CN104357393B - 一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。本发明首先采用物理研磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋巴细胞的纯化；磁珠二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明分离培养所得的目标细胞纯度高达90％。本发明解决了分离培养鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，从而为鸡肠道上皮γδT细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
γδT细胞是近20年人们新认识的1种T细胞亚群，其在机体出现异常变化时做出的反应比αβT细胞更为迅速。与人和其他哺乳动物外周血中只有很少比例(3％～5％)，γδT细胞不同，家禽外周血中γδT细胞占到约50％左右。在受到病原体入侵时，家禽黏膜上皮和外周血中的γδT细胞在机体初期防御中发挥重要作用。但是长期以来鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养一直较为困难。传统研究多集中于体外扩增淋巴细胞并选择性计数γδT细胞(董思源.γδT细胞体外扩增，i-IELs分离和免疫荧光技术的建立.天津:南开大学，2011)，这种方法并未将γδT细胞与其他淋巴细胞分离开。由于γδT细胞的增殖受到多种淋巴细胞分泌的细胞因子的影响，而且体外扩增过程已将γδT细胞活化，故传统方法并不能完全独立研究其静息态下的生物、免疫活性及其激活机制。利用分离自21～35日龄肉仔鸡肠道上皮γδT细胞进行体外分离培养试验，与之相比，具有明显的优点。该方法分离出的肠道上皮γδT细胞，不受机体肠道其他淋巴细胞的影响，不受肠道食糜中某些活性成分的刺激，并能保持较静息态和一定程度的特异性和免疫性，本方法的建立有利于肉仔鸡肠道中该细胞进一步研究。因此，鸡肠道上皮γδT细胞分离培养方法的建立，为研究鸡肠道上皮γδT细胞生物学和免疫学奠定了基础。
鸡肠道上皮细胞的离散是本方法的重要环节。常用方法为剪碎肠道壁后，消化酶消化，但消化酶价格昂贵，然其种类和用量均难确定，处理时间也难以把握。这为肠道上皮淋巴细胞的分离带来了很大的困难。
鸡肠道上皮淋巴细胞的分离是本方法的又一重要环节。由于淋巴细胞分离液密度不合适，往往造成分离细胞纯度不高，肠道上皮细胞大量混杂其中。进而大大浪费了下一步操作中抗体和磁珠的用量，增加操作成本。
此外，对鸡肠道上皮γδT细胞研究，常用方法为混合淋巴细胞培养，给予目标刺激后，研究其增殖情况及生物免疫活性。但γδT细胞增殖活化与其他淋巴细胞分泌的细胞因子及其接触的肠道上皮细胞都有密切关系。混合培养，并不能清晰反映目标刺激对γδT细胞的直接作用，为γδT细胞研究带来较大问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，降低细胞分离过程中的污染风险和成本，减少因分离时间过长带来的诸多弊端，同时，能够提高目标细胞的纯度。
本发明解决的上述技术问题所采用的技术方案为：
1.一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；
步骤2：制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；
步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；
步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；
步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；
步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。
2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1％(V/V)。
3.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤1所述的肠段为空肠中段。
4.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤2中所述的混合消化酶为胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂其质量比为为2:1。
5.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤3中无血清RPMI-1640培养液为RPMI-1640细胞培养基中加入(V/V)0.5％双抗、1％L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.2～7.4。
6.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤4不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL的淋巴细胞分离液原液与PBS一定比例配制而得。
7.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCR1抗体，保证其浓度可达每107个细胞悬液中含有20μL抗体；孵化后，离心去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每107个细胞悬液中含有5μL磁珠，孵化离心去上清；PBS重悬细胞，进行细胞分选仪分选。
8.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤1中的禁食时间，24～36h为最佳禁食时间。
本发明的详细描述：
鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法包括以下步骤：
步骤1：对21～35日龄肉仔鸡禁食24～36h，静脉放血处死，75％酒精浸泡10～15min；0.1％新洁尔灭浸泡5～10min。取出肉仔鸡绑定，75％酒精消毒仔鸡腹腿部，破开腹腔；双抗溶液喷于腹部各器官表面，手术镊找到空肠中段，取2～3cm肠段于1％双抗PBS溶液中(V/V)。
步骤2：将溶液移入超净台，纵向剪开肠壁，1％双抗PBS溶液中冲洗，移入无双抗PBS溶液冲洗，手术剪剥离肠壁脂肪和结缔组织，移入无双抗PBS溶液，手术剪将肠壁剪为浆糊状，玻璃研磨器小心研磨；将组织匀浆液移入离心管，离心；去除上清，加入胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂(GIBCO公司)(质量比为2:1)，37℃，5％CO2，摇床震荡15min。
步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640细胞培养液(其中按体积比加入了0.5％双抗、1％L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH调至7.2～7.4)终止消化，离心；去上清，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过100目，200目自制细胞筛(自制细胞筛为经100目和200目绸布紧固于烧杯而成)，离心去上清。
步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；在离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL的淋巴细胞分离液(不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL淋巴细胞分离液原液(TBD Science公司)与PBS一定比例配制而得)；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心去上清，洗涤，即为肠道上皮淋巴细胞；显微镜下计数细胞，约为1×107/mL，细胞活率95％以上。
步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中加入鼠抗鸡TCR1抗体(Souther Biotech公司)，轻轻混匀，孵化10min，离心去上清；PBS重悬细胞，使细胞浓度达到1×105/μL，加入磁珠，孵化15min，离心去上清；PBS重悬细胞5×107/mL；将细胞悬液置于细胞分选仪(MiltenyBiotec GmbH公司，型号:autoMACS)进样口，得到阳性细胞，进行培养。
步骤6：将细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数(>95％)，调整细胞浓度为1×107/mL。之后于96孔细胞培养板，每孔植入190μL细胞悬液，随后加入刀豆球蛋白ConA(终浓度为5μg/mL)，培养体系为200μL。置5％CO2，40℃二氧化碳培养箱培养48h，MTT法染色细胞，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。
本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。与目前常用的混合培养研究鸡肠道上皮γδT细胞相比，本发明关于一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法有较大的创新性和独特性，建立了成熟的鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，分离得到了纯度高且原始静息的鸡肠道上皮γδT细胞，减少了分离过程的污染风险，缩短了分离所需的时间，保证了分离过程中细胞的活力。该方法的建立有利于独立研究鸡肠道上皮γδT细胞的生物活性和免疫活性。
本发明中的鸡肠道上皮淋巴细胞的分离，采用了物理轻微研磨和化学酶消化相结合的方法。物理研磨分离细胞的弊端在于极易破坏细胞膜，减弱细胞活性，但其可缩短分离时间；化学处理方法温和，但酶的种类、浓度以及处理时间难以确定，这样同样带来抑制细胞活性的弊端。本发明先采用物理轻微研磨，即将剪碎的肠道上皮移入玻璃研磨器，轻且慢研磨两次，每次时间不超过10s；该步骤提高了细胞分离的效率，损伤细胞的程度较小；为化学消化奠定了基础。将物理研磨后的细胞移入培养皿中，加入终浓度为0.05％的胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂，37℃，5％CO2，置于摇床震荡15min，即可看见离散较好的细胞。酶消化法较为温和，不易直接损伤细胞，加之之前的物理消化方法，可在较短时间内得到活力较好的细胞。物理研磨加之化学酶消化，得到了离散较好，活力较好的鸡肠道上皮细胞。
密度梯度分离肠道淋巴细胞，利用较为精准的密度淋巴细胞分离液，得到了纯度较高的淋巴细胞，从而去除了含量较高的肠道上皮细胞及其它杂细胞。
磁珠二抗淋巴细胞分选仪分选，得到纯净的鸡肠道上皮的γδT细胞。先将得到的肠道上皮淋巴细胞与鼠抗鸡TCR1一抗孵化，使TCR1与目标细胞表面的γδ抗原结合，之后加入磁珠孵化，使TCR1与磁珠结合，经由分选仪的磁性分选，得到阳性细胞，即为目标细胞γδT细胞。磁珠二抗分选方法，解决了鸡肠道上皮γδT细胞分离纯度差的问题。使广大科研工作者可以独立研究鸡肠道上皮γδT细胞。
本发明的有益效果
本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。本发明首先采用物理研磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋巴细胞的纯化；磁珠二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明分离培养所得的目标细胞纯度高达90％。本发明解决了分离培养鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，从而为鸡肠道上皮γδT细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。
附图说明
图1：新分离的肉仔鸡肠道上皮γδT细胞图中显示分离得到的肉仔鸡肠道上皮γδT细胞(1×107/mL)。
图2：培养48h的肉仔鸡肠道上皮γδT细胞图中显示培养48h后的肉仔鸡肠道上皮γδT细胞(5×108/mL)。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的内容，下面结合本发明的实施例作进一步详细描述。
实施例1
本实施例以30日龄1.5kg健康白羽肉鸡分离培养肠道上皮γδT细胞。先进行24h的禁食，部污物皮屑，去除腹部及腿部羽毛，浸泡15min；再于0.1％新洁尔灭溶液中浸泡10min；取出肉仔鸡，绑定于手术台上，75％酒精喷于仔鸡腹腿部，破开腹腔；1％双抗溶液喷于腹部各器官表面，手术镊找到空肠中段，取3cm肠段于1％双抗PBS溶液中。
将溶液移入超净台，纵向剪开肠壁，1％双抗PBS溶液中涮洗三次，移入无双抗PBS溶液涮洗两次，手术剪剥离肠壁脂肪和结缔组织，移入无双抗PBS溶液，手术剪将肠壁剪为浆糊状，玻璃研磨器小心研磨2次；将组织匀浆液移入15mL离心管，2500r/min，离心10min；去除上清，加入5mL 0.05％胶原酶混合酶液，37℃，5％CO2，置于摇床震荡15min。
向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，2500r/min，离心10min；去上清，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过100目，200目自制细胞筛，离心去上清。
将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液(配制方法同上)；在15mL离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL的淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，3000r/min，20min离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心去上清，洗涤三次，即为本发明所制备的鸡肠道上皮γδT细胞(肠道上皮淋巴细胞)；显微镜下计数细胞，约为1×107/mL，活率95％以上。
将细胞悬液离心去上清，PBS重悬细胞，使细胞浓度达到1×107/mL，加入鼠抗鸡TCR1一抗，轻轻混匀，保证其浓度可达每107个细胞悬液中含有20μL抗体，4℃孵化10min，2500r/min，离心10min去上清；PBS重悬细胞，再加入磁珠，使其浓度达到每107个细胞悬液中含有5μL磁珠，4℃孵化15min，2500r/min，离心10min去上清；PBS重悬细胞5×107/mL；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞。
收集细胞后，台盼蓝染色，计数活细胞数(>95％)，调整细胞浓度为1×107个/mL。之后于96孔细胞培养板，每孔植入190μL细胞悬液，随后加入刀豆球蛋白Con A(终浓度为5μg/mL)，培养体系为200μL。置5％CO2，40℃二氧化碳培养箱培养48h，每孔轻轻吸弃上清100μL，加入l00μL不含小牛血清的RPMI-1640培养基，同时加入5mg/mL MTT溶液l00μL，继续培养4h，培养结束后，每孔加入100μL DMSO溶液，静置10-15min，使紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。
实施例2
——本发明的方法与传统方法对比试验
对比实验采用传统的0.05％胶原酶Ⅳ消化，37℃，5％CO2，置于摇床震荡45min，促使细胞完全离散。之后经过密度梯度离心，采用磁珠二抗分选后，得到鸡肠道上皮淋巴细胞，检测细胞活力。
发明人使用本方法及对比实施例所述方法，均作了十次试验进行比较，并进行了细胞分离情况的数据统计，如表1比较：
表1 本发明的方法与传统方法分离细胞对比试验
利用本方法分离鸡肠道上皮γδT细胞后，经过48h培养后，对细胞活力和纯度进行流式细胞仪鉴定和数据统计，如表2
表2 本方法分离鸡肠道上皮γδT细胞鉴定和数据统计
表2结果显示，本方法不仅分离得到纯度较高的鸡肠道上皮γδT细胞，而且缩短分离时间，减少了分离过程中的细菌污染。本发明利用物理研磨和化学酶法结合的消化方法，精确密度梯度离心法，磁珠二抗分选法，在细胞培养之后，发现细胞保持了较高的细胞活力和细胞纯度。本方法解决了分离鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，为独立研究鸡肠道上皮γδT细胞的生物学活性和免疫活性奠定了基础。
Claims (8)
1.一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；
步骤2：制备肠壁组织浆液，经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；
步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；
步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；
步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；
步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。
2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1％(V/V)。
3.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤1所述的肠段为空肠中段。
4.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤2中所述的胶原酶混合酶为胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂，其质量比为2:1。
5.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤3中无血清RPMI-1640培养液为RPMI-1640细胞培养基中加入(V/V)0.5％双抗、1％L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.2～7.4。
6.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤4不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL的淋巴细胞分离液原液与PBS一定比例配制而得。
7.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCR1抗体，保证其浓度可达每107个细胞悬液中含有20μL抗体；孵化后，离心去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每107个细胞悬液中含有5μL磁珠，孵化离心去上清；PBS重悬细胞，进行细胞分选仪分选。
8.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤1中的禁食，禁食时间为24～36h。
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