TWI386163B - 抗過敏之乳酸菌 - Google Patents
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Description
本發明係有關應用在食品或醫藥之抗過敏乳酸菌菌株組合物及其應用於抗過敏能力上之用途。
近幾年來過敏疾病有逐年增加的趨勢，不論是在異位性皮膚炎、過敏性鼻炎和支氣管性氣喘的發生率都有增加的情形。目前認為過敏疾病的發生可能與文明的進步有關，包括空氣的污染和感染的減少都可能是導致過敏疾病增加的一些可能原因。而目前應用在氣喘的治療主要是靠藥物治療：如類固醇和抑制肥大細胞釋放發炎物質的藥物、氣管擴張劑和免疫療法等。但是，包括抗發炎藥物和氣管擴張劑在內的藥物治療還是無法真正的改變過敏免疫反應，所以只能說是治標的一種方法。而唯一能夠說是改變過敏免疫體質的治療方式，便是所謂的減敏療法，但是減敏治療通常需要較長的一段時間，而且有時會出現一些副作用，因此也不是所有的病人都能夠使用。
有關過敏疾病的增加，目前認為跟大環境的變化有密切關係，特別是在環境方面有更明顯的關係。人體腸道中的益生菌會刺激免疫系統作用，但如果在日常生活中的食品含有抗生素或是類固醇含量太高，都會導致腸道內的益生菌降低，因而無法有效地刺激免疫細胞中第一型T輔助細胞(Th1)的生成，這些第一型T輔助細胞的生成與第二型T輔助細胞(Th2)相關的過敏疾病發生有著密切關連。因此，如果能利用保健食品來刺激我們的免疫系統，誘發出可以調節過敏免疫反應的Th1型免疫反應平衡過敏所引發Th2型免疫反應，將可達到改善過敏體質的效果。
在人類應用微生物的歷史上，乳酸菌的應用起源相當早。從早期乳製品的加工上發現，食用乳酸菌發酵之食品，有助於改善人類腸胃道疾病的發生率以及延長平均壽命的現象。由此，引發許多學者開始研究探討乳酸菌在促進人體健康中所能扮演的角色。功能性乳酸菌在西元1954年提出之後，在幾年間研究熱潮不斷的發酵，於西元1965年由Lilly DM等人正式提出Probiotic-益生菌的概念，成為功能性乳酸菌的統稱。
一般食用含乳酸菌(LAB)之產品僅具有調整腸道的健康效果，雖然有數以萬計的乳酸菌菌株存在自然界，但僅有少數乳酸菌株具有抗過敏的特質。少數這些細菌株所具有的耐酸與耐膽鹽能力，吸附黏膜表皮細胞之能力及在通過腸胃道後仍可存活的能力等特性，是篩選有促進健康效果的菌株時的重要依據。時至今日，僅有少數幾株經證明其具有抗過敏健康效果之乳酸菌菌株被確認出來，而乳酸菌的對身體健康的功能在於菌株(strain)的特異性而非菌種(species)，此種對於人之身體健康有特殊功效之菌株稱為功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario,Canada April 30 and May 1,2002：1-7)。
過敏疾病，例如過敏性濕疹、蕁麻疹、反覆發作的過敏性鼻炎及過敏性氣喘，在台灣及其他已開發國家已成為嚴重的社會問題。之所以形成過敏疾病的流行程度的提升，是有原因的，這眾所皆知的衛生假說為：嬰幼兒接觸免疫刺激病原體的機會愈少，愈容易引發過敏相關疾病的產生(Strachan,1989)。過敏疾病發生時，人體內的免疫反應會使Th1細胞數量下降，連續產生多種細胞激素促使免疫反應朝向Th2途徑，形成體液免疫反應，例如IgE的產生及嗜伊紅血球過多等(Romagnani,1994;Holt,1995)。
在愛沙尼亞及瑞典這兩個國家的孩童人口中發現，有過敏疾病的孩童腸道內的乳酸桿菌比無過敏疾病的孩重要少(Bjo‥
rksten et al.,1999)。乳酸桿菌被認為可促進Th1的免疫反應進而改善過敏症狀(Cross et al.,2001)。再者，以卵白蛋白誘發小鼠過敏的動物實驗模式中發現，讓小鼠以口服方式食用熱處理後的Lactobacillus casei strain Shitota，可抑制小鼠血清中IgE的含量(Matsuzaki et al.,1998)。此外，以酪蛋白誘發小鼠過敏的動物實驗模式中證明，腹腔注射熱處理後的Lactobacillus plantarum L-137，也可抑制IgE的產生(Murosaki et al.,1998)。由豕草花粉過敏引起的過敏症狀，口服Enterococcus faecalis FK-23萃取物，可使腹膜內聚集的嗜伊紅血球細胞量減少(Shimada et al.,2003)。人體的臨床試驗中，於待產期間服用Lactobacillus rhamnosus strain GG，發現在出生後兩年(Kallioma‥
ki et al.,2001)及嬰兒期後(Kallioma‥
ki et al.,2003)，可降低嬰幼兒產生過敏性濕疹的風險及發生率。Lactobacillus rhamnosus 19070-2及Lactobacillus reuteri DSM122460也可以適度地改善患有異位性皮膚炎的孩童其嚴重溼疹的過敏症狀(Rosenfeldt et al.,2003)。
本發明一方面廣義的包括由下列任一種生物性純培養物：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株，民國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910308、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株，民國九十五年一月十一日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910304、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株，民國九十五年一月十一日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910305、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株，民國九十五年十月十七日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910336、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株，民國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910309。與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑組成之組合物。
在一項具體實施例中，該組合物含有一種或一種以上該等菌株，如生理上可接受的賦形劑或稀釋劑是一種食品為較佳之形式，該食品可以是醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品、乳粉、茶飲料或咖啡中任何一種較佳，又或者，該組合物是醫藥組合物，且其賦形劑或稀釋劑應為醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。
在另一項具體實施例中，增強抗過敏能力之生理上可接受之下列任一種菌株之同種或突變種之生物性純培養物：嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌株。
又，另一項具體實施例中，本發明可廣義的包括經由促進細胞間白素(IL-12)或干擾素γ調控Th1型免疫反應而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反應過剩的過敏現象，其係對哺乳動物投予可達到刺激Th1型免疫效果劑量之任一種前述生物性純培養物。
再者，另一項具體實施例中，含有前述所定義菌株中一至一種以上生物性純培養物，該培養物與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑呈組合物的形式投予與較佳，以及該生理上可接受的賦形劑或稀釋劑為食品較佳，該食品是醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品、乳粉、茶飲料或咖啡中任一種較佳，或者，該組合物是醫藥組合物，且其賦形劑或稀釋劑應為醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。
本發明亦可廣義的包括本申請案說明書中分開或總合說明之部分、構成要件與特徵，及任何包含該等部分、構成要件與特徵中任何一者或更多者之任何或全部組合，且若本文所述及之明確完整事物已於與本發明有關之相關技藝中出現已知之同等物時，此等已知之同等物將如同獨立事項併入本文中。
本發明可廣義的包括由下列任一種生物性純培養物：嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株，民國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910308、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株，民國九十五年一月十一日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910304、唾液乳酸桿菌菌株，民國九十五年一月十一日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910305、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株，民國九十五年十月十七日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910336、嗜酸乳桿菌PM-A0013菌株，民國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910309。
許多文獻指出增加第一型T細胞細胞激素包括細胞間白素(IL-12)、干擾素γ(IFN-gamma)的分泌增加，可以有效改善過敏症狀；進一步的研究也指出特定的乳酸菌株和樹狀細胞上類鐸受體(Toll-like receptor)結合，活化細胞內的轉譯蛋白移至核內而釋放大量細胞激素，屬於先天免疫的一環，因此某些特定的乳酸菌菌種借由其細胞壁多醣類物質如peptidoglycan、lipopolysaccharide、polysaccharide等，經先天免疫系統，確實能活化T細胞的發育。
該五株細菌菌株之冷凍乾燥培養物已寄存在台灣食品工業發展研究所，地址為：中華民國新竹市食品路331號。寄存之詳細資料如表1所示：
如上所列專利寄存的這五株乳酸菌已發現具有抗過敏的能力，包括對於異位性皮膚炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、食物過敏及氣喘的症狀有減緩及治療的功能。
實例1：五株抗過敏乳酸菌之形態學及一般性質。
根據16S rDNA序列分析及API細菌鑑定系統分析結果來確認菌株在分類學上的特徵。發現，東宇菌株編號PM-A0002為嗜酸乳桿菌；東宇菌株編號PM-A0005為加式乳酸桿菌；東宇菌株編號PM-A0006為唾液乳酸桿菌；東宇菌株編號PM-A0009為約式乳酸桿菌及東宇菌株編號PM-A0013為嗜酸乳桿菌。此五株菌株在形態學及一般性質上的特徵詳細列於表2：
實例2：抗過敏乳酸菌對促進干擾素γ的分泌調控Th1型免疫能力的作用(以周邊血液單核球細胞為體外功效驗證平台)。
檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌株對Th1型免疫能力的增進效果，其係測定人類週邊血液單核球與抗過敏乳酸菌共同培養後測定干擾素γ的分泌量，來篩選具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟：
1. 抽取適當人類血液量每次約200ml。
2. 取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3. 取人類周邊血液白血球(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2-3次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。
4. 將細胞與已活化3天之乳酸菌株以1：10比例共同培養48小時。
5. 收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。
數據之統計分析如表3及第1圖所示，以Mean±SD表示之。第1圖所示為當分別以106
至108
個cfu嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株與105
至107
個人類周邊血液白血球(PBMC)共同共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為負控制組，PHA為正控制組，偵測干擾素γ受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液白血球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。表3為分別以五株抗過敏菌株與人類周邊血液單核球培養，刺激干擾素γ的分泌量(means±SD)：
實例3；抗過敏乳酸菌對促進細胞間白素(IL-12)的分泌調控Th1型免疫能力的作用(以樹狀細胞dentritic cell為體外功效驗證平台)。
檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌株對Th1型免疫能力的增進效果，其係測定人類樹狀細胞與抗過敏乳酸菌共同培養後測定細胞間白素(IL-12)的分泌量，來篩選具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟：
1. 抽取適當人類血液量每次約200ml。
2. 取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3. 取人類周邊血液白血球(PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2-3次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。
4. 人類周邊血液白血球(PBMC)細胞以CD14+
microbeads(MiniMACS system)將細胞之CD14+
單核球純化。
5. 以細胞激素(IL-4)及生長激素GM-CSF刺激細胞分化成樹狀細胞，6-7天的培養時間，將已分化之樹狀細胞收集。
6. 將抗過敏乳酸菌株在共同培養之前3天活化，之後以100℃熱致死乳酸菌株30分鐘。
7. 將樹狀細胞與已熱致死之乳酸菌株以1：10比例共同培養48小時。
8. 收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測細胞間白素(IL-12)在上清液中的含量。
數據之統計分析如表4及第2圖所示，以Mean±SD表示之。第2圖所示為當分別以熱殺死106
至108
個cfu嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株與105
至107
個人類樹狀細胞(dentritic cell)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測細胞間白素(IL-12)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為負控制組，PHA為正控制組，偵測細胞間白素(IL-12)受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞間白素(IL-12)與負控制組有顯著性差異。表4所示為分別以五株熱致死抗過敏菌株與樹狀細胞培養，刺激細胞間白素(IL-12)的分泌量(means±SD)：
實例4：抗過敏乳酸菌耐胃酸膽鹽試驗。
檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌株，可否具有通過胃酸膽鹽考驗的能力順利在腸道發揮其抗過敏的功能，試驗流程如下：
1. 將五株抗過敏乳酸菌活化3天。
2. 取1 mL菌液計算原始菌數，剩餘之乳酸菌以500g離心10分鐘，加入去離子水清洗乳酸菌2-3次。
3. 加入以鹽酸調配成pH 2.5之培養基中，乳酸菌與pH 2.5之培養基充分混合後，置於37℃培養箱。
4. 每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2-3次後，計算存活細胞數，至3小時培養時間為止。
5. 剩餘菌液離心後沈澱物再以含1.5%(w/V)牛膽汁(ox gall，Sigma)之培養基中回溶，充分混合後，於37℃培養。
6. 每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2-3次後，計算存活細胞數，至4小時培養時間為止。
7. 記錄乳酸菌生長速率，計算乳酸菌對胃酸與膽鹽之耐受力，以比較樣品中乳酸菌在胃酸及膽鹽存在下，菌株生長是否受到抑制。
耐胃酸的能力結果與分析整理於表5及第3圖所示，第3圖所示其結果顯示市售抗過敏乳酸菌在培養基的活化後，總菌數經由酸性緩衝溶液及膽鹽處理，菌數明顯下降許多；調節過敏之專利寄存乳酸菌株在培養基活化後，將菌株處理酸性緩衝溶液及膽鹽，PM-A0006、PM-A0009、PM-A0013菌數並不受胃酸膽鹼改變影響而急劇下降，PM-A0002及PM-A0005雖然不受胃酸而影響菌數證明對胃酸具有耐受性，但將菌株經由膽鹽處理時，雖然菌株有些許的下降，但對膽鹽仍有耐受性，証明抗過敏之此五株乳酸菌株可以通過人體消化系統嚴格環境的考驗。表5為以pH值2.5的鹽酸與抗過敏乳酸菌混合測驗其耐胃酸能力：
耐膽鹽的能力結果與分析整理於表6及第3圖所示，表6為以1.5%的膽汁與抗過敏乳酸菌混合測驗其耐膽鹽能力。
實例5：抗過敏乳酸菌對人類腸道表皮細胞(CaCo-2)的吸附能力試驗。
在活體外採用已分化的細胞株分析五株抗過敏乳酸菌菌株吸附人類腸道表皮細胞(CaCo-2)的能力。先由人類腸道表皮細胞(CaCo-2)單層細胞株於蓋玻片上生長至單層細胞後，置入多孔細胞培養盤中。然後將細胞：乳酸菌之比例為1：200，共同培養1-3小時，以1×PBS清洗及利用甲醇固定細胞及剩餘之附著菌數後，以1×PBS清洗及利用甲醇固定後細胞及剩餘之附著菌數後，進行格蘭氏染色並確定所附著之菌數。參考Jacobsen等學者(1999)之分析方法，在1000倍顯微鏡下計數20個視野，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。
數據之統計分析以Mean±SD表示之。平均來說，取四十五個視野之計算值‧其結果整理於表7及第4圖所示。第4圖顯示依據Jacobsen等學者(1999)之分析方法，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。顯示嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株等四株抗過敏菌株均判定「強烈附著」而嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株則判定為附著。表7為五株抗過敏乳酸菌對人類腸道表皮細胞(CaCo-2)細胞株之吸附能力試驗：
實例6：以抗過敏乳酸菌作為補充飼料所產生治療或舒緩過敏性氣喘的效果，藉由以餵食唾液乳酸桿菌PM-A0006給卵蛋白(ovalbumin；OVA)致氣喘小白鼠為例藉由如下之實驗進行過敏改善評估。
1. 實驗動物
使用BALB/c小鼠，6-8週大，雌鼠，對照組與實驗組每組14隻。選用常用的BALB/c雌鼠，8週大，餵食六週，每組隻數14隻。自台大動物中心購進SPF六週大的BALB/c雌鼠，每隻小鼠分別飼養於不鏽鋼籠中，室溫控制於22±2℃，光暗循環時間各為12小時(早上六點亮，下午六點暗)，自由攝食飲水及飼料，小鼠八週大時以體重隨機分組，開始以管餵方式給予受測乳酸菌(2.6x106
至2.6x107
cfu/day)同時進行致敏。
2. 建立呼吸道發炎動物模式
小鼠致敏步驟簡述如下：實驗開始第2天以50μg卵白蛋白(OVA)與佐劑Alum 4mg腹腔注射至小鼠體內，於實驗第16、30、44天再以25μg之卵白蛋白(OVA)與4 mg Alum重複注射老鼠。致敏後，在實驗第54、55天，將小鼠麻醉，以鼻腔內(intra-nasal,i.n.)滴入100μg卵白蛋白(OVA)之方式誘發呼吸道發炎反應。
3. 實驗流程如第5圖所示，抗過敏乳酸菌改善過敏實驗的設計流程，管餵抗過敏乳酸菌之階段分為四期：第一期為0~22天；第二期為23~36天；第三期為37~50天；第四期為51~53天。其間以腹腔注射卵蛋白(OVA)致敏小鼠，分四次致敏，第一次為開始管餵之第2天；第二次為開始管餵之第16天；第三次為開始管餵之第30天；第四次為開始管餵之第44天。腹腔注射卵蛋白(OVA)致敏小鼠之隔週皆會抽血檢查小鼠之IgE在體內含量之變化。於犧牲小鼠前4天(第54天)以鼻黏膜吸入之方式致敏小鼠連續2天後，偵測小鼠之肺呼吸阻力之反應，隔天犧牲小鼠進行其他生化值的檢測。
1. 動物犧牲和實驗材料收集與分析
a. 血清樣品的收集
於實驗進行第0、23、37、51天及犧牲時對小鼠進行以眼窩採血(retro-orbital)收集血樣。將小鼠麻醉後，迅速以微量毛細管自眼窩靜脈竇採血，約取200-250 μL血液，4℃靜置2-4小時後，以12000 rpm轉速離心20分鐘，收集血清，於-80℃保存。
b. 測定卵蛋白(OVA)專一性抗體的酵素免疫分析(ELISA)
將0.5mg抗原溶於100μL carbonate coating buffer(0.1 M NaHCO3
)加入微量培養盤於4℃靜置過夜。第2天以含有0.05% Tween 20之1X PBS緩衝液清洗微量培養盤。然後以blocking solution(含有1% BSA之1X PBS緩衝液)進行blocking兩小時以上，清洗3次後，接著加入100μL待測樣本反應於4℃靜置過夜，清洗4次後，加入100μL抗小鼠IgE抗體於室溫反應一至兩小時，再清洗5次。加入100 μL經適當稀釋之avidin-HRP(avidin-horseradish peroxidase conjugated)反應一小時，清洗6次，最後加入100 μL ABTS(2.2'-Azino-bis-3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid)受質溶液於室溫呈色約30分鐘後，以100 μL之5% SDS終止反應，並以吸光值讀取機(microplate reader)讀取吸光值。測定結果以酵素免疫分析(ELISA) unit方式表示如下：
ELISA unit=(Asample
-Ablank
)/(Apositive control
-Ablank
)
c. 呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness,AHR)測定
為研究口服抗過敏乳酸菌是否能減緩致敏小鼠之過敏反應，在兩次氣管內過敏原刺激後，隔天接受呼吸道阻力的測試。測試系統為Buxco system(Biosystem XA,Buxco Electronics Inc. Sharon,CT,USA)。利用系統中的transducer(differential pressure transducer,Buxco)及preamplifier(MAX II,Buxco)收集小鼠呼吸道變化的訊息而計算出Penh值。Penh值的計算方式為pause×PIF/PEF；Pause=(Te-Tr)/Tr,(PIF：peak inspiratory flow；PEF：peak expiratory flow；Te：expiratory time；Tr：relaxation time)。小鼠在意識清醒狀態下置於whole body plethysmograph chamber中，以超音波震盪氣化normal saline導入chamber三分鐘，之後紀錄小鼠三分鐘內每分鐘平均肺呼吸阻力值Penh，再以漸增濃度之Methacholine(6.25、12.5、25、50 mg/mL)噴霧化給予小鼠刺激，各濃度皆在刺激三分鐘後，再記錄三分鐘之呼吸道生理變化。記錄三分鐘內各分鐘平均Penh值。
d. 肺沖洗液及肺部細胞分析
測試完肺呼吸阻力隔天，小鼠進行犧牲，剪開頸部皮肉使氣管露出，以靜脈置留管插入氣管，第一次先以1 mL無菌HBSS buffer沖洗肺部，第二及第三次則以含有2% BSA之HBSS buffer沖洗肺部，首次取得之肺沖洗液經1500 rpm離心5分鐘後，分離上清液保存於-80℃待後續分析。細胞部分則併入後兩次肺沖洗液中，以1500 rpm離心5分鐘，棄置上清液後並將細胞以1mL含有2% BSA之HBSS buffer懸浮，並以trypan blue染色計數，取約1×105
之細胞以離心機(cytospin) 500 rpm離心3分鐘製作細胞抹片，待其自然風乾後，依序以Liu A及Liu B染色，以少量阿拉伯膠封片，使用油鏡(1000 x)判讀至少五個視野之細胞或總數300個以上之細胞，計算其中淋巴球及多核球比例。
e. 脾臟細胞培養
無菌條件下，打開小鼠腹腔取出脾臟置於已加入3 mL HBSS buffer之20 mm petri dish內，以無菌針筒尾端將脾臟磨碎，使其中淋巴細胞釋出，細胞懸浮液吸入15 mL離心管，靜置5分鐘後，取上清液以1500 rpm離心5分鐘，吸除上清液後，加入1 mL RBC lysis buffer，靜置1分鐘使紅血球溶解，加入5 mL HBSS buffer，以1500 rpm離心5分鐘，吸除上清液；以HBSS buffer重複洗兩次後，再加入5 mL含5% FBS之RPMI-1640 complete medium使細胞懸浮。以trypan blue染色法計算細胞總數，調整細胞數至1×107
cells/mL medium。取細胞液0.5 mL加入48-well plate中，再加入等體積培養液、含裂殖素或卵蛋白(OVA)之培養液，使細胞最終濃度為5×106
cells/mL medium。置於恆溫培養箱37℃、5% CO2
培養48小時，收取上清液保存於-80℃待日後分析其中各細胞激素分泌量。
f. 細胞激素的測定
脾臟細胞分泌細胞激素的含量以三明治型酵素免疫分析法(ELISA)來測定。簡述如下：先將抗細胞激素抗體以NaHCO3
緩衝液(pH 9.6)稀釋後加入96孔微量培養盤於4℃靜置過夜。第二天將培養盤清洗3次後，以含1% BSA之PBS在室溫下反應至少1小時進行填塞(blocking)。加入待測樣本後可於37℃反應2小時或置於4℃反應過夜。清洗4次後加入以1% BSA-PBS緩衝液稀釋之biotin-conjugated抗細胞激素抗體於室溫反應1小時，清洗5次，接著加入streptavidin-conjugated peroxidase再反應1小時。最後在清洗後，每孔加入100 μL的酵素受質溶液TMB substrate(Tetramethylbenzidine substrate)，於室溫避光反應約20分鐘。以microplate autoreader讀取波長450 nm的吸光值。
2. 統計方法
實驗結果以平均值±標準誤差表示(Means±SEMs)。各組間差異以Student t-test分析，p<0.05視為有顯著差異(*,p<0.05;**,p<0.001)。另外將p<0.1視為有差異。
實驗結果分析：
血清中卵蛋白(OVA)特異性抗體效價部分，餵食PM-A0006乳酸菌的對照組，卵蛋白(OVA)致敏小鼠血清中的卵蛋白(OVA)特異性IgE抗體有減少的趨勢結果於表8，圖示於第6圖。表8顯示卵蛋白(OVA)專一性抗體IgE測定結果(Means±SEMs,N=14,P value=P)
肺呼吸阻力部分，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌在高濃度乙醯丑甲基膽素(Methacholine)刺激下顯著減低小鼠Penh值。結果於表9，圖示於第7圖。表9顯示呼吸道過度反應測定結果(Means±SEMs,N=14,Pvalue=P)
肺沖洗液中細胞組成部分，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌的實驗組有顯著較低的嗜伊紅白血球(eosinophil)浸潤比例。結果總結於表10，圖示於第8圖。表10顯示肺沖洗液分析結果(Means±SEMs,N=14,P value=P)
相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌的實驗組可顯著降低肺沖洗中eotaxin分泌量且PGE2
也有減少之趨勢。結果總結於表11，圖示於圖9及第10圖。表11顯示肺沖洗細胞激素分析結果(Means±SEMs,N=14,P value=P)
脾臟細胞經ConA或卵蛋白(OVA)刺激培養48小時後，在ConA刺激下，餵食PM-A0006乳酸菌的實驗組之脾臟細胞分泌的IFN-γ顯著高於對照組。結果總結於表12，圖示於第11圖。表12顯示偵測脾臟細胞培養之上清液，分析不同刺激物質對脾臟細胞之細胞激素分泌之影響(Means±SEMs,N=14,P value=P)
綜合上述，本發明電化學免疫檢驗試片係利用免疫反應有效地克服電化學法檢測之干擾性問題，提高檢測敏感度。另外，本發明可提供一單步驟快速檢驗試片與定量之檢測，又，更結合生物技術與電子製造技術生產低成本而簡易方便之生物科技檢驗試片。
本發明之食品組合物，含有以上所述之任意一種或一種以上菌株所組合而成之各種組合物，例如醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶或咖啡等等，且菌株可以活菌或死菌的樣態存於組合物中。
由於乳酸菌要發揮抗過敏的效果除了要找出具有特定功能的菌株外，更要確認該菌株能通過人體胃酸膽鹽的環境外，還要能對小腸黏膜表皮細胞具有良好吸附能力之乳酸菌菌株，也因為此種特性，本發明的抗過敏乳酸菌才可以提供治療或舒緩過敏症狀的醫療用途。本發明所描述的抗過敏乳酸菌可同時增強Th1途徑調控Th2過盛的過敏反應。本發明的一個目標就是繼續朝向達成這些希求或至少提供大眾在過敏治療上除類固醇或是抗組織氨的的新選擇，本發明找出對人體無副作用且有益健康的抗過敏乳酸菌來作為過敏治療的新選擇。以上所述係藉由實施例說明本發明之特點，其目的在使熟習該技術者能瞭解本發明之內容並據以實施，而非限定本發明之專利範圍，故，凡其他未脫離本發明所揭示之精神所完成之等效修飾或修改，仍應包含在以下所述之申請專利範圍中。
第1圖顯示，當分別以106
至108
個cfu嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株與105
至107
個人類周邊血液白血球(PBMC)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測干擾素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為負控制組，PHA為正控制組，偵測干擾素γ受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液白血球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。
第2圖顯示，當分別以熱殺死106
至108
個cfu嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株與105
至107
個人類樹狀細胞(dentritic cell)共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測細胞間白素IL-12在上清液中的含量。其中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為負控制組，PHA為正控制組，偵測細胞間白素(IL-12)受刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞間白素(IL-12)與負控制組有顯著性差異。
第3圖顯示，結果顯示市售抗過敏乳酸菌在培養基的活化後，總菌數經由酸性緩衝溶液及膽鹽處理，菌數明顯下降許多；調節過敏之專利寄存乳酸菌株在培養基活化後，將菌株處理酸性緩衝溶液及膽鹽，PM-A0006、PM-A0009、PM-A0013菌數並不受胃酸膽鹼改變影響而急劇下降，PM-A0002及PM-A0005雖然不受胃酸而影響菌數證明對胃酸具有耐受性，但將菌株經由膽鹽處理時，雖然菌株有些許的下降，但對膽鹽仍有耐受性，証明抗過敏之此五株乳酸菌株可以通過人體消化系統嚴格環境的考驗。
第4圖顯示，依據Jacobsen等學者(1999)之分析方法，當每個視野的平均菌數少於40時，判定為不附著(nonadhesive)；當每個視野的平均菌數介於41至100時，判定為附著(adhesive)；當每個視野的平均菌數大於100時，判定為強烈附著(strongly adhesive)。顯示嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株等四株抗過敏菌株均判定「強烈附著」而嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株則判定為附著。
第5圖顯示，抗過敏乳酸菌改善過敏實驗的設計流程，管餵抗過敏乳酸菌之階段分為四期：第一期為0~22天；第二期為23~36天；第三期為37~50天；第四期為51~53天。其間以腹腔注射卵蛋白(OVA)致敏小鼠，分四次致敏，第一次為開始管餵之第2天；第二次為開始管餵之第16天；第三次為開始管餵之第30天；第四次為開始管餵之第44天。腹腔注射卵蛋白(ovalbumin；OVA)致敏小鼠之隔週皆會抽血檢查小鼠之IgE在體內含量之變化。於犧牲小鼠前4天(第54天)以鼻黏膜吸入之方式致敏小鼠連續2天後，偵測小鼠之肺呼吸阻力之反應，隔天犧牲小鼠進行其他生化值的檢測。
第6圖顯示，為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵蛋白致敏的小白鼠血清中卵蛋白(OVA)特異性抗體效價部分，隨著餵食劑量增加，卵蛋白(OVA)致敏小鼠血清中的卵蛋白(OVA)特異性IgE抗體有減少的趨勢。
第7圖顯示，為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵蛋白致敏的小白鼠肺呼吸阻力部分，相對於對照組，皆可在高濃度乙醯丑甲基膽素(methacholine)刺激下顯著減低小鼠Penh值。
第8圖顯示，為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵蛋白致敏的小白鼠肺沖洗液中細胞組成部分，相對於對照組，有顯著較低的eosinophil浸潤比例。
第9圖顯示，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌可顯著降低肺沖洗中eotaxin分泌量。
第10圖顯示，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌可顯著降低肺沖洗中PGE2
分泌量。
第11圖顯示，脾臟細胞經ConA或卵蛋白(OVA)刺激培養48小時後，在ConA刺激下，餵食PM-A0006乳酸菌組之脾臟細胞分泌的干擾素γ顯著高於對照組。
Claims (7)
- 一種生物性純培養物，其中該培養物係選自由下列組成之群之一菌株：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002(又名PRO-2)：食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910308；及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013(又名PRO-13)：食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910309。
- 一種用於治療過敏之組合物，其包含促進INF-γ及IL-12分泌和減少IgE抗體、嗜伊紅白血球數量之至少一種乳酸桿菌株，其中該乳酸桿菌株係選自由嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002(又名PRO-2)：食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910308及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013(又名PRO-13)：食品工業發展研究所寄存編號BCRC910309及其組合所組成之群。
- 如申請專利範圍第2項之組合物，其中該等菌株係為活菌或死菌。
- 如申請專利範圍第2項之組合物，其中該組合物可添加於食品中。
- 如申請專利範圍第4項之組合物，其中該食品係選自由醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶及咖啡所組成之群。
- 如申請專利範圍第1項之培養物，其中該培養物係指嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002(又名PRO-2)：食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910308。
- 如申請專利範圍第1項之培養物，其中該培養物係指嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013(又名PRO-13)：寄存編號BCRC 910309。
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