JP2024509084A - 核酸ベクター及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）及びその組成物を含む。また、本明細書において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）及びその組成物を、例えばパルス電界療法と組み合わせて投与する方法も提供される。また、異種遺伝子を有する核酸ベクターを投与して腫瘍微小環境を調節することによって癌（例えば、固形腫瘍の存在を特徴とする癌）を治療する方法及び組成物も提供される。

Description

概して、本発明は、例えば癌の治療用の、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を含む組成物及び方法を特徴とする。
癌は、刺激に対する正常な生理学的応答（例えば、傷害若しくは損傷に対する応答、自己修復の開始、又は先天的防御及び後天的防御の増大）が異常又は過剰になるときに発生し、更なる疾患又は病理につながる（例えば、腫瘍成長及び／又は転移により組織損傷及び体全体の不全が引き起こされる）。癌の発症機序は広範囲に研究されており、様々な成功率を有する多種多様な治療アプローチを示唆する非常に多くの仮説が導き出されている。それにもかかわらず、癌は依然としてヒトの健康に対する最も致命的な脅威の１つである。世界保健機関によれば、世界的に癌は２番目の主たる死亡原因であり、死亡の約６人に１人を占め、米国癌協会は癌が米国だけで１日当たり１５００人を超える死亡の原因となると推定している。
遺伝子療法は癌の有効な治療として期待されているが、その可能性はまだ十分に実現されていない。したがって、この分野では、頑健かつ持続的な抗腫瘍効果を与えることができる改善された遺伝子療法が求められている。
本発明は、異種遺伝子を有する核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）を投与して腫瘍微小環境を調節することによって、癌（例えば、固形腫瘍の存在を特徴とする癌）を治療する組成物及び方法を提供する。幾つかの実施の形態において、調節遺伝子は、協調して働いて抗腫瘍免疫応答を起こす免疫調節遺伝子の組合せである。このような調節遺伝子としては、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ４、又はＣＣＬ５）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０、又はＣＤ４０Ｌ）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０）の様々な組合せが挙げられる。本明細書に記載される或る特定の実施の形態において、核酸ベクターは、腫瘍細胞が増殖する際の希釈を軽減するようにＲＮＡレプリカーゼが１つ以上の調節遺伝子に作動可能に連結されている自己複製ＲＮＡ分子をコードする。核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター、例えば自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクター）の投与が腫瘍微小環境内への電界（例えば、パルス電界）の伝達を伴うことで、標的細胞へのエレクトロトランスファーを増強することができる。
一態様において、本発明は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０をコードする遺伝子若しくはＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子、又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）を提供する。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０をコードする遺伝子若しくはＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子、又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）の発現をそれぞれ駆動する第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターを含む。幾つかの実施の形態において、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターの１つ以上はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。幾つかの実施の形態において、第１のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、かつ第３のプロモーターはＣＭＶプロモーターである。幾つかの実施の形態において、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターの１つ以上はＣＡＧプロモーターである。幾つかの実施の形態において、第１のプロモーターはＣＡＧプロモーターであり、第２のプロモーターはＣＡＧプロモーターであり、かつ第３のプロモーターはＣＡＧプロモーターである。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０をコードする遺伝子若しくはＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子、又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）の発現を駆動する単一のプロモーターを含む。特定の実施の形態において、核酸ベクターは非ウイルス性核酸ベクターである。幾つかの実施の形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。他の実施の形態において、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。
上記の実施の形態のいずれかのうちの幾つかにおいて、核酸ベクターは、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠く（例えば、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子の両方を欠く）環状ＤＮＡベクターである。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）は、２．５ｋｂ～２０ｋｂの長さである。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば環状ＤＮＡベクター）は、３．５ｋｂ～１０ｋｂの長さである。
幾つかの実施の形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、５’→３’方向で、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子と、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子と、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子とを含む。幾つかの実施の形態において、環状ＤＮＡベクターは、組換え部位を欠く合成環状ＤＮＡベクター（例えば、組換え部位及び細菌性骨格を欠く合成環状ＤＮＡベクター）である。
別の態様において、本発明は、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠く（例えば、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子の両方を欠く）環状ＤＮＡベクターを特徴とする。環状ＤＮＡベクターは、５’→３’方向に配置された（例えば、作動可能に連結された）以下のエレメント：（ａ）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター又はＣＡＧプロモーター）と、（ｂ）（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列及び（ｉｉ）１つ以上の異種タンパク質をコードする配列（例えば、遺伝子）を含む自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列と、（ｃ）ポリアデニル化配列とを有する。幾つかの実施の形態において、１つ以上の異種タンパク質をコードする配列（例えば、遺伝子）としては、１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。幾つかの実施の形態において、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、又はそれより多く）の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０をコードする遺伝子若しくはＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子、又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）から選択される。幾つかの実施の形態において、１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子には、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０をコードする遺伝子若しくはＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子、又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）の３つ全てが含まれる。上記の態様のいずれかの幾つかの実施の形態において、レプリカーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、ＶＥＥレプリカーゼ又はその変異体（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び／又は配列番号８の１つ以上（１つ、２つ、３つ、又は４つ全て）のアミノ酸配列を有するレプリカーゼ、又は配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び／又は配列番号８に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するその変異体））である。
別の態様において、本発明は、上記の態様の核酸ベクター又は環状ＤＮＡベクターのいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物（例えば、液体組成物又は乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物として）を特徴とする。
別の態様において、治療を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者）における癌を治療する方法が本明細書において提供される。幾つかの実施の形態において、この方法は、上記の態様のいずれか１つの核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、癌を治療するのに有効な量で個体に投与することを含む。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を腫瘍内投与する。他の実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を全身投与する。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の細胞（例えば、腫瘍細胞）内への導入を促進し、それにより異種調節遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、癌を治療することを含む。追加的に又は代替的に、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達することによって（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達することによって）、本発明の任意の実施の形態の核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物が投与された又はこれらが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における癌を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、調節を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者、例えば固形腫瘍を有するヒト癌患者）における腫瘍微小環境を調節する方法を特徴とする。幾つかの実施の形態において、この方法は、上記の態様のいずれか１つの核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、腫瘍微小環境を調節するのに有効な量で個体に投与することを含む。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を腫瘍内投与する。他の実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を全身投与する。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の細胞（例えば、腫瘍細胞）内への導入を促進し、それにより異種調節遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することによって、腫瘍微小環境を調節することを含む。追加的に又は代替的に、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達し（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達し）、それにより異種調節遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することによって、本発明の任意の実施の形態の核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物が投与された又はこれらが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における腫瘍微小環境を調節する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、誘導を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者、例えば固形腫瘍を有するヒト癌患者）における腫瘍微小環境内の調節タンパク質の発現を誘導することを特徴とする。幾つかの実施の形態において、この方法は、上記の態様のいずれか１つの核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、それによりコードされる調節タンパク質の発現を誘導するのに有効な量で個体に投与することを含む。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を腫瘍内投与する。他の実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を全身投与する。幾つかの実施の形態において、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の細胞（例えば、腫瘍細胞）内への導入を促進し、それにより異種調節遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、その発現を誘導することによって、腫瘍微小環境を調節することを含む。追加的に又は代替的に、核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達し（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達し）、それにより異種調節遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、腫瘍微小環境内のベクターによりコードされる調節タンパク質の発現を誘導することによって、本発明の任意の実施の形態の核酸ベクター（例えば、非ウイルス性核酸ベクター）、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物が投与された又はこれらが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における腫瘍微小環境内の調節タンパク質の発現を誘導する方法を提供する。
別の態様において、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を含む非ウイルス性核酸ベクターを、癌を治療するのに有効な量で投与することによって、治療を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者）における癌を治療する方法が本明細書において提供される。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを腫瘍内投与する。他の実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを全身投与する。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が非ウイルス性核酸ベクターの導入を促進し、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、癌を治療することを含む。追加的に又は代替的に、非ウイルス性核酸ベクターを、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達することによって（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達することによって）、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を有する非ウイルス性核酸ベクターが投与された又はこれが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における癌を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を有する非ウイルス性核酸ベクターを、腫瘍微小環境を調節するのに有効な量で個体に投与することによって、調節を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者、例えば固形腫瘍を有するヒト癌患者）における腫瘍微小環境を調節する方法を特徴とする。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを腫瘍内投与する。他の実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを全身投与する。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が非ウイルス性核酸ベクターの細胞（例えば、腫瘍細胞）内への導入を促進し、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することによって、腫瘍微小環境を調節することを含む。追加的に又は代替的に、非ウイルス性核酸ベクターを、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達し（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達し）、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することによって、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を有する非ウイルス性核酸ベクターが投与された又はこれが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における腫瘍微小環境を調節する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を有する非ウイルス性核酸ベクターを、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子の発現を誘導するのに有効な量で個体に投与することによって、誘導を必要とする個体（例えば、ヒト癌患者、例えば固形腫瘍を有するヒト癌患者）における腫瘍微小環境内の調節タンパク質の発現を誘導することを特徴とする。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを腫瘍内投与する。他の実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを全身投与する。幾つかの実施の形態において、非ウイルス性核酸ベクターを、腫瘍微小環境への電界の伝達（例えば、パルス電界療法、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して施されるパルス電界療法）と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、上記方法は、電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が非ウイルス性核酸ベクターの細胞（例えば、腫瘍細胞）内への導入を促進し、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、その発現を誘導することによって、腫瘍微小環境を調節することを含む。追加的に又は代替的に、非ウイルス性核酸ベクターを、追加の抗癌療法（例えば、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ））と組み合わせて投与することができる。
別の態様において、本発明は、電界を腫瘍微小環境に伝達し（例えば、パルス電界を、例えば腫瘍内に配置された電極を使用して腫瘍微小環境に伝達し）、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達して、腫瘍微小環境内の樹状細胞の化学誘引物質の発現を誘導することによって、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を有する非ウイルス性核酸ベクターが投与された又はこれが投与される予定の個体（例えば、ヒト癌患者）における腫瘍微小環境内の樹状細胞の化学誘引物質の発現を誘導する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、発現を必要とする個体における腫瘍微小環境内のタンパク質を発現させる方法を提供する。幾つかの実施の形態において、この方法は、（ａ）タンパク質をコードする合成環状ＤＮＡベクターを投与することと、（ｂ）電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が合成環状ＤＮＡベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それによりタンパク質をコードする配列を腫瘍細胞に送達して、個体における腫瘍微小環境内で発現させることとを含む。幾つかの実施の形態において、工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む。幾つかの実施の形態において、パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する。幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターを腫瘍内投与する。幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターを全身投与する。
幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターを追加の抗癌療法と組み合わせて投与する。幾つかの実施の形態において、タンパク質は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される。
幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターは、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子をコードする。幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターは、複製起点、薬剤耐性遺伝子、又は組換え部位をいずれも含まない。幾つかの実施の形態において、合成環状ＤＮＡベクターは、細菌性骨格を含まない。
単一の転写単位を有する本発明の例示的なＤＮＡベクターを示す概略図である。ＤＮＡベクターは、５’ＣＡＧプロモーター（ＰＣＡＧ）と、ｓＦｌｔ３Ｌをコードする遺伝子と、第１のフーリン－Ｐ２Ａ配列と、ＩＬ－１２をコードする遺伝子と、第２のフーリン－Ｐ２Ａ配列と、ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、３’ポリＡテールとを含む。環状化ＤＮＡベクターは、約３．５ｋｂ～５ｋｂのサイズを有する。 ４５３７ｂｐのサイズを有する、図１Ａの合成環状ＤＮＡベクターを表すバンドを示すゲルの画像を示す図である。アスタリスクはスーパーコイル状の単量体形の位置を示しており、これはここに示される試料の７８％である。レーン１は２００ｎｇでロードされた試料を示し、一方、レーン２は８００ｎｇでロードされた同じ試料を示す。ラダーはスーパーコイル状ラダー（supercoiled ladder）（New England Biosciences）である。 本発明の例示的な多重転写単位ＤＮＡベクターを示す概略図である。このＤＮＡベクターは、第１のＰＣＡＧ、ｓＦｌｔ３Ｌをコードする遺伝子、及び第１の３’ポリＡテールを有する第１の転写単位と、第２のＰＣＡＧ、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、及び第２の３’ポリＡテールを有する第２の転写単位と、第３のＰＣＡＧ、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、及び第３の３’ポリＡテールを有する第３の転写単位とを含む。環状化ＤＮＡベクターは、約５ｋｂ～１０ｋｂのサイズを有する。 ８０３５ｂｐのサイズを有する、図２Ａの合成環状ＤＮＡベクター（配列番号３７）を表すバンドを示すゲルの画像を示す図である。アスタリスクはスーパーコイル状の単量体形の位置を示しており、これはここに示される試料の８５％である。レーン１は２００ｎｇでロードされた試料を示し、一方、レーン２は８００ｎｇでロードされた同じ試料を示す。ラダーはスーパーコイル状ラダー（New England Biosciences）である。 培地に対して正規化し、ＥＬＩＳＡによって測定された、図２Ａに示される８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－Ｔｘ）からの免疫調節タンパク質のタンパク質発現を示すグラフを示す図である。図３ＡはｓＦｌｔ３Ｌの発現を示し、図３ＢはＩＬ－１２ｐ７０の発現を示し、図３ＣはＸＣＬ１の発現を示す。 ＳＥＡＰ－ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅアッセイによるｃ３－Ｔｘによる機能的ＩＬ－１２ｐ７０の発現を示すグラフを示す図である。 様々な条件下での骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の通常型ＤＣ（ｃＤＣ）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）への分化を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。図５Ａはｃ３－Ｔｘでトランスフェクトされた細胞によって発現された２０ｎｇ／ｍＬのｓＦＬＴ３Ｌにおける分化（馴化培地中）を示し、図５Ｂは２０ｎｇ／ｍＬの組換えｓＦＬＴ３Ｌにおける分化を示し、図５Ｃは組換え可溶性ＧＭＣＳＦ（ｒｓＧＭＣＳＦ）における分化を示す。 様々な条件下でのＢＭＤＣのｃＤＣ及びｐＤＣへの分化を示す棒グラフを示す図である。図６Ａはｃ３－Ｔｘでトランスフェクトされた細胞によって発現された２０ｎｇ／ｍＬのｓＦＬＴ３Ｌにおける分化（馴化培地中）を示し、図６Ｂは２０ｎｇ／ｍＬの組換えｓＦＬＴ３Ｌにおける分化を示し、図６Ｃは組換え可溶性ＧＭＣＳＦ（ｒｓＧＭＣＳＦ）における分化を示す。 様々な治療条件下での腫瘍担持マウスにおける経時的なｆＬｕｃ発光を示す生存中画像を示す図である。図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ治療後３日目及び治療後１７日目のＰＢＳコントロールマウスを示す。図７Ｃ及び図７Ｄは、それぞれ治療後３日目及び治療後１７日目のｆＬｕｃをコードするプラスミドＤＮＡベクター（ｐ－ｆＬｕｃ）で治療されたマウスを示す。図７Ｅ及び図７Ｆは、それぞれ治療後３日目及び治療後１７日目のｆＬｕｃをコードする合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－ｆＬｕｃ）で治療されたマウスを示す。 ７日目、１０日目、及び１４日目の追加の時点を含む、図７Ａ～図７Ｆの実験についてのＰＢＳコントロールと比べたｆＬｕｃ放射輝度を示すグラフを示す図である。 ＰＢＳコントロールマウスと比較した、エレクトロトランスファーによりｃ３－Ｔｘで治療されたマウスにおける経時的な腫瘍成長を示すグラフを示す図である。 単回用量のｃ３－Ｔｘ又はＰＢＳを投与し、電気的エネルギーを施した腫瘍における免疫細胞浸潤を示すグラフを示す図である。各データ点はｃ３－Ｔｘ治療マウス又はＰＢＳコントロールマウスにおけるＣＤ４５を発現する腫瘍内の細胞のパーセンテージを表す。 ＰＢＳ又はｃ３－ｆＬｕｃを注射したマウスと比較した、２用量のｃ３－Ｔｘで治療されたマウスの経時的な生存率を示すグラフを示す図である。 ＰＢＳ又はｃ３－ｆＬｕｃを注射したマウスと比較した、２用量のｃ３－Ｔｘで治療されたマウスの経時的な平均腫瘍体積を示すグラフを示す図である。 合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－ＧＦＰ）を注射した後にエレクトロトランスファーを行った腫瘍及びＰＢＳを注射した後にエレクトロトランスファーを行った腫瘍と比較した、ｍＲＮＡ ＧＦＰを注射した後にエレクトロトランスファーを行った腫瘍におけるＧＦＰ発現を示すグラフを示す図である。 １０４２９ｂｐの長さを有する、ｓＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードするトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子を示す概略図である。 １３９７８の長さを有する、ｓＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードするトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドを示す概略図である。 培地に対して正規化し、ＥＬＩＳＡによって測定された、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドからの免疫調節タンパク質のタンパク質発現を示すグラフを示す図である。図１５ＡはｓＦｌｔ３Ｌの発現を示し、図１５ＢはＩＬ－１２ｐ７０の発現を示し、図１５ＣはＸＣＬ１の発現を示す。 ＳＥＡＰ－ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅアッセイによる、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドによる機能的ＩＬ－１２ｐ７０の発現を示すグラフを示す図である。 ｒＦＬＴ３Ｌ及びｒＧＭＣＳＦでの治療と比較した、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドからの馴化培地での処理を含む、様々な条件下でのＢＭＤＣのｃＤＣ及びｐＤＣへの分化を示す棒グラフを示す図である。 本発明の自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクターを合成する例示的な方法を示す概略図である。各エレメントの相対編成が示されている。図１８Ａは、出発材料として有用な個々のＤＮＡ断片を示す概略図である。ＣＡＧプロモーター（ＰＣＡＧ）と、非構造タンパク質（レプリカーゼ）をコードする配列と、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）とを有する５’配列は３つの部分に分けられている。可溶性Ｆｌｔ３リガンド（ｓＦｌｔ３Ｌ）をコードする遺伝子、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、及びＸＣＬ１をコードする遺伝子は、フーリン－Ｐ２Ａ配列を介して動作可能に接続されている。３’ポリアデニル化シグナル配列（ポリＡ）が示されている。図１８Ｂは、図１８Ａに示されるＤＮＡ断片のゴールデンゲートアセンブリ（golden gate assembly）により生産される環状ＤＮＡプラスミドを示す概略図である。環状プラスミドは、約１３ｋｂのサイズを有する。各エレメントの相対編成が示されている。ＤＮＡベクターは、５’ＵＴＲに対するＰＣＡＧと、非構造タンパク質（レプリカーゼ）をコードする配列と、ＳＧＰと、ｓＦｌｔ３Ｌをコードする遺伝子と、第１のフーリン－Ｐ２Ａ配列と、ＩＬ－１２をコードする遺伝子と、第２のフーリンＰ２Ａ配列と、ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、リボザイムと、ポリＡテールとを含む。 本発明の自己複製ＲＮＡ分子を合成する例示的な方法を示す概略図である。各エレメントの相対編成が示されている。図１９Ａは、出発材料として有用な個々のＤＮＡ断片を示す概略図である。Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）と、非構造タンパク質（レプリカーゼ）をコードする配列と、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）とを有する５’配列は３つの部分に分けられている。ＸＣＬ１をコードする遺伝子、可溶性Ｆｌｔ３リガンド（ｓＦｌｔ３Ｌ）をコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子は、フーリン－Ｐ２Ａ配列を介して動作可能に接続されている。３’ポリアデニル化配列（ＡＡＡＡ）が示されている。図１９Ｂは、図１９Ａに示されるＤＮＡ断片のゴールデンゲートアセンブリにより生産される環状ＤＮＡプラスミドを示す概略図である。環状プラスミドは、約１３．５ｋｂのサイズを有する。図１９Ｃは、Ｉ－ＳｃｅＩによる消化により生成される線状化ＤＮＡ分子を示す概略図である。線状化ＤＮＡ分子は、約１０．５ｋｂのサイズを有する。図１９Ｄは、図１９Ｃの線状化ＤＮＡ分子のｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写により生成される自己複製ＲＮＡ分子を示す概略図である。図１９Ｅは、３’末端に伸長したポリアデニル化配列を有する５’キャップ化自己複製ＲＮＡ分子を示す概略図である。
本発明は、調節遺伝子を有する核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与して腫瘍微小環境を調節することによって、癌を治療する組成物及び方法に関する。本発明は、少なくとも部分的に、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）が多数の免疫調節遺伝子の送達を通じて抗腫瘍免疫応答を起こすのに有効であり得るという発見に基づいている。本発明の組成物及び方法は、樹状細胞の動員及び／又は活性化を通じて腫瘍微小環境を効果的に調節することができ、樹状細胞は腫瘍抗原をリンパ球（例えば、Ｔ細胞）に提示することによって抗腫瘍免疫を導くことができる。幾つかの例において、（例えば、腫瘍内に配置された電極を介してパルス電界を伝達することによって）電界を腫瘍微小環境に伝達する際に、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を、癌を患う個体に投与する。本発明の特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、自己複製ＲＮＡ分子を腫瘍微小環境に供給することによって、急速な腫瘍細胞増殖の結果としての調節遺伝子発現の希釈を軽減することができる。
Ｉ．定義
特段の規定がない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって、また本出願において使用される用語の多くに対する一般的な手引きを当業者に与える出版文書を参照することによって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に示される定義と参考出版物の定義との間に何らかの相反がある場合は、本明細書に示される定義が優先されるものとする。
本明細書において使用される場合、「環状ＤＮＡベクター」という用語は、環状の形態のＤＮＡ分子を指す。このような環状形態は、典型的には、ローリングサークル型増幅によってコンカテマーに増幅することができる。末端に鎖の連接を有する線状二本鎖核酸（例えば、ヘアピンループ又は他の構造によって共有結合された骨格）は、本明細書において使用されるような環状ベクターではない。「環状ＤＮＡベクター」という用語は、本明細書において「共有結合により閉じた環状ＤＮＡベクター」という用語と区別なく使用される。当業者であれば、そのような環状ベクターには、本明細書において記載されるように、共有結合により閉じられてスーパーコイル状及び複雑なＤＮＡトポロジーを有するベクターが含まれることを理解するであろう。特定の実施形態において、環状ＤＮＡベクターはスーパーコイル状である。或る特定の例において、環状ＤＮＡベクターは細菌の複製起点を欠いている（例えば、環状ＤＮＡベクターが自己複製ＲＮＡ分子をコードする場合には、環状ＤＮＡベクターは細菌の複製起点を欠き、ＲＮＡ複製起点をコードする）。
本明細書において使用される場合、環状ＤＮＡベクターを生産する「無細胞法」とは、細菌（例えば、Ｅ．コリ（E. coli））宿主細胞等の宿主細胞内に何らかのＤＮＡが含まれることに依存せずに、テンプレートＤＮＡベクター（例えば、プラスミドＤＮＡベクター）の準備から治療用環状ＤＮＡベクターの生産に至る方法のあらゆる工程を容易にする方法を指す。例えば、無細胞法は１つ以上の合成容器（例えば、ガラス管若しくはプラスチック管、バイオリアクター、槽、タンク、又は他の適切な容器）内にて適切な溶液（例えば、緩衝溶液）内で行われ、そこに酵素及び他の作用物質を添加して、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ改変、及びＤＮＡ単離を容易にすることができる。
本明細書において使用される場合、「組換え部位」及び「部位特異的組換え認識部位」という用語は、それぞれ、部位特異的組換えの産物である核酸配列を指し、第１のリコンビナーゼ付着部位の一部に対応する第１の配列と、第２のリコンビナーゼ付着部位の一部に対応する第２の配列とを含む。ハイブリッド組換え部位の一例はａｔｔＲであり、これは部位特異的組換えの産物であり、ａｔｔＰの一部に対応する第１の配列と、ａｔｔＢの一部に対応する第２の配列とを含む。代替的には、組換え部位を、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えから生成することができる。したがって、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えから生成されたベクター（例えば、ＬｏｘＰ部位を含むベクター）は、本明細書において使用される組換え部位を含む。組換え部位を生成する他の部位特異的組換え事象は、例えば、ラムダインテグラーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、及びＫｗリコンビナーゼを含む。非部位特異的組換え事象（例えば、ＩＴＲ媒介分子間組換え）から生じる核酸配列は、本明細書で定義されるような組換え部位ではない。
本明細書において使用される場合、「自己複製ＲＮＡ分子」という用語は、１つの複製起点から複製するＲＮＡを含む自己複製遺伝要素を指す。「自己複製ＲＮＡ」、「レプリコンＲＮＡ」、及び「自己増幅レプリコンＲＮＡ」という用語は、本明細書において区別なく使用される。
本明細書において使用される場合、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合を介して（すなわち、一次構造として）互いに結合した複数のアミノ酸を指し、非共有結合的に会合している多量体（例えば、二量体、三量体等）タンパク質（例えば、四次構造を有するタンパク質）を含む。したがって、「タンパク質」という用語は、ペプチド、ネイティブタンパク質、組換えタンパク質、及びそれらの断片を包含する。幾つかの実施形態において、タンパク質は一次構造を有し、生理学的条件下では二次構造、三次構造、又は四次構造を有さない。幾つかの実施形態において、タンパク質は、一次構造及び二次構造を有し、生理学的条件下では三次構造又は四次構造を有さない。特定の実施形態において、タンパク質は、一次構造、二次構造、及び三次構造を有するが、生理学的条件下では四次構造を有さない（例えば、１つ以上の折り畳まれたアルファ－ヘリックス及び／又はベータ－シートを有する単量体タンパク質）。幾つかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質のいずれかは、少なくとも２５アミノ酸（例えば、５０アミノ酸～１０００アミノ酸）の長さを有する。
本明細書において使用される場合、「調節配列」という用語は、それによって発現される受容体（例えば、表面受容体）を介して結合及びシグナル伝達することによって細胞に係合し、細胞を調節する１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を指す。調節配列は、モノシストロン性又はポリシストロン性（例えば、バイシストロン性又はトリシストロン性）であり得る。
本明細書において使用される場合、「免疫調節配列」という用語は、例えば、免疫細胞上の受容体（例えば、表面受容体）を介した結合及びシグナル伝達によって、免疫細胞（例えば、自然免疫細胞又は適応免疫細胞）に係合し、免疫細胞を調節する１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を指す。免疫調節配列は、モノシストロン性又はポリシストロン性（例えば、バイシストロン性又はトリシストロン性）であり得る。
本明細書において使用される場合、「ポリシストロン性」という用語は、単一のプロモーターの下流に２つ以上のタンパク質コード遺伝子を含む（すなわち、１つのプロモーターが２つ以上のタンパク質の発現を駆動する）核酸配列（例えば、ＤＮＡベクター又はＲＮＡ配列）を指す。ポリシストロン配列は、バイシストロン配列及びトリシストロン配列を含む。幾つかの例において、ポリシストロン配列は、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の免疫調節タンパク質コード遺伝子を含む。ポリシストロン核酸配列を合成する方法は、当該技術分野において知られている。幾つかの例において、複数のタンパク質コード遺伝子は、終結シグナル及び／又は切断部位（例えば、フーリン－Ｐ２Ａ部位）によって分離される。
核酸ベクター中のプロモーターを識別するために本明細書において使用される「第１」、「第２」、及び「第３」という用語は、ベクター上のプロモーターの位置決めを説明するものではなく、すなわち、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターは、５’→３’方向に配置されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、ＸＣＬ１、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ－１２の発現をそれぞれ駆動する第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターを含む核酸ベクターは、以下の５’→３’方向のそれぞれをカバーする：プロモーター（Ｐ）－ＸＣＬ１－Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ－Ｐ－ＩＬ－１２；Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ－Ｐ－ＩＬ－１２－Ｐ－ＸＣＬ１；Ｐ－ＩＬ－１２－Ｐ－ＸＣＬ１－Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ；Ｐ－ＸＣＬ１－Ｐ－ＩＬ－１２－Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ；Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ－Ｐ－ＸＣＬ１－Ｐ－ＩＬ－１２；及びＰ－ＩＬ－１２－Ｐ－ＦＬＴ３Ｌ－Ｐ－ＸＣＬ１。第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターは、同じプロモーター（例えば、ＣＡＧ）であってもよい。
本明細書において使用される場合、「樹状細胞の化学誘引物質」という用語は、樹状細胞（例えば、従来の樹状細胞（例えば、ｃＤＣ１又はｃＤＣ２）又は形質細胞様ＤＣ（例えば、ｐＤＣ））を、その上に発現される受容体に結合することで（例えば、樹状細胞表面受容体に結合することによって）樹状細胞を引き付ける（例えば、浸潤を促進する）タンパク質を指す。樹状細胞の化学誘引物質は、樹状細胞が高濃度の化学誘引物質に向かって移動する濃度勾配を形成することにより、組織の領域への樹状細胞の浸潤を促進することができる。幾つかの実施形態において、樹状細胞の化学誘引物質は、炎症性樹状細胞の化学誘引物質である。例示的な樹状細胞の化学誘引物質としては、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、及びＣＣＬ４が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「ＸＣＬ１」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＸＣＬ１（リンフォタクチン、Ｌｔｎ、ＡＴＡＣ、ＳＣＹＣ－α、又はＳＣＹＣ－１としても知られる、Ｃケモカインサブファミリーのメンバー）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン（muteins）、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＸＣＲ１シグナル伝達に基づいて（例えば、ＤＣ発現ＸＣＲ１へのＸＣＬ１結合により）決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性（例えば、ＸＣＬ１の構造的（例えば、フォールディング）安定性を付与するムテイン）を示す。ＸＣＬ１は、完全長のプロセシングされていないＸＣＬ１、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＸＣＬ１を包含する。例示的なヒトＸＣＬ１配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ：６３７５として提供される。幾つかの例において、ＸＣＬ１は、配列番号９又は配列番号９Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号９又は配列番号９Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＸＣＬ１は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１０に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「ＸＣＬ２」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＸＣＬ２（ＳＣＭ１－β、又はＳＣＹＣ－２としても知られる、Ｃケモカインサブファミリーのメンバー）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＸＣＲ２シグナル伝達に基づいて（例えば、ＤＣ発現ＸＣＲ２へのＸＣＬ２結合により）決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性（例えば、ＸＣＬ２の構造的（例えば、フォールディング）安定性を付与するムテイン）を示す。ＸＣＬ２は、完全長のプロセシングされていないＸＣＬ２、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＸＣＬ２を包含する。例示的なヒトＸＣＬ２配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ：６８４６として提供される。幾つかの例において、ＸＣＬ２は、配列番号１１又は配列番号１１Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１１又は配列番号１１Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＸＣＬ１は、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１２に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「ＣＣＬ５」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ（Regulated on Activation, Normal T sell Expressed and Secreted）としても知られる）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＣＲ５シグナル伝達及び／又はその既知の下流効果（例えば、樹状細胞、好酸球、好塩基球、単球、エフェクターメモリーＴ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞によるＣＣＲ５関連遊走及び／又は腫瘍浸潤）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＣＣＬ５は、完全長のプロセシングされていないＣＣＬ５、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＣＬ５を包含する。例示的なヒトＣＣＬ５タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１３５０１として提供される。幾つかの例において、ＣＣＬ５は、配列番号１３又は配列番号１３Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１３又は配列番号１３Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＣＣＬ５は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１４に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「ＣＣＬ４」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＣＣＬ４（マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）としても知られる）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＣＲ５受容体シグナル伝達及び／又はその既知の下流効果（例えば、樹状細胞、好酸球、好塩基球、単球、エフェクターメモリーＴ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞によるＣＣＲ５関連遊走及び／又は腫瘍浸潤）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＣＣＬ４は、完全長のプロセシングされていないＣＣＬ４、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＣＬ４を包含する。例示的なヒトＣＣＬ４タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１３２３６として提供される。幾つかの例において、ＣＣＬ４は、配列番号１５又は配列番号１５Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１５又は配列番号１５Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＣＣＬ４は、配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１６に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「樹状細胞の成長因子又は活性化因子」という用語は、樹状細胞（例えば、従来の樹状細胞（例えば、ｃＤＣ１又はｃＤＣ２）又は形質細胞様ＤＣ（例えば、ｐＤＣ））を、その上に発現される受容体に結合することで（例えば、樹状細胞表面受容体に結合することによって）分化、活性化、及び／又は動員を促進するタンパク質を指す。樹状細胞の成長因子又は活性化因子としては、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌが挙げられる。本明細書において使用される場合、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＤ４０をコードする遺伝子又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子である。
本明細書において使用される場合、「Ｆｍｓ関連受容体チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＦＬＴ３Ｌを指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。ＦＬＴ３Ｌは、可溶性ＦＬＴ３Ｌ（ｓＦＬＴ３Ｌ）を包含する。機能的に同等及び改善された変異体は、チロシンキナーゼＩＩＩ受容体シグナル伝達及び／又はその既知の下流効果（例えば、ＦＬＴ３Ｌ関連造血調節）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＦＬＴ３Ｌは、完全長のプロセシングされていないＦＬＴ３Ｌ、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＦＬＴ３Ｌを包含する。例示的なヒトＦＬＴ３Ｌタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９７７１として提供される。幾つかの例において、ｓＦＬＴ３Ｌは、配列番号１７は配列番号１７Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７又は配列番号１７Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＦＬＴ３Ｌは、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＧＭ－ＣＳＦ（ＣＳＦ２としても知られる）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＳＦ２Ｒ受容体シグナル伝達及び／又はその既知の下流効果（例えば、ＪＡＫ－２動員及び活性化、ＳＴＡＴ５リン酸化、ｐｉｍ－１及び／又はＣＩＳ転写、ＰＩ３Ｋシグナル伝達、及び／又はＪＡＫ／ＳＴＡＴ－Ｂｃｌ－２シグナル伝達）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＧＭ－ＣＳＦは、完全長のプロセシングされていないＧＭ－ＣＳＦ、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＧＭ－ＣＳＦを包含する。例示的なヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４１４１として提供される。幾つかの例において、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１９は配列番号１９Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１９又は配列番号１９Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＧＭ－ＣＳＦは、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２０に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「分化抗原群４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＣＤ４０Ｌを指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５シグナル伝達及び／又はその既知の下流効果（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合と組み合わせたＴ細胞共刺激、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１０産生、ＮＦκＢ活性化、Ｔ細胞におけるＭＡＰＫ８活性化、及び／又はＴ細胞におけるＰＡＫ２活性化）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＣＤ４０Ｌは、完全長のプロセシングされていないＣＤ４０Ｌ、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＤ４０Ｌを包含する。例示的なヒトＣＤ４０Ｌタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５として提供される。幾つかの例において、ＣＤ４０Ｌは、配列番号２１は配列番号２１Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２１又は配列番号２１Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＣＤ４０Ｌは、配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２２に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「リンパ球シグナル伝達タンパク質」という用語は、リンパ球上に発現される受容体に結合することで（例えば、リンパ球表面受容体に結合することによって）リンパ球にシグナルを送るタンパク質を指す。幾つかの例において、リンパ球シグナル伝達タンパク質は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞等のリンパ球の活性化及び／又は浸潤（例えば、腫瘍浸潤）を引き起こす。幾つかの例において、リンパ球シグナル伝達タンパク質は、可溶性リンパ球シグナル伝達タンパク質である。リンパ球シグナル伝達タンパク質としては、サイトカイン及びケモカインが挙げられる。
「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして（例えば、パラクリンシグナルとして）免疫細胞（例えば、自然免疫細胞又は適応免疫細胞）に作用する可溶性タンパク質を指す。例示的なサイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－３６－γ；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β；インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－α；並びに白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のタンパク質因子が挙げられる。幾つかの例において、サイトカインはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞等のリンパ球の活性化を引き起こす。
本明細書において使用される場合、「ケモカイン」という用語は、走化性及び活性化（例えば、腫瘍の浸潤及び活性化）を選択的に誘導するように免疫細胞に作用する細胞によって放出される可溶性タンパク質を指す。ケモカインはまた、血管新生、炎症、創傷治癒、及び腫瘍形成を引き起こす可能性がある。幾つかの例において、ケモカインは炎症性である。例示的なケモカインとしては、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０が挙げられる。本発明の一部として有用なケモカインの他の非限定的な例としては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１０が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）」は、本明細書において使用される場合、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＩＬ－１２（例えば、ＩＬ－１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロ二量体；ＩＬ－１２ｐ７０）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、当該技術分野で知られている特定の炎症誘発性及び／又はＴｈ１歪曲効果（Th1-skewing effect）（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞からのＩＦＮ－γの誘導）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＩＬ－１２は、完全長のプロセシングされていないＩＬ－１２、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＩＬ－１２を包含する。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５及びｐ４０の（例えば、リンカーを介する）合成融合体を包含する。幾つかの例において、ＩＬ－１２は、配列番号２３又は配列番号２３Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２３又は配列番号２３Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＩＬ－１２は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）」は、本明細書において使用される場合、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＩＬ－１５を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、突然変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＩＬ－１５Ｒシグナル伝達経路の活性化（例えば、ＪＡＫキナーゼ活性化、ＳＴＡＴ３活性化、ＳＴＡＴ５活性化、及び／又はＳＴＡＴ６活性化；及び／又はＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化）に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＩＬ－１５は、完全長のプロセシングされていないＩＬ－１５、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＩＬ－１５を包含する。ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５及びその受容体の合成融合体を包含する。幾つかの例において、ＩＬ－１５は、配列番号２５又は配列番号２５Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５又は配列番号２５Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＩＬ－１５は、配列番号２６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２６に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＣＸＣＬ９（ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても知られる）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＸＣＲ３受容体相互作用に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＣＸＣＬ９は、完全長のプロセシングされていないＣＸＣＬ９、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＸＣＬ９を包含する。例示的なヒトＣＸＣＬ９タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７３２５として提供される。幾つかの例において、ＣＸＣＬ９は、配列番号２７又は配列番号２７Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７又は配列番号２７Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＣＸＣＬ９は、配列番号２８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２８に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意のネイティブＣＸＣＬ１０（ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても知られる）を指し、それに加えて機能的に同等又は改良された変異体（例えば、天然変異体又は合成変異体）、例えば、変異体、ムテイン、類縁体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、及びそれらの断片も指す。機能的に同等及び改善された変異体は、ＣＸＣＲ３受容体相互作用に基づいて決定され得る。幾つかの実施形態において、機能的に同等又は改善された変異体は、改善された安定性を示す。ＣＸＣＬ１０は、完全長のプロセシングされていないＣＸＣＬ１０、及び細胞内のネイティブプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＸＣＬ１０を包含する。例示的なヒトＣＸＣＬ１０タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７７８として提供される。幾つかの例において、ＣＸＣＬ１０は、配列番号２９又は配列番号２９Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２９又は配列番号２９Ａに対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性）を有する異種遺伝子によってコードされる。幾つかの例において、異種遺伝子によってコードされるＣＸＣＬ１０は、配列番号３０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３０に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性）を有する。
本明細書において使用される場合、「治療用配列」という用語は、標的細胞における１つ以上の治療部分の転写に必要な任意の遺伝物質を含むＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡベクター又はそのコンカテマー（concatemer））の部分を指し、１つ以上のコード配列、プロモーター、ターミネーター、イントロン、及び／又は他の調節エレメントを含み得る。治療部分は、治療用タンパク質（例えば、置換タンパク質（例えば、標的細胞内の欠陥タンパク質を置き換えるタンパク質）又は内因性タンパク質（例えば、サイトカイン等の免疫調節タンパク質））及び／又は治療用核酸（例えば、１つ以上のマイクロＲＮＡ）であり得る。２つ以上の転写単位を有するＤＮＡベクターにおいて、治療用配列は、複数の転写単位を含む。治療用配列は、治療目的のために投与される１つ以上の遺伝子（例えば、異種遺伝子又は導入遺伝子）を含み得る。
「異種遺伝子」という用語は、（例えば、ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子の一部として）投与される導入遺伝子を指す。異種遺伝子は、異種遺伝子を受容する個体によって内因的に発現される哺乳動物遺伝子（例えば、異種調節（例えば、免疫調節）タンパク質をコードする遺伝子）であり得る。本明細書において使用される場合、異種遺伝子、レプリカーゼ、又はその断片の「変異体」は、天然に存在するアミノ酸配列又は或るアミノ酸配列等の参照アミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基において異なる。これに関連して、少なくとも１つのアミノ酸残基における違いは、例えば、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸への突然変異、欠失又は挿入からなり得る。変異体は、本明細書で定義される治療用タンパク質又はその断片のホモログ、アイソフォーム、又は転写産物変異体であってもよく、ホモログ、アイソフォーム又は転写産物変異体は、それぞれ本明細書で定義される同一性又は相同性の程度によって特徴付けられる。
幾つかの例において、異種遺伝子、レプリカーゼ、又はその断片の変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、１アミノ酸置換～１００アミノ酸置換、１アミノ酸置換～５０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～２０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～１０アミノ酸置換、例えば、１アミノ酸置換、２アミノ酸置換、３アミノ酸置換、４アミノ酸置換、５アミノ酸置換、６アミノ酸置換、７アミノ酸置換、８アミノ酸置換、９アミノ酸置換、又は１０アミノ酸置換）を含む。同じクラスのアミノ酸同士が交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正又は負に帯電した側鎖、側鎖又はアミノ酸中に芳香族基を有するアミノ酸であり、その側鎖は、水素架橋、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖を形成することができる。保存的構成（conservative constitution）により、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、対応する極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置き換えられてもよく、又は、例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、対応する疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置き換えられてもよい（例えば、セリン（スレオニン）がスレオニン（セリン）によって、又はロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）によって）。或る特定の実施形態において、タンパク質又はその断片の変異体は、本発明によるＲＮＡによってコードされてもよく、ここで、アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基は、それぞれの天然に存在する配列等の参照配列と比較して、少なくとも１つの保存的置換を含む。
幾つかの例において、例えば、タンパク質の三次元構造の実質的な改変を引き起こさない位置における挿入、欠失、及び／又は非保存的置換もまた、変異体という用語によって包含される。挿入（複数の場合もある）又は欠失（複数の場合もある）による三次元構造の改変は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
２つの配列（例えば、核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はアミノ酸配列）が同一であるパーセンテージを決定するために、配列を、その後に互いに比較するために整列させることができる。この目的のため、ギャップを第１の配列の配列に挿入し、第２の配列の対応する位置にある構成要素を比較することができる。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置の場合と同じ構成要素によって占められている場合、２つの配列はこの位置において同一である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一位置の数を位置の総数で割った関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定され得る。使用され得る数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877又はAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムを、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムに統合することができる。本発明の配列と或る程度同一である配列を、このプログラムによって同定することができる。本明細書に記載の任意の実施形態において、配列は、記載される特定の配列番号（例えば、配列番号１～配列番号３６のいずれか１つ）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。当業者は、遺伝暗号のおかげで、本明細書に記載されるＤＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列の推定を可能にし、同様に、ＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の推定を可能にすることを理解する。本明細書に記載される全ての配列を表１に列挙する。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された（operably linked）」又は「動作可能に連結された（operatively linked）」という用語は、要素の配置を指し、ここで、そのように記載された構成要素は、それらの通常の機能を果たすように構成される。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるときに「作動可能に連結」又は「動作可能に連結」される。例えば、プロモーターは、１つ以上の異種遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、１つ以上の異種遺伝子に作動可能に連結される。さらに、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる。制御エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在する可能性があり、プロモーター配列は依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に産生され、ネイティブ宿主ゲノムに組み込まれていないことを意味する。例えば、単離された核酸ベクターは、脂質エンベロープ（例えば、リポソーム）又はポリマーマトリックスに封入された核酸ベクターを含む。幾つかの実施形態において、「単離された」という用語は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、無細胞環境において）、例えば、ローリングサークル型増幅又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された；（ｉｉ）分子クローニングにより組換え的に産生された；（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼ切断及びゲル電気泳動分画、若しくはカラムクロマトグラフィーにより精製された；又は（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたＤＮＡベクターを指す。単離された核酸ベクターは、当該技術分野で良く知られている組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能なものである。したがって、５’及び３’の制限部位が既知であるか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されていると見なされるが、天然宿主に天然状態で存在する核酸配列は単離されていない。単離された核酸ベクターは、実質的に精製されていてもよいが、必ずしもそうである必要はない。単離された自己複製分子は、当該技術分野で良く知られている組換え技術によって容易に操作可能なものである。単離された自己複製ＲＮＡ分子は、実質的に精製されてもよいが、必ずしもそうである必要はない。例えば、単離された自己複製ＲＮＡ分子は、脂質エンベロープ（例えば、リポソーム）又はポリマーマトリックスに封入された自己複製ＲＮＡ分子を含む。
本明細書において使用される場合、「裸の」という用語は、脂質エンベロープ（例えば、リポソーム）又はポリマーマトリックスに封入されておらず、個体への投与時に固体構造（例えば、粒子状構造）と物理的に会合していない（例えば、共有結合的又は非共有結合的に結合していない）核酸分子（例えば、環状ＤＮＡベクター）を指す。本発明の幾つかの例において、医薬組成物は、裸の環状ＤＮＡベクター（例えば、裸の合成環状ＤＮＡベクター）を含む。
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる１つ以上の有効成分の生物学的活性が有効であり、製剤が投与される患者に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含まないような形態の作用物質を指す。医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体（例えば、液体形態又は乾燥（例えば凍結乾燥）形態）を含み得る。
「薬学的に許容可能な」という語句は、物質又は組成物が、製剤を含む他の成分、及び／又はそれによって治療される哺乳動物と化学的及び／又は毒物学的に適合しなければならないことを示す。
「担体」という用語は、本発明のベクター又は組成物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。好適な医薬担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Academic Press., 23rd edition, 2020に記載される。
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）を担持することができる核酸分子を指し、標的細胞に連結され、次いで、異種遺伝子を標的細胞内で複製させ、プロセシングさせ、及び／又は発現させることができる。標的細胞又は宿主細胞がベクターの対象の配列（例えば、ゲノム）をプロセシングした後は、対象の配列（例えば、ゲノム）はベクターとは見なされない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る細菌性骨格を含む環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。或る特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、或る特定のベクターは、それらが動作可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」又は「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。
本明細書において使用される場合、「標的細胞」は、異種遺伝子によってコードされる調節タンパク質を発現する細胞を指す。標的細胞は、腫瘍細胞（すなわち、癌細胞）及び腫瘍常在性細胞（例えば、腫瘍微小環境に存在する健常細胞（例えば、樹状細胞等の腫瘍常在性抗原提示細胞、及びＴ細胞等の腫瘍浸潤リンパ球））を含む。
本明細書において使用される場合、「個体」という用語は、本明細書に記載の治療又は予防の方法を必要とする任意の哺乳動物（例えば、癌を有する哺乳動物）を含む。幾つかの実施形態において、個体はヒトである。他の実施形態において、個体は、非ヒト哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、又はイヌ）である。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。一実施形態において、対象は、癌、例えば、１つ以上の固形腫瘍の存在を特徴とする癌を有する。
「癌」は、悪性癌細胞の異常な増殖を指し、肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢癌及び胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、並びに脳癌等の固形腫瘍の存在を特徴とする癌を含む。癌患者における癌細胞（例えば、腫瘍細胞）は、対象における正常な体細胞と免疫学的に区別され得る（例えば、癌腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、癌細胞は、癌細胞によって発現される１つ以上の抗原に対して癌患者において全身性免疫応答を誘発する可能性がある。免疫応答を誘発する抗原は、腫瘍抗原であってもよく、又は正常細胞によって共有されてもよい。癌を有する患者は、当該技術分野で知られている少なくとも１つの識別可能な適応症、症状又は臨床基準に従って癌を診断するのに十分な検査結果を示し得る。かかる臨床基準の例は、医学教科書、例えばHarrison's Principles of Internal Medicine (Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson J, Loscalzo J. eds. 18e. New York, NY McGraw-Hill; 2012)等に記載される。場合によっては、個体における癌の診断は、個体から得られた体液又は組織の試料における特定の細胞型（例えば、癌細胞）の同定を含み得る。
本明細書において使用される場合、「固形腫瘍」は、血液、骨髄、又はリンパ系以外の任意の体組織の癌である。固形腫瘍は更に、上皮細胞起源のものと非上皮細胞起源のものとに分けることができる。上皮細胞又は固形腫瘍の例としては、頭頸部、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、陰唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器官、尿器官、膀胱、及び皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮起源の固形腫瘍としては、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「腫瘍微小環境」は、固形腫瘍内の細胞及び細胞外物質（例えば、マトリックスタンパク質、小胞、及び可溶性因子（例えば、サイトカイン））の集合体を指す。
本明細書において使用される場合、核酸ベクター又はその組成物の「有効量」又は「有効用量」は、例えば、選択された投与の形態、経路、及び／又はスケジュールに従って個体に投与された場合に、所望の生物学的及び／又は薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。当業者には理解されるように、有効である特定の組成物の絶対量は、所望の生物学的又は薬理学的エンドポイント、送達される作用物質、標的組織等の要因に応じて変化し得る。当業者は、「有効量」を細胞と接触させるか、又は単回用量で若しくは複数回用量の使用を通じて対象に投与することができることを更に理解するであろう。癌を治療するための有効量の組成物は、（例えば、参照集団、例えば未治療又はプラセボ集団と比較して）疾患進行（例えば、腫瘍成長及び／又は転移）を遅延又は停止させ、部分的又は完全な応答を増加させ、全生存期間を増加させることができる。
本明細書において使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」等の文法的変形例）は、治療される個体の自然な経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の経過中のいずれかに行うことができる。治療の望ましい効果としては、限定されるものではないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。幾つかの実施形態において、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、疾患の発症を遅らせるため、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
特に、治療は、癌の完全寛解及び／又は癌転移の阻害を含む、癌の成長を減少又は阻害することを含み得る。癌の成長は、一般に、より発達した形態での癌の変化を示す幾つかの指標のいずれかを指す。したがって、癌の成長の阻害を測定するための指標は、癌細胞の生存率、腫瘍体積又は形態（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像化方法を用いて決定される）において低減され得る。腫瘍成長の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型皮膚過敏反応試験（delayed hypersensitivity skin tests）におけるパフォーマンスの改善、細胞溶解性Ｔリンパ球活性の増加及び腫瘍特異的抗原レベルの低下。対象において癌性腫瘍における免疫抑制を低減させることは、癌の成長、特に、対象に既に存在する癌の成長に抵抗する対象の能力を改善することができ、及び／又は対象における癌成長の傾向を低減させることができる。
「低減する又は阻害する」とは、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の全体的な低下を引き起こす能力を意味する。低減する又は阻害するは、治療される障害の症状、転移の存在又はサイズ、原発腫瘍のサイズを指すことができる。
本明細書において使用される場合、腫瘍微小環境を「調節すること」又は「調節する」は、腫瘍進行と腫瘍クリアランスとの間のバランスと相関する、又はそれに影響を与える（すなわち、直接的又は間接的）ことが知られている任意の腫瘍バイオマーカーに測定可能な変化を引き起こすことを意味する。例えば、腫瘍微小環境は、治療が腫瘍クリアランスに関連するバイオマーカー、例えば、腫瘍微小環境における免疫原性タンパク質（例えば、炎症誘発性サイトカイン若しくは樹状細胞活性化タンパク質、又は活性化腫瘍浸潤リンパ球等の細胞表面に発現するタンパク質）、及び／又は腫瘍微小環境における免疫原性細胞プロファイル（例えば、腫瘍浸潤リンパ球の存在の増加）の相対的発現を増加させる場合、治療によって調節される。幾つかの実施形態において、腫瘍微小環境は、治療が腫瘍進行に関連するバイオマーカー（例えば、Ｔ細胞疲弊のバイオマーカー、例えば、腫瘍微小環境におけるＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１発現）の相対的発現を減少させる場合、治療によって調節されると言われる。腫瘍クリアランス又は腫瘍進行に関連するバイオマーカーは、任意の適切な手段、例えばウェスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、シングルセルシーケンシング、フローサイトメトリー、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）、又は、例えば、腫瘍微小環境又は血液（例えば、循環細胞、血漿、又は血清）の生検に対して実施される他の従来のアッセイによって決定され得る。幾つかの実施形態において、測定可能な変化は、例えば、免疫原性タンパク質又は腫瘍進行に関連する他のバイオマーカーの発現レベルにおける、任意の統計的に有意な変化である。例えば、発現レベルの測定可能な変化は、基準発現レベル（例えば、参照細胞、参照組織、又は治療なし若しくは治療前の対象における発現）に対する免疫原性タンパク質又は腫瘍進行に関連する他のバイオマーカーの発現レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％の変化であり得る。幾つかの例において、腫瘍微小環境は、治療が無増悪生存期間を延長し、部分奏効又は完全奏効を含む客観的奏効をもたらし、全生存期間を延長し、及び／又は癌の１つ以上の症状を改善する場合、治療によって調節されたと判断される。
本明細書において使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、又は糖脂質ベースの分子マーカーを指し、その発現又は存在は、個体、対象、又は患者の試料において標準的な方法（又は本明細書に開示される方法）によって検出することができ、環状ＤＮＡベクター、又はその組成物に対する腫瘍環境の応答性又は感受性をモニタリングするのに有用である。かかるバイオマーカーの発現は、参照レベル（例えば、患者、例えば、固形腫瘍を有する患者の群／集団からの試料におけるバイオマーカーの発現レベルの中央値；患者、例えば、固形腫瘍を有する患者の群／集団からの試料におけるバイオマーカーの発現レベルの中央値；又は、予め個人から以前に取得した試料におけるレベルを含む）に対して本発明の方法に従って治療された個体から得られた試料においてより高い又はより低いと決定され得る。バイオマーカーの参照発現レベルより高い又は低い発現レベルを有する個体は、治療によって調節された腫瘍微小環境を有する個体として特徴付けることができる。例えば、参照レベル（上記の中央値レベル等）に対して最も極端な５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％（すなわち、より高い又はより低い）の遺伝子発現レベルを示すかかる個体は、治療によって調節された腫瘍微小環境を有する個体として同定され得る。
「発現のレベル」又は「発現レベル」という用語は区別なく使用され、一般に、生体試料（例えば、腫瘍試料）中のポリヌクレオチド、又はアミノ酸産物若しくはタンパク質の量を指す。「発現」は、一般に、遺伝子コードされた情報が細胞内に存在し、動作する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によれば、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を指す場合がある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片も、それらが選択的スプライシングによって生成された転写産物若しくは分解された転写産物に由来するか、又は例えばタンパク質分解による、タンパク質の翻訳後プロセシングに由来するかにかかわらず、発現されたとみなされるものとする。「発現された遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写された後、タンパク質に翻訳されるものを含み、ＲＮＡに転写されるがタンパク質に翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。
本明細書において使用される場合、「発現持続性」という用語は、対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）又はその機能部分（例えば、治療用ＤＮＡベクターの１つ以上のコード配列）が、トランスフェクトされた細胞（「細胞内持続性」）又はトランスフェクトされた細胞の任意の子孫（「世代間持続性」）において発現可能である期間を指す。対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）又はその機能部分は、例えば、ＤＮＡメチル化及び／又はヒストンメチル化及びコンパクションによってサイレンシングされない場合に発現可能であり得る。発現持続性は、（ｉ）標的細胞又はその子孫における対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）から転写されるｍＲＮＡ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、又は任意の他の適切な方法を介して）、及び（ｉｉ）標的細胞又はその子孫における対象の配列（例えば異種遺伝子又は治療用配列）から翻訳されたタンパク質（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は任意の他の適切な方法を介して）を検出又は定量化することによって評定することができる。幾つかの例において、発現持続性は、（ｉ）標的細胞又はその子孫において対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）から転写されるｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）標的細胞又はその子孫において対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）から翻訳されたタンパク質のいずれか又は両方と併せて、標的細胞又はその子孫における治療用ＤＮＡを検出又は定量化することによって評定される（例えば、標的細胞における治療用環状ＤＮＡベクターの存在、例えば、エピソームＤＮＡコピー数解析による）。対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）、又はその機能部分の発現持続性を、当該技術分野において知られている任意の遺伝子発現を特性評価する方法を用いて、細菌で産生されるコントロールベクター等の参照ベクター（例えば、細菌で産生されるか、又は本発明のベクターに存在しない１つ以上の細菌シグネチャを有する環状ベクター（例えば、プラスミド））に対して、定量化することができる。発現持続性は、ベクターの投与後の任意の所与の時点で定量化することができる。例えば、幾つかの実施形態において、本発明の治療用環状ＤＮＡベクターの発現は、治療用環状ＤＮＡベクターの投与から２週間後に標的細胞又はその子孫において検出可能である場合、投与後少なくとも２週間持続する。幾つかの実施形態において、遺伝子の発現は、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれより長い間、標的細胞において検出可能である場合、標的細胞において「持続する」。幾つかの実施形態において、対象の配列（例えば、異種遺伝子又は治療用配列）の発現は、所与の期間後（例えば、投与後１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、又はそれより長い間）、元の発現レベルの任意の検出可能な割合（例えば、元の発現量の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも１００％）が残存する場合、投与後所与の期間持続すると言われる。
「試料」及び「生体試料」という用語は、身体組織（例えば、腫瘍組織）、体液、細胞、又は他の供給源を含む個体から得られた任意の生体試料を指すために区別なく使用される。体液は、例えば、リンパ液、血清、全新鮮血、末梢血単核細胞、凍結全血、血漿（新鮮又は凍結を含む）、尿、唾液、精液、滑液及び髄液である。試料はまた、乳房組織、腎臓組織、結腸組織、脳組織、筋肉組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、及び腫瘍組織を含む。哺乳動物から組織生検及び体液を得るための方法は、当該技術分野においてよく知られている。
本明細書において使用される場合、「投与する」とは、本発明の核酸ベクター又はその組成物（例えば、医薬組成物、例えば、核酸ベクターを含む医薬組成物）の投与量を個体に与える方法を意味する。本明細書に記載の方法において利用される組成物は、例えば、腫瘍内、腫瘍周囲、静脈内、皮下、皮内、経皮的（percutaneously）、筋肉内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹膜内、結膜下、膀胱内（intravesicularly）、粘膜内、心膜内、臍帯内（intraumbilically）、眼内、眼窩内、経口、局所、経皮（transdermally）、眼周囲、結膜内、腱鞘下（subtenonly）、前房内、網膜下、球後、涙管内、吸入によって、注射によって、埋め込みによって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸漬する局所灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームにおいて、又は脂質組成物において投与することができる。本明細書に記載の方法において利用される組成物を、全身的又は局所的に（例えば、腫瘍内又は腫瘍周囲に）投与することができる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。
「と組み合わせて投与される」とは、同じ治療レジメンの一部としての複数の治療成分の投与を指す。本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、パルス電界療法と組み合わせて、例えば、同じ外来処置の一部として、又は数日間にわたって投与することができる。追加的に又は代替的に、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、別の治療剤と組み合わせて（例えば、同じ医薬組成物の一部として、又は別々の医薬組成物として、同時に又は異なる時間に）投与され得る。
本明細書において使用される場合、「エレクトロトランスファー」は、細胞が存在する微小環境への電界（例えば、パルス電界）の伝達によって引き起こされる、標的細胞の膜を横切る分子（例えば、核酸ベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター）の（例えば、標的細胞の外側から内側への）移動を指す。エレクトロトランスファーは、電気泳動、すなわち、分子の電荷に基づく電界に沿った（例えば、電流の方向への）分子（例えば、核酸ベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター）の移動の結果として起こり得る。電気泳動は、例えば、分子（例えば、核酸ベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター）を細胞膜の近接に移動させて、分子を細胞内に運ぶための生物輸送プロセス（例えば、ピノサイトーシス又は食作用を含むエンドサイトーシス）又は受動輸送（例えば、拡散又は脂質分配）を可能にすることによって、エレクトロトランスファーを誘導することができる。追加的に又は代替的に、エレクトロポレーション、すなわち、電界（例えば、パルス電界）の伝達によって引き起こされる標的細胞における細孔の生成の結果としてエレクトロトランスファーが起こる場合があり、細孔のサイズ、形状、及び持続時間は、標的細胞の外側から標的細胞の内側への分子（例えば、核酸ベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター）の移動に適応させるのに適している。したがって、幾つかの例において、エレクトロトランスファーは、電気泳動及びエレクトロポレーションの組合せの結果として生じる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物（chemical compound）である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコン、メトレドパ及びウレドパ等のアジリジン；アイトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミン（trimethylomelamine）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（methylamelamines）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（商標））；ベータラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、及び９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類縁体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン等のニトロソウレア；エネジイン系抗生物質（例えば、カリキアマイシン）等の抗生物質；ＣＤＰ３２３、経口アルファ－４インテグリン阻害剤；ダイネマイシンＡを含む、ダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連色タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オーストラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ－９９（ＭＹＯＣＥＴ（商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（商標））、エポチロン、及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）等の代謝拮抗剤；コンブレタスタチン；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸類縁体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤（anti-adrenals）；フロリン酸（frolinic acid）等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）多糖類複合体（オレゴン州ユージーンのJHS Natural Products）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「アラＣ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、ニュージャージー州プリンストンのBristol-Myers Squibb Oncology）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、フランス国アントニーのRhome-Poulene Rorer）；クロランブシル（chloranbucil）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、及びカルボプラチン等の白金剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを防ぐビンカ（vincas）；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（商標））を含むレチノイン酸等のレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（商標）又はＯＳＴＡＣ（商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（商標））、又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（商標））等のビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）））等；及び、細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ－Ａ；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン等のワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Bayer）；ＳＵ－１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（商標）、Pfizer）；ペリフォシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（商標））；ＣＣＩ－７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（商標））等のＢｃｌ－２阻害剤；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標））等のセリン－スレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファミブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））等のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；また同様に、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ；オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５－ＦＵ及びロイコボリンとを組み合わせた治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸ等の上記の２つ以上の組合せ、並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；また同様に、上記の２つ以上の組合せが挙げられる。
本明細書で定義される化学療法剤は、癌の成長を促進し得るホルモンの効果を調節、低減、遮断、又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療薬」を含む。それらは、限定するものではないが、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標））、４－ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及びＳＥＲＭ３等の選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルの抗エストロゲン薬；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（商標））、及びＥＭ８００等のアゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン薬（かかる作用物質は、エストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制する可能性がある）；フォルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（商標））等のステロイド性アロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、及びアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（商標））及びアミノグルテチミド等の非ステロイド性アロマターゼ阻害剤を含むホルモンそのものであってもよく、他のアロマターゼ阻害剤としては、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（商標））、ファドロゾール、及び４（５）－イミダゾール；ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリンを含む黄体化ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロン等のプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリン等のエストロゲン、並びにフルオキシメステロン等のアンドロゲン／レチノイド、全てのトランスレチノイン酸及びフェンレチニドを含む、性ステロイド；オナアプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミド等の抗アンドロゲン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びに上記の２つ以上の組合せが挙げられる。
本明細書において使用される場合、「細胞毒性剤」という用語は、細胞機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞死又は破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素等の酵素及びその断片；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素等の毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；並びに本明細書に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤が挙げられる。
本明細書において使用される場合の「成長阻害剤」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指す。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期における細胞のパーセンテージを有意に低下させるものであってもよい。成長阻害剤の例としては、（Ｓ期以外の場所で）細胞周期の進行を遮断する作用物質、例えば、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する作用物質が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。Ｇ１を停止させる作用物質、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、及びアラＣ等のＤＮＡアルキル化剤もＳ期停止に波及する。更なる情報は、Murakami et al. (W.B.Saunders, Philadelphia, 1995)によるMendelsohn et al. eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"の例えば１３頁に見ることができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、どちらもイチイの木に由来する抗癌剤である。ヨーロッパのイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、Rhone-Poulenc Rorer）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Bristol-Myers Squibb）の半合成類縁体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、解重合を防ぐことによって微小管を安定化させ、細胞内の有糸分裂を抑制する。
数量を特定しない単数形（"a" and "an"）は、「１つ以上の」を意味する。例えば、「遺伝子（a gene）」は、１つ以上のかかる遺伝子を表すと理解される。したがって、数量を特定しない単数形、「の１つ以上」、及び「の少なくとも１つ」は、本明細書において区別なく使用される。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、参照値から±１０％変動以内の値を指す。
ＩＩ．治療用組成物
本発明は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター、例えば、裸の環状ＤＮＡベクター；又は自己複製ＲＮＡ分子）、及びその医薬組成物を含み、これらは、例えば、腫瘍微小環境の調節（例えば、腫瘍微小環境の免疫調節）を介して癌を治療する方法において有用である。かかる核酸ベクターとしては、環状ＤＮＡベクター（例えば、それぞれが免疫調節遺伝子をコードする複数の転写単位を有する環状ＤＮＡベクター；複数の免疫調節遺伝子をコードする単一の転写単位を有する環状ＤＮＡベクター；並びにレプリカーゼ及び１つ以上の免疫調節遺伝子をコードする自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクター）が挙げられる。幾つかの例において、環状ＤＮＡベクター（例えば、裸の環状ＤＮＡベクター）は、合成環状ＤＮＡベクターであり、これは、テンプレートからのそれらの産生が細菌細胞を伴わない無細胞プロセスを用いて産生される環状ＤＮＡベクターを指す。
核酸ベクター
本明細書において、調節配列を有する核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター、又は自己複製ＲＮＡ分子）が提供され、各調節配列は、複数の調節遺伝子をコードする。自己複製ＲＮＡ分子を含む実施形態において、調節配列をレプリカーゼに作動可能に連結することができる。調節配列は、免疫調節性、すなわち、例えば、免疫細胞を動員（mobilize）及び／又は免疫細胞を活性化するために免疫細胞の表面に結合する免疫調節タンパク質をコードすることによって、免疫細胞を調節することができる。調節配列（例えば、免疫調節配列）は、モノシストロン性又はポリシストロン性（すなわち、バイシストロン性、トリシストロン性等）であり得る。免疫調節配列は、種々の免疫細胞に結合することができるペプチド及びタンパク質をコードする１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子、例えば、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子をコードする遺伝子、及びリンパ球シグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、免疫調節タンパク質は、抗原提示細胞（例えば、交差提示抗原提示細胞、例えば、樹状細胞（例えば、従来の樹状細胞（例えば、ｃＤＣ１又はｃＤＣ２）又は形質細胞様ＤＣ（例えば、ｐＤＣ））等のプロフェッショナル抗原提示細胞）に結合し、それを介してシグナルを伝達する。かかる抗原提示細胞結合免疫調節タンパク質は、樹状細胞の化学誘引物質、例えばＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４を含む。したがって、本発明の幾つかの例において、免疫調節配列としては、ＸＣＬ１をコードする遺伝子（例えば、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号９若しくは配列番号９Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）、ＸＣＬ２をコードする遺伝子（例えば、配列番号１２に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号１１若しくは配列番号１１Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）、ＣＣＬ５をコードする遺伝子（例えば、配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号１３若しくは配列番号１３Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子（例えば、配列番号１６に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号１５若しくは配列番号１５Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）が挙げられる。抗原提示細胞結合免疫調節タンパク質はまた、樹状細胞成長因子及び活性化因子、例えばＦＬＴ３Ｌ（例えば、可溶性ＦＬＴ３Ｌ（ｓＦＬＴ３Ｌ））、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０、又はＣＤ４０Ｌ）を含む。したがって、本発明の幾つかの例において、免疫調節配列としては、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号１７若しくは配列番号１７Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子））が挙げられる。他の例において、免疫調節配列としては、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子（例えば、配列番号２０に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号１９若しくは配列番号１９Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）が挙げられる。他の例において、免疫調節配列としては、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子（例えば、配列番号２２に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び／又は配列番号２１若しくは配列番号２１Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する遺伝子）が挙げられる。幾つかの例において、核酸ベクターは、免疫調節配列における複数の遺伝子の発現を駆動する単一のプロモーター（例えば、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子、及び／又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子）の発現を駆動する単一のプロモーター）を特徴とする。他の実施形態において、核酸ベクターは、免疫調節配列内の各遺伝子を駆動するプロモーター（例えば、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現をそれぞれ駆動する第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーター）を含む。
幾つかの例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含む。或る特定の実施形態において、かかる免疫調節配列は、２つ以下の遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、複数の転写単位を有し、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子に対して５’の第１のプロモーターと、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子に対して５’の第２のプロモーターとを含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、バイシストロン性であり、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子に対して５’の単一のプロモーターを含む。
免疫調節タンパク質は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＢ細胞）に結合して、それを介してシグナル伝達することもできる。幾つかの例において、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を有する免疫調節配列を含む。リンパ球シグナル伝達タンパク質は、サイトカイン及びケモカインを含み、その受容体に結合するとリンパ球を活性化又は刺激し得る。したがって、幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、サイトカイン又はケモカイン等のリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む。サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－３６－γ；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β；インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、及びＩＦＮ－α；並びに白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のタンパク質因子が挙げられる。特定の実施形態において、免疫調節配列によってコードされるサイトカインは、ＩＬ－１２（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は、配列番号２３若しくは配列番号２３Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）、ＩＬ－１５（例えば、配列番号２６に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は配列番号２５若しくは配列番号２５Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）、ＩＦＮ－β（例えば、配列番号３２に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は配列番号３１若しくは配列番号３１Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）、又はＩＬ－３６－γ（例えば、配列番号３６に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は、配列番号３５若しくは配列番号３５Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）である。ケモカインとしては、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、及びＣＣＬ１１が挙げられる。幾つかの実施形態において、免疫調節配列によってコードされるケモカインは、ＣＸＣＬ９（例えば、配列番号２８に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は、配列番号２７若しくは配列番号２７Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）又はＣＸＣＬ１０（例えば、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するサイトカイン；及び／又は、配列番号２９若しくは配列番号２９Ａに対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する免疫調節配列）である。
幾つかの例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。他の例では、免疫調節配列は、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。或る特定の実施形態において、かかる免疫調節配列は、２つ以下の遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、複数の転写単位を有し、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子に対して５’の第１のプロモーターと、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子に対して５’の第２のプロモーターとを含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、バイシストロン性であり、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子に対して５’の単一のプロモーターを含む。
幾つかの例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、複数の転写単位を有し、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子に対して５’の第１のプロモーター、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子に対して５’の第２のプロモーター、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子に対して５’の第３のプロモーターを含む。他の実施形態において、免疫調節配列はトリシストロン性であり、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子に対して５’の単一のプロモーターを含む。
例えば、免疫調節配列（例えば、図２に例示されるような３つの転写単位を有する免疫調節配列、又は図１に例示されるようなトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含み得る。代替的には、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含み得る。代替的には、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＣＬ４をコードする遺伝子を含み得る。他の特定の実施形態において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＣＬ５をコードする遺伝子を含み得る。
幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）を含む。代替的には、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例では、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例では、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例では、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例では、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例では、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子）、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びリンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）を含む。代替的には、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びリンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）を含む。代替的には、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の例において、免疫調節配列（例えば、３つの転写単位を有する免疫調節配列、又はトリシストロン性免疫調節配列）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、リンパ球の活性化サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子、ＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。更に他の例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。代替的な例において、免疫調節配列は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子、及びＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
特定の実施形態において、免疫調節配列は、３つの転写単位を有し、ここで、第１のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子に対して５’であり、第２のプロモーターがｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子に対して５’であり、第３のプロモーターがＩＬ－１２をコードする遺伝子に対して５’である。代替的な実施形態において、免疫調節配列は、トリシストロン性であり、ここで、単一のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子に対して５’である。
特定の実施形態において、免疫調節配列は、３つの転写単位を有し、ここで、第１のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子に対して５’であり、第２のプロモーターがｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子に対して５’であり、第３のプロモーターがＩＬ－１５をコードする遺伝子に対して５’である。代替的な実施形態において、免疫調節配列は、トリシストロン性であり、ここで、単一のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子、ｓＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子に対して５’である。
代替的には、幾つかの例において、免疫調節配列は、３つの転写単位を有し、ここで、第１のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子に対して５’であり、第２のプロモーターがＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子に対して５’であり、第３のプロモーターがＩＬ－１２をコードする遺伝子に対して５’である。代替的な実施形態において、免疫調節配列は、トリシストロン性であり、ここで、単一のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子に対して５’である。
特定の実施形態において、免疫調節配列は、３つの転写単位を有し、ここで、第１のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子に対して５’であり、第２のプロモーターがＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子に対して５’であり、第３のプロモーターがＩＬ－１５をコードする遺伝子に対して５’である。代替的な実施形態において、免疫調節配列は、トリシストロン性であり、ここで、単一のプロモーターがＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子に対して５’である。
先の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）のいずれかの幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子）を含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子）を含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子）を含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子）を含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、及び樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子）を含む。他の実施形態において、免疫調節配列は、５’→３’方向に動作可能に連結された、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、レプリカーゼをコードする配列、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子）を含む。
特定の実施形態において、免疫調節配列は、配列番号３４に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。付加的又は代替的には、幾つかの実施形態において、免疫調節配列は、配列番号３３又は配列番号３３Ａに対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
本発明の上述の実施形態のいずれかの或る特定の例において、トリシストロン性免疫調節配列は、３つ以下の遺伝子を含む。
本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子のいずれかの異種遺伝子は、本明細書に記載されるタンパク質、又はその変異体（例えば、樹状細胞の化学誘引物質、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子、及び／又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質）のいずれかの機能的に同等の断片をコードし得る。本発明による自己複製ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質又はその変異体の断片は、参照アミノ酸配列（例えば、それぞれの天然に存在する完全長タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列）と少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。
免疫調節配列内で有用な他の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子には、他のサイトカイン、ケモカイン、及び成長因子をコードする遺伝子が含まれる。本発明の一部として有用な他のサイトカインとしては、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、及びＩＬ－１８が挙げられる。本発明の一部として有用なケモカインの非限定的な例としては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１０が挙げられる。成長因子の非限定的な例としては、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、成長分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。
本明細書に記載されるポリシストロン性核酸ベクター（例えば、ＤＮＡベクター、例えば、環状ＤＮＡベクター）のいずれかにおいて、切断部位がタンパク質をコードする領域の間に設計され得る。例えば、フーリン－Ｐ２Ａ部位は、本明細書に記載されるタンパク質をコードする遺伝子のいずれかを分離することができる。タンパク質をコードする遺伝子の下流の部位を切断するために、リボザイムを自己複製ＲＮＡ分子に組み込むこともできる。幾つかの実施形態において、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、又は任意の他の好適な自己切断部位（例えば、ウイルス由来切断部位）が、本明細書に記載されるタンパク質をコードする遺伝子のいずれかを分離することができる。
環状ＤＮＡベクター
本発明の幾つかの実施形態は、環状ＤＮＡベクター（例えば、それぞれが免疫調節遺伝子をコードする複数の転写単位を有する環状ＤＮＡベクター、複数の免疫調節遺伝子をコードする単一の転写単位を有する環状ＤＮＡベクター、及びレプリカーゼと１つ以上の免疫調節遺伝子とをコードする自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクター）を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される免疫調節配列をコードするのに有用な環状ＤＮＡベクターは、プラスミドＤＮＡベクターであり得る。本発明の特定の例において、環状ＤＮＡベクターは、プラスミド骨格要素（例えば、（ｉ）細菌複製起点及び／又は（ｉｉ）薬剤耐性遺伝子等の細菌要素）を欠くという点で従来のプラスミドＤＮＡベクターとは異なる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子のいずれかをコードするＤＮＡベクター）は、組換え部位を欠く（例えば、無細胞プロセスによって作製される合成環状ＤＮＡベクター）。代替的な実施形態において、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子のいずれかをコードする）は、組換え部位を含む（例えば、ミニサークルＤＮＡベクター）。
本発明の環状ＤＮＡベクターは、自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列の５’に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターが自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列の転写をもたらすことができる場合に、プロモーターは、その自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されている。環状ＤＮＡベクターの一部として使用され得るプロモーターとしては、構成的プロモーター、誘導プロモーター、ネイティブプロモーター、及び組織特異的プロモーターが挙げられる。構成的プロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを伴う）、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１ａプロモーターが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。幾つかの実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーターを含む。
代替的には、本発明の環状ＤＮＡベクターは、誘導プロモーターを含む。誘導プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子、若しくは特定の生理的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態によって、又は複製細胞のみにおいて調節され得る。誘導プロモーター及び誘導系は、様々な商業的供給源から利用可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン誘導性マウス乳癌ウイルスプロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、及びラパマイシン誘導系が挙げられる。この文脈において有用であり得る更に他のタイプの誘導プロモーターは、特定の生理的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、又は複製細胞のみにおいて調節されるものである。
本発明の環状ＤＮＡベクターは、自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列の３’にポリアデニル化配列を含んでいてもよい。有用なポリアデニル化配列としては、２０ｎｔ超（例えば、２５ｎｔ超、３０ｎｔ超、３５ｎｔ超、４０ｎｔ超、５０ｎｔ超、６０ｎｔ超、７０ｎｔ超、若しくは８０ｎｔ超、例えば、２０ｎｔ～１００ｎｔ、３０ｎｔ～１００ｎｔ、４０ｎｔ～１００ｎｔ、５０ｎｔ～１００ｎｔ、６０ｎｔ～１００ｎｔ、７０ｎｔ～１００ｎｔ、８０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～２００ｎｔ、２００ｎｔ～３００ｎｔ、若しくは３００ｎｔ～４００ｎｔ、又はそれ以上）の伸長ポリアデニル化配列が挙げられる。
ＤＮＡ複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子等の細菌要素を欠く環状ＤＮＡベクターは、従来のＤＮＡベクター（例えば、プラスミド）よりも長く、また裸のＲＮＡよりも長く個体内に留まることができる。自己複製ＲＮＡを含む或る特定の実施形態において、環状ＤＮＡベクターは、それにコードされる自己複製ＲＮＡ分子に安定性の向上をもたらす。
環状ＤＮＡベクターは、様々なサイズ及び形状を有し得る。本発明の自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクターは、５ｋｂ～２０ｋｂの長さ（例えば、６ｋｂ～１８ｋｂ、７ｋｂ～１６ｋｂ、８ｋｂ～１４ｋｂ、又は９ｋｂ～１２ｋｂの長さ、例えば、５ｋｂ～６ｋｂ、６ｋｂ～７ｋｂ、７ｋｂ～８ｋｂ、８ｋｂ～９ｋｂ、９ｋｂ～１０ｋｂ、１０ｋｂ～１１ｋｂ、１１ｋｂ～１２ｋｂ、１２ｋｂ～１３ｋｂ、１３ｋｂ～１４ｋｂ、１４ｋｂ～１５ｋｂ、１５ｋｂ～１６ｋｂ、１６ｋｂ～１８ｋｂ、又は１８ｋｂ～２０ｋｂの長さ、例えば、約５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１０．５ｋｂ、約１１ｋｂ、約１１．５ｋｂ、約１２ｋｂ、約１２．５ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１７ｋｂ、約１８ｋｂ、約１９ｋｂ、又は約２０ｋｂの長さ）であり得る。
本発明の一部として有用な環状ＤＮＡベクターは、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される様々な手段によって容易に合成することができる。例えば、プラスミド骨格要素（例えば、（ｉ）細菌複製起点及び／又は（ｉｉ）薬剤耐性遺伝子等の細菌要素）を欠く環状ＤＮＡベクターは、細菌ベースの方法と比べてより純粋な組成物をもたらし得るｉｎ ｖｉｔｒｏ（無細胞）方法を用いて作製することができる。かかるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法は、例えば、ローリングサークル型増幅を用いる複製ツールとして、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ等のファージポリメラーゼの使用を伴い得る。環状ＤＮＡベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の特定の方法は、国際公開第２０１９／１７８５００号（引用することにより本明細書の一部をなす）に更に記載されている。
自己複製ＲＮＡ分子及びそれをコードするＤＮＡベクター
調節療法、例えば、免疫調節療法として有用な自己複製ＲＮＡ分子が本明細書に提供される。自己複製ＲＮＡ分子は、脊椎動物細胞に送達されると、それ自体からの転写によって（それ自体から生成されるアンチセンスコピーを介して）複数の娘ＲＮＡの産生をもたらし得る。幾つかの例において、自己複製ＲＮＡ分子は、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳によってレプリカーゼが産生され、これが続いて送達されたＲＮＡからアンチセンス転写産物及びセンス転写産物を産生する。これにより、送達されたＲＮＡが複数の娘ＲＮＡの産生をもたらす。これらの娘ＲＮＡは、サブゲノム転写産物と同様、翻訳されて、コードされたタンパク質（例えば、調節タンパク質、例えば、免疫調節タンパク質）のｉｎ ｓｉｔｕ発現をもたらすことができるか、又は翻訳されて調節タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現をもたらす、送達されたＲＮＡと同じセンスを有する更なる転写産物を与えるように転写されてもよい。この一連の転写の全体としての結果は、自己複製ＲＮＡ分子の数の増幅であり、コードされた調節タンパク質は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞及び／又は腫瘍常在性細胞）の主要なポリペプチド産物となり得る。
幾つかの例において、上述のＤＮＡベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）のいずれかが、調節配列を含む自己複製ＲＮＡ分子をコードする。かかる自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来するレプリカーゼ配列を含み、これは標的細胞への送達後にレプリカーゼ（又はレプリカーゼ－転写酵素）へと翻訳されるプラス鎖レプリコンを有することを特徴とする。レプリカーゼは、ポリプロテインとして翻訳され、これは自己切断して、送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を与える。これらのマイナス鎖転写産物は、それ自体が転写されて、プラス鎖親ＲＮＡの更なるコピーを生じ、またサブゲノム転写産物（例えば、調節配列）を生じることができる。このように、サブゲノム転写産物の翻訳は、感染細胞による調節タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現をもたらす。
本発明のレプリカーゼをコードする配列が由来し得るアルファウイルスの非限定的な例としては、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦ）、ミデルブルグウイルス（ＭＩＤ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮ）、ロスリバーウイルス（ＲＲ）、バーマ森林ウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧ）、ベバルウイルス（ＢＥＢ）、マヤロウイルス（ＭＡＹ）、ウナウイルス（ＵＮＡ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡ）、ババンキウイルス（ＢＡＢ）、ハイランズＪウイルス（ＨＪ）、及びフォートモーガンウイルス（ＦＭ）が挙げられる。本発明の特定の例において、自己複製ＲＮＡ分子は、ＶＥＥレプリカーゼ又はその変異体を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号１又は配列番号１Ａのレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号１又は配列番号１Ａと少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号１又は配列番号１Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）核酸配列を含むレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号３又は配列番号３Ａと少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号３又は配列番号３Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）核酸配列を含むレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号５又は配列番号５Ａと少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号５又は配列番号５Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）核酸配列を含むレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号７又は配列番号７Ａと少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号７又は配列番号７Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）核酸配列を含むレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号１又は配列番号１Ａと少なくとも９５％同一の（配列番号１又は配列番号１Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第１の核酸配列と、配列番号３又は配列番号３Ａと少なくとも９５％同一の（配列番号３又は配列番号３Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第２の核酸配列と、配列番号５又は配列番号５Ａと少なくとも９５％同一の（配列番号５又は配列番号５Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第３の核酸配列と、配列番号７又は配列番号７Ａと少なくとも９５％同一の（配列番号７又は配列番号７Ａと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第４の核酸配列とを含むレプリカーゼをコードする配列を含む。幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１Ａ、配列番号３、配列番号３Ａ、配列番号５、配列番号５Ａ、配列番号７、及び配列番号７Ａを含む核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号２と少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号２と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号４と少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号４と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号６と少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号６と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号８と少なくとも９５％同一の（例えば、配列番号８と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％）同一の）アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号２と少なくとも９５％同一の（配列番号２と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第１のアミノ酸配列と、配列番号４と少なくとも９５％同一の（配列番号４と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第２のアミノ酸配列と、配列番号６と少なくとも９５％同一の（配列番号６と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第３のアミノ酸配列と、配列番号８と少なくとも９５％同一の（配列番号８と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の）第４のアミノ酸配列とをコードする。幾つかの実施形態において、レプリカーゼをコードする配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８を含むアミノ酸配列をコードする。
突然変異型又は野生型ウイルス配列を使用することができる。例えば、幾つかの例において、自己複製ＲＮＡは、ＶＥＥレプリカーゼの弱毒化ＴＣ８３突然変異体を含む。例えば、Yingzhong et al., Sci Rep. 2019, 9: 6932（その方法論が引用することにより本明細書の一部をなす）に教示されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ発生法によって得られるレプリカーゼ突然変異レプリカーゼ（例えば、突然変異ＶＥＥレプリカーゼ）を含む、レプリカーゼにおける他の突然変異が本明細書で企図される。
幾つかの例において、自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）レプリカーゼをコードする配列（例えば、自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列）と（ｉｉ）異種調節遺伝子とを含む。ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ、例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。幾つかの例において、ポリメラーゼは、ＶＥＥレプリカーゼ、例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４を含むＶＥＥレプリカーゼである。
本発明の幾つかの例において、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質）をコードしない。かかる自己複製ＲＮＡは、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを産生することができないとは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子が、それ自体を感染型で存続させることができないことを意味する。アルファウイルス構造タンパク質は、サブゲノム転写産物が、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、異種調節タンパク質（複数の場合もある）をコードするように、対象の異種調節タンパク質（複数の場合もある）をコードする遺伝子（複数の場合もある）に置き換えることができる。
したがって、幾つかの例において、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、１つ以上（例えば、２つ又は３つ）の異種調節タンパク質（例えば、本明細書に記載される免疫調節タンパク質のいずれか、又はその組合せ）をコードする。幾つかの実施形態において、ＲＮＡは、例えば、更なる異種遺伝子をコードするか、又は補助ポリペプチドをコードするために、付加的な（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有していてもよい。
好適な自己複製ＲＮＡ分子は、様々な長さを有し得る。本発明の幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子の長さは、５０００ヌクレオチド～５００００ヌクレオチド（すなわち、５ｋｂ～５０ｋｂ）である。幾つかの例において、自己複製ＲＮＡ分子は、５ｋｂ～２０ｋｂの長さ（例えば、６ｋｂ～１８ｋｂ、７ｋｂ～１６ｋｂ、８ｋｂ～１４ｋｂ、又は９ｋｂ～１２ｋｂの長さ、例えば、５ｋｂ～６ｋｂ、６ｋｂ～７ｋｂ、７ｋｂ～８ｋｂ、８ｋｂ～９ｋｂ、９ｋｂ～１０ｋｂ、１０ｋｂ～１１ｋｂ、１１ｋｂ～１２ｋｂ、１２ｋｂ～１３ｋｂ、１３ｋｂ～１４ｋｂ、１４ｋｂ～１５ｋｂ、１５ｋｂ～１６ｋｂ、１６ｋｂ～１８ｋｂ、又は１８ｋｂ～２０ｋｂの長さ、例えば、約５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１０．５ｋｂ、約１１ｋｂ、約１１．５ｋｂ、約１２ｋｂ、約１２．５ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１７ｋｂ、約１８ｋｂ、約１９ｋｂ、又は約２０ｋｂの長さ）である。
自己複製ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有していてもよい。さらに、自己複製ＲＮＡ分子は、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含んでいてもよい。
自己複製ＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知であるか、又は本明細書に記載される任意の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって作製することができる。ＩＶＴには、細菌においてプラスミド形態で作製し、伝播させるか、又は合成的に（例えば、遺伝子合成及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工学的方法によって）作製した（ｃＤＮＡ）鋳型を用いることができる。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ等）を用いて、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写することができる。適切なキャッピング反応及びポリＡ付加反応を必要に応じて用いることができる（しかし、レプリコンのポリＡは、通常はＤＮＡ鋳型内にコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチド（複数の場合もある）について厳密な要件を有することがあり、幾つかの実施形態において、ＩＶＴ転写されるＲＮＡが自己コードされるレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、これらの要件をコードされるレプリカーゼの要件と適合させる必要がある。
幾つかの例において、自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）修飾核酸塩基を有する１つ以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、自己複製ＲＮＡ分子は、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ－６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２’－β－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ－６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ－６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ－６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ－６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ－６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ－６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ－６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ－６－メチル－Ｎ－６－スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ－６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート））、Ｉ（イノシン）、ｍ１１（１－メチルイノシン）、ｍ’Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ－４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－β－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート））、ｙＷ（ウイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシウイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシウイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（修飾不十分な（undermodified）ヒドロキシウイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（ケウオシン）、ｏＱ（エポキシケウオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル－ケウオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－ケウオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ－４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６ Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２ Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（（１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン（irinomethyluridine））、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン）、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、又はａｃ６Ａ（Ｎ－６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、又は脱塩基ヌクレオチドを含み得る。例えば、自己複製ＲＮＡ分子は、シュードウリジン残基及び／又は５－メチルシトシン残基等の１つ以上の修飾ピリミジン核酸塩基を含み得る。
本発明の他の実施形態において、自己複製ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレアーゼを有するヌクレオチドを実質的に含まない。例えば、幾つかの例において、自己複製ＲＮＡ分子は、修飾核酸塩基を含まず、修飾ヌクレオチドを含まなくてもよく、すなわち、ＲＮＡ中のヌクレオチドの全てが、標準的なＡ、Ｃ、Ｇ及びＵリボヌクレオチドである（７’－メチルグアノシンを含み得る任意の５’キャップ構造を除く）。
幾つかの例において、自己複製ＲＮＡは、ヌクレオシド間にホスホジエステル結合のみを含む。幾つかの例において、自己複製ＲＮＡは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、及び／又はメチルホスホネート結合を含む。本明細書に記載されるポリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子のいずれにおいても、切断部位をタンパク質コード領域間に設計することができる。
特定の実施形態において、本発明によるＲＮＡは、ルシフェラーゼ等のレポーター分子、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードしない。
幾つかの実施形態において、自己複製ＲＮＡによってコードされる異種タンパク質は、本明細書に記載される異種タンパク質のいずれかの変異体である。付加的又は代替的には、自己複製ＲＮＡによってコードされるレプリカーゼは、本明細書に記載されるレプリカーゼのいずれかの変異体であり得る。幾つかの実施形態において、変異体は、機能的断片（例えば、そのタンパク質と機能的に同様又は機能的に同等のタンパク質の断片）である。
医薬組成物
本明細書に記載される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子）のいずれかを薬学的に許容可能な担体中に有する医薬組成物が本明細書に提供される。このため、幾つかの例において、本発明の医薬組成物は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）及び１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子（例えば、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む免疫調節配列（例えば、複数の転写単位を有する免疫調節配列、又はポリシストロン性免疫調節配列）を有する核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子）を薬学的に許容可能な担体中に含む。
他の例において、本発明の医薬組成物は、１つ以上の核酸ベクター（例えば、それぞれが異なる免疫調節遺伝子をコードする１つ以上の環状ＤＮＡベクター、例えば、不均一組成核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター））を含む。例えば、かかる例において、本発明の医薬組成物は、２つ以上（例えば、２つ又は３つ）の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、各ベクターは、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）若しくはケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）又は樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、（ａ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
上述の医薬組成物のいずれにおいても、免疫調節配列は、自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼコード配列を含む自己複製ＲＮＡコード配列内にあり得る。
幾つかの例において、医薬組成物は、２つの自己複製ＲＮＡ分子を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列、及び（ｂ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列、及び（ｂ）リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、３つの自己複製ＲＮＡ分子を薬学的に許容可能な担体中に含み、ここで、（ｉ）第１の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列、及び（ｂ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列、及び（ｂ）樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含み、（ｉｉｉ）第３の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列、及び（ｂ）リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。薬学的に許容可能な担体は、用いられる投与量及び濃度で個体に対して非毒性の賦形剤及び／又は安定化剤を含み得る。幾つかの実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。薬学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はｔｗｅｅｎ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びｐｌｕｒｏｎｉｃ等の非イオン界面活性剤が挙げられる。
本発明の自己複製ＲＮＡ分子を有する医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含有し得る。組成物を液体形態で提供する場合、担体は、水（例えば、パイロジェンフリー水）、等張食塩水、又は緩衝水溶液、例えば、リン酸緩衝溶液又はクエン酸緩衝溶液であり得る。医薬組成物の注射は、水、又は例えば、ナトリウム塩（例えば、少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩）、カルシウム塩（例えば、少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩）、若しくはカリウム塩（例えば、少なくとも３ｍＭのカリウム塩）を含有する水性緩衝液等の緩衝液中で行うことができる。特定の実施形態によると、ナトリウム塩、カルシウム塩、又はカリウム塩は、それらのハロゲン化物、例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物の形態、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩等の形態で生じ得る。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ２、ＮａＨＣＯ２、及びＮａ２ＳＯ４が挙げられる。カリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ２、ＫＨＣＯ２、及びＫ２ＳＯ４が挙げられる。カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ２、ＣａＳＯ４、及びＣａ（ＯＨ）２が挙げられる。さらに、上述のカチオンの有機アニオンが緩衝液中に含有されていてもよい。特定の実施形態によると、上で定義された注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含有していてもよく、更なるアニオンが存在していてもよい。ＣａＣｌ２をＫＣｌ等の別の塩に置き換えることもできる。幾つかの実施形態において、注射緩衝液中の塩は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の濃度で存在する。注射緩衝液は、特定の参照媒体を基準にして高張、等張、又は低張であってもよく、すなわち、緩衝液は、特定の参照媒体を基準にして、より高い、同一の又はより低い塩含有量を有していてもよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果による細胞の損傷を引き起こさない濃度の上述の塩が使用され得る。参照媒体は、血液、リンパ液、細胞質液、他の体液、又は一般的な緩衝液等の液体であり得る。かかる一般的な緩衝液又は液体は、当業者に既知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
１つ以上の適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤、又は封入化合物が個体（person）への投与に適し得る。本発明による医薬組成物の構成成分は、典型的な使用条件下で本発明による（医薬）組成物の薬学的有効性を大幅に低下させる相互作用が生じないような方法で、本明細書において定義される本発明による核酸ベクターと混合することが可能である。薬学的に許容可能な担体、充填剤及び希釈剤は、治療される個体への投与に適したものとなるように、十分に高い純度及び十分に低い毒性を有し得る。薬学的に許容可能な担体、充填剤、又はその構成成分として使用することができる化合物の幾つかの例は、ラクトース、グルコース、トレハロース、及びスクロース等の糖；トウモロコシデンプン若しくはジャガイモデンプン等のデンプン；デキストロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；獣脂；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等の固体流動促進剤；硫酸カルシウム；ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びカカオ由来の油等の植物油；ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール等のポリオール；又はアルギン酸である。
薬学的に許容可能な担体の選択は、医薬組成物を投与する方法に応じて決定することができる。
注射に適した単位投与形態としては、水、生理食塩水、及びそれらの混合物の滅菌溶液が挙げられる。かかる溶液のｐＨは、約７．４に調整することができる。注射に適した担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用に適した薬学的に許容可能な担体には、ローション、クリーム、ゲル等への使用に適したものが含まれる。医薬組成物を経口投与する場合、錠剤、カプセル等が好ましい単位投与形態である。
医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、ｔｗｅｅｎ等の乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、着色剤、医薬担体、安定化剤、酸化防止剤、及び防腐剤である。
本発明による医薬組成物は、液体で、又は乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供され得る。特定の実施形態において、医薬組成物の核酸ベクターは、凍結乾燥形態で提供される。本発明の核酸ベクターを含む凍結乾燥組成物は、投与前に、有利には水性担体をベースとする好適な緩衝液、例えば、乳酸リンゲル液、リンゲル液、又はリン酸緩衝溶液中で再構成することができる。
本発明の或る特定の実施形態において、本発明の核酸ベクターのいずれかを、１つ以上のカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物、例えば、カチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー、カチオン性若しくはポリカチオン性のペプチド若しくはタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性若しくはポリカチオン性の多糖、及び／又はカチオン性若しくはポリカチオン性の脂質と複合体形成させることができる。
特定の実施形態によると、本発明の核酸ベクターを脂質と複合体形成させて、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を形成することができる。したがって、一実施形態において、本発明の組成物は、核酸ベクターを含むリポソーム、リポプレックス、及び／又は脂質ナノ粒子を含む。
脂質ベースの配合物は、その生体適合性及びその大規模生産の容易さから、核酸ベクターの効果的な送達系であり得る。カチオン性脂質は、核酸の送達のための合成材料として広く研究されている。混合後に、核酸がカチオン性脂質によって縮合され、リポプレックスとして知られる脂質／核酸複合体が形成される。これらの脂質複合体は、ヌクレアーゼの作用から遺伝物質を保護し、負に帯電した細胞膜と相互作用することによって遺伝物質を細胞内に送達することができる。リポプレックスは、正に帯電した脂質と負に帯電した核酸とを生理的ｐＨで直接混合することによって作製することができる。
従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、又は中性のリン脂質とコレステロールとで構成され得る脂質二重層を含み、脂質二重層が水性コアを取り囲む。脂質二重層及び水性空間はどちらも、それぞれ疎水性又は親水性の化合物を組み込むことができる。リポソームの特性及びｉｎ ｖｉｖｏでの挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソーム表面に付加して、立体安定化をもたらすことによって変更することができる。さらに、リポソームは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）を、その表面に又は付着させるＰＥＧ鎖の末端に付着させることによって特異的標的化に使用することができる。
リポソームは、水性コンパートメントを取り囲むリン脂質二重層で構成されたコロイド状の脂質ベース及び界面活性剤ベースの送達系である。リポソームは、球形の小胞として存在することができ、サイズは２０ｎｍ～数ミクロンの範囲であり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、負に帯電した核酸と静電相互作用によって複合体形成させることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ臨床用途に必要とされる生体適合性、低毒性、及び大規模生産の可能性をもたらす複合体を生じる。リポソームは、取込みのために原形質膜と融合することができる。細胞内に入ると、リポソームがエンドサイトーシス経路によってプロセシングされ、遺伝物質が続いてエンドソーム／担体から細胞質へと放出される。
カチオン性リポソームは、ＲＮＡの送達系として機能することができる。ＭＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）等のカチオン性脂質は、負に帯電した核酸と静電相互作用によって複合体又はリポプレックスを形成して、ナノ粒子を形成することができ、高いｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率をもたらす。さらに、核酸ベクター送達のための中性脂質ベースのナノリポソーム、例えば、中性１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）ベースのナノリポソームが利用可能である。
このため、本発明の一実施形態において、本発明の核酸ベクターをカチオン性脂質及び／又は中性脂質と複合体形成させ、それによりリポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス又は中性脂質ベースのナノリポソームを形成する。
特定の実施形態において、本発明による医薬組成物は、カチオン性若しくはポリカチオン性の化合物、及び／又はポリマー担体とともに配合される本発明の核酸ベクターを含む。したがって、本発明の更なる実施形態において、本明細書において定義される核酸ベクターは、任意に約５：１（ｗ／ｗ）～約０．２５：１（ｗ／ｗ）、例えば、約５：１（ｗ／ｗ）～約０．５：１（ｗ／ｗ）、例えば、約４：１（ｗ／ｗ）～約１：１（ｗ／ｗ）若しくは約３：１（ｗ／ｗ）～約１：１（ｗ／ｗ）、例えば、約３：１（ｗ／ｗ）～約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される核酸ベクターとカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物及び／又はポリマー担体との重量比で、又は任意に約０．１～１０の範囲、例えば、約０．３～４若しくは０．３～１の範囲、例えば、約０．５～１若しくは０．７～１の範囲、例えば、約０．３～０．９若しくは０．５～０．９の範囲の核酸ベクターとカチオン性若しくはポリカチオン性の化合物及び／又はポリマー担体との窒素／リン酸（Ｎ／Ｐ）比で、カチオン性若しくはポリカチオン性の化合物又はポリマー担体と会合又は複合体形成させる。例えば、核酸ベクターと１つ以上のポリカチオンとのＮ／Ｐ比は、約０．３～４、約０．５～２、約０．７～２及び約０．７～１．５の範囲を含む約０．１～１０の範囲である。
本明細書に記載される核酸ベクターは、トランスフェクション効率及び／又は本発明による調節遺伝子の発現を増加させるためのビヒクル、トランスフェクション剤又は複合体形成剤と会合させることもできる。
幾つかの例において、本発明による核酸ベクターを１つ以上のポリカチオン、好ましくはプロタミン又はオリゴフェクタミンと複合体形成させる。トランスフェクション剤又は複合体形成剤として使用され得る更なるカチオン性又はポリカチオン性の化合物としては、カチオン性多糖、例えばキトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ：［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ－Ｃ１４－アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＬＥＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＭＡＰ：ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ－６－１４：Ｏ，Ｏ－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ－［（２，３－ジオクタデシルオキシプロピル）（２－ヒドロキシエチル）］－ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピル－オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピル－オキシスクシニルオキシ）エチル］－トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー、例えば修飾ポリアミノ酸、例えばβ－アミノ酸ポリマー若しくは逆ポリアミド等、修飾ポリエチレン、例えばＰＶＰ（ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド））等、修飾アクリレート、例えばｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））等、修飾アミドアミン、例えばｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等、修飾ポリβ－アミノエステル（ＰＢＡＥ）、例えばジアミン末端修飾１，４－ブタンジオールジアクリレート－ｃｏ－５－アミノ－１－ペンタノールポリマー等、デンドリマー、例えばポリプロピルアミンデンドリマー若しくはｐＡＭＡＭベースのデンドリマー等、ポリイミン（類）、例えばＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等、ポリアリルアミン、糖骨格ベースのポリマー、例えばシクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサン等、シラン骨格ベースのポリマー、例えばＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳコポリマー等、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば上述のようなカチオン性ポリマーから選択される）と１つ以上の親水性若しくは疎水性のブロック（例えばポリエチレングリコール）との組合せからなるブロックポリマー等を挙げることができる。
特定の実施形態によると、本発明の医薬組成物は、ポリマー担体内に封入されるか、又はポリマー担体に付着した核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を含む。本発明に従って使用されるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されたポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋カチオン性成分は、互いに同じであっても、又は異なっていてもよい。ポリマー担体は、更なる成分を含有することもできる。本発明に従って使用されるポリマー担体が、本明細書に記載されるようにジスルフィド結合によって架橋された、カチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマー、及び任意に本明細書において定義される更なる成分の混合物を含むことも特に好ましい。この文脈において、国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示が引用することにより本明細書の一部をなす。この文脈において、ジスルフィド架橋によってポリマー担体の基礎を形成するカチオン性成分は、通例、この目的に適した任意の好適なカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマー、特に本明細書において定義される核酸ベクター又は組成物に含まれる更なる核酸と複合体形成し、それにより好ましくは核酸ベクターを縮合させることが可能な任意のカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーから選択される。カチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーは、直鎖状分子であってもよいが、分岐したカチオン性又はポリカチオン性のペプチド、タンパク質又はポリマーを使用することもできる。
本発明の医薬組成物の一部として含まれる、本発明による核酸ベクターを複合体形成させるために使用され得る、ポリマー担体の全てのジスルフィド架橋のカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質、ペプチド又はポリマーは、本明細書において言及されるようなポリマー担体のカチオン性成分としての少なくとも１つの更なるカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質、ペプチド又はポリマーとの縮合の際にジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも１つのＳＨ部分（例えば、少なくとも１つのシステイン残基、又はＳＨ部分を示す任意の更なる化学基）を含み得る。
本発明の核酸ベクターを複合体形成させるために使用される、かかるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性（又はポリカチオン性）成分によって形成され得る。特に、少なくとも１つのＳＨ部分を含むか、又は少なくとも１つのＳＨ部分を含むように付加的に修飾されたポリマー担体のかかるカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質又はポリマーは、複合体形成剤としてタンパク質、ペプチド、及びポリマーから選択することができる。
他の実施形態において、本発明による医薬組成物は、任意の更なるビヒクル、トランスフェクション剤、又は複合体形成剤と会合させることなく裸で投与され得る。
本明細書に提供される医薬組成物は、治療される特定の癌にとって必要な場合に２つ以上の有効成分を含有していてもよい。例えば、幾つかの例において、本明細書に記載される医薬組成物のいずれかが、付加的な治療剤、例えば抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体薬物複合体、癌ワクチン、又はそれらの組合せ）を含み得る。特定の実施形態において、付加的な治療剤は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１アンタゴニスト又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、例えばペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、又はＡＭＰ－２２４）である。幾つかの実施形態において、抗癌剤は、ＢＣＬ－２阻害剤（ＧＤＣ－０１９９／ＡＢＴ－１９９等）、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（商標））、ＰＩ３Ｋ－δ阻害剤（イデラリシブ（ＺＹＤＥＬＩＧ（商標））等）、アゴニスト（例えば、活性化共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、又はＩＬＡとしても知られる）、ＣＤ２７（例えば、ＣＤＸ－１１２７）、ＨＶＥＭ、又はＣＤ１２７に対するアゴニスト抗体）、アンタゴニスト、例えば、阻害性共刺激分子、例えば、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ（例えば、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴとしても知られる））、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＧＩＴＲ（例えば、ＴＲＸ５１８）又はアルギナーゼに対するアンタゴニスト抗体、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、又はＹＥＲＶＯＹ（商標）としても知られる）、トレメリムマブ（チシリムマブ又はＣＰ－６７５，２０６としても知られる）、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３としても知られる）、ＭＧＡ２７１、ＴＧＦβに対するアンタゴニスト、例えば、メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２としても知られる）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８としても知られる）、ＬＹ２１５７２９９ｋ、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、すなわちＣＴＬ）の養子移入、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβＩＩ型受容体を含むＴ細胞の養子移入である。
ＩＩＩ．治療方法
核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子）、又はその組成物のいずれかを治療有効量で個体に投与することによって、治療を必要とする個体において癌を治療する方法が本明細書に提供される。特定の例において、核酸ベクターの治療効果（例えば、腫瘍微小環境の免疫調節）は、腫瘍微小環境への電界の伝達後に生じる。
核酸ベクター及びその組成物の投与
本発明は、本明細書に記載される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター及び自己複製ＲＮＡ分子）、又はその医薬組成物を、癌を有する個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含む。幾つかの実施形態において、（例えば、医薬組成物又は本明細書に記載される治療方法のいずれかの一部として）投与される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、上記のポリシストロン性核酸ベクターのいずれかである。例えば、本発明の方法は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）及び１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子（例えば、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含むポリシストロン性（例えば、バイシストロン性又はトリシストロン性）免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクターを個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含む。このため、特定の例において、本発明の方法は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）；ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）；又はＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含む。
本発明の代替的な方法は、複数の転写単位を含む免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクターを個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含み、ここで、１つの転写単位が樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含み、別の転写単位が１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子（例えば、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。このため、特定の例において、本発明の方法は、第１の転写単位がＸＣＬ１をコードする遺伝子を含み、第２の転写単位がＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子を含み、第３の転写単位がＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む、３つの転写単位を含む免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）；第１の転写単位がＸＣＬ１をコードする遺伝子を含み、第２の転写単位がＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子を含み、第３の転写単位がＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む、３つの転写単位を含む免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）；又は第１の転写単位がＸＣＬ１をコードする遺伝子を含み、第２の転写単位がＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、第３の転写単位がＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む３つの転写単位を含む免疫調節配列を含む免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含む。
他の例において、本発明の治療方法は、１つ以上のモノシストロン性核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含む。例えば、かかる例において、本発明の方法は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）、樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）、又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を有する１つ以上の免疫調節核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を個体（例えば、ヒト癌患者）に投与することを含む。
幾つかの実施形態において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）又は樹状細胞の成長因子若しくは活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ２をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ４をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子）を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの例において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＣＬ５をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、２つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、（ａ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（例えば、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＸＣＬ２をコードする遺伝子、ＣＣＬ５をコードする遺伝子、又はＣＣＬ４をコードする遺伝子）を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、又はＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子）を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（例えば、サイトカインをコードする遺伝子（例えば、ＩＬ－１２をコードする遺伝子又はＩＬ－１５をコードする遺伝子）又はケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子又はＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子））を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、薬学的に許容可能な担体中に、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＦＬＴ３をコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、方法は、３つの核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を投与することを含み、ここで、（ｉ）第１の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子を含む免疫調節配列（例えば、モノシストロン性免疫調節配列）を含み、（ｉｉ）第２の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子を含み、（ｉｉｉ）第３の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子を含む。
上述の方法のいずれにおいても、免疫調節配列は、自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼコード配列を含む自己複製ＲＮＡコード配列内にあり得る。
様々な投与経路が本発明によって提供される。特定の実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物は、腫瘍内に投与される。他の実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物は、腫瘍周囲に投与される。他の実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物は、真皮下（例えば、腫瘍近くの真皮下）に投与される。他の実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその組成物は、全身的（例えば、静脈内）に投与される。
幾つかの例において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の単回注射が、治療の過程にわたって個体に投与される。幾つかの実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の単回注射が、個体に腫瘍内投与される。
核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物は、単回投与として投与することができる。代替的には、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物は、治療の過程にわたって複数回投与（例えば、２回以上の投与、３回以上の投与、４回以上の投与、５回以上の投与、６回以上の投与、例えば、２回の投与、３回の投与、４回の投与、５回の投与、又は６回の投与）で投与することができる。
幾つかの実施形態において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、若しくは１０週間に１回、若しくは１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、若しくは３ヶ月に１回、又はそれ以下の頻度である。療法の進行（例えば、腫瘍微小環境の調節）は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される方法に従って容易にモニタリング（例えば、検出又は定量化）することができる。核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与計画は、時間とともに変更することができる。
本明細書に記載される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与量は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の１回以上の投与を受けた個体において経験的に決定することができる。個体に核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の漸増投与量を与える。核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の有効性を評定するために、疾患／障害の指標をモニタリングすることができる。数日以上にわたる反復投与については、病態に応じて、腫瘍微小環境の調節の所望のレベルが達成されるまで治療を持続させる。
幾つかの例において、本明細書に記載される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の適切な投与量は、特定の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）、癌のタイプ及び重症度、以前の療法、個体の病歴及び核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）に対する応答、及び主治医の裁量によって決まる。臨床医は、所望の結果（例えば、腫瘍微小環境の調節であり、本明細書において定義される）を達成する投与量に達するまで核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）、又はその医薬組成物を投与することができる。幾つかの実施形態において、所望の結果は、腫瘍進行に関連するバイオマーカーの発現レベルの減少、又は腫瘍クリアランスに関連するバイオマーカー（例えば、免疫調節タンパク質）の発現レベルの増加である。他の実施形態において、所望の結果は、腫瘍負荷の減少、腫瘍細胞数若しくは代謝活性の減少、又は免疫細胞活性の増加である。投与量が所望の結果をもたらしたかを決定する更なる方法は、当業者に明らかである。１つ以上の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の投与は、例えば、個体の生理的状態及び当業者に既知の他の要因に応じて連続的又は断続的であり得る。核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の投与は、予め選択された時間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は例えば、標的の疾患若しくは障害を発症する前、その最中、若しくはその後のいずれかで一連の間隔を空けた投与であってもよい。
一般命題として、ヒトに投与する核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の治療有効量は、１．０ｐｇ～１ｍｇの核酸（例えば、０．０１ｎｇ～１００μｇ、０．１ｎｇ～５０μｇ、１ｎｇ～１０μｇ、又は１０ｎｇ～１μｇ、例えば、０．０１ｎｇ～０．０５ｎｇ、０．０５ｎｇ～０．１ｎｇ、０．１ｎｇ～０．５ｎｇ、０．５ｎｇ～１ｎｇ、１ｎｇ～５ｎｇ、５ｎｇ～１０ｎｇ、１０ｎｇ～５０ｎｇ、５０ｎｇ～１００ｎｇ、１００ｎｇ～５００ｎｇ、５００ｎｇ～１μｇ、１μｇ～５μｇ、又は５μｇ～１０μｇ、例えば、約１ｐｇ、約５ｐｇ、約１０ｐｇ、約２０ｐｇ、約２５ｐｇ、約５０ｐｇ、約７５ｐｇ、約１００ｐｇ、約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約２５ｎｇ、約５０ｎｇ、約７５ｎｇ、約１００ｎｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、約７５μｇ、約１００μｇ、又は約５００μｇ）の範囲であり得る。
本発明の治療には、治療される特定の癌に適した１つ以上の付加的な治療剤（例えば、抗癌剤）の投与が含まれていてもよい。例えば、化学療法剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、及び／又は抗ホルモン剤から選択される付加的な治療剤（例えば、抗癌剤）を更に投与することが望ましい場合がある。
電界の伝達
本発明の幾つかの態様において、電界は腫瘍微小環境内に伝達される。腫瘍微小環境内に伝達された電界は、腫瘍微小環境内の標的細胞（例えば、腫瘍細胞又は腫瘍浸潤免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球又は腫瘍常在性抗原提示細胞（例えば、腫瘍常在性樹状細胞）））への核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の導入を促進することができる。このような電界媒介核酸導入（エレクトロトランスファー）を、電気泳動、動電駆動された薬物取り込み、及び／又はエレクトロポレーションを含む幾つかの機構のいずれか１つ（及びそれらの組合せ）を通じて行うことができる。理論に縛られるものではないが、或る特定の例において、腫瘍微小環境内に伝達される電界は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）によって伝えられる抗腫瘍適応免疫を促進することができる。哺乳動物組織における核酸のエレクトロトランスファー用の電界を生成する適切な手段は当該技術分野において知られており、当該技術分野において知られる又は本明細書に記載されるあらゆる適切な手段を、本発明の一部として使用するのに適合させることができる。
エレクトロトランスファーに適した電界は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与時又は投与に近い時点で（例えば、同じ手順の一部として）腫瘍微小環境に伝達され得る。例えば、本発明は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の１時間以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の５５分以内、５０分以内、４５分以内、４０分以内、３５分以内、３０分以内、２５分以内、２０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、４分以内、３分以内、２分以内、９０秒以内、６０秒以内、４５秒以内、３０秒以内、２０秒以内、１５秒以内、１０秒以内、９秒以内、８秒以内、７秒以内、６秒以内、５秒以内、４秒以内、３秒以内、２秒以内、又は１秒以内に）（例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）若しくはその医薬組成物の投与と同時に、又は投与後であるが、上述の期間のいずれかの範囲内に）電界が伝達される方法を含む。幾つかの実施形態において、電界は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の２４時間以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の２２時間以内、２０時間以内、１８時間以内、１６時間以内、１４時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、９０分以内、６０分以内、４５分以内、３０分以内、２０分以内、１５分以内、１０分以内、８分以内、６分以内、５分以内、４分以内、３分以内、又は２分以内に）伝達される。幾つかの実施形態において、電界は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の７日以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与の６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、又は２日以内に）伝達される。
本明細書において、電界を発生させ、腫瘍微小環境に伝達する様々な手段が本発明の方法の一部として企図される。哺乳動物組織において電界を（例えば、エレクトロトランスファーに適した条件で）伝達するのに適した電極を備えるデバイス及びシステムは市販されており、本明細書に開示される方法において有用であり得る。幾つかの例において、電界は、１つ以上のニードルを備えた電極（例えば、腫瘍の内部（腫瘍内）又は腫瘍の近く（腫瘍周囲）に配置された１つ以上のニードル、例えば、シングルニードル電極、マルチニードル電極、又はニードルアレイ電極）を介して伝達される。適切なニードル電極としては、IGEA（商標）によって販売されるＣＬＩＮＩＰＯＲＡＴＯＲ（商標）電極及びAMBU（商標）によって販売されるニードル電極が挙げられる。このようなニードル電極は、表在性腫瘍又は上皮表面を越えたところ（例えば、体外）からアクセス可能な腫瘍（例えば、黒色腫、癌腫、又は肉腫（例えば、頭頸部腫瘍））、例えば上皮表面から４ｃｍ以内（例えば、上皮表面から３ｃｍ以内、上皮表面から２ｃｍ以内、又は上皮表面から１ｃｍ以内、例えば上皮表面から１ｃｍ～４ｃｍ、上皮表面から１ｃｍ～３ｃｍ、上皮表面から１ｃｍ～２ｃｍ、上皮表面から２ｃｍ～４ｃｍ、上皮表面から２ｃｍ～３ｃｍ、又は上皮表面から３ｃｍ～４ｃｍ）に（全体的に又は部分的に）位置する腫瘍内に電界を伝達するように構成されていてもよい。
他の例において、電界は、非ニードル型電極（例えば、ピンセット型電極（例えば、ＢＴＸ（商標）ツイーザートロード（tweezertrodes））、プレート型電極、又はノギス型電極）を介して伝達される。このような非ニードル型電極は、腫瘍（例えば、表在性腫瘍又は上皮表面を越えたところ（例えば、体外）からアクセス可能な腫瘍（例えば、黒色腫、癌腫、又は肉腫（例えば、頭頸部腫瘍））、例えば上皮表面から４ｃｍ以内（例えば、上皮表面から３ｃｍ以内、上皮表面から２ｃｍ以内、又は上皮表面から１ｃｍ以内、例えば上皮表面から１ｃｍ～４ｃｍ、上皮表面から１ｃｍ～３ｃｍ、上皮表面から１ｃｍ～２ｃｍ、上皮表面から２ｃｍ～４ｃｍ、上皮表面から２ｃｍ～３ｃｍ、又は上皮表面から３ｃｍ～４ｃｍ）に（全体的に又は部分的に）位置する腫瘍）内に電界を低侵襲性又は非侵襲性に伝達するように構成されていてもよい。適切な電極としては、単極電極（例えば、単極ニードル電極）及び双極電極（例えば、双極ピンセット型電極、双極プレート型電極、双極ノギス型電極、又は双極マルチニードル電極）が挙げられる。
エレクトロトランスファーに適した電界は、あらゆる適切な電圧、波形、周波数等を有することができる。本明細書において記載される電界を伝達する方法のいずれかの幾つかの実施形態において、パルス電界が伝達される。エレクトロトランスファーに適したパルス電界は、様々な電圧、波形、及び周波数で伝達され得る。幾つかの例において、パルス電界は、０．００１ミリ秒～１００ミリ秒（例えば、０．００５ミリ秒～５０ミリ秒、０．０５ミリ秒～２５ミリ秒、又は０．１ミリ秒～５ミリ秒、例えば０．００１ミリ秒～０．０１ミリ秒、０．０１ミリ秒～０．１ミリ秒、０．１ミリ秒～１．０ミリ秒、１ミリ秒～２ミリ秒、２ミリ秒～４ミリ秒、４ミリ秒～６ミリ秒、６ミリ秒～１０ミリ秒、１０ミリ秒～２０ミリ秒、２０ミリ秒～５０ミリ秒、又は５０ミリ秒～１００ミリ秒、例えば約０．００５ミリ秒、約０．０１ミリ秒、約０．０５ミリ秒、約０．１ミリ秒、約０．５ミリ秒、約０．６ミリ秒、約０．７ミリ秒、約０．８ミリ秒、約０．９ミリ秒、約１ミリ秒、約１．５ミリ秒、約２ミリ秒、約２．５ミリ秒、約３ミリ秒、約４ミリ秒、約５ミリ秒、約６ミリ秒、約７ミリ秒、約８ミリ秒、約９ミリ秒、約１０ミリ秒、約１２ミリ秒、約１５ミリ秒、約２０ミリ秒、約２５ミリ秒、約３０ミリ秒、約３５ミリ秒、約４０ミリ秒、約５０ミリ秒、約６０ミリ秒、約７０ミリ秒、約８０ミリ秒、約９０ミリ秒、又は約１００ミリ秒）のパルス持続時間を有する一連のパルスにおいて伝達される。
幾つかの実施形態において、パルス電界は、２個～１００個のパルス（例えば、４個～５０個のパルス、５個～４０個のパルス、６個～３０個のパルス、７個～２５個のパルス、又は８個～２０個のパルス、例えば１個～５個のパルス、５個～１０個のパルス、８個～１２個のパルス、１０個～１５個のパルス、１５個～２０個のパルス、２０個～５０個のパルス、又は５０個～１００個のパルス）を含む。パルスは、矩形波、正弦波、又は鋸歯状波等のあらゆる適切な波形を有してもよい。幾つかの実施形態において、パルス電界は或る周波数で送達される。
パルス電界の伝達を含む方法の上述の実施形態のいずれかの幾つかにおいて、１個以上のパルスのエネルギー（例えば、標的組織での電圧）は、５０Ｖ～１００００Ｖ（例えば、１００Ｖ～５０００Ｖ、２００Ｖ～４０００Ｖ、３００Ｖ～３０００Ｖ、４００Ｖ～２０００Ｖ、５００Ｖ～１５００Ｖ、又は６００Ｖ～１００Ｖ、例えば１００Ｖ～２００Ｖ、２００Ｖ～３００Ｖ、３００Ｖ～４００Ｖ、４００Ｖ～５００Ｖ、５００Ｖ～６００Ｖ、６００Ｖ～７００Ｖ、７００Ｖ～８００Ｖ、８００Ｖ～９００Ｖ、９００Ｖ～１０００Ｖ、１０００Ｖ～１５００Ｖ、１５００Ｖ～２０００Ｖ、２０００Ｖ～３０００Ｖ、３０００Ｖ～５０００Ｖ、又は５０００Ｖ～１００００Ｖ、例えば約１００Ｖ、約１５０Ｖ、約２００Ｖ、約２５０Ｖ、約３００Ｖ、４００Ｖ、５００Ｖ、６００Ｖ、７００Ｖ、８００Ｖ、９００Ｖ、１０００Ｖ、１５００Ｖ、約２０００Ｖ、約３０００Ｖ、約４０００Ｖ、約５０００Ｖ、約６０００Ｖ、約７０００Ｖ、約８０００Ｖ、約９０００Ｖ、又は約１００００Ｖ）である。幾つかの例において、１個以上（例えば、全て）のパルスの振幅は、５０Ｖ～１００００Ｖ（例えば、１００Ｖ～５０００Ｖ、２００Ｖ～４０００Ｖ、３００Ｖ～３０００Ｖ、４００Ｖ～２０００Ｖ、５００Ｖ～１５００Ｖ、又は６００Ｖ～１００Ｖ、例えば１００Ｖ～２００Ｖ、２００Ｖ～３００Ｖ、３００Ｖ～４００Ｖ、４００Ｖ～５００Ｖ、５００Ｖ～６００Ｖ、６００Ｖ～７００Ｖ、７００Ｖ～８００Ｖ、８００Ｖ～９００Ｖ、９００Ｖ～１０００Ｖ、１０００Ｖ～１５００Ｖ、１５００Ｖ～２０００Ｖ、２０００Ｖ～３０００Ｖ、３０００Ｖ～５０００Ｖ、又は５０００Ｖ～１００００Ｖ、例えば約１００Ｖ、約１５０Ｖ、約２００Ｖ、約２５０Ｖ、約３００Ｖ、４００Ｖ、５００Ｖ、６００Ｖ、７００Ｖ、８００Ｖ、９００Ｖ、１０００Ｖ、１５００Ｖ、約２０００Ｖ、約３０００Ｖ、約４０００Ｖ、約５０００Ｖ、約６０００Ｖ、約７０００Ｖ、約８０００Ｖ、約９０００Ｖ、又は約１００００Ｖ）である。上述の電圧のいずれかが、矩形波形のトップ、正弦波形のピーク、鋸歯状波形のピーク、正弦波形の二乗平均平方根（ＲＭＳ）電圧、又は鋸歯状波形のＲＭＳ電圧であり得る。
エレクトロトランスファーに適した電界は、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与部位又は投与部位付近で伝達され得る。例えば、幾つかの実施形態において、電界を、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物が投与される腫瘍微小環境と同じ腫瘍微小環境に伝達する。幾つかの例において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物を、電界に曝露される（又は、電界伝達が後続する場合には電界に曝露される予定の）位置に送達する。幾つかの実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物を、最大組織電圧の１％以上（例えば、最大組織電圧の少なくとも５％、最大組織電圧の少なくとも１０％、最大組織電圧の少なくとも２０％、最大組織電圧の少なくとも３０％、最大組織電圧の少なくとも４０％、最大組織電圧の少なくとも５０％、最大組織電圧の少なくとも６０％、最大組織電圧の少なくとも７０％、最大組織電圧の少なくとも８０％、又は最大組織電圧の少なくとも９０％、例えば最大組織電圧の１％～１０％、最大組織電圧の１０％～２０％、最大組織電圧の２０％～３０％、最大組織電圧の３０％～４０％、最大組織電圧の４０％～５０％、最大組織電圧の５０％～６０％、最大組織電圧の６０％～７０％、最大組織電圧の７０％～８０％、最大組織電圧の８０％～９０％、最大組織電圧の９０％～９５％、又は最大組織電圧の９５％～１００％）である電圧に曝露される（又は曝露される予定の）位置に伝達する。幾つかの例において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物を腫瘍内投与する（例えば、電界が送達される腫瘍と同じ腫瘍（例えば、同じ腫瘍微小環境）において腫瘍内投与する）。幾つかの例において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物を腫瘍周囲投与する。
代替的には、投与部位は電界から離れた組織領域であり得る。例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物の投与は全身投与（例えば、静脈内投与）であり得るのに対し、電界は腫瘍に伝達される。幾つかの実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその医薬組成物を非腫瘍組織に投与する（例えば、筋肉内投与、皮下投与、又は真皮下投与する）。
追加の療法
本明細書において提供される治療方法の或る特定の実施形態において、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）又はその組成物の投与と併せて、例えば電界の伝達の代わりに又は電界の伝達と組み合わせて１つ以上の追加の療法を施す。例示的な追加の療法としては、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与）、又は抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ）等の抗癌療法が挙げられる。したがって、幾つかの例において、本発明は、核酸ベクター（例えば、本明細書に記載される環状ＤＮＡベクター（例えば、モノシストロン性又はポリシストロン性（例えば、バイシストロン性又はトリシストロン性）核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）、又は多数の転写単位を有する核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター））のいずれかを、放射線療法（例えば、細胞傷害性放射線療法）、光線力学的療法、温熱療法、又は腫瘍溶解療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）と組み合わせて投与するあらゆる方法を含み、ここで、放射線療法、光線力学的療法、温熱療法、又は腫瘍溶解療法は、あらゆる既知の又は容易に入手可能なプロトコルに従って（例えば、電界の伝達の代わりに）施される。
幾つかの実施形態において、追加の療法は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗体－薬物コンジュゲート、癌ワクチン、又はそれらの組合せ）等の追加の療法剤である。特定の実施形態において、追加の療法は化学療法剤である。他の特定の実施形態において、付加的な療法は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１アンタゴニスト又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、例えばペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、又はＡＭＰ－２２４）である。幾つかの実施形態において、付加的な療法は、ＢＣＬ－２阻害剤（ＧＤＣ－０１９９／ＡＢＴ－１９９等）、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（商標））、ＰＩ３Ｋ－δ阻害剤（イデラリシブ（ＺＹＤＥＬＩＧ（商標））等）、アゴニスト（例えば、活性化共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、又はＩＬＡとしても知られる）、ＣＤ２７（例えば、ＣＤＸ－１１２７）、ＨＶＥＭ、又はＣＤ１２７に対するアゴニスト抗体）、アンタゴニスト、例えば、阻害性共刺激分子、例えば、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ（例えば、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴとしても知られる））、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＧＩＴＲ（例えば、ＴＲＸ５１８）又はアルギナーゼに対するアンタゴニスト抗体、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、又はＹＥＲＶＯＹ（商標）としても知られる）、トレメリムマブ（チシリムマブ又はＣＰ－６７５，２０６としても知られる）、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３としても知られる）、ＭＧＡ２７１、ＴＧＦβに対するアンタゴニスト、例えば、メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２としても知られる）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８としても知られる）、ＬＹ２１５７２９９ｋ、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、すなわちＣＴＬ）の養子移入、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβＩＩ型受容体を含むＴ細胞の養子移入から選択される付加的な療法剤である。
更なる例において、追加の療法としては、リツキシマブ又はヒト化Ｂ－Ｌｙ１抗体（例えば、オビニツズマブ（obinituzumab））等の抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、及び／又はイブリツモマブチウキセタンである。
幾つかの例において、追加の療法としては、４－［５－［ビス（２－クロロエチル）アミノ］－１－メチルベンズイミダゾール－２－イル］ブタン酸又はその塩等のアルキル化剤が挙げられる。幾つかの実施形態において、アルキル化剤はベンダムスチンである。
本発明の更なる態様において、追加の療法はＢＣＬ－２阻害剤を含む。幾つかの実施形態において、ＢＣＬ－２阻害剤は４－（４－｛［２－（４－クロロフェニル）－４，４－ジメチルシクロヘキサ－１－エン－１－イル］メチル｝ピペラジン－１－イル）－Ｎ－（｛３－ニトロ－４－［（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）アミノ］フェニル｝スルホニル）－２－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イルオキシ）ベンズアミド及びその塩である。一実施形態において、ＢＣＬ－２阻害剤はベネトクラクス（ＣＡＳ番号：１２５７０４４－４０－８）である。
本発明の更なる態様において、追加の療法はホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を含む。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はデルタアイソフォームＰＩ３Ｋ（すなわち、Ｐ１１０δ）を阻害する。幾つかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は５－フルオロ－３－フェニル－２－［（１Ｓ）－１－（７Ｈ－プリン－６－イルアミノ）プロピル］－４（３Ｈ）－キナゾリノン及びその塩である。幾つかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はイデラリシブ（ＣＡＳ番号：８７０２８１－８２－６）である。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＰＩ３Ｋのアルファアイソフォーム及びデルタアイソフォームを阻害する。幾つかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は２－｛３－［２－（１－イソプロピル－３－メチル－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－５－イル）－５，６－ジヒドロベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，２－ｄ］［１，４］オキサゼピン－９－イル］－１Ｈ－ピラゾール－１－イル｝－２－メチルプロパンアミド及びその塩である。
本発明の更なる態様において、追加の療法はブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤を含む。一実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は１－［（３Ｒ）－３－［４－アミノ－３－（４－フェノキシフェニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］ピペリジン－１－イル］プロパ－２－エン－１－オン及びその塩である。一実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブ（ＣＡＳ番号：９３６５６３－９６－１）である。
本発明の更なる態様において、追加の療法はサリドマイド又はその誘導体を含む。一実施形態において、サリドマイド又はその誘導体は（ＲＳ）－３－（４－アミノ－１－オキソ１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン及びその塩である。一実施形態において、サリドマイド又はその誘導体はレンダリドミド（lendalidomide）（ＣＡＳ番号：１９１７３２－７２－６）である。
本発明の更なる態様において、追加の療法はシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、又はプレドニゾロン（ＣＨＯＰ）の１つ以上を含む。一実施形態において、追加の療法は上記の抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＧＡ－１０１及び／又はＲＩＴＵＸＡＮ（商標））を更に含む。上記の方法及び療法のいずれも、例えば固形腫瘍を含むあらゆる癌に対して制限なく使用することができる。
或る特定の実施形態において、追加の療法剤は、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法において使用される作用物質、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、又は他の作用物質、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（タルセバ）、血小板由来成長因子阻害剤（例、グリベック（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、本発明の抗ＣＤ３抗体以外の抗体、例えば以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ－β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ ＶＥＧＦ、若しくはＶＥＧＦの受容体（複数の場合もある）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２のうちの１つ以上に結合する抗体、又は別の生体活性作用物質若しくは有機化学的作用物質である。
幾つかの実施形態において、本発明は、追加の療法剤がグルココルチコイドである方法を提供する。一実施形態において、グルココルチコイドはデキサメタゾンである。
腫瘍及び個体
本明細書に記載される組成物及び方法は、様々な種類の癌の治療に適している。特定の例において、治療される癌は固形腫瘍（例えば、肉腫、癌腫、又はリンパ腫）である。本発明の方法により治療可能な固形腫瘍としては、上皮細胞起源の固形腫瘍及び非上皮細胞起源の固形腫瘍が挙げられる。上皮細胞起源の固形腫瘍の例としては、頭頸部、消化管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、陰唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、尿器官、膀胱の腫瘍、及び皮膚腫瘍が挙げられる。非上皮細胞起源の固形腫瘍としては、肉腫及び脳腫瘍が挙げられる。
幾つかの例において、本発明の組成物及び方法は黒色腫の治療に適している。本発明の組成物の方法によって治療することができる黒色腫としては、表在性拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、母斑黒色腫、スピッツ母斑様黒色腫、及び線維形成性黒色腫が挙げられる。
幾つかの例において、本組成物及び本方法は頭頸部癌の治療に適している。本発明の方法及び組成物によって治療することができる頭頸部癌としては、扁平上皮癌（例えば、口腔扁平上皮癌）が挙げられる。幾つかの例において、本発明によって治療可能な頭頸部癌は鼻咽頭、中咽頭、下咽頭、喉頭、又は気管の癌（例えば、癌腫、例えば扁平上皮癌）である。幾つかの実施形態において、頭頸部癌は、唇、口腔、中咽頭、下咽頭、鼻咽頭、声門喉頭、又は声門上喉頭における腫瘍を特徴とする。幾つかの実施形態において、頭頸部癌は、篩骨洞腫瘍、上顎洞腫瘍、唾液腺腫瘍、潜在性原発腫瘍、又は粘膜黒色腫を特徴とする。
他の実施形態において、癌はデスモイド腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、食道癌、中皮腫、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、胸腺癌、又はリンパ腫からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、腫瘍はクラッキン腫瘍、肺門腫瘍、胚細胞腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍、ライディッヒ細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、又はセルトリ細胞腫瘍である。幾つかの実施形態において、腫瘍は扁平上皮癌、総排泄腔癌、腺癌、腺扁平上皮癌、胆管癌、肝細胞癌、浸潤性乳頭状尿路上皮癌、及び扁平尿路上皮癌からなる群から選択される癌腫である。
幾つかの実施形態において、腫瘍は切除可能な腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は切除不能な腫瘍である。幾つかの実施形態において、腫瘍は進行期の腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は早期の腫瘍である。幾つかの実施形態において、癌は再発癌及び／又は難治性癌である（例えば、上記方法は第二選択療法又は第三選択療法である）。
本発明により調製される核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）及び医薬組成物を使用して、小児又は成人を治療することができる。したがって、個体（例えば、ヒト患者）は、１歳未満、５歳未満、１歳～５歳、５歳～１５歳、１５歳～５５歳、又は少なくとも５５歳であり得る。
腫瘍微小環境調節の検出
本明細書において提供される治療方法による腫瘍微小環境の調節を当該技術分野において知られるあらゆる方法を使用して（例えば、腫瘍微小環境の調節についての遺伝子バイオマーカー又はタンパク質バイオマーカーを検出することによって）検出することができる。治療が特定の腫瘍微小環境を調節するかどうかを判定するのに有用な遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーは、当業者であれば、例えば全米総合癌ネットワーク（ＮＣＣＮ）によって利用可能な情報を通じて容易に利用可能である。追加的に又は代替的に、腫瘍微小環境の調節を、固形癌の効果判定規準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）（ＲＥＣＩＳＴ）ガイドラインにおいて定義される読み取り値等の臨床的奏効基準の観点で検出又は定量化することができる。
幾つかの例において、治療（例えば、本発明の治療、例えば、核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）の投与及び／又は電界の伝達を含む治療）が腫瘍クリアランスに関連するバイオマーカー（例えば、腫瘍微小環境における免疫原性タンパク質（例えば、炎症誘発性サイトカイン又は樹状細胞活性化タンパク質））の相対的な発現を増加させるのであれば、腫瘍微小環境はその治療によって調節される。追加的に又は代替的に、治療が腫瘍の進行に関連するバイオマーカー（例えば、Ｔ細胞疲弊のバイオマーカー、例えばＰＤ－１発現）の相対的な発現を減少させるのであれば、腫瘍微小環境はその治療によって調節されると考えられる。
幾つかの実施形態において、腫瘍微小環境の調節の指標となるバイオマーカーの発現レベルにおける測定可能な変化は、バイオマーカーの発現レベルにおける少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％の変化である。例えば、腫瘍の進行に関連するバイオマーカーの発現レベルにおける測定可能な減少は、バイオマーカーの発現における減少が基準レベルに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％である場合、望ましい腫瘍微小環境の調節を示す。追加的に又は代替的に、腫瘍クリアランスに関連するバイオマーカー（例えば、免疫原性タンパク質）の発現レベルにおける測定可能な増加は、バイオマーカーの発現における増加が少なくとも、基準レベルに対して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍（例えば、基準レベルに対して１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、２倍～３倍、３倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～２０倍、２０倍～５０倍、５０倍～１００倍又はそれ以上、例えば、基準レベルに対して１％～１００％、２倍～１０倍、１０倍～５０倍、５０倍～１００倍又はそれ以上）増加する場合、望ましい腫瘍微小環境の調節を示す。
幾つかの実施形態において、腫瘍クリアランスに関連するバイオマーカーは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、例えば無細胞ｃｔＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はノンコーディングＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）等の循環バイオマーカーである。
特定の例において、腫瘍微小環境の調節は、抗腫瘍適応免疫応答（例えば、基準レベルに対する抗腫瘍適応免疫応答の発生、伝播、又は増強）、例えば、治療を受けている個体における腫瘍によって発現される１つ以上の腫瘍抗原に対して起こされた適応免疫応答（例えば、腫瘍抗原がその場で生成及び認識され、治療によって提供されない場合）の検出を特徴とする。したがって、幾つかの例において、本発明の方法のいずれかは、個体における抗腫瘍適応免疫応答を検出する工程を（例えば、本発明による治療後、本発明による治療前、又はその両方に）更に含む。
組織試料又は細胞試料を、ノーザン、ドットブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護アッセイ、又はＤＮＡマイクロアレイのスナップショットを含む市販されているＤＮＡ ＳＮＰチップマイクロアレイを使用して、例えば、遺伝子バイオマーカーからのｍＲＮＡ又はＤＮＡについてアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイ等のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイは、当該技術分野においてよく知られている。本発明の幾つかの例において、腫瘍試料（例えば、固形腫瘍試料）等の生体試料中の対象の遺伝子バイオマーカーからｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して逆転写によって試料からｃＤＮＡを生成することと、こうして生成されたｃＤＮＡを増幅することと、増幅されたｃＤＮＡの存在を検出することとを含む。さらに、そのような方法は、（例えば、アクチンファミリーメンバー等の「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）生体試料中のｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする１つ以上の工程を含み得る。任意に、増幅されたｃＤＮＡの配列を決定することができる。
特定の一実施形態において、本明細書に記載される遺伝子バイオマーカーの発現をＲＴ－ＰＣＲ技術によって行うことができる。ＰＣＲに使用されるプローブは、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、又は酵素等の検出可能なマーカーで標識され得る。このようなプローブ及びプライマーを使用して、試料中の発現された遺伝子（例えば、免疫調節遺伝子）の存在を検出することができる。当業者によって理解されるように、多数の様々なプライマー及びプローブを調製し、１つ以上の調節（例えば、免疫調節）遺伝子を増幅し、クローニングし、及び／又はその存在及び／又は発現レベルを決定するのに効果的に使用することができる。追加的に又は代替的に、腫瘍試料由来の遺伝子バイオマーカーを、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング、アレル特異的アレイ化プライマー伸長、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、突然変異体エンリッチメント液体チップ（mutant-enriched liquid chip）、増幅不応性突然変異システム、より低い変性温度での同時増幅－ＰＣＲ、及びビーズ／エマルジョン／増幅／磁気ＰＣＲ等の既知の方法を使用して検出及び／又は定量化することができる。
他の方法としては、マイクロアレイ技術によって組織（例えば、腫瘍組織、例えば固形腫瘍組織）又は細胞試料中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーからのｍＲＮＡを検査又は検出するプロトコルが挙げられる。核酸マイクロアレイを使用して、試験組織試料及びコントロール組織試料からの試験ｍＲＮＡ試料及びコントロールｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識して、ｃＤＮＡプローブを作製する。次いで、固体支持体上に固定化された核酸のアレイにプローブをハイブリダイズさせる。このアレイは、アレイの各要素の順序及び位置が既知であるように構成されている。例えば、或る特定の疾患状態において発現する可能性がある選択遺伝子を固体支持体上でアレイ化することができる。標識されたプローブと特定のアレイ要素とのハイブリダイゼーションは、プローブの由来となる試料がその遺伝子を発現していることを示す。疾患組織の遺伝子発現差異分析により、有益な情報を得ることができる。マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリダイゼーション技術及びコンピューティング技術を利用して、単一の実験内で数千の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価する（例えば、国際公開第２００１／７５１６６号を参照）。アレイ作製の議論については、例えば米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，４４５，９３４号、及び米国特許第５，８０７，５２２号、Lockart, Nat. Biotechnol. 14:1675-1680 (1996)、並びにCheung et al., Nat. Genet. 21(Suppl):15-19 (1999)を参照のこと。
さらに、例えば欧州特許第１７５３８７８号において記載されるように、マイクロアレイを利用したＤＮＡプロファイリング及び検出方法を使用することができる。このような方法は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）解析及びＤＮＡマイクロアレイを利用して、異なるＤＮＡ配列間を迅速に特定し、区別する。一実施形態において、標識されたＳＴＲ標的配列を、相補的プローブを担持するＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせる。これらのプローブは、考えられるＳＴＲの範囲を網羅するよう長さが様々である。ＤＮＡハイブリッドの標識された一本鎖領域を、ハイブリダイゼーション後の酵素消化を利用してマイクロアレイ表面から選択的に除去する。未知の標的におけるリピートの数を、マイクロアレイにハイブリダイズしたままの標的ＤＮＡのパターンに基づいて推定する。マイクロアレイプロセッサーの一例は、市販されているAffymetrixのＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）システムであり、これはガラス表面上でのオリゴヌクレオチドの直接合成によって作製されたアレイを含む。当業者に知られるように、他のシステムを使用してもよい。
ＲＴ－ＰＣＲ又は別のＰＣＲベースの方法以外のバイオマーカーのレベルを決定する他の方法としては、プロテオミクス技術だけでなく、分子レベルでの患者の応答に基づいて癌を治療するのに有用であり得る個別化された遺伝子プロファイルも挙げられる。本明細書における特殊なマイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイは、腫瘍進行又は腫瘍クリアランス（例えば、抗腫瘍免疫による）と相関する発現プロファイルを有する１つ以上のバイオマーカーを含み得る。本発明において使用される核酸を検出するのに使用することができる他の方法には、例えばＲＮＡＳｅｑ等のＲＮＡベースのゲノム分析を含むハイスループットＲＮＡ配列発現分析が含まれる。
特定の例において、腫瘍微小環境の調節は、利用可能なＮＧＳ技術、例えばＡＶＥＮＩＯ（商標）腫瘍組織キット及びｃｔＤＮＡ分析キット等の腫瘍特異的ＮＧＳキットを使用して、検出し、定量化し、及び／又はモニタリングすることができる。
タンパク質バイオマーカーの検出及び定量化には、例えば、限定されるものではないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、血液ベースの定量的アッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザン分析、又はノーザン分析を含む抗体ベースの方法並びに質量分光分析法及び当該技術分野において知られる他の類似の手段を含む様々なアッセイが利用可能である。抗体ベースの方法の場合に、例えば、抗体－バイオマーカー複合体の形成に十分な条件下で試料を上記バイオマーカーに特異的な抗体と接触させた後に、上記複合体を検出することができる。タンパク質バイオマーカーの存在の検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロッティング（免疫沈降あり又は免疫沈降なし）、二次元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫沈降、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、並びに血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料をアッセイするＥＬＩＳＡ手順等の様々な様式で実現され得る。このようなアッセイ形式を使用する広範囲のイムノアッセイ技術が利用可能である。例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、米国特許第４，４２４，２７９号、及び米国特許第４，０１８，６５３号を参照のこと。これらのアッセイ技術としては、非競合型の単一部位及び２部位のアッセイ、又は「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイの両方が挙げられる。これらのアッセイとしては、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接的な結合も挙げられる。
サンドイッチアッセイは、最も一般的に使用されるアッセイの１つである。サンドイッチアッセイ技術には多数の変形形態が存在し、全ては本発明により包含されることが意図される。簡潔には、典型的なフォワードアッセイにおいて、非標識抗体を固体基材上に固定化し、試験される試料を結合分子と接触させる。抗体－抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間にわたる適切なインキュベーション期間の後に、次いで、検出可能なシグナルを生成することができるレポーター分子で標識された抗原に特異的な二次抗体を加え、抗体－抗原－標識抗体の別の複合体を形成するのに十分となる時間インキュベートする。未反応の物質を全て洗い流し、レポーター分子によって生成されるシグナルの観察によって抗原の存在を判定する。結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものであっても、又は既知量のバイオマーカーを含むコントロール試料と比較することによる定量化されたものであってもよい。
フォワードアッセイの変形形態としては、試料及び標識抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイが挙げられる。これらの技術は、すぐに理解されるようなあらゆる小さな変形も含めて当業者にはよく知られている。典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいて、バイオマーカーに対する特異性を有する一次抗体を固体表面に共有結合させるか、又は受動的に結合させる。固体表面は典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又はイムノアッセイを行うのに適したあらゆる他の表面の形態であってもよい。結合過程は当該技術分野においてよく知られており、一般に架橋、共有結合、又は物理的吸着からなり、ポリマー－抗体複合体は試験試料を調製する際に洗浄される。次いで、試験される試料のアリコートを固相複合体に加え、適切な条件下（例えば、室温から４０℃まで、例えば境界も含めて２５℃から３２℃の間）で十分な時間（例えば、２分間～４０分間、又はより簡便には一晩）インキュベートして、抗体に存在する任意のサブユニットの結合を可能にする。インキュベーション期間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、バイオマーカーの一部に特異的な二次抗体とともにインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を示すのに使用されるレポーター分子に連結されている。
代替的な方法では、試料中の標的バイオマーカーを固定化した後に、固定化された標的を、レポーター分子で標識されていても又は標識されていなくてもよい特異抗体に曝露することが含まれる。標的の量及びレポーター分子シグナルの強さに応じて、結合した標的は抗体による直接的な標識によって検出可能であり得る。代替的に、一次抗体に特異的な二次標識抗体を標的－一次抗体複合体に曝露して、標的－一次抗体－二次抗体の三元複合体を形成する。この複合体は、レポーター分子によって発せられるシグナルによって検出される。レポーター分子は、その化学的性質により、抗原に結合した抗体の検出を可能にする分析的に識別可能なシグナルを生ずる分子である。この種類のアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、蛍光体、又は放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位体）及び化学発光分子のいずれかである。
酵素イムノアッセイの場合に、酵素は一般にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩を用いて二次抗体にコンジュゲートされる。しかしながら、容易に認識されるように、当業者であれば容易に利用可能な多種多様な様々なコンジュゲート技術が存在する。一般的に使用される酵素としては、とりわけ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられる。特定の酵素とともに使用される基質は一般に、対応する酵素による加水分解時に検出可能な色の変化が生じるように選択される。適切な酵素の例としては、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが挙げられる。また、上記の発色基質ではなく蛍光生成物を生ずる蛍光原基質を使用することも可能である。全ての例において、酵素標識抗体を一次抗体－分子マーカー複合体に加え、結合させた後に、過剰な試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含む溶液を抗体－抗原－抗体の複合体に加える。基質は二次抗体に連結された酵素と反応し、それにより定性的な視覚シグナルが生じ、このシグナルを通常は分光光度法により更に定量化して、試料中に存在したバイオマーカーの量の指標とすることができる。代替的に、フルオレセイン及びローダミン等の蛍光化合物を、抗体の結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップリングさせることもできる。特定の波長の光を照射することにより活性化させると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、それにより分子内に励起状態が誘導され、続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光が放出される。ＥＩＡの場合と同様に、蛍光標識抗体を一次抗体－分子マーカー複合体に結合させる。未結合の試薬を洗い流した後に、残った三元複合体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光の観察により対象の分子マーカーの存在が示される。免疫蛍光技術及びＥＩＡ技術は両方とも当該技術分野において非常に十分に確立されている。放射性同位体、化学発光分子、又は生物発光分子等の他のレポーター分子を使用することもできる。
臨床的奏効基準を使用して、腫瘍微小環境が調節されるかどうかを判定することもできる。ＲＥＣＩＳＴガイドラインを含む、あらゆる確立された臨床的奏効基準を利用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、無増悪生存期間を延長し、部分奏効又は完全奏効を含む客観的奏効をもたらし、全生存期間を延長し、及び／又は癌の１つ以上の症状を改善する治療によって、腫瘍微小環境は調節されていると判定される。
ＩＶ．キット及び製造品
本発明の別の態様において、上記の治療に有用な材料を含む製造品又はキットが提供される。製造品には、容器と、容器上の又は容器に付属したラベル又は添付文書とが含まれる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、静注液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を単独で又は病態の治療、予防、及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせて収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は静注液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性作用物質は、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子）、又は本発明の核酸ベクターを含む医薬組成物である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択される癌の治療に使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）及び／又は組成物を含む組成物が中に収容された第１の容器と、（ｂ）追加の療法剤（例えば、追加の抗癌剤）を含む組成物が中に収容された第２の容器とを含む。製造品は、組成物を使用して特定の病態を治療することができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等の薬学的に許容可能な担体又は上記に開示される薬学的に許容可能な担体のいずれかを収容する第２（又は第３）の容器を更に含んでいてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的な観点及び利用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
本発明の特定の例において、（ｉ）上記の物質（例えば、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター又は自己複製ＲＮＡ分子）、又は核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）、追加の療法剤（例えば、追加の抗癌剤）、及び／又は１つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む組成物）のいずれか１つ若しくはそれより多くと、（ｉｉ）エネルギー送達デバイス（例えば、上記のあらゆる適切なデバイス又はシステム等の、腫瘍微小環境に電界を伝達する電極を備えるデバイス）の１つ以上の要素とを含むキットが提供される。幾つかの実施形態において、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）と電極とを含むキットが本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、本発明の核酸ベクター（例えば、環状ＤＮＡベクター）を含む医薬組成物と電極とを含むキットが本明細書において提供される。
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以下は、上記の組成物を作製し、試験する方法、及びそのような組成物を用いて個体を治療する方法の非限定的な例である。
実施例１．治療用トリプレット（therapeutic triplet）をコードする合成環状ＤＮＡベクターの無細胞生産
この実施例は、治療用トリプレットをコードする２つの合成環状ＤＮＡベクター：（１）３つ全ての治療用配列の発現を駆動する単一のプロモーターを有する単一転写単位ベクター（図１に示される）、及び（２）それぞれが３つの治療用配列のうちの１つの発現を駆動する３つのプロモーターを有する多重転写単位ベクター（図２Ａに示される）の生産及び特性評価を説明する。この実施例において、治療用配列はｓＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１（５’→３’方向で作動可能に連結されている）である。
以下の試薬を１×Ｐｈｉ２９バッファー（New England Biolabs）中で混合して、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）溶液を調製した：単一転写単位又は多重転写単位のいずれかの構成で治療用トリプレットを含むプラスミドＤＮＡ（５μｇ／ｍＬの最終濃度）、ランダムプライマー（５０μＭの最終濃度）、ＮａＯＨ（１０ｍＭの最終濃度）、ｄＮＴＰ（２ｍＭの最終濃度）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（２００Ｕ／ｍＬの最終濃度）、及びピロホスファターゼストック（New England Biolabs、０．４ｍＵ／ｍＬの最終濃度）。ＲＣＡ溶液を３０℃で１８時間連続的に混合した。
インキュベーション後に、温度を６５℃まで４５分間上昇させることにより、ＲＣＡ溶液を熱失活させた。次いで、失活させたＲＣＡ溶液の温度を３７℃まで下げた。
ＢｓａＩ溶液を生成するのに、失活させたＲＣＡ溶液（１ｍＬ当たり０．２ｍｇのＤＮＡの最終濃度）を、ＢｓａＩ（１μｇのＤＮＡ当たり２．５Ｕの最終濃度）を含むＣＵＴＳＭＡＲＴ（商標）バッファー（１×の最終濃度）に添加した。ＢｓａＩ溶液を３７℃で２時間連続的に混合した。ＢｓａＩ溶液には熱失活を行わなかった。消化されたＢｓａＩ溶液の温度を２５℃まで下げた。
ライゲーション溶液を生成するのに、消化されたＢｓａＩ溶液（１ｍＬ当たり４０μｇのＤＮＡの最終濃度）を、Ｔ４リガーゼ（１μｇのＤＮＡ当たり１０ＵのＴ４リガーゼ）及びリボＡＴＰ（１ｍＭの最終濃度）を含むＣＵＴＳＭＡＲＴ（商標）バッファーに添加した。ライゲーション溶液を２５℃で２時間インキュベートした。
インキュベーション後に、温度を６５℃まで４５分間上昇させることにより、ライゲーション溶液を熱失活させた。次いで、失活させたライゲーション溶液の温度を３７℃まで下げた。
スーパーコイル溶液を生成するのに、ライゲーション溶液を、ＤＮＡジャイレースを含むジャイレースバッファー（１μｇのＤＮＡ当たり１．５Ｕのジャイレース）に添加した。ジャイレースバッファーには、３５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２４ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＤＴＴ、１．８ｍＭのスペルミジン、３２％のグリセロール（重量／容量）、並びに１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍＬのＢＳＡが含まれている。スーパーコイル溶液を３７℃で２時間連続的に混合した。スーパーコイル溶液には熱失活を行わなかった。
次に、スーパーコイル溶液を、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（１μｇのＤＮＡ当たり２．５ＵのＴ５エキソヌクレアーゼ）を含む酢酸カリウムバッファー（５０ｍＭの酢酸カリウムの最終濃度）に添加して、クリーンアップ溶液を生成した。クリーンアップ溶液を３７℃で少なくとも２時間連続的に混合した。クリーンアップ溶液には熱失活を行わなかった。
次いで、クリーンアップ溶液を０．２２μｍのフィルターを介して滅菌濾過し、１．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭＯＰＳ、３０％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、及び０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（容量／容量）を含むバッファー中で１：１に希釈して、７６０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、及び０．１５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（容量／容量）の最終濃度を達成した。希釈したクリーンアップ溶液をQiagenのプラスミドプレップカラムに加え、ＱＮバッファーでＤＮＡを溶出した。溶出液をＩＰＡ（４０％（容量／容量））で希釈し、４℃にて１５０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを７０％のＥｔＯＨで洗浄し、再び４℃にて１５０００ｇで３０分間遠心分離した。２回目の遠心分離後、ペレットを１．０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁した。
スーパーコイル状単量体を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（BIO-RAD（商標））を使用したゲル電気泳動調製物のデンシトメトリー分析によって計算した。２００ｎｇの合成環状ＤＮＡベクター試料をトリス－酢酸－ＥＤＴＡゲルにロードし、電気泳動を１００Ｖで４０分間実行した後、１％のＥｔＢｒで２０分間染色した。それぞれの合成環状ＤＮＡベクター試料について、そのサイズに応じて標的バンドを特定し、「バンド検出感度」を「検出設定」において５０の値の「カスタム感度」として設定した。
上記の方法により、０．４２ｍｇのプラスミドから１．７ｍｇの図１Ａの単一転写単位ベクター（４５３７ｂｐ）が得られた（およそ４倍の増加）のに比べ、０．７５ｍｇのプラスミドから４．０ｍｇの図２Ａの多重転写単位ベクター（８０３５ｂｐ）が得られた（５．３倍の増加）。単一転写単位ベクターは、上記で論じられたデンシトメトリー分析によって測定して７８％がスーパーコイル状であると計算された。多重転写単位ベクターは、同じ分析によって８５％がスーパーコイル状であると計算された。比較すると、ＣＡＧプロモーターによって駆動される単一遺伝子（ＩＬ－１２）をコードする合成環状ＤＮＡベクター（３４６６ｂｐ）の試料が同じ方法によって生産され、０．３２ｍｇのプラスミドから２．５ｍｇのベクターが得られた（７．８倍の増加）。単一遺伝子ベクターは、上記で論じられたデンシトメトリー分析によって測定して８４％のスーパーコイルを有すると計算された。このデータは、本明細書に記載される無細胞生産方法を利用して、多数の遺伝子を含む比較的大きな合成環状ＤＮＡベクターに加えて、単一の遺伝子を含むより小さな合成環状ＤＮＡベクターも効果的に生産することができることを示している。
実施例２．合成環状ＤＮＡベクターの３つの治療用配列それぞれについてのタンパク質発現
配列番号３７の８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－Ｔｘ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現について特性評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を透明な平底を有する１２ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２００Ｋ個の細胞の密度で播種し、１ウェル当たり１μｇの濃度のベクター＋１ウェル当たり３μＬのリポフェタミン３０００＋１ウェル当たり２μＬのＰ３０００とともに４８時間インキュベートした。ｃ３－ＴｘによるｓＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ１、及びＩＬ－１２のタンパク質発現を、培地をネガティブコントロールとして使用してＥＬＩＳＡによって定量化した。ｓＦｌｔ３Ｌ（図３Ａ）、ＩＬ－１２（図３Ｂ）、及びＸＣＬ１（図３Ｃ）についてタンパク質発現を検出したところ、ｃ３－Ｔｘが３つ全ての免疫調節タンパク質についてタンパク質発現をもたらすことが実証された。
実施例３．合成環状ＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質についての機能的アッセイ
機能的アッセイを実施して、図２Ａの８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質が、実施例２に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後に生物学的に機能的であるかどうかを判定した。
ＩＬ－１２活性を測定するのに、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ－ＩＬ－１２細胞を使用してＱｕａｎｔｉ Ｂｌｕｅ／胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイを実施した。簡潔には、１ウェル当たり５００００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ１２細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を１ウェル当たり２０μＬのｍｕＩＬ １２ｐ７０（標準曲線）、ｈｕＩＮＦα（ネガティブコントロール）、又はトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地で処理（１：１００希釈）し、３７℃で２４時間インキュベートした。各試料からの２０μＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ１２細胞上清を９６ウェルプレートのウェルに移し、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液を加えた。試料を３７℃で１時間インキュベートし、６３０ｎｍでの吸光度を測定した。図４は、図２Ａの８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターから発現されたＩＬ－１２ｐ７０が生物学的に機能的であったことを示している。
Ｆｌｔ３Ｌ活性を、ｓＦｌｔ３Ｌ馴化培地による骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の分化に基づいて測定した。簡潔には、ＨＥＫ細胞を図２の８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターとともにインキュベートして、馴化培地を作製した。骨髄前駆細胞をマウスの大腿骨から採取し、馴化培地（２０ｎｇ／ｍＬ）、ポジティブコントロールとしての組換えｓＦＬＴ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地、及びネガティブコントロールとしての組換えＧＭＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地中で培養した。各条件について、培地を３日目及び６日目に補充し、緩く接着した細胞を７日目に採取した。フローサイトメトリーを実施して、図５Ａ～図５Ｃにおける代表的なプロットによって示されるように、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（通常型ＤＣ；ｃＤＣ）及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ－Ｂ２２０＋細胞（形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ））に対してゲーティングすることによって細胞の免疫表現型検査を行った。図６Ａ～図６Ｃは、各条件において生成されたｃＤＣ及びｐＤＣの数を示す。ｓＦＬＴ３Ｌ馴化培地は、組換えｓＦＬＴ３Ｌと同様のｃＤＣ／ｐＤＣプロファイルへのＢＭＤＣの分化を引き起こした（図６Ａ及び図６Ｂ）のに対し、組換えＧＭＣＳＦではＢＭＤＣ表現型がｐＤＣからｃＤＣに向かって偏った（図６Ｃ）。まとめると、これらのデータは、図２Ａの８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターから発現されたｓＦＬＴ３Ｌが生物学的に機能的であったことを示している。
実施例４．プラスミドと比較した合成環状ＤＮＡベクターの腫瘍内発現持続性の改善
この実施例において、合成環状ＤＮＡベクターを腫瘍内発現持続性について試験した。ｆＬｕｃをコードする合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－ｆＬｕｃ）を、本明細書に記載される無細胞法を使用して調製し、ｆＬｕｃをコードするプラスミドＤＮＡベクター（ｐ－ｆＬｕｃ）と比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、治療１１日前にＣＴ－２６腫瘍細胞を側腹部において接種した。ｃ３－ｆＬｕｃ又はｐ－ｆＬｕｃを腫瘍内投与し（１ｍｇ／ｍＬの濃度で４６μＬ～５５μＬ）、続いて腫瘍の表面に接触するように配置されたプレート型電極によって電気的エネルギーを伝達した。各腫瘍に対して、８００Ｖ／ｃｍで８個の５ミリ秒のパルスを施して、腫瘍細胞内へのベクターのエレクトロトランスファーを実施した。動物を生存中イメージングによって１７日間モニタリングした。
図７Ａ～図７Ｆは、ＰＢＳ（図７Ａ及び図７Ｂ）、ｐ－ｆＬｕｃ（図７Ｃ及び図７Ｄ）、及びｃ３－ｆＬｕｃ（図７Ｅ及び図７Ｆ）による治療から３日目（図７Ａ、図７Ｃ、及び図７Ｅ）及び１７日目（図７Ｂ、図７Ｄ、及び図７Ｆ）のマウスにおけるｆＬｕｃ発現を示す画像である。これらのデータの定量化を７日目、１０日目、及び１４日目の追加の時点とともに図８のグラフに示す。これらのデータでは、合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３ｆＬｕｃ）で治療された動物においてはｆＬｕｃの放射輝度が１７日間の時間経過を通じて維持されたのに対し、プラスミドＤＮＡベクター（ｐｆＬｕｃ）で治療された動物においてはｆＬｕｃ発現が弱まったことを示されることから、合成環状ＤＮＡベクターがプラスミドと比較して向上した発現持続性を示したことを示唆している。
実施例５．単回用量の治療用合成環状ＤＮＡベクターで治療されたマウスにおける腫瘍成長の減少
図２Ａの８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターをｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍縮小について試験した。この研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、治療８日前にＣＴ－２６腫瘍細胞を側腹部において接種した。図２Ａの治療用合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－Ｔｘ）を本明細書に記載される無細胞法を使用して調製し、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて医薬組成物として製剤化した。ＰＢＳ治療群をネガティブコントロールとして用いた。単回用量の５０μＬの合成環状ＤＮＡベクター製剤又はＰＢＳを各マウスの腫瘍内に投与し、各投与後にマルチニードル電極アレイを使用してエレクトロトランスファーを行った。６本の２８ゲージのニードルが３本ずつ２列に配置され、各列における各ニードル間は１．５ｍｍ（３ｍｍの列の長さ）であり、列間は２．５ｍｍであった。ニードルアレイを腫瘍内に挿入し、８００Ｖ／ｃｍ（ニードルの列間を流れる電流）で８個の５ミリ秒のパルスを施した。
腫瘍体積を経時的にモニタリングした。図９に示されるように、ｃ３ Ｔｘ治療マウスは、ＰＢＳコントロール群と比べて、７日目以降で大幅により低い平均腫瘍体積を示した。これらのデータは、腫瘍組織における治療用合成環状ＤＮＡベクターのエレクトロトランスファーが腫瘍成長を減少させ得ることを示している。
腫瘍試料を収集して、観察されたｃ３ Ｔｘの効果が免疫細胞の腫瘍浸潤の増加と関連しているかどうかを判定した。ＣＤ４５＋発現のフローサイトメトリー定量化によって測定したところ、ＰＢＳを注射した腫瘍内の腫瘍細胞のうち、およそ８％が免疫表現型を示した（図１０）。対照的に、ｃ３ Ｔｘを注射した腫瘍においては細胞のおよそ１７％を免疫細胞が占めていた。この単回用量研究においては、生存をモニタリングする代わりに、腫瘍試料の分析を実施した。
実施例６．治療用合成環状ＤＮＡベクターの長期にわたる再投与により、腫瘍成長の減少及び生存の延長がもたらされた
図２Ａの８０３５ｂｐの多重転写単位合成環状ＤＮＡベクターを腫瘍担持マウスの生存に対する効果について試験した。この研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、治療１２日前にＣＴ－２６腫瘍細胞を側腹部において接種した。図２Ａの治療用合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－Ｔｘ）を本明細書に記載される無細胞法を使用して調製し、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて医薬組成物として製剤化した。ネガティブコントロールには、ＰＢＳ群及びｆＬｕｃをコードする合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－ｆＬｕｃ、１ｍｇ／ｍＬ）が含まれていた。５０μＬの合成環状ＤＮＡベクター製剤又はＰＢＳを研究の１日目及び４日目に腫瘍内に投与した。ベクターの各投与後に、実施例５において記載される双極マルチニードル電極アレイを使用してエレクトロトランスファーを実施した。８個の５ミリ秒のパルスを８００Ｖ／ｃｍで施した。腫瘍体積をモニタリングし、腫瘍量（２０００ｍｍ３）に達した時点でマウスを安楽死させた。
図１１は、各群（ｎ＝１０）についての生存曲線を示す。治療用合成環状ＤＮＡベクターで治療されたマウスは、ＰＢＳ治療群又はｃ３ ｆＬｕｃコントロール群よりも長く生存し、経時的な腫瘍体積によって測定したところ、平均してより遅い腫瘍成長を見せた（図１２）。このデータは、実施例６における観察を裏付けている。さらに、これらのデータは、ｃ３ ｆＬｕｃの有効性の欠如によって示されるように、合成環状ＤＮＡベクターの治療効果が、ＤＮＡベクター自体に対する非特異的免疫応答ではなく、治療用配列に依存することを示している。
実施例７．ｍＲＮＡベクターの腫瘍内エレクトロトランスファー
エレクトロトランスファーによる腫瘍組織におけるｍＲＮＡ発現の実現可能性を判定するのに、研究の１日目に、ＧＦＰをコードする５０μＬの裸のｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝１２）のＣＴ－２６側腹部腫瘍内に注射した。ＧＦＰをコードする合成環状ＤＮＡベクター（ｃ３－ＧＦＰ）をポジティブコントロールとして使用し、ＰＢＳをネガティブコントロールとして使用した。核酸注射の直後に、実施例５において記載される双極マルチニードルアレイを使用してエレクトロトランスファーを実施した。８個の５ミリ秒のパルスを８００Ｖ／ｃｍで施した。腫瘍におけるＧＦＰタンパク質発現についての終端点（２日目、５日目、及び８日目）で腫瘍を収集した。
図１３は経時的なＧＦＰ発現を示す。合成環状ＤＮＡベクターを注射した腫瘍において、各時点でＧＦＰが高度に発現された。合成環状ＤＮＡベクター群と比べて発現がより低いにもかかわらず、裸のｍＲＮＡを注射した腫瘍は２日目及び５日目に検出可能な発現を示した。
実施例８．トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドの３つの治療用配列のそれぞれについてのタンパク質発現
１０４２９ｂｐの長さを有するｓＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＳＲ－Ｔｘ、図１４Ａ）を生産し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現について特性評価した。比較のために、１３９７８ｐｍの長さを有するｓＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１をコードする自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミド（ｐＳＲ－Ｔｘ、図１４Ｂ）も生産し、試験した。トランスフェクションコントロール（ＴＣ）も示される。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を透明な平底を有する１２ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２００Ｋ個の細胞の密度で播種し、１ウェル当たり１μｇの濃度のベクター＋１ウェル当たり３μＬのリポフェタミン３０００＋１ウェル当たり２μＬのＰ３０００又は１ウェル当たりＰ３０００の３のリポフェクタミンメッセンジャーマックス（lipofectamine messenger max）ととともに４８時間インキュベートした。ｃ３－ＴｘによるｓＦｌｔ３Ｌ、ＸＣＬ１、及びＩＬ－１２のタンパク質発現をＥＬＩＳＡによって定量化した。自己複製ＲＮＡ（ＳＲ－Ｔｘ）及び自己複製ＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＳＲ－Ｔｘ）の両方に関して、タンパク質発現をｓＦｌｔ３Ｌ（図１５Ａ）、ＩＬ－１２（図１５Ｂ）、及びＸＣＬ１（図１５Ｃ）について検出した。
実施例９．トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドによって発現されるタンパク質についての機能的アッセイ
機能的アッセイを実施して、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドによって発現されるタンパク質が、実施例２に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後に生物学的に機能的であるかどうかを判定した。
ＩＬ－１２活性を測定するのに、上記の実施例３に記載されるようにＱｕａｎｔｉ Ｂｌｕｅ／ＳＥＡＰアッセイを実施した。図１６は、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドから発現されたＩＬ－１２ｐ７０が生物学的に機能的であったことを示している。
Ｆｌｔ３Ｌ活性を、上記の実施例３に記載されるようにｓＦｌｔ３Ｌ馴化培地によるＢＭＤＣ分化に基づいて測定した。フローサイトメトリーを実施して、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（通常型ＤＣ；ｃＤＣ）及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ－Ｂ２２０＋細胞（形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ））に対してゲーティングすることによって細胞の免疫表現型検査を行った。図１７は、各条件において生成されたｃＤＣ及びｐＤＣの数を示す。両方の試験コンストラクトからのｓＦＬＴ３Ｌ馴化培地は、組換えｓＦＬＴ３Ｌと同様に、ＢＭＤＣのｐＤＣ及びｃＤＣの両方への分化を引き起こしたのに対し、組換えＧＭＣＳＦではＢＭＤＣ表現型がｐＤＣからｃＤＣに向かって偏った。まとめると、これらのデータは、トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子及びトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドから発現されたｓＦＬＴ３Ｌが生物学的に機能的であったことを示している。
実施例１０．トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードする環状ＤＮＡベクターの無細胞生産
ここでは、免疫調節用のトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡベクターを合成する例示的な方法を記載する。当業者であれば、他の方法を使用して、同様の自己複製ＲＮＡ分子又は本発明の説明に含まれる他の配列を有する自己複製ＲＮＡ分子に到達し得ることを認識するであろう。
最初に、５’ＵＴＲ非構造タンパク質１～非構造タンパク質４（ｓｎＰ１～ｎｓＰ４）及び３つの免疫調節遺伝子（ここではｓＦｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１２、及びＸＣＬ１として表される）をコードする個々のＤＮＡ断片を、３’ＵＴＲポリアデニル化配列及びプラスミド骨格を用いてゴールデンゲートアセンブリ法を介して組み立てる（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。生産物は約１３ｋｂのサイズを有する環状プラスミドである（図１８Ｂ）。この環状プラスミドに、ｐｈｉ２９ポリメラーゼを使用してローリングサークル型増幅を行い、制限酵素により消化を行う。ＤＮＡのライゲーションを行い、環状ＤＮＡベクターを形成する。
実施例１１．環状ＤＮＡベクターのパルス電界媒介投与を使用した癌の治療
ここでは、癌治療の一部として本発明の環状ＤＮＡベクターを投与する例示的な方法を記載する。
この実施例において、治療を受ける患者は、約１０ｍｍの直径を有する腫瘍が存在することを特徴とする結節型黒色腫と診断された個体である。黒色腫の治療には、免疫調節環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物の投与と併せて、腫瘍にパルス電界を伝達する療法が含まれる。治療は外来診療の場で行われる。
３つの免疫調節タンパク質（すなわち、図１Ａ又は図２Ａに示されるＸＣＬ１、ｓＦｌｔ３Ｌ、及びＩＬ－１２）をコードする環状ＤＮＡベクターを、本明細書及び国際公開第２０１９／１７８５００号の国際特許公報に記載される方法に従って合成する。環状ＤＮＡベクターを含む組成物は、緩衝剤として薬学的に許容可能な塩を含む使い捨てガラスバイアルに入った凍結乾燥粉末として提供される。凍結乾燥組成物中のＤＮＡの量は約２００μｇである。臨床専門家はバイアルに２００μＬの滅菌水を加えて、環状ＤＮＡベクターを再懸濁し、それによって投与用の１．０ｍｇ／ｍＬの液体医薬組成物を調製する。環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物を３０ゲージの針を備えた滅菌注射器に充填する。
医師は３０ゲージの針を使用して、直接の視覚的誘導下及び／又はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）誘導下で主要血管を避けて、環状ＤＮＡベクターを含む医薬組成物を腫瘍内に直接投与する。
医薬組成物の腫瘍内注射から３０分以内に、医師は注射部位又はその近くにニードル電極を挿入し、腫瘍内にパルス電界を伝達する。それぞれ５０ミリ秒の持続時間及び５００Ｖの振幅の一連の８個の矩形波形を発生させることによって電界を伝達する。パルスは約１秒ごとに送達される。パルス電界の伝達時に治療は完了する。
治療後に、患者を毎週ＣＴによって腫瘍の進行についてモニタリングする。腫瘍直径の縮小（すなわち、１０ｍｍ未満）は、治療が有効であることを裏付けている。
実施例１２．トリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子の合成
ここでは、免疫調節用のトリシストロン性自己複製ＲＮＡ分子を合成する例示的な方法を記載する。当業者であれば、他の方法を使用して、同様の自己複製ＲＮＡ分子又は本発明の説明に含まれる他の配列を有する自己複製ＲＮＡ分子に到達し得ることを認識するであろう。
最初に、５’ＵＴＲ非構造タンパク質１～非構造タンパク質４（ｓｎＰ１～ｎｓＰ４）及び３つの免疫調節遺伝子（ここではＸＣＬ１、ｓＦｌｔ３Ｌ、及びＩＬ－１２として表される）をコードする個々のＤＮＡ断片を、３’ＵＴＲポリアデニル化配列及びプラスミド骨格を用いてゴールデンゲートアセンブリ法を介して組み立てる（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。生産物は約１３．５ｋｂのサイズを有する環状プラスミドである（図１４Ｂ）。次に、環状プラスミドを制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩでの消化により切断して、５’Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）及びポリアデニル化３’末端を有する線状化されたＤＮＡ片を生成する。図１４Ｃは、約１０．５ｋｂのサイズを有する、得られた線状ＤＮＡ分子を示す。この線状ＤＮＡを、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写を使用して線状の自己複製ＲＮＡ分子に転写する（図１４Ｄ）。次に、ｍＲＮＡ Ｃａｐ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼによって５’末端をキャップ化（ｍ７Ｇ）し、Ｅ．コリのポリ（Ａ）ポリメラーゼによってポリ（Ａ）テールを伸長させ、それにより自己複製ＲＮＡ分子の合成を完了する。５’キャップ類縁体を使用して、半減期を含む合成されたｍＲＮＡの特性を変更することができる。
図１４Ｅは、最終生産物、すなわち伸長したポリアデニル化配列と、自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４）と、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子（すなわち、ＸＣＬ１）、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子（すなわち、ｓＦｌｔ３Ｌ）、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子（すなわち、ＩＬ－１２）を有するトリシストロン性免疫調節配列とを有する５’キャップ化自己複製ＲＮＡ分子を図解している。
実施例１３．自己複製ＲＮＡ分子のパルス電界媒介投与を使用した癌の治療
ここでは、癌治療の一部として本発明の自己複製ＲＮＡ分子を投与する例示的な方法を記載する。
この実施例において、治療を受ける患者は、約１０ｃｍ３の体積を有する鼻咽頭腫瘍が存在することを特徴とする頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）と診断された個体である。扁平上皮癌の治療には、自己複製ＲＮＡ分子の医薬組成物の投与と併せて、鼻咽頭腫瘍にパルス電界を伝達する療法が含まれる。治療は外来診療の場で行われる。
３つの免疫調節遺伝子（すなわち、ＸＣＬ１、ｓＦｌｔ３Ｌ、及びＩＬ－１２）をコードする自己複製ＲＮＡ分子を実施例１の方法に従って合成し、これは、緩衝剤として薬学的に許容可能な塩を含む使い捨てガラスバイアルに入った凍結乾燥粉末として提供される。凍結乾燥組成物中の自己複製ＲＮＡの量は約２００μｇである。臨床専門家はバイアルに２００μＬの滅菌水を加えて、自己複製ＲＮＡを再懸濁し、それによって投与用の１．０ｍｇ／ｍＬの液体医薬組成物を調製する。自己複製ＲＮＡを含む医薬組成物を３０ゲージの針を備えた滅菌注射器に充填する。
医師は３０ゲージの針を使用して、直接の視覚的誘導下及び／又はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）誘導下で主要血管を避けて、自己複製ＲＮＡを含む医薬組成物を腫瘍内に直接投与する。
自己複製ＲＮＡを含む医薬組成物の腫瘍内注射から３０分以内に、医師は注射部位又はその近くにニードル電極を挿入し、腫瘍内にパルス電界を伝達する。それぞれ５０ミリ秒の持続時間及び５００Ｖの振幅の一連の８個の矩形波形を発生させることによって電界を伝達する。パルスは約１秒ごとに送達される。パルス電界の伝達時に治療は完了する。
治療後に、患者を毎週ＣＴによって腫瘍の進行についてモニタリングする。腫瘍体積の縮小（すなわち、１０ｃｍ３未満）は、治療が有効であることを裏付けている。
他の実施形態
本明細書において挙げられる全ての出版物、特許、及び特許出願は、それぞれ独立した出版物又は特許出願が引用することにより具体的にかつ個別に本明細書の一部をなしているのと同じ程度で、引用することにより本明細書の一部をなす。
本発明をその具体的な実施形態に関連して説明してきたが、本発明は更なる変更が可能であることが理解されるであろうし、本出願は、一般に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内における既知の実施又は慣行の範囲内であり本明細書において上記の本質的な特徴に該当し得る本開示からの逸脱を含む本発明のあらゆる変形、使用、又は適合を網羅することが意図され、特許請求の範囲に従うものである。
付番した実施形態
本明細書に記載される技術の幾つかの実施形態は、以下の付番した項目のいずれかに従って規定され得る：
１．樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子と、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子と、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
２．樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子は、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、項目１の核酸ベクター。
３．樹状細胞の成長因子又は活性化因子は、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０Ｌである、項目１又は２の核酸ベクター。
４．リンパ球のシグナル伝達タンパク質は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、項目１～３のいずれか一項の核酸ベクター。
５．核酸ベクターは、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現をそれぞれ駆動する第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターを含む、項目１～４のいずれか一項の核酸ベクター。
６．核酸ベクターは、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現を駆動する単一のプロモーターを含む、項目１～４のいずれか一項の核酸ベクター。
７．ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子と、ＩＬ－１２をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
８．ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子と、ＩＬ－１５をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
９．ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子と、ＩＬ－１５をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
１０．ＤＮＡベクターである、項目１～９のいずれか一項の核酸ベクター。
１１．環状ＤＮＡベクターである、項目１０の核酸ベクター。
１２．環状ＤＮＡベクターは細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠いている、項目１１の核酸ベクター。
１３．核酸ベクターは、２．５ｋｂ～２０ｋｂの長さである、項目１～１２のいずれか一項の核酸ベクター。
１４．核酸ベクターは、３．５ｋｂ～１０ｋｂの長さである、項目１３の核酸ベクター又は環状ＤＮＡベクター。
１５．５’→３’方向で、
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列及び（ｉｉ）１つ以上の異種タンパク質をコードする遺伝子を含む自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列と、
（ｃ）ポリアデニル化配列と、
を含む環状ＤＮＡベクターであって、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠いている、環状ＤＮＡベクター。
１６．１つ以上の異種タンパク質をコードする遺伝子は、１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を含む、項目１５の環状ＤＮＡベクター。
１７．１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び／又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む、項目１６の環状ＤＮＡベクター。
１８．樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子は、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、項目１７の環状ＤＮＡベクター。
１９．樹状細胞の成長因子又は活性化因子は、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０Ｌである、項目１７又は１８の環状ＤＮＡベクター。
２０．リンパ球のシグナル伝達タンパク質は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、項目１７～１９のいずれか一項の環状ＤＮＡベクター。
２１．核酸ベクターは、１０ｋｂ～１３ｋｂの長さである、項目１５～２０のいずれか一項の環状ＤＮＡベクター。
２２．核酸ベクターは、約１１．５ｋｂの長さである、項目２１の環状ＤＮＡベクター。
２３．（ａ）項目１～１４のいずれか一項の核酸ベクター、又は項目１５～２２のいずれか一項の環状ＤＮＡベクターと、（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
２４．個体における癌を治療する方法であって、項目１～１４のいずれか一項の核酸ベクター、項目１５～２２のいずれか一項の環状ＤＮＡベクター、又は項目２３の医薬組成物を、癌を治療するのに有効な量で個体に投与することを含む、方法。
２５．調節を必要とする個体における腫瘍微小環境を調節する方法であって、
（ａ）項目１～１４のいずれか一項の核酸ベクター、項目１５～２２のいずれか一項の環状ＤＮＡベクター、又は項目２３の医薬組成物を個体に投与することと、
（ｂ）電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が核酸分子又は環状ＤＮＡベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより調節タンパク質をコードする遺伝子を腫瘍細胞に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することと、
を含む、方法。
２６．工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む、項目２５の方法。
２７．パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、項目２６の方法。
２８．核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を腫瘍内投与する、項目２４～２７のいずれか一項の方法。
２９．核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を全身投与する、項目２４～２７のいずれか一項の方法。
３０．核酸ベクター、環状ＤＮＡベクター、又は医薬組成物を追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、項目２４～２９のいずれか一項の方法。
３１．調節を必要とする個体における腫瘍微小環境を調節する方法であって、
（ａ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を含む非ウイルス性核酸ベクターを投与することと、
（ｂ）電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が非ウイルス性核酸ベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を腫瘍細胞に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することと、
を含む、方法。
３２．工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む、項目３１の方法。
３３．パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、項目３２の方法。
３４．非ウイルス性核酸ベクターを腫瘍内投与する、項目３１～３３のいずれか一項の方法。
３５．非ウイルス性核酸ベクターを全身投与する、項目３１～３３のいずれか一項の方法。
３６．非ウイルス性核酸ベクターを追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、項目３１～３５のいずれか一項の方法。
本明細書に記載される技術の他の実施形態は、以下の付番した項目のいずれかに従って規定され得る：
１．（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列と、（ｂ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子及び１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を含むポリシストロン性免疫調節配列とを含む、免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
２．１つ以上の追加の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子を含む、項目１の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
３．１つ以上の追加の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む、項目１又は２の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
４．免疫調節配列は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む、項目１の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
５．樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子はＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、項目１～４のいずれか一項の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
６．樹状細胞の成長因子又は活性化因子はＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０Ｌである、項目２又は４の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
７．リンパ球のシグナル伝達タンパク質はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、項目３又は４の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
８．（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼと、（ｂ）ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列とを含む、免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
９．（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼと、（ｂ）ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列とを含む、免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１０．（ａ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼと、（ｂ）ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むトリシストロン性免疫調節配列とを含む、免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１１．自己複製ＲＮＡ分子は５ｋｂ～２０ｋｂの長さである、項目１～１０のいずれか一項の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１２．自己複製ＲＮＡ分子は９ｋｂ～１２ｋｂの長さである、項目１１の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１３．自己複製ＲＮＡ分子は５’キャップを含む、項目１～１２のいずれか一項の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１４．自己複製ＲＮＡ分子は伸長したポリアデニル化配列を含む、項目１～１３のいずれか一項の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子。
１５．（ａ）項目１～１４のいずれか一項の自己複製ＲＮＡ分子と、（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
１６．個体における癌を治療する方法であって、項目１～１４のいずれか一項の免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子、又は項目１５の医薬組成物を、癌を治療するのに有効な量で個体に投与することを含む、方法。
１７．免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子又は医薬組成物を腫瘍内投与する、項目１６の方法。
１８．免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子又は医薬組成物を全身投与する、項目１６の方法。
１９．免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子をパルス電界療法と組み合わせて投与する、項目１６～１８のいずれか一項の方法。
２０．免疫調節性自己複製ＲＮＡ分子を追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、項目１９の方法。
２１．調節を必要とする個体における腫瘍微小環境を調節する方法であって、
（ａ）（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列及び（ｉｉ）異種調節遺伝子を含む自己複製ＲＮＡ分子を個体に投与することと、
（ｂ）電界を腫瘍微小環境内に伝達することで、電界が自己複製ＲＮＡ分子の腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより異種調節遺伝子を腫瘍細胞に送達して、個体における腫瘍微小環境を調節することと、
を含む、方法。
２２．異種調節遺伝子は免疫調節タンパク質をコードする遺伝子である、項目２１の方法。
２３．免疫調節タンパク質は化学誘引物質である、項目２２の方法。
２４．化学誘引物質は樹状細胞の化学誘引物質である、項目２３の方法。
２５．樹状細胞の化学誘引物質はＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、項目２４の方法。
２６．自己複製ＲＮＡ分子は１つ以上の追加の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を更に含む、項目２１～２５のいずれか一項の方法。
２７．１つ以上の追加の免疫調節タンパク質は樹状細胞の成長因子又は活性化因子である、項目２６の方法。
２８．１つ以上の追加の免疫調節タンパク質はリンパ球のシグナル伝達タンパク質である、項目２６又は２７の方法。
２９．自己複製ＲＮＡ分子は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む、項目２８の方法。
３０．樹状細胞の成長因子又は活性化因子はＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０Ｌである、項目２９の方法。
３１．リンパ球のシグナル伝達タンパク質はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、項目２９又は３０の方法。
３２．自己複製ＲＮＡ分子は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む、項目３１の方法。
３３．自己複製ＲＮＡ分子は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子、及びＩＬ－１５をコードする遺伝子を含む、項目３１の方法。
３４．自己複製ＲＮＡ分子は、ＸＣＬ１をコードする遺伝子、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子、及びＩＬ－１２をコードする遺伝子を含む、項目３１の方法。
３５．工程（ａ）は腫瘍内投与を含む、項目２１～３４のいずれか一項の方法。
３６．工程（ａ）は全身投与を含む、項目２１～３４のいずれか一項の方法。
３７．工程（ｂ）はパルス電界を伝達することを含む、項目２１～３６のいずれか一項の方法。
３８．パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、項目３７の方法。
他の実施形態は特許請求の範囲内に含まれる。

Claims (49)

  1. 樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子と、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子と、リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
  2. 前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子は、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、請求項１に記載の核酸ベクター。
  3. 前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子は、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０である、請求項１又は２に記載の核酸ベクター。
  4. 前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  5. 前記核酸ベクターは、前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現をそれぞれ駆動する第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び第３のプロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  6. 前記核酸ベクターは、前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現を駆動する単一のプロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  7. ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子と、ＩＬ－１２をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
  8. ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子と、ＩＬ－１５をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
  9. ＸＣＬ１をコードする遺伝子と、ＧＭＣＳＦをコードする遺伝子と、ＩＬ－１５をコードする遺伝子とを含む、核酸ベクター。
  10. ＤＮＡベクターである、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  11. 環状ＤＮＡベクターである、請求項１０に記載の核酸ベクター。
  12. 前記環状ＤＮＡベクターは、細菌の複製起点、薬剤耐性遺伝子、及び組換え部位を欠いた合成環状ＤＮＡベクターである、請求項１１に記載の核酸ベクター。
  13. 前記核酸ベクターは、２．５ｋｂ～２０ｋｂの長さである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  14. 前記核酸ベクターは、３．５ｋｂ～１０ｋｂの長さである、請求項１３に記載の核酸ベクター。
  15. ５’→３’方向で、前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子と、前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子と、前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子とを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  16. ５’→３’方向で、
    （ａ）プロモーターと、
    （ｂ）（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写するレプリカーゼをコードする配列及び（ｉｉ）１つ以上の異種タンパク質をコードする配列を含む自己複製ＲＮＡ分子をコードする配列と、
    （ｃ）ポリアデニル化配列と、
    を含む環状ＤＮＡベクターであって、細菌の複製起点及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠いている、環状ＤＮＡベクター。
  17. 前記環状ＤＮＡベクターは、組換え部位を欠いた合成環状ＤＮＡベクターである、請求項１６に記載の環状ＤＮＡベクター。
  18. 前記１つ以上の異種タンパク質をコードする配列は、１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１６又は１７に記載の環状ＤＮＡベクター。
  19. 前記１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及び／又はリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１８に記載の環状ＤＮＡベクター。
  20. 前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子は、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ５、又はＣＣＬ４である、請求項１９に記載の環状ＤＮＡベクター。
  21. 前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子は、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭＣＳＦ、又はＣＤ４０である、請求項１９又は２０に記載の環状ＤＮＡベクター。
  22. 前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、又はＣＸＣＬ１０である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡベクター。
  23. 前記核酸ベクターは、１０ｋｂ～１３ｋｂの長さである、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡ。
  24. 前記核酸ベクターは、約１１．５ｋｂの長さである、請求項２３に記載の環状ＤＮＡベクター。
  25. ５’→３’方向で、前記樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子と、前記リンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子と、前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子とを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡベクター。
  26. （ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸ベクター、又は請求項１６～２５のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡベクターと、（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  27. 個体における癌を治療する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸ベクター、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡベクター、又は請求項２６に記載の医薬組成物を、前記癌を治療するのに有効な量で前記個体に投与することを含む、方法。
  28. 調節を必要とする個体における腫瘍微小環境を調節する方法であって、
    （ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸ベクター、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の環状ＤＮＡベクター、又は請求項２６に記載の医薬組成物を前記個体に投与することと、
    （ｂ）電界を前記腫瘍微小環境内に伝達することで、前記電界が前記核酸分子又は前記環状ＤＮＡベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより調節タンパク質をコードする遺伝子を前記腫瘍細胞に送達して、前記個体における前記腫瘍微小環境を調節することと、
    を含む、方法。
  29. 工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記核酸ベクター、前記環状ＤＮＡベクター、又は前記医薬組成物を腫瘍内投与する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記核酸ベクター、前記環状ＤＮＡベクター、又は前記医薬組成物を全身投与する、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記核酸ベクター、前記環状ＤＮＡベクター、又は前記医薬組成物を追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 調節を必要とする個体における腫瘍微小環境を調節する方法であって、
    （ａ）樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を含む非ウイルス性核酸ベクターを投与することと、
    （ｂ）電界を前記腫瘍微小環境内に伝達することで、前記電界が前記非ウイルス性核酸ベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより前記樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子を前記腫瘍細胞に送達して、前記個体における前記腫瘍微小環境を調節することと、
    を含む、方法。
  35. 工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記非ウイルス性核酸ベクターを腫瘍内投与する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記非ウイルス性核酸ベクターを全身投与する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記非ウイルス性核酸ベクターを追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 発現を必要とする個体における腫瘍微小環境内のタンパク質を発現させる方法であって、
    （ａ）前記タンパク質をコードする合成環状ＤＮＡベクターを投与することと、
    （ｂ）電界を前記腫瘍微小環境内に伝達することで、前記電界が前記合成環状ＤＮＡベクターの腫瘍細胞内への導入を促進し、それにより前記タンパク質をコードする配列を前記腫瘍細胞に送達して、前記個体における前記腫瘍微小環境内で発現させることと、
    を含む、方法。
  41. 工程（ｂ）は、パルス電界を伝達することを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記パルス電界を腫瘍内に配置された電極を介して伝達する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記合成環状ＤＮＡベクターを腫瘍内投与する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記合成環状ＤＮＡベクターを全身投与する、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記合成環状ＤＮＡベクターを追加の抗癌療法と組み合わせて投与する、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記タンパク質は、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記合成環状ＤＮＡベクターは、樹状細胞の化学誘引物質をコードする遺伝子、樹状細胞の成長因子又は活性化因子をコードする遺伝子、及びリンパ球のシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子をコードする、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記合成環状ＤＮＡベクターは、複製起点、薬剤耐性遺伝子、又は組換え部位をいずれも含まない、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記合成環状ＤＮＡベクターは、細菌性骨格を含まない、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
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