TWI400076B - 多種乳酸菌株在治療過敏之新用途 - Google Patents
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Description
本發明係有關應用在食品或醫藥之治療過敏乳酸菌菌株組合物及其應用於治療過敏能力上之用途。
近幾年來過敏疾病有逐年增加的趨勢，不論是在異位性皮膚炎、過敏性鼻炎和支氣管性氣喘的發生率都有增加的情形。目前認為過敏疾病的發生可能與文明的進步有關，包括空氣的污染和感染的減少都可能是導致過敏疾病增加的一些可能原因。而目前應用在氣喘的治療主要是靠藥物治療：如類固醇和抑制肥大細胞釋放發炎物質的藥物、氣管擴張劑和免疫療法等。但是，包括抗發炎藥物和氣管擴張劑在內的藥物治療還是無法真正的改變過敏免疫反應，所以只能說是治標的一種方法。
有關過敏疾病的增加，目前認為跟大環境的變化有密切關係，特別是在清潔方面有更明顯的關係。人體腸道中的益生菌會刺激免疫細胞，但如果在日常生活中的食品中的抗生素或是類固醇含量太高，都會導致腸道內的益生菌降低，因而無法有效地刺激免疫細胞中第一型T輔助細胞的生成，這些第一型T輔助細胞的生成與第二型T輔助細胞相關的過敏疾病發生有著
密切關連。因此，如果能利用保健食品來刺激我們的免疫系統，誘發出可以調節過敏免疫反應的第一型免疫反應，將可達到改善過敏體質的效果。
一般食用含乳酸菌(LAB)之產品僅具有調整腸道的健康效果，雖然有數以萬計的乳酸菌菌株存在自然界，但僅有少數乳酸菌株具有抗過敏的特質。少數這些細菌株所具有的耐酸與耐膽鹽能力，吸附黏膜表皮細胞之能力及在通過腸胃道後仍可存活的能力等特性，是篩選有促進健康效果的菌株時的重要依據。時至今日，僅有少數幾株經證明其具有抗過敏健康效果之乳酸菌菌株被確認出來，而乳酸菌的對身體健康的功能在於菌株(strain)的特異性而非菌種(species)，此種對於人之身體健康有特殊功效之菌株稱為功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario,Canada April 30 and May 1,2002：1-7)。
過敏疾病，例如過敏性濕疹、蕁麻疹、反覆發作的過敏性鼻炎及過敏性氣喘，在台灣及其他已開發國家已成為嚴重的社會問題。之所以形成過敏疾病的流行程度的提升，是有原因的，這眾所皆知的衛生假說為：嬰幼兒接觸免疫刺激病原體的機會愈少，愈容易引發過敏相關疾病的產生(Strachan,1989)。過敏疾病發生時，人體內的免疫反應會使Th1細胞數量下降，連續產生多種細胞激素促使免疫反應朝向Th2途徑，形成體液免疫反應，例如IgE的產生及嗜伊紅血球過多等(Romagnani,1994；Holt,1995)。
在愛沙尼亞及瑞典這兩個國家的孩童人口中發現，有過敏疾病的孩童腸道內的乳酸桿菌比無過敏疾病的孩童要少
(Bjo¨rksten et al.,1999)。乳酸桿菌被認為可促進Th1的免疫反應進而改善過敏症狀(Cross et al.,2001)。再者，以卵白蛋白誘發小鼠過敏的動物實驗模式中發現，讓小鼠以口服方式食用熱處理後的Lactobacillus casei strain Shitota，可抑制小鼠血清中IgE的含量(Matsuzaki et al.,1998)。此外，以酪蛋白誘發小鼠過敏的動物實驗模式中證明，腹腔注射熱處理後的Lactobacillus plantarum L-137，也可抑制IgE的產生(Murosaki et al.,1998)。由豕草花粉過敏引起的過敏症狀，口服Enterococcus faecalis FK-23萃取物，可使腹膜內聚集的嗜伊紅血球細胞量減少(Shimada et al.,2003)。人體的臨床試驗中，於待產期間服用Lactobacillus rhamnosus strain GG，發現在出生後兩年(Kallioma¨ki et al.,2001)及嬰兒期後(Kallioma¨ki et al.,2003)，可降低嬰幼兒產生過敏性濕疹的風險及發生率。Lactobacillus rhamnosus 19070-2及Lactobacillus reuteri DSM122460也可以適度地改善患有異位性皮膚炎的孩童其嚴重溼疹的過敏症狀(Rosenfeldt et al.,2003)。
腸道是人體最大的免疫系統，乳酸菌藉由腸道免疫細胞群影響人體的免疫系統反應，來達到調節人體不適症狀的改善或減輕症狀。特殊的抗過敏乳酸菌株影響人體之機制便是藉由腸道免疫系統，引發身體其他免疫反應，達到免疫反應Th1提升而緩解Th2免疫反應，使過敏症狀改善或緩解。因此，藉由適當的試驗方法，篩選出能夠具備此等功能之菌株，對過敏病人而言，無疑是一大福音，也讓過敏病人能夠經由乳酸菌株的幫助，慢慢減少對藥物的依賴及使用，長期而言，對病人的健康促進，會是一大利多。
本發明一方面廣義的包括由下列任一種乳酸桿菌株：唾液乳
酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)GL-101菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 12574以及嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)GL-206菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 10695。與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑組成之組合物。
在另一項具體實施例中，增強抗過敏能力之生理上可接受之下列任一種菌株之同種或突變種之乳酸菌株：唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574以及嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695。
又，另一項具體實施例中，本發明可廣義的包括經由促進細胞間白素12p70(IL-12p70)或干擾素γ調控Th1型免疫反應而改善Th2型免疫反應過盛的過敏現象，其係對哺乳動物投予可達到刺激Th1型免疫效果劑量之任一種前述乳酸桿菌株。
本發明亦可廣義的包括本申請案說明書中分開或總合說明之部分、構成要件與特徵，及任何包含該等部分、構成要件與特徵中任何一者或更多者之任何或全部組合，且若本文所述及之明確完整事物已於與本發明有關之相關技藝中出現已知之同等物時，此等已知之同等物將如同獨立事項併入本文中。
本發明可廣義的包括由下列任一種乳酸菌株：唾液乳酸桿菌GL-101菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 10695、鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株，食品工業發展研究所寄存編號BCRC 16095。
許多文獻指出增加第一型T細胞細胞激素包括細胞間白素12p70(IL-12p70)、干擾素γ(IFN-gamma)的分泌增加，可以有效改善過敏症狀；進一步的研究也指出特定的乳酸菌株和樹狀細胞上類鐸受體(Toll-like receptor)結合，活化細胞內的轉譯蛋白移至核內而釋放大量細胞激素，屬於先天免疫的一環，因此某些特定的乳酸菌菌株借由其細胞壁多醣類物質如peptidoglycan、lipopolysaccharide、polysaccharide等，經先天免疫系統，確實能活化T細胞的發育。
該四株細菌菌株已寄存在台灣食品工業發展研究所，地址為；中華民國新竹市食品路331號。寄存之詳細資料如表1所示：
如上所列已寄存的這四株乳酸菌已發現具有抗過敏的能力，可以藉由口服上述任一株或組合其中一株以上的乳酸菌，包括對於異位性皮膚炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、食物過敏及氣喘的症狀有減緩及治療的功能。
檢視四株抗過敏乳酸菌株，唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC
16095對Th1型免疫能力的增進效果，其係測定人類周邊血液單核球細胞((Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)與前述四株抗過敏乳酸菌分別共同培養後測定干擾素γ的分泌量，來驗證具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟：
1.抽取適當人類血液量每次約200mL。
2.取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3.取人類周邊血液白血球細胞層，緩衝溶液清洗細胞2-3次後，以適當之培養基懸浮細胞。
4.將細胞與已活化3天之乳酸菌株以1：10比例共同培養48小時。
5.收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。
數據之統計分析如表2及第1圖所示，以Mean±SD表示之。第1圖所示為當分別以106至108個cfu，唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095與105至107個人類周邊血液單核球細胞(PBMC)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC 17001)為負控制組，PHA(Phytohemagglutinin)為正控制組，偵測干擾素γ受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液單核球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。表2為四株抗過敏菌株分別與人類周邊血液單核球細胞(PBMC)培養，刺激干擾素γ的分泌量(means±SD)：
檢視四株抗過敏乳酸菌株，唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095對Th1型免疫能力的增進效果，其係測定人類樹狀細胞(dendritic cell)與不同的抗過敏乳酸菌共同培養後測定細胞間白素12p70(IL-12p70)的分泌量，來驗證具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟：
1.抽取適當人類血液量每次約200mL。
2.取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3.取人類周邊血液單核球(PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2-3次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。
4.人類周邊血液單核球(PBMC)細胞以CD14+ microbeads(MiniMACS system)將細胞之CD14+單核球純化。
5.以細胞激素(IL-4)及生長激素(GM-CSF)刺激細胞分化成樹狀細胞，6-7天的培養時間，將已分化之樹狀細胞收集。
6.將抗過敏乳酸菌株在共同培養之前3天活化，之後以100℃熱致死乳酸菌株30分鐘。
7.將樹狀細胞與已熱致死之乳酸菌株以1：10比例共同培養48小時。
8.收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測細胞間白素12p70(IL-12p70)在上清液中的含量。
數據之統計分析如表3及第2圖所示，以Mean±SD表示之。第2圖所示為當分別以熱致死106至108個cfu唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095與105至107個人類樹狀細胞共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測細胞間白素12p70(IL-12p70)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC 17001)為負控制組，LPS(Lipopolysaccharide)為正控制組，偵測細胞間白素12p70(IL-12p70)受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞間白素12p70(IL-12p70)與負控制組有顯著性差異。表3所示為分別以五株熱致死抗過敏菌株與樹狀細胞培養，刺激細胞間白素12p70(IL-12p70)的分泌量(means±SD)：
檢視四株抗過敏乳酸菌株，唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095，可否具有通過胃酸膽鹽考驗的能力順利在腸道發揮其抗過敏的功能，試驗流程如下：
1.將四株抗過敏乳酸菌活化3天。
2.取1 mL菌液計算原始菌數，剩餘之乳酸菌以500g離心10分鐘，加入去離子水清洗乳酸菌2-3次。
3.加入以鹽酸調配成pH 2.5之培養基中，乳酸菌與pH 2.5之培養基充分混合後，置於37℃培養箱。
4.每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2-3次後，計算存活細胞數，至3小時培養時間為止。
5.剩餘菌液離心後沈澱物再以含1.5%(w/V)牛膽汁(ox gall，Sigma)之培養基中回溶，充分混合後，於37℃培養。
6.每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2-3次後，計算存活細胞數，至4小時培養時間為止。
7.記錄乳酸菌生長速率，計算乳酸菌對胃酸與膽鹽之耐受力，以比較樣品中乳酸菌在胃酸及膽鹽存在下，菌株生長是否受到抑制。
耐胃酸的能力結果與分析整理於表4及第3圖所示，第3圖所示其結果顯示，調節過敏之乳酸菌株在培養基活化後，將菌株處理酸性緩衝溶液及膽鹽，唾液乳酸桿菌GL-101，寄存編號BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205，寄存編號BCRC 10360、
嗜酸乳酸桿菌，寄存編號BCRC 10695、鼠李糖乳酸桿菌，寄存編號BCRC 16095菌數並不受胃酸影響而急劇下降，唯BCRC 10695及BCRC 16095雖然不受胃酸而影響菌數證明對胃酸具有耐受性，但將菌株經由膽鹽處理時，雖然菌株有些許的下降，但對膽鹽仍有耐受性，証明抗過敏之此四株乳酸菌株可以通過人體消化系統嚴格環境的考驗。表4為以pH值2.5的鹽酸與抗過敏乳酸菌混合測驗其耐胃酸能力：
耐膽鹽的能力結果與分析整理於表5及第3圖所示，表5為以1.5%的膽汁與抗過敏乳酸菌混合測驗其耐膽鹽能力。
在活體外採用已分化的細胞株分析四株抗過敏乳酸菌菌株吸附人類腸道表皮細胞(Caco-2)的能力。先由人類腸道表皮細胞(Caco-2)單層細胞株於蓋玻片上生長至單層細胞後，置入多孔細胞培養盤中。然後將細胞：乳酸菌之比例為1：200，共同培養1-3小時，以1×PBS清洗及利用甲醇固定細胞及剩餘之附著菌
數後，進行格蘭氏染色並確定所附著之菌數。參考Jacobsen等學者(1999)之分析方法，在1000倍顯微鏡下計數20個視野，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。
數據之統計分析以Mean±SD表示之。平均來說，取四十五個視野之計算值．其結果整理於表6及第4圖所示。第4圖顯示依據Jacobsen等學者(1999)之分析方法，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。顯示唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695、鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095等四株抗過敏菌株均判定「強烈附著」表6為四株抗過敏乳酸菌對人類腸道表皮細胞(CaCo-2)細胞株之吸附能力試驗：
由於乳酸菌要發揮抗過敏的效果除了要找出具有特定功能的菌株外，更要確認該菌株能通過人體胃酸膽鹽的環境外，還要能對小腸黏膜表皮細胞具有良好吸附能力之乳酸菌菌株，也
因為此種特性，本發明的抗過敏乳酸菌才可以提供治療或舒緩過敏症狀的醫療用途。本發明所描述的多株抗過敏乳酸菌可增強Th1途徑調控Th2過盛的過敏反應。本發明找出對人體無副作用且有益健康的抗過敏乳酸菌來作為過敏治療的新選擇。
以上所述係藉由實施例說明本發明之特點，其目的在使熟習該技術者能瞭解本發明之內容並據以實施，而非限定本發明之專利範圍，故，凡其他未脫離本發明所揭示之精神所完成之等效修飾或修改，仍應包含在以下所述之申請專利範圍中。
第1圖顯示，當分別以106至108個cfu之唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695、鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095與105至107個人類周邊血液單核球細胞(PBMC)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC17001)為負控制組，PHA為正控制組，偵測干擾素γ受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液單核球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。
第2圖顯示，當分別以熱致死106至108cfu之唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695或鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095與105至107個人類樹狀細胞(dendritic cell)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測細胞間白素12p70在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC17001)為負控制組，LPS為正控制組，偵測細胞間白素12p70(IL-12p70)受刺激濃
度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞間白素12p70(IL-12p70)與負控制組有顯著性差異。
第3圖顯示，結果顯示多種抗過敏乳酸菌在培養基的活化後，總菌數經由模擬胃酸溶液及膽鹽溶液處理不同時間，唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695與鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095，菌數並不受胃酸影響而急劇下降，惟嗜酸乳酸桿菌GL-206，BCRC 10695及鼠李糖乳酸桿菌GL-209，BCRC 16095雖然不受胃酸而影響菌數證明對胃酸具有耐受性，但將菌株經由膽鹽處理時，雖然菌株有些許的下降，但對膽鹽仍有耐受性，証明抗過敏之此四株乳酸菌株可以通過人體消化系統嚴格環境的考驗。
第4圖顯示，依據Jacobsen等學者(1999)之分析方法，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。顯示唾液乳酸桿菌GL-101菌株BCRC 12574、發酵乳酸桿菌GL-205菌株BCRC 10360、嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株BCRC 10695與鼠李糖乳酸桿菌GL-209菌株BCRC 16095等四株抗過敏菌株均判定「強烈附著」。
Claims (14)
- 一種用於治療過敏之醫藥組合物，其包含可刺激免疫細胞分泌IFN-γ或IL-12p70有效治療過敏之乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)GL-101菌株，寄存編號BCRC 12574以及嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)GL-206菌株，寄存編號BCRC 10695至少其中之一，此等乳酸菌菌株均寄存於台灣新竹食品工業發展研究所(FIRDI)及醫藥上可接受的賦形劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為唾液乳酸桿菌GL-101菌株，寄存編號BCRC 12574。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株更包含發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)GL-205菌株，寄存編號BCRC 10360，其寄存於台灣新竹食品工業發展研究所。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株，寄存編號BCRC 10695。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為活的菌株或去活性(inactivated)的菌株。
- 如申請專利第5項之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為去活性乳酸菌。
- 一種食品組合物，其包含可刺激免疫細胞分泌IFN-γ或IL-12p70有效治療過敏之乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)GL-101菌株，寄存編號BCRC 12574以及嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)GL-206菌株，寄存編號BCRC 10695至少其中之一，此等乳酸菌菌株均寄存於台灣新竹食品工業發展研究所(FIRDI)及生理上可接受的賦形劑或稀釋劑之其中之一者。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該生理上可接受的賦形劑或稀釋劑為一種食品。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該食品係，指醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶或咖啡任一種。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為唾液乳酸桿菌GL-101菌株，寄存編號BCRC 12574。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該乳酸菌菌株更包含發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)GL-205菌株，寄存編號BCRC 10360，其寄存於台灣新竹食品工業發展研究所。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為嗜酸乳酸桿菌GL-206菌株，寄存編號BCRC 10695。
- 如申請專利範圍第7項之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為活的菌株或去活性(inactivated)的菌株。
- 如申請專利第13項之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為去活性乳酸菌。
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| TW200611973A (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-16 | Genmont Biotech Inc | Novel microorganism strain GM-090 of lactobacillus fermentum and its use for stimulating IFN-γ secretion and/or treating allergy |
| TW200829175A (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-16 | Promd Biotech Co Ltd | Anti-allergy lactic acid bacteria |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201019942A (en) | 2010-06-01 |
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