CN101328468B - 抗过敏的乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的乳酸菌菌株，及含一种或多种所述菌株的组合物，其中所述菌株具有现有技术中未知的可用于增进抗过敏的能力，且该组合物为食品或药物组合物形式。本发明还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过增进Th1型免疫反应来调控因过敏而反应过度的Th2型免疫反应的方法。
Description
技术领域
本发明涉及应用在食品或医药中的抗过敏乳酸菌菌株组合物，及其在提高抗过敏能力中的用途。
背景技术
近几年来，过敏疾病有逐年增加的趋势，不论是在异位性皮肤炎、过敏性鼻炎和支气管性气喘的发生率都有增加的情形。目前认为过敏疾病的发生可能与文明的进步有关，包括空气的污染和感染的减少都是导致过敏疾病增加的一些可能原因。而目前气喘的治疗主要依靠药物治疗：如使用类固醇和抑制肥大细胞释放发炎物质的药物、气管扩张剂和免疫疗法等。但是，包括抗发炎药物和气管扩张剂在内的药物治疗还是无法真正的改变过敏免疫反应，所以只能说是治标的方法。而唯一能够说是改变过敏免疫体质的治疗方式，便是所谓的减敏疗法，但是减敏治疗通常需要较长的一段时间，而且有时会出现一些副作用，因此也不能用于所有的病人。
有关过敏疾病的增加，目前认为跟大环境的变化有密切关系，特别是在环境方面有更明显的关系。人体肠道中的益生菌会刺激免疫系统作用，但如果在日常生活中食品所含抗生素或是类固醇的含量太高的话，都会导致肠道内的益生菌降低，因而无法有效地刺激免疫细胞中辅助型T细胞1(Th1)的生成，而这些辅助型T细胞1的生成与辅助型T细胞2(Th2)相关过敏疾病的发生有着密切联系。因此，如果能利用保健食品刺激免疫系统，激发可以调节过敏免疫反应中的Th1型免疫反应来平衡过敏所引发的Th2型免疫反应，将可达到改善过敏体质的效果。
在人类应用微生物的历史上，乳酸菌的应用起源相当早。从早期乳制品的加工上发现，食用以乳酸菌发酵的食品，有助于改善人类肠胃道疾病的发生率以及延长平均寿命。由此，引发许多学者开始研究探讨乳酸菌在促进人体健康中所起的作用。1954年提出功能性乳酸菌之后，在几年间不断掀起研究的热潮，并于1965年由Lilly DM等人正式提出Probiotic-益生菌的概念，使之成为功能性乳酸菌的统称。
一般食用含乳酸菌(LAB)的产品仅具有调整肠道的健康效果，虽然有数以万计的乳酸菌菌株存在于自然界，但仅有少数乳酸菌株具有抗过敏的特质。少数这些细菌株所具有的耐酸与耐胆盐能力、吸附粘膜表皮细胞的能力及在通过肠胃道后仍可存活的能力等特性，是筛选具有促进健康效果的菌株时的重要依据。时至今日，仅有少数几株乳酸菌菌株经证明具有抗过敏的健康效果，而乳酸菌对身体健康的功能在于菌株(strain)的特异性而非菌种(species)，这种对人类身体健康具有特殊功效的菌株被称为功能性益生菌(Guidelines for theevaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group ondrafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；“食品益生菌评估指南”，FAO/WHO联合工作组关于起草食品益生菌评估指南的报告，LondonOntario，Canada，2002年4月30日和5月1日：1-7)。
过敏疾病，例如过敏性湿疹、荨麻疹、反复发作的过敏性鼻炎及过敏性气喘，在台湾及其它发达国家中已成为严重的社会问题。导致过敏疾病流行程度的上升是有原因的，众所皆知的卫生学假说为：婴幼儿接触免疫刺激病原体的机会愈少，愈容易引发过敏相关疾病(Strachan，1989)。过敏疾病发生时，人体内的免疫反应会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反应朝向Th2途径，形成体液免疫反应，例如IgE的产生及嗜伊红细胞过多等(Romagnani，1994；Holt，1995)。
在爱沙尼亚及瑞典这两个国家的儿童人口中发现，患过敏疾病的儿童肠道内的乳酸杆菌比无过敏疾病的孩童要少(
等，1999)。乳酸杆菌被认为可促进Th1的免疫反应进而改善过敏症状(Cross等，2001)。再者，在以卵白蛋白诱发小鼠过敏的动物实验模型中发现，让小鼠以口服方式食用热处理后的干酪乳酸菌Shitota株(Lactobacillus casei strain Shitota)，可抑制小鼠血清中IgE的含量(Matsuzaki等，1998)。此外，在以酪蛋白诱发小鼠过敏的动物实验模型中证明，腹腔注射热处理后的胚芽乳酸杆菌L-137(Lactobacillus plantarum L-137)，也可抑制IgE的产生(Murosaki等，1998)。在由豕草花粉过敏引起的过敏症状中，口服粪肠球菌(Enterococcus faecalis)FK-23萃取物，可使腹膜内聚集的嗜伊红细胞细胞量减少(Shimada等，2003)。人体的临床试验中，于孕妇待产期间服用糖和鼠李糖乳杆菌菌株GG(Lactobacillus rhamnosus strain GG)，发现在婴儿出生后两年(
等，2001)及婴儿期后(
等，2003)，可降低婴幼儿发生过敏性湿疹的风险及发生率。鼠李糖乳杆菌19070-2及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM122460也可以适度地改善患有异位性皮肤炎的儿童的严重湿疹过敏症状(Rosenfeldt等，2003)。
发明内容
本发明一方面广义上包括由下列任一种生物性纯培养物与生理上可接受的赋形剂或稀释剂组成的组合物：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207038；加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207039；唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207040；约氏乳酸杆菌(Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207041；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207042。
在本发明的一项具体实施方式中，该组合物含有一种或一种以上所述菌株，优选的生理上可接受的赋形剂或稀释剂是一种食品，该食品可以是酸酵乳、酸乳酪(yogurt)、乳酪、乳制饮品、乳粉、茶饮料或咖啡中的任何一种。或者，该组合物是药物组合物，且其赋形剂或稀释剂应为药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
在另一项具体实施方式中，采用了具有增强抗过敏能力的、生理上可接受的下列任一种菌株的同种或突变种的生物性纯培养物：嗜酸乳杆菌PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌PM-A0013菌株。
此外，在另一项具体实施方式中，本发明可广义包括通过促进白介素-12(IL-12)或干扰素γ调控Th1型免疫反应而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反应过度的过敏现象的方法，所述方法包括给予哺乳动物可达到刺激Th1型免疫效果剂量的任一种前述生物性纯培养物。
再者，在另一项具体实施方式中，采用了前述所定义菌株中一种以上生物性纯培养物，优选以组合物的形式给予该培养物与生理上可接受的赋形剂或稀释剂，其中所述生理上可接受的赋形剂或稀释剂优选为食品，该食品优选是酸酵乳、酸乳酪、乳酪、乳制饮品、乳粉、茶饮料或咖啡中的任一种。或者，该组合物是药物组合物，且其赋形剂或稀释剂应为药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
在另一项具体实施方式中，提供了上述任一或多种生物性纯培养物在制备用于刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素的药物中的用途。
本发明亦可广义的包括本申请说明书中单独或总合说明的部分、其构成要件与特征，及任何包含这些部分、构成要件与特征中任何一种或多种的任何组合或其全部的组合，且若本文所述及的明确完整事物已在与本发明有关之相关技术中出现已知的同等物时，这些已知的同等物将视为独立事项并入本文中。
附图说明
图1显示：分别将106至108个cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0013菌株与105至107个人类外周血单核细胞(PBMC)共同培养48小时后，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中，以无抗过敏功能的乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249，Lactobacillus casei BCRC12249-台湾食品工业发展研究所)为阴性对照组，PHA为阳性对照组，检测干扰素γ的受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类外周血单核细胞(PBMC)分泌干扰素γ，与阴性对照组有显著性差异。
图2显示：分别将热灭活的106至108个cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0013菌株与105至107个人类树突状细胞(dendritic cell)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测白介素IL-12在上清液中的含量。其中，以无抗过敏功能的乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249-台湾食品工业发展研究所)为阴性对照组，PHA为阳性对照组，检测白介素-12(IL-12)的受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类树突状细胞分泌白介素-12(IL-12)，与阴性对照组有显著性差异。
图3显示：试验结果显示市售抗过敏乳酸菌在培养基的活化后，经由酸性缓冲溶液及胆盐处理后，菌数明显下降；而本发明具有调节过敏作用的保藏乳酸菌株在培养基活化后，用酸性缓冲溶液及胆盐处理，PM-A0006、PM-A0009、PM-A0013菌数并不受胃酸胆碱改变影响而急剧下降，PM-A0002及PM-A0005不受胃酸影响(菌数证明其对胃酸具有耐受性)，而将菌株经由胆盐处理时，虽然菌数有些许的下降，但对胆盐仍有耐受性，证明这五株抗过敏的乳酸菌株可以通过人体消化系统严格环境的考验。
图4显示：依据Jacobsen等学者(1999)的分析方法，当每个视野的平均菌数少于40个时，判定为“不附着(nonadhesive)”；当每个视野的平均菌数介于41个至100个时，判定为“附着(adhesive)”；当每个视野的平均菌数大于100个时，判定为“强烈附着(strongly adhesive)”。结果显示嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株等四株抗过敏菌株均判定“强烈附着”，而嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株则判定为“附着”。
图5显示：抗过敏乳酸菌改善过敏实验的设计流程，将管饲抗过敏乳酸菌的阶段分为四期：第一期为0～22天；第二期为23～36天；第三期为37～50天；第四期为51～53天。其间以腹腔注射卵白蛋白(OVA)致敏小鼠，分四次致敏，第一次为开始管饲的第2天；第二次为开始管饲的第16天；第三次为开始管饲的第30天；第四次为开始管饲的第44天。对通过腹腔注射卵白蛋白(ovalbumin；OVA)致敏的小鼠进行隔周抽血，检查小鼠体内IgE含量的变化。于处死小鼠前4天(第54天)以鼻粘膜吸入方式致敏小鼠连续2天后，检测小鼠的肺呼吸阻力反应，隔天处死小鼠进行其它生化值的检测。
图6显示：为小白鼠补充唾液乳酸杆菌PM-A0006乳酸菌株时，以卵白蛋白致敏的小白鼠血清中卵白蛋白(OVA)特异性抗体效价部分，随着喂食剂量增加，卵白蛋白(OVA)致敏小鼠血清中的卵白蛋白(OVA)特异性IgE抗体有减少的趋势。
图7显示：为小白鼠补充唾液乳酸杆菌PM-A0006乳酸菌株时，以卵白蛋白致敏的小白鼠肺呼吸阻力部分，相对于对照组，均可在高浓度乙酰甲胆碱(methacholine)刺激下显著减低小鼠Penh值。
图8显示：为小白鼠补充唾液乳酸杆菌PM-A0006乳酸菌株时，以卵白蛋白致敏的小白鼠肺冲洗液中细胞组成部分，相对于对照组，有显著较低的嗜伊红细胞(eosinophil)浸润比例。
图9显示：相对于对照组，喂食PM-A0006乳酸菌可显著降低肺冲洗中嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)的分泌量。
图10显示：相对于对照组，喂食PM-A0006乳酸菌可显著降低肺冲洗中PGE2分泌量。
图11显示：脾脏细胞经ConA或卵白蛋白(OVA)刺激培养48小时后，在ConA刺激下，喂食PM-A0006乳酸菌组的脾脏细胞分泌的干扰素γ显著高于对照组。
具体实施方式
本发明可广义的包括下列任一种生物性纯培养物：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207038；加氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)PM-A0005菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207039；唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207040；约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207041；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0013菌株，二○○七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号M 207042。
许多文献指出增加辅助型T细胞1的细胞激素包括白介素-12(IL-12)、干扰素γ(IFN-gamma)的分泌增加，可以有效改善过敏症状；进一步的研究也指出特定的乳酸菌株和树突状细胞上Toll样受体(Toll-like receptor)结合，活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，属于先天免疫的一个环节，因此某些特定的乳酸菌菌种借由其细胞壁多糖类物质如肽聚糖(peptidoglycan)、脂多糖(lipopolysaccharide)、多糖(polysaccharide)等，经先天免疫系统，确实能活化T细胞的发育。
该五株细菌菌株的冷冻干燥培养物已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学。保藏的详细资料如表1所示：
表1
| 菌株名 | 编号 | 日期 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0002 | M 207038 | 2007年04月6日 |
| 加氏乳酸杆菌PM-A0005 | M 207039 | 2007年04月6日 |
| 唾液乳酸杆菌PM-A0006 | M 207040 | 2007年04月6日 |
| 约氏乳酸杆菌PM-A0009 | M 207041 | 2007年04月6日 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0013 | M 207042 | 2007年04月6日 |
已发现如上所列保藏的这五株乳酸菌具有抗过敏的能力，包括对于异位性皮肤炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、食物过敏及气喘的症状有减缓及治疗的功能。
实施例
实施例1：五株抗过敏乳酸菌的形态学及一般性质
根据16S rDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。发现，东宇菌株编号PM-A0002为嗜酸乳杆菌；东宇菌株编号PM-A0005为加式乳酸杆菌；东宇菌株编号PM-A0006为唾液乳酸杆菌；东宇菌株编号PM-A0009为约式乳酸杆菌；及东宇菌株编号PM-A0013为嗜酸乳杆菌。此五株菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于表2：
表2
实施例2：抗过敏乳酸菌对通过促进干扰素γ的分泌来调控Th1型免疫能力的作用(以外周血单核细胞为体外功效验证平台)
检测五株抗过敏乳酸菌株：嗜酸乳杆菌PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌PM-A0013菌株对Th1型免疫能力的增进效果，通过测定人类外围血液单核细胞与抗过敏乳酸菌共同培养后干扰素γ的分泌量，来筛选具有抗过敏能力的菌株。使用如下的实验步骤：
1.抽取适量人类血液，每次约200ml。
2.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与血液在18-20℃下以400g离心30-40分钟。
3.取人类外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)层，用缓冲溶液清洗细胞2-3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。
4.将细胞与已活化3天的乳酸菌株以1∶10比例共同培养48小时。
5.收取细胞培养之上清液。利用酶联免疫分析法(ELISA)检测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。
数据统计分析如表3及图1所示，以平均值±SD表示。图1所示为：分别以106至108个cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株与105至107个人类外周血单核细胞(PBMC)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中，以无抗过敏功能的乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249)为阴性对照组，PHA(phyohenagglutimin)为阳性对照组，检测干扰素γ受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类外周血单核细胞(PBMC)分泌干扰素γ，与阴性对照组有显著性差异。表3为分别以五株抗过敏菌株与人类外周血单核细胞一起培养，刺激干扰素γ的分泌量(平均值±SD)：
表3
| 菌株名称 | 干扰素γ的分泌量(pg/ml) |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0002 | 19833±2767 |
| 加式乳酸杆菌PM-A0005 | 46625±3624 |
| 唾液乳酸杆菌PM-A0006 | 25850±2347 |
| 约氏乳酸杆菌PM-A0009 | 25725±2008 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0013 | 17416±2803 |
| 阴性对照组(干酪乳酸菌BCRC 12249) | 11±2.3 |
| 阳性对照组 | 44666±2488 |
实施例3：抗过敏乳酸菌对白介素(IL-12)的分泌调控的Th1型免疫能力的作用(以树突状细胞为体外功效验证平台)
检测五株抗过敏乳酸菌株：嗜酸乳杆菌PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌PM-A0013菌株对Th1型免疫能力的增进效果，通过测定人类树突状细胞与抗过敏乳酸菌共同培养后白介素-12(IL-12)的分泌量，来筛选具有抗过敏能力的菌株。使用如下的实验步骤：
1.抽取适量人类血液，每次约200ml。
2.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与血液在18-20℃下以400g离心30-40分钟。
3.取人类外周血单核细胞(PBMC)层，用缓冲溶液清洗细胞2-3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。
4.以CD14+微球(MiniMACS system)纯化人类外周血单核细胞(PBMC)中的CD14+单核细胞。
5.以细胞激素(IL-4)及生长激素GM-CSF刺激细胞分化成树突状细胞，6-7天的培养时间后，收集已分化的树突状细胞。
6.将抗过敏乳酸菌株在共同培养之前3天活化，之后以100℃热灭活乳酸菌株30分钟。
7.将树突状细胞与已热灭活的乳酸菌株以1∶10比例共同培养48小时。
8.收集细胞培养上清液。利用酶联免疫分析法(ELISA)检测白介素(IL-12)在上清液中的含量。
数据统计分析如表4及图2所示，以平均值±SD表示。图2所示为：分别以热灭活106至108个cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株与105至107个人类树突状细胞(dentritic cell)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法检测白介素(IL-12)在上清液中的含量。其中，以无抗过敏功能乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249)为阴性对照组，PHA为阳性对照组，检测白介素(IL-12)受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类树突状细胞分泌白介素-12(IL-12)，与阴性对照组有显著性差异。表4所示为分别以五株热灭活抗过敏菌株与树突状细胞一起培养，刺激白介素(IL-12)的分泌量(平均值±SD)：
表4
| 菌株名称 | 白介素(IL-12)的分泌量(pg/ml) |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0002 | 15019±569 |
| 加式乳酸杆菌PM-A0005 | 19222±212 |
| 唾液乳酸杆菌PM-A0006 | 18625±365 |
| 约氏乳酸杆菌PM-A0009 | 18291±39 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0013 | 17836±168 |
| 阴性对照组(干酪乳酸菌BCRC 12249) | 80±15 |
| 阳性对照组 | 13786±341 |
实施例4：抗过敏乳酸菌耐胃酸胆盐试验
检测五株抗过敏乳酸菌株：嗜酸乳杆菌PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌PM-A0009菌株或嗜酸乳杆菌PM-A0013菌株，是否具有通过胃酸胆盐考验的能力，从而得以顺利地在肠道发挥其抗过敏的功能，试验流程如下：
1.将五株抗过敏乳酸菌活化3天。
2.取1mL菌液计算原始菌数，剩余的乳酸菌以500g离心10分钟，加入去离子水清洗乳酸菌2-3次。
3.加入以盐酸调配成pH 2.5的模拟胃酸溶液中，乳酸菌与pH 2.5的培养基充分混合后，置于37℃培养箱。
4.每小时取出1mL菌液以去离子水清洗2-3次后，计算存活细胞数，至3小时培养时间为止。
5.剩余菌液离心后沉淀物再以含1.5％(w/V)牛胆汁(ox gall，Sigma)的模拟胆碱溶液中回溶，充分混合后，于37℃培养。
6.每小时取出1mL之菌液以去离子水清洗2-3次后，计算存活细胞数，至4小时培养时间为止。
7.记录乳酸菌生长速率，计算乳酸菌对胃酸与胆盐的耐受力，以比较样品中乳酸菌在胃酸及胆盐存在下，菌株生长是否受到抑制。
耐胃酸的能力结果与分析整理于表5及图3中，图3所示为试验结果显示市售抗过敏乳酸菌在培养基的活化后，经由酸性缓冲溶液及胆盐处理，菌数明显下降；调节过敏的本发明保藏乳酸菌株在培养基活化后，用酸性缓冲溶液及胆盐处理菌株，PM-A0006、PM-A0009、PM-A0013菌数并不受胃酸胆碱改变影响而急剧下降，PM-A0002及PM-A0005不受胃酸影响(菌数证明其对胃酸具有耐受性)，而将菌株经由胆盐处理时，虽然菌株有些许的下降，但对胆盐仍有耐受性，证明抗过敏的这五株乳酸菌株可以通过人体消化系统严格环境的考验。表5为以pH值2.5的盐酸与抗过敏乳酸菌混合测验其耐胃酸能力的结果：
表5：
| 菌株名称 | 原始菌数 | pH2.5，1hr | pH2.5，2hr | pH2.5，3hr |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0002 | 8.20×108 | 6.50×108 | 2.87×108 | 2.51×108 |
| 加式乳酸杆菌PM-A0005 | 2.65×109 | 2.06×109 | 1.19×109 | 7.10×108 |
| 唾液乳酸杆菌PM-A0006 | 2.55×109 | 9.70×108 | 1.42×109 | 1.43×109 |
| 约氏乳酸杆菌PM-A0009 | 6.87×108 | 4.05×108 | 4.15×108 | 4.35×108 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0013 | 1.78×109 | 1.83×109 | 1.86×109 | 1.73×109 |
耐胆盐的能力结果与分析整理于表6及图3中，表6为以1.5％的胆汁与抗过敏乳酸菌混合测验其耐胆盐能力的结果。
表6
实施例5：抗过敏乳酸菌对人类肠道表皮细胞(CaCo-2)的吸附能力试验
在活体外采用已分化的细胞株分析五株抗过敏乳酸菌菌株吸附人类肠道表皮细胞(CaCo-2)的能力。先将人类肠道表皮细胞(CaCo-2)单层细胞接种于盖玻片上，生长至单层细胞后，置入多孔细胞培养盘中。然后将细胞：乳酸菌以1∶200的比例，共同培养1-3小时，以1×PBS清洗并用甲醇固定细胞和剩余的附着菌数后，进行格兰氏染色并确定所附着的菌数。参考Jacobsen等学者(1999)的分析方法，在1000倍显微镜下计数20个视野，当每个视野的平均菌数少于40个时，判定为“不附着(nonadhesive)”；当每个视野的平均菌数介于41个至100个时，判定为“附着(adhesive)”；当每个视野的平均菌数大于100个时，判定为“强烈附着(strongly adhesive)”。
数据的统计分析以平均值±SD表示。平均来说，取四十五个视野的计算值.其结果整理于表7及图4中。图4显示依据Jacobsen等学者(1999)的分析方法，当每个视野的平均菌数少于40个时，判定为“不附着(nonadhesive)”；当每个视野的平均菌数介于41个至100个时，判定为“附着(adhesive)”；当每个视野的平均菌数大于100个时，判定为“强烈附着(strongly adhesive)”。结果显示嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株等四株抗过敏菌株均被判定为“强烈附着”，而嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0013菌株则被判定为“附着”。表7为五株抗过敏乳酸菌对人类肠道表皮细胞(CaCo-2)细胞株的吸附能力的试验结果：
表7
| 菌株名 | 平均值±SD |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0002 | 115.4±4.4 |
| 加式乳酸杆菌PM-A0005 | 100.1±2.6 |
| 唾液乳酸杆菌PM-A0006 | 108.3±1.4 |
| 约氏乳酸杆菌PM-A0009 | 208.3±22.1 |
| 嗜酸乳杆菌PM-A0013 | 62.8±5.0 |
实施例6：以抗过敏乳酸菌作为补充饲料所产生治疗或舒缓过敏性气喘的效果
以给卵白蛋白(ovalbumin；OVA)致气喘的小白鼠喂食唾液乳酸杆菌PM-A0006为例，藉由如下实验进行过敏改善评估。
A.实验设计
1.实验动物
使用BALB/c小鼠，6-8周大的雌鼠喂食六周，对照组与实验组每组14只。自台大动物中心购进SPF级，六周大的BALB/c雌鼠，每只小鼠分别饲养于不锈钢笼中，室温控制于22±2℃，光暗循环时间各为12小时(早上六点亮，下午六点暗)，自由摄食、饮水及饲料，小鼠八周大时以体重随机分组，开始以管饲方式给予受测乳酸菌(2.6×106至2.6×107cfu/天)同时进行致敏。
2.建立呼吸道发炎动物模式
小鼠致敏步骤简述如下：实验开始第2天以50μg卵白蛋白(OVA)与佐剂Alum 4mg腹腔注射至小鼠体内，于实验第16、30、44天再以25μg卵白蛋白(OVA)与4mg Alum重复注射老鼠。致敏后，在实验第54、55天，将小鼠麻醉，以鼻腔内(intra-nasal，i.n.)滴入100μg卵白蛋白(OVA)的方式诱发呼吸道炎反应。
3.实验流程为如图5所示的抗过敏乳酸菌改善过敏实验的设计流程
将管饲抗过敏乳酸菌的阶段分为四期：第一期为0～22天；第二期为23～36天；第三期为37～50天；第四期为51～53天。其间以腹腔注射卵白蛋白(OVA)的方式致敏小鼠，分四次致敏，第一次为开始管饲的第2天；第二次为开始管饲的第16天；第三次为开始管饲的第30天；第四次为开始管饲的第44天。对腹腔注射卵白蛋白(OVA)致敏的全部小鼠隔周进行抽血，检查小鼠体内IgE的含量变化。于处死小鼠前4天(第54天)以鼻粘膜吸入的方式致敏小鼠连续2天后，检测小鼠的肺呼吸阻力反应，隔天处死小鼠进行其它生化值的检测。
B.实验方法
1.动物的处死和实验材料的收集与分析
a.血清样品的收集
于实验进行第0、23、37、51天及处死时对小鼠进行逆眼眶采血(retro-orbital)，收集血样。将小鼠麻醉后，迅速以微量毛细管自眼眶静脉窦采血，约取200-250μL血液，4℃静置2-4小时后，以12000rpm转速离心20分钟，收集血清，于-80℃保存。
b.测定卵白蛋白(OVA)特异性抗体的酶联免疫分析(ELISA)
将0.5mg抗原溶于100μL碳酸盐包被缓冲液(carbonate coating buffer，0.1M NaHCO3)加入微量培养板，于4℃静置过夜。第2天以含有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液清洗微量培养板。然后以封闭溶液(含有1％BSA的1X PBS缓冲液)进行两小时以上的封闭，清洗3次后，接着加入100μL待测样本，反应于4℃静置过夜，清洗4次后，加入100μL抗小鼠IgE抗体，于室温下反应一至两小时，再清洗5次。加入100μL经适当稀释的抗生物素蛋白-HRP(avidin-horseradish peroxidase conjugated，辣根过氧化物酶结合的抗生物素蛋白)反应一小时，清洗6次，最后加入100μL ABTS(2.2′-Azino-bis-3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid，2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)底物溶液，于室温显色约30分钟后，以100μL的5％SDS终止反应，并用全自动定量绘图酶标仪(microplate reader)读取吸光值。测定结果以酶联免疫分析(ELISA)单位的方式表示如下：
ELISA单位＝(A样品-A空白)/(A阳性对照-A空白)
c.气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)测定
为研究口服抗过敏乳酸菌是否能减缓致敏小鼠的过敏反应，在两次气管内过敏原刺激后，隔天接受呼吸道阻力的测试。测试系统为Buxco system(Biosystem XA，Buxco Electronics Inc.Sharon，CT，USA)。利用系统中的传感器(压差传感器，differential pressure transducer，Buxco)及前置放大器(preamplifier)(MAX II，Buxco)收集小鼠呼吸道的变化信号，从而计算出Penh值。Penh值的计算方式为：间歇×PIF/PEF；间歇＝(Te-Tr)/Tr，(PIF：吸气量峰值(peakinspiratory flow)；PEF：呼气量峰值(peak expiratory flow)；Te：呼气时间(expiratory time)；Tr：舒张时间(relaxation time))。将小鼠在意识清醒的状态下置于全身体积扫描仪(whole body plethysmograph)腔室内，将超音波震荡气化的生理盐水导入腔室(chamber)三分钟，然后记录小鼠三分钟内每分钟平均肺呼吸阻力值Penh，再以渐增浓度的乙酰甲胆碱(Methacholine，6.25、12.5、25、50mg/mL)喷雾化给予小鼠刺激，各浓度都在刺激三分钟后，记录三分钟内呼吸道的生理变化。记录三分钟内各分钟的平均Penh值。
d.肺冲洗液及肺部细胞分析
测试完肺呼吸阻力的隔天，处死小鼠，剪开颈部皮肉使气管露出，以静脉置留管插入气管，第一次先以1mL无菌HBSS缓冲液冲洗肺部，第二及第三次则以含有2％BSA的HBSS(Hanks’balanced salt solution)缓冲液冲洗肺部，首次得到的肺冲洗液经1500rpm离心5分钟后，分离上清液保存于-80℃，待后续分析。将细胞部分并入后两次肺冲洗液中，以1500rpm离心5分钟，弃置上清液后，以1mL含有2％BSA的HBSS缓冲液悬浮细胞，并以台盼蓝(trypan blue)染色计数，取约1×105个细胞以细胞离心涂片机(cytospin)500rpm离心3分钟制作细胞涂片，待其自然风干后，依次以Liu A及Liu B染色，以少量阿拉伯胶封片，使用油镜(1000x)读取至少五个视野中的细胞或总数300个以上的细胞，计算其中淋巴细胞及多核细胞的比例。
e.脾脏细胞的培养
在无菌条件下，打开小鼠腹腔取出脾脏，置于已加入3mL HBSS缓冲液的20mm培养皿(petri dish)内，以无菌针筒尾端将脾脏磨碎，使其中淋巴细胞释出，将细胞悬浮液吸入15mL离心管中，静置5分钟后，取上清液以1500rpm离心5分钟，吸除上清液后，加入1mL RBC裂解缓冲液(lysis buffer)，静置1分钟使红血球溶解，加入5mL HBSS缓冲液，以1500rpm离心5分钟，吸除上清液；以HBSS缓冲液重复洗两次后，再加入5mL含5％FBS的RPMI-1640完全培养基使细胞悬浮。以台盼蓝染色法计算细胞总数，调整细胞数至1×107个细胞/mL培养基。取细胞液0.5mL加入48孔培养板(48-well plate)中，再加入等体积培养液、含裂殖素或卵白蛋白(OVA)的培养液，使细胞最终浓度为5×106个细胞/mL培养基。置于恒温培养箱37℃、5％CO2培养48小时，收取上清液保存于-80℃待日后分析其中各细胞激素的分泌量。
f.细胞激素的测定
以夹心酶联免疫分析法(ELISA)测定脾脏细胞所分泌的细胞激素的含量。简述如下：先将抗细胞激素抗体以NaHCO3缓冲液(pH 9.6)稀释后加入96孔微量培养板，于4℃静置过夜。第二天将培养板清洗3次后，以含1％BSA的PBS在室温下反应至少1小时进行封闭(blocking)。加入待测样本后可于37℃反应2小时或置于4℃反应过夜。清洗4次后加入以1％BSA-PBS缓冲液稀释的生物素接合(biotin-conjugated)的抗细胞激素抗体于室温反应1小时，清洗5次，接着加入抗生物素蛋白链菌素接合的过氧化物酶(streptavidin-conjugated peroxidase)再反应1小时。最后在清洗后，向每孔加入100μL的酶底物溶液四甲基联苯胺(TMB)底物(Tetramethylbenzidine substrate)，于室温避光反应约20分钟。以全自动定量绘图酶标仪(microplate autoreader)读取波长450nm的吸光值。
2.统计方法
实验结果以平均值±标准误差表示(Means±SEMs)。各组间差异以Student T检验(t-test)分析，p＜0.05视为有显著差异(*，p＜0.05；**，p＜0.001)。另外将p＜0.1视为有差异。
实验结果分析：
A.测定卵白蛋白(OVA)特异性抗体的酶联免疫分析(ELISA)的结果
血清中卵白蛋白(OVA)特异性抗体效价部分，喂食PM-A0006乳酸菌的对照组，卵白蛋白(OVA)致敏小鼠血清中的卵白蛋白(OVA)特异性IgE抗体有减少的趋势，结果于表8，图示于图6。表8显示卵白蛋白(OVA)特异性抗体IgE的测定结果(平均值±SEM，N＝14，P值＝P)
表8
B.气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)测定结果
肺呼吸阻力部分，相对于对照组，喂食PM-A0006乳酸菌在高浓度乙酰甲胆碱(Methacholine)刺激下显著减低小鼠Penh值。结果示于表9，图示于图7中。表9显示气道高反应性测定结果(平均值±SEM，N＝14，P值＝P)
表9
C.肺冲洗液及肺部细胞分析结果
肺冲洗液中细胞组成部分，相对于对照组，喂食PM-A0006乳酸菌的实验组有显著较低的嗜伊红细胞(eosinophil)浸润比例。结果总结于表10，图示于图8。表10显示肺冲洗液分析结果(平均值±SEM，N＝14，P值＝P)
表10
D.肺冲洗液细胞激素分析结果
相对于对照组，喂食PM-A0006乳酸菌的实验组可显著降低肺冲洗中嗜酸粒细胞趋化因子分泌量且PGE2也有减少的趋势。结果总结于表11，图示于图9及图10。表11显示肺冲洗细胞激素分析结果(平均值±SEM，N＝14，P值＝P)
表11
E.脾脏细胞培养的上清液细胞激素分析结果
脾脏细胞经ConA或卵白蛋白(OVA)刺激培养48小时后，在ConA刺激下，喂食PM-A0006乳酸菌的实验组的脾脏细胞分泌的IFN-γ显著高于对照组。结果总结于表12，图示于图11。表12显示检测脾脏细胞培养的上清液，分析不同刺激物质对脾脏细胞的细胞激素分泌的影响(平均值±SEM，N＝14，P值＝P)
表12
本发明的食品组合物，含有以上所述的任意一种或一种以上菌株所组合而成的各种组合物，例如发酵乳、酸乳酪、乳酪、乳制饮品乳粉、茶或咖啡等等，且菌株可以活菌或死菌的形式存在于组合物中。
由于乳酸菌要发挥抗过敏的效果，除了要找出具有特定功能的菌株外，更要确认该菌株能否通过人体胃酸胆盐的环境，还要求该菌株能对小肠粘膜表皮细胞具有良好吸附能力。也正是因为这种特性，使得本发明的抗过敏乳酸菌才可以提供治疗或舒缓过敏症状的医疗用途。本发明所描述的抗过敏乳酸菌可同时增强Th1途径和调控Th2过盛的过敏反应。本发明的一个目标就是继续朝向达成这些目标或至少为大众在过敏治疗上提供除类固醇或抗组胺的新选择，本发明找出对人体无副作用且有益健康的抗过敏乳酸菌来作为过敏治疗的新选择。
以上所述是通过实施例说明本发明的特点，其目的在于使本领域技术人员能了解本发明的内容并据以实施，而非限定本发明的专利范围。因此，凡其它未脱离本发明所揭示的精神而完成的等效修饰或修改，仍应包含在以下所述之权利要求范围中。
菌种保藏
本发明的五株乳酸菌菌株于2007年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号及信息见表13。这五种培养物的存活性由保藏中心于2007年4月27日检测完毕，结果均为存活。
此外，本发明的五株细菌菌株的冷冻干燥培养物曾保藏在台湾食品工业发展研究所，地址为：台湾新竹市食品路331号。台湾保藏的详细资料如表13所示。
Claims (8)
1.一种食品组合物，其包含：
刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素浓度的唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006：CCTCC NO：M 207040，及生理上可接受的赋形剂与稀释剂中的任何一种。
2.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，所述菌株是活菌或死菌。
3.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，所述的生理上可接受的赋形剂或稀释剂为一种食品。
4.如权利要求1所述的食品组合物，其特征在于，所述的食品为发酵乳、乳酪、乳制饮品、乳粉、茶或咖啡中的任一种。
5.如权利要求4所述的食品组合物，其特征在于，所述的乳酪为酸乳酪。
6.一种用于抗过敏的药物组合物，其包含
刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素浓度的唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006：CCTCCNO：M 207040，及药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述菌株是活菌或死菌。
8.一种生物性纯培养物在制备用于刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素的药物中的用途：所述生物性纯培养物是唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006：CCTCC N0：M 207040。
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