。与经GFP处理的小鼠相比，处理组2(IL-12+CCL21a+抗CTLA4抗体)、4(IL-12+CCL21a)和7(IL-12+CCL21a+抗CD40抗体)抑制CT26结肠肿瘤的平均生长(图16B，右图)。当随着时间过去测量每个处理组中个别的小鼠的肿瘤体积时，观察到类似结果(图16A)。因此，用表达免疫疗法的MSC组合治疗抑制体内结肠癌细胞的生长。
图18A展示表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制小鼠结肠直肠癌模型中的肿瘤生长。图18B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图18C是肿瘤微环境内浸润免疫群体的代表图。图18D展示总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比。用工程化MSC-IL2和CCL21a处理的肿瘤微环境中Treg的数目显著下降。图18E使免疫浸润百分比与肿瘤重量相关。发现淋巴细胞增加(CD3+)的样品与低肿瘤重量相关，而具有高骨髓(CD11b+)浸润的样品与较高肿瘤负荷相关。
长期生存
向小鼠给与两次不同浓度的工程化MSC-IL12和CCL21a疗法与注射的抗CD40抗体组合。在第二次给药之后，每周监测肿瘤体积两次，直至肿瘤负荷超过1500mm3并处死小鼠。图17A展示个别组的肿瘤体积。图17B左图随时间追踪来自个别组的小鼠重量和肿瘤体积。图17B右图展示不同组的生存曲线。
MSC功效
图20A展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤体积。图20B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
肿瘤生长动力学
图21A-21B展示腹膜内间隙中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并且在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长动力学。利用IVIS成像器监测肿瘤负荷，图21A第一行测量小鼠体重和ROI。第二行监测每个组中个别的小鼠的肿瘤的肿瘤重量和ROI。第三行将肿瘤重量与整体ROI或肿瘤ROI相关。图21B展示第18天组中三(3)只小鼠的免疫概况以更好地了解肿瘤微环境。
肿瘤浸润统计数据/免疫百分比/肿瘤重量
皮下小鼠模型
图22A包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制皮下结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。图23A-23B包括肿瘤免疫浸润统计数据。三只小鼠选自PBS、未处理MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(组合)组，以针对免疫概况肿瘤微环境进行流式细胞术。图23A展示与给与未处理MSC的组相比，组合组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体显著增加。图23B展示与用未处理MSC处理的组相比，组合组中粒细胞骨髓来源抑制性细胞(gMDSC)和巨噬细胞群体显著减少。
图24A-24B包括关于免疫百分比和肿瘤重量的数据，展示具有更多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和中央图)与肿瘤重量下降强烈相关。这些图还展示具有较少CD11b骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和MDSC的样品显示较低肿瘤负荷(图24A的中下和右图以及图24B的上排)。
原位小鼠模型
图26A展示表达IL-12和CCL21a或CCL21a和IFN-β的工程化MSC抑制原位小鼠结肠直肠癌模型中的肿瘤生长；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且将所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图26A的每条线表示个别的小鼠。图26B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。MSC-IL12+MSC-CCL21a展示与注射未处理MSC的小鼠相比功效更佳。还在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a处理的组中观察到处理功效。
图27A-27B是展示用所指示的工程化MSC处理的每个组的免疫概况的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理之后观察到巨噬细胞群体一致下降(图27A)。相对于未处理MSC，与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比，还观察到CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总趋势(图27A和图27B)。
图28A-28B展示免疫浸润与肿瘤重量相关。具有低巨噬细胞和树突状细胞的样品具有较低肿瘤负荷(图28B，中上和右上)。图28C展示来自每个组的平均肿瘤重量。与未处理MSC相比，在MSC-IL12+MSC-CCL21a或MSC-IFNb+MSC-CCL21a下均观察到统计显著性。
图29展示将以上来自结肠直肠癌模型的体内数据(图22A和图26A)组合的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据记录三组：仅仅肿瘤(PBS)、用未处理MSC处理和用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理。
图30A-30C还展示来自图22A和图26A的组合数据。所述图展示来自流式细胞术实验数据的免疫浸润平均数。从图30A中，观察到CD8+T的统计显著性，这证实了MSC-IL12+MSC-CCL21a能够使肿瘤微环境恢复极化，并且允许更多细胞毒性T细胞浸润。此外，在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组中CD11b+骨髓群体浸润减少(图30B)。使用树突状细胞和巨噬细胞群体收集的数据具有统计显著性。
腹膜内和皮下小鼠结肠直肠癌模型中的IL12和CCL21a疗法
图25A-25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试三批不同的慢病毒转导的细胞系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号表示一批)。图25A展示在皮下与腹膜内模型中MSC-IL12+MSC-CCL21a所有三个批次均可降低肿瘤负荷(前5个图来自SC模型并且后3个图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25B展示来自每个组的平均肿瘤重量。
实施例6.MSC组合细胞因子疗法方法
以下方法用于实验中，如所指示。
方法：
MSC培养
从Cyagen(分别目录号MUBMX-01001和MUCMX-01001)购得骨髓C57BL/6和Balb/C鼠类MSC(mMSC)。mMSC培养基由以下构成：MEM Corning目录号10-022-CV(500ml)+MSC FBSGibco目录号12662-029(最终浓度10％)+L-Glut(200mM)干细胞07100(最终浓度2mM)+PenStrep 100XVWR目录号97063-708(最终浓度1X)+鼠类FGF Peprotech目录号450-33-100uG(最终浓度-1:10,000稀释)。购得TrypLE Express(ThermoFisher-#12604021)。PBS不含镁、钙或酚红。
mMSC根据以下方案进行传代：
1.mMSC应在70％-90％汇合下传代。
2.从器皿/烧瓶吸出培养基。
3.用PBS冲洗平板(例如10cm器皿用2mL，15cm器皿用3ml)。
4.添加TrypLE Express(例如10cm器皿用2mL，15cm器皿用3ml)。
5.在37℃下孵育3-4分钟。
6.在侧面敲打平板以移去细胞。通过显微术证实大部分细胞已移去。
7.使用培养基将细胞从平板洗去(例如10cm器皿用8mL)。
8.将细胞置于15个圆锥管中并且400×g离心5分钟。
9.吸出培养基。
10.使细胞再悬浮于适当培养基中并将细胞涂铺至新鲜平板/烧瓶中。注意：70％汇合细胞可1:3分离。90％汇合细胞可1:4分离。可替代地，细胞可以3000-5000个细胞/平方厘米涂铺。
购得骨髓来源人MSC(RoosterBank-hBM-1M-XF,RoosterBio)。购得各种hMSC培养基：无异种蛋白的hMSC培养基-(RoosterBio-#KT-016)；+FBS(含血清)hMSC培养基(Lonza-MSCGM培养基-#PT-3001)。购得TrypLE Express(ThermoFisher-#12604021)。PBS不含镁、钙或酚红。
hMSC根据以下例示性方案进行传代：
1.hMSC应在70％-90％汇合下传代。
2.从器皿/烧瓶吸出培养基。
3.用PBS冲洗平板(例如10cm器皿用2mL)。
4.添加TrypLE Express(例如10cm器皿用2mL)。
5.在37℃下孵育3-4分钟或在室温下孵育5分钟。
6.在侧面敲打平板以移去细胞。通过显微术证实大部分细胞已移去。
7.使用Lonza MSCGM培养基将细胞从平板洗去(例如10cm器皿用8mL)。
8.将细胞置于15个锥形管中并且400×g离心5分钟。
9.吸出培养基。
10.使细胞再悬浮于Rooster无异种蛋白的培养基中并将细胞涂铺至新鲜平板/烧瓶中。
注意：70％汇合细胞可1:3分离。90％汇合细胞可1:4分离。可替代地，细胞可以3000-5000个细胞/平方厘米涂铺。
hMSC根据以下例示性方案进行解冻：
1.使hMSC培养基预温至37℃。
2.从液氮去除hMSC等分试样。
3.通过保持管1/2浸入在37℃浴的中60-90秒解冻，直至2/3冷冻样品解冻。
4.用70％酒精擦拭管以将管杀菌。
5.将0.5mL培养基添加至冷冻管，轻轻地移液2-3次，接着将细胞转移至15mL锥形管中的9mL培养基(总共10mL)。
6.400×g离心5分钟。
7.吸出培养基，接着轻轻地使团粒再悬浮于适当体积的Rooster无异种蛋白的培养基中。以3000-5000细胞/平方厘米的浓度涂铺细胞。
慢病毒产生
使用以下产生慢病毒：Lenti-X 293T包装细胞系(Clontech，目录号632180)；LX293T完全生长培养基，没有抗生素；DMEM，高葡萄糖；1mM丙酮酸钠；10％FBS，热失活；Opti-Mem I还原血清培养基(Gibco/Thermo Fisher；目录号31985)；FuGene HD(Promega；目录号E2311)；包膜质粒、包装质粒和转移载体质粒；VSV-G假型包膜载体(pMD2.G)；含有Gag、Pol、Rev和Tat的包装载体，其可与第二代和第三代转移载体(psMAX2)一起使用。在转染前一天下午稍晚时间将293T(FT)细胞从90％汇合10cm器皿提升并以1:3稀释分配，并且在37℃、5％CO2下如常孵育细胞过夜(在转染次日细胞应60％-85％汇合)。
根据以下方案，为每个10cm器皿准备转染反应：
1.在另一1.7mL管中为每个10cm器皿准备转染反应。
2.在室温下添加900uL Opti-Mem I。
3.每一反应添加9ug载体主链(含有所关注的基因)。
4.每一反应添加8ug包装载体。
5.每一反应添加1ug包膜载体(pMD2.G)。
6.通过迅速旋转3秒彻底混合。
7.每一反应添加55uL Fugene HD。
8.通过迅速地上下移液20-30次来混合。
9.在室温下静置10分钟(允许DNA复合物形成)。
10.以逐滴方式将混合物慢慢添加在器皿周围，接着通过轻轻地前后和上下晃动5-10秒(不旋动)来混合。
11.将器皿置放于病毒孵育箱中。
在第2天和第3天，使用血清移液管收获病毒上清液。使用Millipore steriflip0.45um过滤器去除细胞碎片。根据如下方案使用Lenti-X浓缩液(目录号631231和631232)：1)将1体积Lenti-X浓缩液与3体积澄清上清液组合。通过轻轻倒转来混合；2)在冰上或在4℃下孵育混合物30分钟至过夜；(3)在4℃下以1,500×g离心样品45分钟；(4)小心去除上清液并弃去，注意不扰动团粒；(5)使用无菌PBS+0.1％BSA轻轻地使原始体积的1/10至1/100的团粒再悬浮。
载体
将细胞因子表达盒克隆至pL17D中，其载体图展示于图31中，其中注释显著特征；例如SFFV启动子；FLAG和MYC抗原决定基标签；LTR等。
慢病毒转导
当细胞50％汇合时将鼠类MSC接种于6孔平板中并感染。病毒以适当MOI添加并孵育3小时以转导细胞。在感染后，将新鲜培养基添加至细胞中。
遵循以下例示性方案转导人MSC：
1.将200,000个人MSC于2mL无异种蛋白的人MSC培养基中涂铺于6孔平板的每个孔中。
2.在2小时之后，去除培养基并替换为1mL PBS。
3.将适当量的病毒添加至每个孔中，如通过以下MOI指示，并且在偶尔晃动下将细胞与病毒一起在37℃和5％CO2下孵育3小时。
4.在3小时之后去除病毒，用培养基洗涤平板，接着照常培养MSC(如上所述)，直至细胞到达衰老。计数每个传代的细胞，以便可确定总细胞数目。
实施例7：MSC组合细胞因子疗法(CT26)
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达各种细胞因子。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis LifeSciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化成处理组，并且用经腹膜内递送的呈单一剂或呈mMSC组合的表达效应分子的mMSC(1×106)处理以递送剂组合。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。在第12天和第17天评定肿瘤负荷。针对每一个别的小鼠，相对于起始信号(处理前)，标准化生物发光信号(光子/秒)。BLI信号减少超过100倍(0.01)相当于完全治愈(在尸检时无明显肿瘤)。如图32所示，如通过BLI水平所评定，单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC证明在IP肿瘤模型中降低CT26肿瘤负荷的功效。
实施例8：MSC组合细胞因子疗法(B16F10)
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达各种细胞因子。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化成处理组，并且用经腹膜内递送的呈单一剂或呈mMSC组合的表达效应分子的mMSC(1×106)处理以递送剂组合。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。在第12天和第17天评定肿瘤负荷。针对每一个别的小鼠，相对于起始信号(处理前)，标准化生物发光信号(光子/秒)。BLI信号减少超过100倍(0.01)相当于完全治愈(在尸检时无明显肿瘤)。如图33所示，如通过BLI水平所评定，单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC证明在IP肿瘤模型中降低B16F10肿瘤负荷的功效。
实施例9：工程化的人MSC细胞因子产生
在以下实施例中，对骨髓来源hMSC(源自于3名人类志愿健康供体)进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法从单一慢病毒表达载体表达人IL12(p70)和人CCL21a。慢病毒表达载体(其示意载体图展示于图34中)使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
如图35所示，如通过细胞因子ELISA所评定，工程化的hMSC能够产生hIL12(图35A)和hCCL21a(图35B)。值得注意地，蛋白质分泌与MSC转导期间使用的病毒粒子的量(MOI)有关。
实施例10：工程化的人MSC的功能评定
在以下实施例中，对骨髓来源hMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达人IL12(p70)。工程化的hMSC与从健康献血者分离的人类T细胞共培养至0.4μmtranswell插入物(transwell测定法的示意图展示于图36A中)。为了评定活化的未处理T细胞上IL12诱导的Th1极化，通过ELISA，在从下部隔室(T细胞)收集的上清液上测量T细胞的IFNγ产生。如图36B所示，通过CD3 T细胞与表达IL12p70的hMSC共培养，IFNγ产生以MOI剂量依赖方式增加。
实施例11：IP模型中MSC归巢至肿瘤
在以下实施例中，将表达fLUC的balb/c MSC(2×106个细胞)IP注射至CT-26IP肿瘤负载小鼠中。将小鼠处死并在注射后24小时收集组织。如图37所示，如通过生物发光成像(图37A中所示的影像、图37B中影像的定量)、定量实时PCR(图37C)和针对萤火虫荧光素酶的荧光显微术(图37D)所检测，fLUC-MSC显著富集在肿瘤。
另外，在植入肿瘤7天后，经腹膜内向C57Bl/6小鼠植入5×104B16F10-fLUC细胞，经腹膜内注射被工程化用于表达Nanoluc-EGFP的1×106C57Bl/6鼠类BM-MSC。在注射MSC之后24小时将小鼠处死，并且针对nanoluc信号传导，离体对腹膜器官(胃、肾、肝脏、结肠、脾、胰腺、网膜/肿瘤、卵巢和输卵管)成像(NanoGlo底物试剂盒，厂商：Promega，目录号：N1110)。如图37E所示，在B16F10肿瘤模型中，与腹膜腔中的其它器官相比，鼠类MSCnanoluc信号优先富集在肿瘤中。
实施例12：在IP模型中产生IL12的MSC减少CT26肿瘤负荷
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis LifeSciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图38所示，在CT26模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
实施例13：在IP模型中产生IL12的MSC减少B16F10肿瘤负荷
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC 1×106个处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图39所示，在B16F10模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
实施例14：在CT26 IP肿瘤模型中产生IL12和CCL21a的MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis LifeSciences)的CT26肿瘤细胞(1×106个细胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的由相同MSC表达IL12p70和CCL21a的mMSC1×106(“MSC-IL-12p70_2A_CCL21a”)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图40所示，在CT26模型中，如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。图40A展示如通过BLI所评定，PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(三角形)的平均肿瘤负荷。图40B展示如通过BLI所评定，个别的小鼠中PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(分别为左图、中图和右图)的平均肿瘤负荷。值得注意地，如图40C所示，用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长生存(100％生存超过90天)，而对照物处理的小鼠至第20天均死亡或处死。
实施例15：在B16F10 IP肿瘤模型中产生IL12和IL21的MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12(p70)或鼠类IL21(即每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)与表达IL21的mMSC(1×106个细胞)的组合或单独的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图41所示，相对于对照物处理的小鼠，用表达IL12p70的MSC处理延长生存，但所有小鼠至第50天均死亡或处死。相比之下，相对于用表达IL12p70的MSC处理，用表达IL12p70的MSC与表达IL21的MSC的组合处理延长生存(60％生存超出60天)。因此，MSC表达IL21可增强表达IL12p70的MSC的功效。
实施例16：在CT26 IP肿瘤模型中产生IL12和CCL21a的同种异体MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对balb/c mMSC(同基因)和C57BL/6mMSC(同种异体)进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis LifeSciences)的CT26肿瘤细胞(1×106个细胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的由相同MSC表达IL12p70和CCL21a的mMSC(1×106个细胞)(“MSC-IL12+CCL21”)处理。balb/c对照mMSC(同基因)和C57BL/6对照mMSC(同种异体)被工程化用于表达MSC-Flag-Myc(“未处理”)。PBS也用作阴性对照物。如图1所示，在CT26模型中，如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC减少肿瘤负荷，而对照处理则未减少。另外，在同基因和同种异体模型中先前用表达IL12p70和CCL21a的mMSC处理并且确定90天无肿瘤的小鼠随后用皮下植入大腿中的CT26肿瘤细胞(100μl PBS中0.5×106个细胞)激发，如图2A中所图示。如图2B所示，与其中建立肿瘤的未处理对照小鼠对比，无肿瘤小鼠排斥肿瘤植入物。因此，用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长肿瘤负荷减少以及免疫记忆。
实施例17：产生IL12和CCL21a的MSC显示相对于未修饰的细胞增强的生长
在以下实施例中，来自3种不同供体的人MSC以不同感染复数(MOI)进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达和分泌人IL-12和人CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
如图42所示，在所测试的三种供体中，与未基因工程化的人MSC(MOI＝0)相比，基因工程化的MSC(MOI＝95000、9500或950)展现增强的细胞扩增和生长(图42A，供体1；图42B，供体2；图42C，供体3)。经慢病毒进行基因工程化以表达GFP的人MSC未显示类似增强的细胞扩增或生长表型(数据未示)。
实施例18：用于人骨髓MSC(BM-MSC)中持续蛋白质表达的启动子的选择
在以下实施例中，针对驱动人MSC中报告EGFP构建体的表达，测试各种启动子。所测试的启动子为CMV、SFFV、EF1a、EF1a-LTR、EFS、MND、PGK、UbC(参见表4)。使用实施例中所述的慢病毒转导方法，使用同等MOI(感染复数)将细胞转导。使用流式细胞术，定量连续传代的EGFP百分比和中值荧光强度(MFI)。
如图43所示，来自2种不同供体的两种独立人类BM-MSC细胞系(分别为顶行和底行)进行工程化并且在转导后第25天评定工程化细胞的GFP百分比(左图)和MFI(右图)。通过GFP百分比与MFI，SFFV启动子在两种细胞系中显示GFP表达。
如图44所示，针对两种独立人类BM-MSC细胞系个别(左图)或来自两种独立人类BM-MSC细胞系组合的数据(右图)，随时间追踪EGFP MFI(转导后第7天至第28天)。在超过28天期间蛋白质表达随时间稳定。另外，如通过MFI所定量，与EF1a启动子相比，SFFV启动子一致地驱动多几乎十倍的蛋白质表达。
实施例19：对人MSC进行工程化以产生IL12和IL21
在以下实施例中，对人骨髓MSC进行稳定转导以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法从各种构建体表达IL12p70和IL21。在转导后细胞扩增3至4个传代，并且将0.2×106个细胞于4mL培养基中接种于6孔平板中。在24小时之后收集条件培养基并且进行ELISA以确定所产生的IL-12和IL-21浓度。
测试具有启动子-信号序列1-细胞因子1-2A接头-信号序列2-细胞因子2的不同组合和/或排列的各种构建体。测试的组合描述于下表7中。构建体SB00880的细节呈现于下表8中。
表7-IL-12和IL-21表达构建体
Figure BDA0003092762570001961
Figure BDA0003092762570001971
*fT2A是指弗林蛋白酶-T2A
表8-SB00880表达构建体序列
Figure BDA0003092762570001972
Figure BDA0003092762570001981
Figure BDA0003092762570001991
Figure BDA0003092762570002001
Figure BDA0003092762570002011
Figure BDA0003092762570002021
如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-12p70和IL-21的分泌分别示于图45和图46中。SB00880显示工程化MSC表达两种细胞因子的水平高于大部分测试构建体。另外，如通过ELISA所评定和图47中所示，确定IL-12与IL-21的比率。使用SB00880进行工程化的MSC显示IL-12p70相对于IL-21高10倍的比率。值得注意地，10:1的比率显示临床前功效(数据未示)。
进行功能测定，展示工程化MSC的IL-12p70的表达。具有STAT4-SEAP报告体的HEK-293T细胞用于确定由工程化的hMSC产生的IL12p70的效力和活性，所述STAT4-SEAP报告体报告IL12p70与其受体的结合和通过JAK-STAT4通路的信号传导。将工程化MSC培养24小时并收集培养基，并且与HEK-293T STAT4-SEAP报告细胞一起孵育。用分光光度计确定SEAP产生。如图48所示，编码IL-12的所有构建体均显示报告活性，表明功能性IL12p70信号传导。
进行功能测定，展示工程化MSC的IL-21的表达。NK-92人类自然杀伤细胞用于确定由工程化的hMSC产生的IL-21的功能。将工程化的hMSC培养24小时，并且收集条件培养基，并且用于处理源自于IL-2的NK-92细胞。进行细胞内磷酸流动以定量磷酸化STAT1和磷酸化STAT3活化，作为IL-21活性的读数。如图49所示，所有编码IL-21的构建体均显示STAT1(左图)和STAT3(右图)磷酸化，表明功能性IL-21信号传导。
还使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚报告体(
Figure BDA0003092762570002031
U2OS IL21R/IL2RG二聚细胞系,DiscoverX目录号：93-1035C3)进行IL-21的功能测定。将报告细胞与来自工程化的人MSC的条件培养基或适当阳性(重组细胞因子)或阴性对照物一起孵育。如图50所示，所有编码IL-21的构建体均显示二聚。
实施例20：CT26肿瘤模型中的工程化MSC功效
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达图51A中所示的各种鼠类免疫效应子中的每一种。每种MSC被工程化用于仅仅表达单一剂。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 Imanis LifeSciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c雌性小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的工程化的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。
如图51A所示，在CT26同基因肿瘤模型中产生所选效应子的工程化MSC和产生所选效应子的工程化MSC显著减少肿瘤负荷。通过相对于处理前BLI对处理后BLI(第10天)进行标准化，计算每一个别的小鼠的肿瘤负荷变化倍数。肿瘤负荷变化倍数低于1(点线)的所有情况表示肿瘤负荷减少。实现肿瘤负荷显著减少的最佳MSC-效应子为：IL12、IL15、IL12+抗PD1(微体)、IL12+IL21、IL12+CCL21a、IL12+CXCL10、IL12+CXCL11、IL21+CXCL11、IL21+CCL21a、IL15+CXCL10、GM-CSF+IL12、IL12+IL21+CCL21a。
实施例21：B16F10肿瘤模型中的工程化MSC功效
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达图51B中所示的各种鼠类免疫效应子中的每一种。每种MSC被工程化用于仅仅表达单一剂。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达免疫调节细胞因子或趋化因子，例如IL12p70的mMSC 1×106处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。
如图51B所示，在CT26同基因肿瘤模型中产生所选效应子的工程化MSC和产生所选效应子的工程化MSC显著减少肿瘤负荷。所选效应子或组合实现肿瘤负荷显著减少：IL12、IL12+CD40L、IL12+CXCL10、IL12+IL21、IL12+IL21+Flt3L、IL12+IL21+CXCL10、IL12+CCL21a+Flt3L。
实施例22：在IP模型中产生IL12的MSC减少CT26肿瘤负荷
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70或鼠类IL21(即，每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 Imanis Life Sciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。此外，在终止时(肿瘤植入后第17天)测定肿瘤重量。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。实验队列包括：表达鼠类IL12的鼠类MSC、表达鼠类IL21的鼠类MSC以及表达鼠类IL12的鼠类MSC与表达鼠类IL21的鼠类MSC的组合处理(组合中每一种递送1×106个细胞)。
如图52A和图52B所示，在CT26模型中，如通过BLI(图52A左图)和通过肿瘤重量(图52A右图)所评定，相对于对照物，接受表达IL12p70的MSC、表达IL21的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合的组减少肿瘤负荷，包括组合处理中显著减少。图52B展示个别的小鼠的BLI荧光素酶测量(结果概述于图52A左图中)。
重复以上实验，其中修改为递送较低剂量的工程化的mMSC(1×105个细胞)。如图53A所示，在CT26模型中，如通过BLI(图53A；小鼠的个别BLI测量-左图；BLI测量的概述-右图)所评定，相对于对照物，接受表达IL12p70的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合的组减少肿瘤负荷，包括组合处理中显著减少。另外，组合处理显示相对于接受单独的表达IL12p70的MSC的组功效增加。如图53B所示，在所有处理的小鼠中用1×105个表达IL12p70的MSC与1×105个表达IL21的MSC组合处理引起无肿瘤生存直至40天(n＝8；未达到中位生存期)。相比之下，用1×105个单独的表达IL12p70的MSC处理至第40天仅产生25％生存率(n＝8；中位生存期19天)。针对FLAG-MSC用PBS处理的对照组至第40天产生0％生存率(各n＝8；每一个的中位生存期12天)。因此，MSC表达IL21可增强表达IL12p70的MSC的功效。
实施例23：在IP模型中产生IL12的MSC减少B16F10肿瘤负荷
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70或鼠类IL21(即每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis LifeSciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。此外，在终止时(肿瘤植入后第17天)测定肿瘤重量。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。实验队列包括：表达鼠类IL12的鼠类MSC、表达鼠类IL21的鼠类MSC以及表达鼠类IL12的鼠类MSC与表达鼠类IL21的鼠类MSC的组合处理(组合中每一种递送1×106个细胞)。
如图54和图55所示，在B16F10模型中，如通过BLI(图54左图)和通过肿瘤重量(图54右图)所评定，相对于对照物，接受表达IL12p70的MSC和表达IL12p70和IL21的MSC的组合的组减少肿瘤负荷，包括组合处理中显著减少。值得注意地，单独的表达IL21的MSC未显示肿瘤负荷或肿瘤重量显著减少。图55显示对于对照的表达FLAG的MSC和表达IL12的MSC与表达IL21的MSC的组合，个别的小鼠的BLI荧光素酶测量结果(结果概述于图54左图中)。
实施例24：在B16F10 IP肿瘤中产生IL12和IL21的MSC延长无肿瘤生存期并且在肿瘤再激发后生存
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12(p70)或鼠类IL21(即每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis LifeSciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。实验队列包括：表达鼠类IL12的鼠类MSC、表达鼠类IL21的鼠类MSC以及表达鼠类IL12的鼠类MSC与表达鼠类IL21的鼠类MSC的组合处理(组合中每一种递送1×106个细胞)。
如图56所示，相对于对照物处理的小鼠(PBS处理和表达FLAG的MSC的处理后中位生存期为8天)，用表达IL12p70的MSC处理延长生存(处理后中位生存期27天)。相对于用表达IL12p70的MSC处理，用表达IL12p70的MSC与表达IL21的MSC的组合处理延长生存(54.5％生存；未达到中位生存期)。因此，MSC表达IL21可增强表达IL12p70的MSC的功效。
另外，超过90天无肿瘤的小鼠随后用植入侧腹中的B16-F10肿瘤细胞(1×106个细胞)再次激发。未处理的小鼠在与对照物相同的时间植入。通过测径规测量皮下肿瘤负荷。如图57C所示，先前接受表达IL12的MSC和表达IL21的MSC组合处理的所有小鼠(n＝4)排斥重新植入的肿瘤，生存，这表明处理实现抗肿瘤免疫记忆。先前接受单独的表达IL12的MSC处理的小鼠具有50％肿瘤排斥率(4只小鼠中的2只；图57B)。相比之下，60％未处理小鼠中建立肿瘤(5只小鼠中的3只；图57A)。
实施例25：在B16F10 IP肿瘤模型中产生IL12的MSC与免疫检查点疗法组合延长生存
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12(p70)。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。将小鼠随机化至处理组并且通过IP施用200mg/kg的剂量的单独抗PD1抗体(纯系RMP1-14)或与低剂量(1e5)的表达IL12的鼠类MSC组合的抗PD1抗体来处理。
如图56所示，用单独抗PD1处理产生12.5％生存率和23天的中位生存期(图56“抗PD1”；8只小鼠中的1只具有长期无肿瘤生存期)。相比之下，抗PD1与表达IL12p70的MSC组合处理产生50％生存率(图56“MSC-IL12(p70)+抗PD1”；8只小鼠中的4只具有长期无肿瘤生存期；尚未确定中位生存期)。因此，MSC表达IL12增强抗PD1免疫检查点疗法的功效并且将检查点难治性或抗性模型(B16F10)转变成反应性的。
实施例26：在CT26 IP肿瘤模型中产生IL12和IL21的MSC减少肿瘤负荷
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 Imanis Life Sciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中1×105个细胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组并且用在1×104至1×106个细胞范围内的不同量的mMSC IP处理。MSC-Flag-Myc(1×106个细胞)和PBS用作阴性对照物。
如图58A-C所示，如通过BLI所评定，观察到表达IL12和IL21的MSC以剂量依赖性方式抗肿瘤的活性(图58A第17天相对于第7天标准化；图58B和图58C个别的小鼠随时间的BLI)。在对照FLAG或PBS小鼠中未观察到功效(图58A和图58B)。相比之下，在1×104的剂量下观察到最小功效，其中在每个递增剂量下功效递增(图58A和图58C)。如图58D所示，观察到以剂量依赖性方式的至肿瘤植入后60天的长期无肿瘤生存期，其中用1×106至1×105处理的小鼠显著延长的无肿瘤生存期(植入后中位生存期：PBS/FLAG-19天；1×106至1×105-未达到；3×104-53天；1×104-18-19天)。
实施例27：在B16F10 IP肿瘤模型中产生IL12和IL21的MSC减少肿瘤负荷
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组并且用在1×105至1×107个细胞范围内的不同量的mMSC处理。MSC-Flag-Myc(3×106个细胞)和PBS用作阴性对照物。一些组用多剂量处理，相隔5天(在植入肿瘤后第7天、第12天和第17天处理)。
如图59A-D所示，如通过BLI所评定，观察到表达IL12和IL21的MSC以剂量依赖性方式抗肿瘤的活性(图59A第17天相对于第7天标准化；图59B-D个别的小鼠随时间的BLI)。在对照FLAG或PBS小鼠中未观察到功效(图59A和图59B)。在1×105或3×105个细胞的剂量下未观察到功效(图59A和图59C)。相比之下，在1×106的剂量下观察到最小功效，其中在每个递增剂量下功效递增(图59A和图59C)。在多次施用较高剂量后还观察到功效(图59D)。如图59E所示，观察到以剂量依赖性方式的长期无肿瘤生存期，并且在多次施用较高剂量后还观察到(植入后中位生存期：PBS-20天；FLAG(×3)-27天；1×107-31.5天；3×106-36天；3×106(×3)-39天；1×106-33天；1×106(×3)-39天；3×105-27天；3×105(×3)-27天[曲线与3×105处理重叠]；1×105-24天)。
实施例28：在MC-38IP肿瘤模型中产生IL12和IL21的MSC减少肿瘤负荷
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。MC-38肿瘤细胞经fLUC-EGFP构建体转导并且基于EGFP荧光分类，接着将5×105个细胞注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入九天后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组并且用在3×104至1×106个细胞范围内的不同量的mMSC处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。
如图60A和图60B所示，如通过BLI所评定，观察到表达IL12和IL21的MSC以剂量依赖性方式抗肿瘤的活性(图60A第18天相对于第9天标准化；图60B个别的小鼠随时间的BLI)。在对照FLAG或PBS小鼠中未观察到功效(图60A和图60B)。在1×105或3×104个细胞的剂量下未观察到功效(图60A和图60B)。相比之下，在3×105的剂量下观察到最小功效，其中在1×106个细胞的递增剂量下功效递增(图60A和图60B)。如图60C所示，观察到以剂量依赖性方式的长期无肿瘤生存期，其中用1×106个细胞处理的所有小鼠生存超过至少第30天(植入后中位生存期：PBS-21天；FLAG-29天；1×106-未达到；3×105-28天；1×105-21天；3×104-21天[PBS、1×105和3×104重叠)。因此，被工程化用于表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21的mMSC在MC-38肿瘤模型中显示功效。
实施例29：IP模型中人MSC归巢至肿瘤
在以下实施例中，IP向NSG小鼠植入OVCAR8-fLUC细胞。在植入肿瘤14-21天后，IP递送被工程化用于表达Nanoluc-EGFP的1×106个人类BM-MSC。在注射MSC之后24小时将小鼠处死，并且针对NanoLuc信号传导，离体对腹膜器官(胃、肾、肝脏、结肠、脾、胰腺、网膜/肿瘤、卵巢和输卵管)成像(NanoGlo底物试剂盒，厂商：Promega，目录号：N1110)。在注射后24小时以及22天收集的肿瘤切片中通过EGFP荧光使人MSC成像。
如图61A和图61B所示，与腹膜腔中的其它器官相比，人MSC NanoLuc信号优先富集在肿瘤中(图61A概述荧光素酶定量；图61B为荧光素酶信号的代表性影像)。另外，MSC的持久性低于22天，并且在最迟时间点未检测到细胞(图61B最右图)。
实施例30：效应细胞因子的生物分布和PK
在以下实施例中，评定由工程化MSC产生的效应细胞因子的生物分布和PK。
在第一实验中，IP向NSG小鼠植入5×106个OVCAR8-fLUC肿瘤细胞。在植入肿瘤21-27天后，基于由BLI测量的肿瘤负荷将小鼠随机化，并且用1×106个被工程化用于从单一慢病毒表达载体表达人IL12(p70)和人IL21的hMSC处理。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。在MSC处理后16-24小时或3天、4天和7天将小鼠处死，并经由IP灌洗，通过将1mL PBS注射至腹膜间隙中并收集来收集腹膜液。在心内穿刺之后从全血分离血清。ELISA(R&D systems)用于确定每个时间点和处理类型的每个隔室(腹膜液对比血清)中的蛋白质量。
如图62A所示，观察到腹膜液(每个相应时间点的左列)和血清(每个相应时间点的右列)中人IL12(左图)和人IL21(右图)短暂产生。观察到腹膜间隙(局部)中，与全身(血清)相比，蛋白质丰度增加至少10倍，显示工程化MSC局部递送细胞因子。
在另一个实验中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70或鼠类IL21(即，每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。将CT26-fLUC肿瘤细胞(100μl中1×105个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。IP递送表达鼠类IL12的鼠类MSC和表达鼠类IL21的鼠类MSC(组合中每一种递送1×106个细胞)。在MSC处理后24小时或72小时将小鼠处死，并且经由IP灌洗，通过将1mL PBS注射至腹膜间隙中并收集来收集腹膜液。在心内穿刺之后从全血分离血清。Luminex(Millipore)用于确定每个时间点和处理类型的每个隔室(腹膜液对比血清)中的蛋白质量。
如图62B所示，观察到腹膜液(每个相应时间点的左列)和血清(每个相应时间点的右列)中鼠类IL12(左图)和鼠类IL21(右图)短暂产生。观察腹膜间隙(局部)中，与全身(血清)相比，蛋白质丰度增加至少10倍，显示工程化MSC局部递送细胞因子。
实施例31：CT26 IP肿瘤模型中MSC处理和重组细胞因子处理的比较
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21。还对Balb/c mMSC进行工程化以表达鼠类IL12(p70)或鼠类IL21。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis Life Sciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中1×105个细胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。对于MSC处理的小鼠，将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的mMSC(1×106个细胞)处理，接受表达鼠类IL12的鼠类MSC、表达鼠类IL21的鼠类MSC或表达鼠类IL12和IL21的鼠类MSC，其中MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。另外，处理组还包括接受剂量为MSC在体外产生的量(通过ELISA测量-重组IL12：5ug/小鼠；重组IL21：0.4ug/小鼠)4倍的团注的相应重组细胞因子的小鼠。通过fLUC BLI，跨越时间点测量肿瘤负荷，并且当由于肿瘤负荷而达到终点标准时将小鼠处死。确定卡普兰梅耶生存曲线(Kaplan Meier survival curve)以计算无肿瘤生存期。
如图63A-C所示，根据延长的无肿瘤生存期，在所有情况下，用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理的小鼠胜过重组细胞因子疗法(图63A-MSC-IL12对比rIL12；图63B-MSC-IL21对比rIL21；图63C-MSC-IL12/IL21对比rIL12+rIL21)。另外，如图63D-E所示，如通过肿瘤负荷BLI评定，在所有情况下，用被工程化用于产生细胞因子的MSC处理的小鼠胜过重组细胞因子疗法(图63D底行-MSC-IL12对比rIL12；图63E顶行-MSC-IL21对比rIL21；图63E底行-MSC-IL12/IL21对比rIL12+rIL21)。
实施例32：B16F10 IP肿瘤模型中MSC处理和重组细胞因子处理的比较
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类IL21。C57BL/6mMSC还被工程化用于表达鼠类IL12(p70)或鼠类IL21。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中1×105个细胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。对于MSC处理的小鼠，将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的被工程化用于表达表达IL12和IL21的鼠类MSC的mMSC(3×106个细胞)处理，其中MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。另外，处理组还包括接受剂量为MSC在体外产生的量(通过ELISA测量-重组IL12：3ug/小鼠；重组IL21：0.03ug/小鼠)4倍的团注的相应重组细胞因子的小鼠。通过处理后第7天的肿瘤重量测量肿瘤负荷，并且当由于肿瘤负荷而达到终点标准时将小鼠处死。确定卡普兰梅耶生存曲线以计算无肿瘤生存期。
如图64A所示，如通过肿瘤重量所评定，用被工程化用于产生IL12和IL21的MSC处理的小鼠胜过重组细胞因子疗法。另外，如图64B所示，如通过延长的无肿瘤生存期所评定，用被工程化用于产生IL12和IL21的MSC处理的小鼠胜过重组细胞因子疗法。
实施例33：在CT26 IP肿瘤模型中在用产生IL12和IL21两者的MSC处理后小鼠的免疫概况
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70或鼠类IL21(即，每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。将被修饰用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 Imanis Life Sciences)的CT26肿瘤细胞(1×105个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组并且用腹膜内递送的表达鼠类IL12的鼠类MSC和表达鼠类IL21的鼠类MSC的组合处理(组合中每一种递送1×106个细胞)或MSC-Flag-Myc和PBS作为阴性对照物进行处理。将小鼠处死并且在处理后72小时收集器官。多色流式细胞术用于表征响应于处理的免疫浸润。
如图65A和图65B所示，在用MSC-IL12+MSC IL21处理后，腹膜液中T细胞子集和活化标志物(CD3、CD4、CD8、CD8/CD38+、CD8/IFNg+、CD8/Gzmb+、NK/Gzmb+和CD8:Treg-FoxP3比率)显著增加。另外，如图65C所示，在用MSC-IL12+MSC-IL21处理后，腹膜肿瘤-引流淋巴结中例如树突状细胞的抗原呈递细胞也显著增加(CD11c/MHC-II hi、CD86+、CD103+、CD11b+)。因此，表达鼠类IL12的鼠类MSC和表达鼠类IL21的鼠类MSC的组合处理显示活化免疫概况。
实施例34：信号肽序列的优化
在以下实施例中，效应分子被修饰成用外源性信号肽序列替换其天然信号肽序列(测试的例示性信号肽序列参见表5)。测试修饰的效应分子的功能改善，例如改善的表达和维持的分泌，例如尤其环境(例如肿瘤微环境)。还在肿瘤模型中测试修饰的效应分子的功能效能(例如改善的清除肿瘤的能力、改善的在不同环境中清除肿瘤的能力或改善的清除不同类型肿瘤的能力)。
实施例35：工程化MSC的富集
在以下实施例中，MSC被工程化用于在包括未修饰的细胞，例如未修饰的MSC的细胞群体内表达效应分子。通过使工程化MSC与生长因子(例如表1中所述的效应分子)接触来富集工程化MSC，使得富集的那些工程化MSC是表达所述生长因子的受体或受体配体的工程化MSC的子群。所关注的工程化MSC的子群以各种方式接触生长因子：
1.以自分泌方式，通过对MSC本身进行基因工程化来表达因子。
2.以旁分泌方式，通过对饲养细胞或支持细胞进行基因工程化来表达所述因子且将那些因子供应至MSC，或通过使用含有来自被工程化用于表达这些因子的饲养细胞或支持细胞(例如293T)的所述因子的条件培养基。
3.以内分泌方式，通过在MSC移植后将这些因子的重组蛋白或核酸型式注射至患者中。
4.经由添加这些因子的可溶性重组蛋白型式至MSC培养条件。
5.经由用这些因子的重组型式涂布用于MSC繁殖的组织培养平板/烧瓶表面。
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关于引用的主题，本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都以引用的方式并入，在一些情况下可涵盖文献整体。
如本文在说明书和权利要求书中所用，除非相反地明显指示，否则应了解不定冠词“一种(a/an)”意指“至少一种”。
还应了解，除非相反地明显指示，否则在本文中要求的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的次序不一定限于叙述的方法的步骤或动作的次序。
在权利要求书以及以上说明书中，应理解例如“包含”、“包括”、“运载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等所有衔接词语都是开放性的，即意指包括(但不限于)。仅衔接词语“由……组成”和“基本上由……组成”分别为封闭或半封闭式衔接词语，如美国专利局专利审查程序手册(the United States Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)章节2111.03中所述。

Claims (29)

1.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，
并且其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
2.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得所述多核苷酸能够转录为包含所述式S1-E1-L-S2-E2的单一多核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列与所述第一效应分子和所述第二效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
4.如权利要求3所述的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签或编码内部核糖体进入位点(IRES)，任选地其中当所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签时，所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
5.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码第二启动子，
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S1-E1的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述第二启动子可操作地连接于所述表达盒，以使得包含式S2-E2的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为人类细胞，任选地其中所述人类细胞从选自由以下组成的组的组织分离：骨髓、脂肪组织、脐带、胎肝、肌肉和肺组织。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为MSC，并且其中MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-的细胞标志物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II类HLA-的细胞标志物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+和CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-和HLA-DR-的细胞标志物表型。
8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含组成型启动子，任选地其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
9.如权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述第二启动子包含诱导型启动子，任选地其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化细胞，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说为天然的天然信号肽。
11.如权利要求1-9中任一项所述的工程化细胞，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽分别包含对于所述第一效应分子或所述第二效应分子来说非天然的非天然信号肽，任选地其中所述非天然信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα、CXCL12和IL21。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化细胞，其中所述第一信号肽和所述第二信号肽是相同的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞，其中各效应分子独立地选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶，任选地其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的，任选地其中所述第一效应分子和/或所述第二效应分子为修饰的效应分子，其在表达时系栓至所述工程化MSC的细胞膜。
14.如权利要求13所述的工程化细胞，其中：
i)所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL12p70融合蛋白、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ；
ii)所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合蛋白、CCL19、CXCL9和XCL1；
iii)所述生长因子选自由以下组成的组：Flt3L和GM-CSF；
iv)所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L；并且
v)所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2，
任选地其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP和它们的组合，
任选地其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体，并且
任选地其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工程化细胞，其中所述第一效应分子包含IL12p70融合蛋白且所述第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15、IL21、Flt3L、抗PD1抗体、CD40L或CXCL10-CXCL11融合蛋白。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化细胞，其中所述表达盒在E2之后还包含额外外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包含下式，从5’至3’定向，所述式包含：
(L-S-E)X
其中
S包含编码信号肽的多核苷酸序列，
E包含编码效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
X＝1至20
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，并且其中对于各X来说，对应的所述信号肽与所述效应分子可操作地相关联，
任选地其中所述额外效应分子中的一个或多个包含IL15、Flt3L、抗PD1抗体、腺苷脱氨酶、CD40L、CXCL10-CXCL11融合蛋白和/或XCL1。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工程化细胞，其中构建体包含：
a)SFFV启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，
任选地其中所述构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化细胞，其中所述外源性多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列，任选地其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子或腺病毒多核苷酸序列。
19.一种细胞群体，其中所述细胞群体包含一种或多种如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞。
20.一种药物组合物，其中所述药物组合物包含如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞或如权利要求19所述的细胞群体。
21.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者递送包含如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞、如权利要求19所述的细胞群体或如权利要求20所述的药物组合物中的任一种的组合物，任选地其中所述工程化细胞对于所述受试者为同种异体的。
22.一种诱导受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞、如权利要求19所述的细胞群体或如权利要求20所述的药物组合物中的任一种，任选地其中所述工程化细胞对于所述受试者为同种异体的。
23.一种外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包含启动子和下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
24.如权利要求23所述的外源性多核苷酸，其中所述外源性多核苷酸包含包括SFFV启动子和下式所述的表达盒的序列，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一信号肽为人IL12信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二信号肽为人IL21信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，任选地其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
25.一种诱导受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送包含被工程化用于产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的细胞的组合物，其中各工程化细胞包含：
a)启动子；和
b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1-E1-L-S2-E2
其中
S1包含编码第一信号肽的多核苷酸序列，
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，
L包含接头多核苷酸序列，
S2包含编码第二信号肽的多核苷酸序列，
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，并且
其中所述启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二信号肽可操作地连接于所述第二效应分子，并且
其中所述工程化细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞(MSC)、干细胞、免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、骨髓细胞、树突状细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、病毒特异性T细胞、γ-δT细胞、调节T细胞和B细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述构建体包含SEQ ID NO:144中所示的多核苷酸序列。
27.一种诱导受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括以有效诱导免疫应答的量向受试者递送能够对细胞进行工程化以产生调节肿瘤介导的免疫抑制机制的多种效应分子的组合物，其中所述组合物包含如权利要求23或24所述的外源性多核苷酸。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统，
任选地其中所述病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子和腺病毒，并且
任选地其中所述核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
29.如权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂和/或抗CD40抗体，任选地其中所述检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体或抗CTLA-4抗体。
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