CN113061575B - 从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法 - Google Patents

从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞分离纯化技术领域，公开了一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，步骤：小鼠结肠加细胞解离液孵育；加细胞消化液孵育，过滤，将结肠加HBSS中离心，去除上清液加HBSS重悬，并加壳聚糖包覆改性羰基铁，用金属过滤网过滤，在过滤时对过滤网通2～5mA的微弱电流，得过滤液；用44％第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％第二Percoll液的离心管离心；收集中间层细胞，再离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。本发明能够克服大龄小鼠结肠固有层中结缔组织对固有淋巴样细胞的分离纯化的影响，提高大龄小鼠肠粘膜中固有淋巴样细胞的分离纯度和绝对细胞数量。

Description

从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞分离纯化技术领域，尤其涉及一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法。
背景技术
固有淋巴样细胞(Innate lymphoid cells，简称ILC)是一类近些年来见诸于报道的特殊淋巴细胞，缺乏重排的抗原特异性受体。ILC家族主要分为ILC1、ILC2、ILC3、ILCreg，还包括NK细胞和淋巴组织诱导细胞(LTi)。目前发现，ILC可以从组织微环境中接收其它细胞的信号，在粘膜表面发挥着重要的免疫作用。他们可以调节组织内动态平衡、粘膜和非粘膜组织的炎症与修复；其主要存在于小肠、结肠、肺、皮肤、脂肪组织、淋巴组织等部位。ILC主要通过分泌细胞因子、通过与间质细胞以及其它免疫细胞之间的相互作用发挥效应作用。
随着免疫活性细胞分离方法的进步，肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视，肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中，因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受，同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠黏膜主要由上皮层、固有层及浆膜层构成，含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞，是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所，其功能与感染、肿瘤等多种疾病密切相关。近年针对ILC的研究逐渐兴起，有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平。对肠黏膜中原代ILC进行分离纯化是开展此类研究的关键前提条件。
申请号的CN201810208300.7的专利申请文件公开了一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，具体过程包括：获取动物结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；移除上清液，加入中和液1，搅拌；移除上清液，加入中和液2，静置分离；移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；所得滤液离心后用Percoll液重悬后移至底部铺有Percoll液的离心管；离心，中间层细胞收集，离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬所得的细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。
上述技术方法虽然能够从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞，但是其只适用于从小龄小鼠(周龄16周以下)的小肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞，而对于大龄小鼠(周龄16周以上)，由于大龄小鼠肠粘膜中，尤其是结肠固有层中的结缔组织较多，在分离纯化固有淋巴样细胞时，结肠固有层中的结缔组织不易分离去除，导致固有淋巴样细胞分离后的纯度较低，固有淋巴样细胞绝对数量较少，影响后期对固有淋巴样细胞的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，能够克服大龄小鼠结肠固有层中的结缔组织对固有淋巴样细胞的分离纯化的影响，提高大龄小鼠结肠固有层中固有淋巴样细胞的分离纯度和绝对细胞数量，利于固有淋巴样细胞的后期研究。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，包括以下步骤，
A1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行旋涡；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次旋涡，得到第一混合液；
A3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；氢氧化铁和氢氧化铝溶液的加入，可以对第一混合液中的部分结缔组织进行絮凝，并且可以使得Fe3+、Al3+与部分结缔组织进行吸附，使得在进行初滤的时候能够将大部分的结缔组织过滤分离出去，便于下一步结缔组织的精过滤；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800g离心10～20分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；
A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，收集沉淀；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。
进一步，所述步骤A1和A2中细胞解离液均为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1。
进一步，所述步骤A3中细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液。
进一步，所述步骤A3中D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1。
进一步，所述步骤A6和A7中再次离心采用20℃、800g离心10～20分钟。
进一步，所述稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100。
进一步，所述步骤A7中抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2或其任意的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1或其任意的组合。
进一步，所述步骤A8中流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。
进一步，所述壳聚糖包覆改性羰基铁的制备方法，包括以下步骤，
B1、按质量份数，取5～8份的纳米羰基铁粉末放入容器中，加入20～30份的无水乙醇，使用超声分散10～15分钟，加入10～15份的氨水，然后加热到35～40℃，在搅拌状态下逐滴加加入3～5份的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4～5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤并烘干，得到改性羰基铁；
B2、取8～10份的壳聚糖颗粒溶于100～200份的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以20～30kHz的功率超声后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒温下搅拌1h，静置；
B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在搅拌状态下滴入Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1～2h；
B4、静置后，以6000～8000r/min的速率搅拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；
B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。
本发明的有益效果：
本发明将壳聚糖与改性羰基铁制备成为壳聚糖包覆改性羰基铁，使得改性羰基铁能够填充于壳聚糖内，壳聚糖包覆改性羰基铁的壳聚糖表面具有很好的吸附能力，其在加入到第二混合液中，能够大量的吸附第二混合液中的结缔组织，当第二混合液使用金属过滤网进行过滤时，因为过滤网上通有2～5mA的微弱电流，使得金属过滤网周边具有微弱的电场，当吸附有结缔组织的改性羰基铁的壳聚糖通过金属过滤网时，金属过滤网能够对吸附有结缔组织的改性羰基铁的壳聚糖进行吸附，阻挡在过滤网上，从而第三混合液过滤后的过滤液中基本不含有结缔组织等杂质，从而在使用44％的第一Percoll液和67％的第二Percoll液进行重悬和离心后，其中间层细胞中的固有淋巴样细胞纯度更高，从而可以提高大龄小鼠结肠固有层中固有淋巴样细胞的分离纯度，绝对细胞数量更多，利于固有淋巴样细胞的后期研究。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细说明：
实施例1、
本实施例进行壳聚糖包覆改性羰基铁的制备，制备方法包括以下步骤，
B1、称取5g粒径为8～10nm的羰基铁粉末放入反应瓶容器中，加入20g的无水乙醇，使用频率为20kHz功率的超声分散10分钟，然后加入10g的氨水，将反应瓶放入水浴中加热到35℃，在20r/min的搅拌状态下逐滴加加入3g的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤，并于50℃的温度下烘干，得到改性羰基铁；
B2、称取8g的壳聚糖颗粒溶于100g的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以20kHz的功率超声10分钟后，加入40g的乙酸，在40℃的水浴恒温下搅拌1小时，静置1小时；
B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入30g的正己烷，在20r/min搅拌状态下滴入10g的Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1g的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1h；
B4、静置后，以6000r/min的速率搅拌10min，然后逐滴加入8g的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；
B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。
实施例2、
本实施例进行壳聚糖包覆改性羰基铁的制备，制备方法包括以下步骤，
B1、称取6.5g粒径为9nm的羰基铁粉末放入反应瓶容器中，加入25g的无水乙醇，使用频率为25kHz功率的超声分散12分钟，然后加入12g的氨水，将反应瓶放入水浴中加热到37℃，在25r/min的搅拌状态下逐滴加加入4g的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4.5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤，并于50℃的温度下烘干，得到改性羰基铁；
B2、称取9g的壳聚糖颗粒溶于150g的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以25kHz的功率超声12分钟后，加入25g的乙酸，在40℃的水浴恒温下搅拌1小时，静置1小时；
B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入35g的正己烷，在25r/min搅拌状态下滴入15g的Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1.5g的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1.5h；
B4、静置后，以7000r/min的速率搅拌15min，然后逐滴加入9g的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；
B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。
实施例3、
本实施例进行壳聚糖包覆改性羰基铁的制备，制备方法包括以下步骤，
B1、称取8g粒径为10nm的羰基铁粉末放入反应瓶容器中，加入30g的无水乙醇，使用频率为30kHz功率的超声分散15分钟，然后加入15g的氨水，将反应瓶放入水浴中加热到40℃，在30r/min的搅拌状态下逐滴加加入5g的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤，并于50℃的温度下烘干，得到改性羰基铁；
B2、称取10g的壳聚糖颗粒溶于200g的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以30kHz的功率超声15分钟后，加入50g的乙酸，在40℃的水浴恒温下搅拌1小时，静置1小时；
B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入40g的正己烷，在30r/min搅拌状态下滴入20g的Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和2g的三乙烯四胺，40℃恒温下静置2h；
B4、静置后，以8000r/min的速率搅拌20min，然后逐滴加入10g的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；
B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。
实施例4、
本实施例进行固有淋巴样细胞的提取前，进行肠组织的分离，具体为：
在实验开始之前，准备10厘米培养皿加入冰冷的PBS，放在冰上。打开周龄16～40周小鼠的腹膜腔后，用镊子将结肠和结肠轻轻移出腹膜腔。并尽可能的在此过程中去除肠系膜脂肪。切下盲肠，将结肠和结肠放入装有PBS的单独培养皿中。用直的23毫米边缘剪刀纵向切开肠子，然后在培养皿中快速旋转以除去大部分粪便。将肠转移到装有25mL冰冷PBS的50ml EP锥形管，然后旋紧试管并剧烈摇动。用新鲜的PBS代替PBS，然后重复此步骤，直到在组织上不再检测到粪便为止。
固有淋巴样细胞的提取方法包括以下步骤，
A1、将一只小鼠的结肠经清洗、剪碎后置于离心管中，加入10ml的细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20分钟后进行旋涡；细胞解离液为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20分钟后再次旋涡，得到第一混合液，本步骤的细胞解离液与步骤A1中的细胞解离液配方比例相同；
A3、将再次旋涡后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3mol/L的氢氧化铁和0.1mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20分钟，得到第二混合液，细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液，其中，D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入实施例2中制备得到的壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800g离心10分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀，离心采用20℃、800g离心10分钟；
A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，离心采用20℃、800g离心10分钟，收集沉淀，稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100，所述抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1的组合；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞；流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。
实施例5、
本实施例的固有淋巴样细胞的提取方法包括以下步骤，
A1、将一只小鼠的结肠经清洗、剪碎后置于离心管中，加入10ml的细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育25分钟后进行旋涡；细胞解离液为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育25分钟后再次旋涡，得到第一混合液，本步骤的细胞解离液与步骤A1中的细胞解离液配方比例相同；
A3、将再次旋涡后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到2℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.4mol/L的氢氧化铁和0.15mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育25分钟，得到第二混合液，细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液，其中，D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入实施例2中制备得到的壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用70μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通3.5mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800g离心15分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀，离心采用20℃、800g离心15分钟；
A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，离心采用20℃、800g离心15分钟，收集沉淀，稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100，所述抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1的组合；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞；流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。
实施例6、
本实施例的固有淋巴样细胞的提取方法包括以下步骤，
A1、将一只小鼠的结肠经清洗、剪碎后置于离心管中，加入10ml的细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育30分钟后进行旋涡；细胞解离液为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育30分钟后再次旋涡，得到第一混合液，本步骤的细胞解离液与步骤A1中的细胞解离液配方比例相同；
A3、将再次旋涡后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.5mol/L的氢氧化铁和0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育30分钟，得到第二混合液，细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液，其中，D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入实施例2中制备得到的壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通5mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800g离心20分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀，离心采用20℃、800g离心20分钟；
A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，离心采用20℃、800g离心20分钟，收集沉淀，稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100，所述抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1的组合；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞；流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。
实施例7、
本实施例与实施例5对比，其区别仅仅在于步骤A4，其余步骤相同，本实施例的步骤A4中使用的为实施例1制备的壳聚糖包覆改性羰基铁。
实施例8、
本实施例与实施例5对比，其区别仅仅在于步骤A4，其余步骤相同，本实施例的步骤A4中使用的为实施例3制备的壳聚糖包覆改性羰基铁。
对比实施例、
对比实施例与实施例5对比，其区别仅仅在于步骤A4，其余步骤相同，本实施例的步骤A4为：对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，再使用70μm金属过滤网过滤，得到过滤液。
最终通过实施例4-实施例6，以及对比实施例的对比，经多次抗体筛选后，其固有淋巴样细胞比例和绝对细胞数如下表所示：
Figure BDA0002992778450000111
从上述的结果中，实施例4-实施例6与对比实施例对比可以看出，将壳聚糖包覆改性羰基铁加入到第二混合液中，能够大量的吸附第二混合液中的结缔组织，当第二混合液使用金属过滤网进行过滤时，因为过滤网上通有微弱电流，使得金属过滤网周边具有微弱的电场，当吸附有结缔组织的改性羰基铁的壳聚糖通过金属过滤网时，金属过滤网能够对吸附有结缔组织的改性羰基铁的壳聚糖进行吸附，阻挡在过滤网上。最终第三混合液过滤后的过滤液中基本不含有结缔组织等杂质，从而在使用44％的第一Percoll液和67％的第二Percoll液进行重悬和离心后，其中间层细胞中的固有淋巴样细胞纯度更高，从而可以提高大龄小鼠结肠固有层中固有淋巴样细胞的分离纯度，绝对细胞数量更多。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (8)

1.从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤，
A1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行涡旋混匀；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次涡旋混匀，得到第一混合液；
A3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800×g离心10～20分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；
A7、用稀释后抗体混悬步骤A6所得的细胞团，离心，收集沉淀；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞；
所述壳聚糖包覆改性羰基铁的制备方法，包括以下步骤，
B1、按质量份数，取5～8份的纳米羰基铁粉末放入容器中，加入20～30份的无水乙醇，使用超声分散10～15分钟，加入10～15份的氨水，然后加热到35～40℃，在搅拌状态下逐滴加入3～5份的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4～5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤并烘干，得到改性羰基铁；
B2、取8～10份的壳聚糖颗粒溶于100～200份的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以20～30kHz的功率超声后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒温下搅拌1h，静置；
B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在搅拌状态下滴入Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1～2h；
B4、静置后，以6000～8000r/min的速率搅拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；
B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。
2.根据权利要求1所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A1和A2中细胞解离液均为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1。
3.根据权利要求2所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mL DNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1。
5.根据权利要求4所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A6和A7中再次离心采用20℃、800×g离心10～20分钟。
6.根据权利要求5所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100。
7.根据权利要求6所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A7中抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2或其任意的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1或其任意的组合。
8.根据权利要求7所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A8中流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。
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