CN112375722A - 一种改善过敏的干酪乳杆菌lc-12及其产品、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生物技术领域，具体的说是一种改善过敏的干酪乳杆菌LC‑12及其产品、应用，本发明所述干酪乳杆菌LC‑12分离自新疆伊犁州健康婴儿粪便样本。保藏编号为CGMCCNO.21372;本发明所述干酪乳杆菌LC‑12及其产品在过敏症状中的应用，可以有效改善过敏症状。

Description

一种改善过敏的干酪乳杆菌LC-12及其产品、应用
技术领域
本发明涉及一种微生物技术领域，具体的说是一种改善过敏的干酪乳杆菌LC-12及其产品、应用。
背景技术
乳酸杆菌是一群对机体有益的微生物，它具有维护人体健康和调节免疫功能的作用。干酪乳杆菌能维持机体特异性和非特异性的免疫机制。
干酪乳杆菌经过发酵后不仅可为食品增加发酵风味物质，还能保护食品原有颜色、促进矿物质吸收、产生人体所必需的多种维生素、乳酸菌素、消化酶等物质，从而具有健胃、助消化及提高机体免疫能力的功效。
目前，随着环境的不断恶化以及人们饮食习惯的不断改变，免疫症状诸如过敏、气喘、慢性鼻炎、异位性皮肤炎(atopicdermatitis)、皮肤过敏病、花粉、过敏哮喘病、过敏性哮喘，荨麻疹等过敏性疾病的发生率逐年提高，尤其是过敏性哮喘，据统计在1990年全国0—14岁儿童哮喘患病率调查为0.91%，2000年已上升为1.5%，这个数字意味着我国存在1000多万哮喘病患儿，同时由于儿童的特殊人群，往往不能使用一些现有的治疗哮喘的药物，同时目前用于过敏性疾病的治疗方法大多采用口服或涂抹类固醇，然而其缺点是容易产生副作用例如使病人变胖或增加感染率，甚至有致死的风险；或是脱离过敏源，但是这需要去医院检查过敏源、然后再远离过敏源，此方法治疗效果慢、增加病患的痛苦，又费时、费力、增加医疗成本。
随着人们生活水平的不断提高，人们对食品安全和天然食品添加剂这块就更为重视，尤其是人们对益生菌产品就更为青睐，因此，许多研究团队正在开发更安全的方法，尽可能在减少副作用的前提下，舒缓或是改善过敏和免疫疾病，已成为目前医学上亟待解决的难题之一。
发明内容
本发明为解决目前在治疗、舒缓或改善过敏疾病和免疫疾病上即过敏性疾病或过敏性哮喘疾病上的药物具有副作用，治疗效果慢，患病时间长、医疗成本高的问题，提供一种干酪乳杆菌LC-12，该菌种具有降低特异性IgE的表达水平、提高特异性IgG2a的表达水平、提高白介素10的表达水平的作用，可以有效改善过敏性症状，解决现有过敏症状中出现的患病时间长、医疗成本高的问题。
针对上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种干酪乳杆菌LC-12，干酪乳杆菌LC-12分离自新疆伊犁州健康婴儿粪便样本，干酪乳杆菌LC-12的保藏号为：CGMCCNO.21372，保藏日期为2020年12月14日，菌种命名为LC-12，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，干酪乳杆菌LC-12，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei。
进一步，所述的一种干酪乳杆菌LC-12在降低特异性IgE的表达水平、提高特异性IgG2a的表达水平、提高白介素10的表达水平中的应用。
本发明的第二个目的在于所述的一种干酪乳杆菌LC-12在制备改善过敏产品中应用。
进一步，所述的产品包括内服制剂和/或外用制剂。
进一步，所述产品是以权利要求1中所述的保藏编号为：CGMCCNO.21372的干酪乳杆菌LC-12进行制备。
进一步，所述的内服制剂和/或外用制剂中均含有干酪乳杆菌LC-12粉剂。
进一步，所述内服制剂中干酪乳杆菌LC-12粉剂的活菌数﹥50亿/g；
所述外用制剂中干酪乳杆菌LC-12粉剂的活菌数﹥50亿/g。
进一步，所述干酪乳杆菌LC-12粉剂的制备方法为：按体积百分比，将1%的干酪乳杆菌LC-12接种到99%的MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养12小时，吸取培养菌液，在1500转/分钟条件下、离心15分钟，冻干，得到沉淀物，然后按重量份数比，在1份沉淀物中加入0.5份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到干酪乳杆菌LC-12粉剂；
进一步，所述干酪乳杆菌LC-12分离自新疆伊犁州健康婴儿粪便样本。
进一步，所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4•7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、CH3COONa•3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4•7H2O 0.2g、MnSO4•4H2O 0.05g、蒸馏水1000mL。
本发明的有益效果为：
本发明提供的干酪乳杆菌LC-12为Lactobacillus casei（干酪乳杆菌），干酪乳杆菌LC-12可降低特异性IgE的表达水平、提高特异性IgG2a的表达水平、提高白介素10的表达水平，有效提高机体特异性IgG2a蛋白、抗体，提高白介素10的表达水平，降低特异性IgE的表达水平，可以有效减少过敏源对呼吸道组织机理的浸润，具有很强的耐酸性和耐胆盐性，可以增强机体免疫力，提高抗病能力，有效舒缓或改善过敏性疾病或过敏性哮喘疾病，无副作用，疗效快且医疗成本低。
本发明利用干酪乳杆菌LC-12菌粉制备的产品，在服用后可以有效缓解过敏源的对人体的侵润，减轻过敏源对呼吸道的影响，可以改善过敏反应。
本发明制备的含有干酪乳杆菌LC-12的内服制剂和/或外用制剂，可以改善过敏性疾病、免疫疾病，具有疗效快、减少病患的患病时间、减少医疗成本，减少资源消耗。
附图说明
图1为实施例2各菌种模拟胃酸液计算菌种存活率的对照图；
图2为实施例3各菌种模拟肠液计算菌种存活率的对照图；
图3为实施例4各菌种对降低过敏源在小鼠体内特异性IgE的表达水平的对照图；
图4为实施例4各菌种对提高过敏源在小鼠体内特异性IgG2a的表达水平的对照图；
图5为实施例4各菌种对提高小鼠机体内IL-10的表达水平的对照图；
图6为实施例4各组小鼠的肺部组织片中炎症浸润程度的对照图；
图中标号：1、ATCC7469，2、ATCC6117，3、LC-12，4、CICC6104，5、control，6、positive。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
本发明提供的干酪乳杆菌LC-12，干酪乳杆菌LC-12分离自新疆伊犁州健康婴儿粪便样本。其保藏号为：CGMCCNO.21372，保藏日期为2020年12月14日，菌种命名为LC-12，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，干酪乳杆菌LC-12的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei。
本发明中所用对照检测菌种均为市售产品；
所述低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司；
所述基因组DNA试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
所述ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司公司；
所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4•7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、CH3COONa•3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4•7H2O 0.2g、MnSO4•4H2O0.05g、蒸馏水1000mL；
所述MRS液体培养基的制备方法：在蒸馏水中加入蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、K2HPO4•7H2O、柠檬酸三铵、CH3COONa•3H2O、葡萄糖、吐温80 、MgSO4•7H2O 、MnSO4•4H2O，混合均匀，调节pH值至6.2～6.5，分装、115℃、灭菌15分钟，制得MRS液体培养基；
所述PBS缓冲液：取KH2PO4 0.2g、NaCl 8.0g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Tween-200.5mL、KCl0.2g，用去离子水定容至1000mL，混合均匀，调节pH值为7.4，121℃、灭菌15分钟，得到PBS缓冲液；
所述检测混合物：取10μg的Derp2、20mg的Alum（Alum为十二水合硫酸铝钾）用无菌PBS混合液定容至200µL，混合均匀，制得检测混合物；依此制备方法制得试验中所需检测混合物的用量；
所述包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液）：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，去离子水定容至1000mL，调pH至9.6，制得包被缓冲液；
所述洗涤缓冲液：KH2PO40.2g，NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.9g，Tween-200.5mL，KCl0.2g，去离子水定容至1000ml，调pH至7.4，制得洗涤缓冲液；
封闭液：称取BSA（牛血清白蛋白）1g，加洗涤缓冲液定容至100ml，制得封闭液；
所述稀释的二抗：按二抗：洗涤缓冲液为1:7000的倍数进行稀释，制得稀释的二抗；
所述TBS缓冲液：称取Nacl8.8g、Tris(三羟甲基氨基甲烷)2.42g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，制得TBS缓冲液；
所述TMB显色底物购自北京康为。
实施例1
本发明提供的一种干酪乳杆菌LC-12
1.样本采集
样本来源于新疆伊犁州健康婴儿粪便；
2.菌种的分离、纯化
1）将样本按10倍梯度进行稀释，制得稀释液，备用；
2）平板培养基制备
在1000mL蒸馏水中加入蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4•7H2O2g、柠檬酸三铵2g、CH3COONa•3H2O5g、葡萄糖20g、吐温801mL、MgSO4•7H2O0.2g、MnSO4•4H2O0.05g搅拌至各组分完成溶解，调节pH至6.2～6.4，然后加入琼脂15g，加热煮沸至琼脂完全溶解，121℃，灭菌15分钟，形成平板培养基；
3）取100μL步骤1）中的稀释液，将其均匀涂布在平板培养基中，置于厌氧罐内，37℃条件下厌氧培养48小时，直至长出1-2mm的特征菌落；
所述特征菌落为菌落白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起；
4）挑取步骤3）中5个直径为1-2mm的特征菌落，将特征菌落通过划线接种到平板培养基上进行纯化培养，37℃条件下、厌氧活化48小时，观察平板培养基中的单菌落，挑取直径为2mm的单菌落，既得培养物菌种，命名为LC-12；
3.菌种的鉴定
1）选取通用引物：27F引物、1492R引物，备用；
引物序列为：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2）菌种的鉴定
A、利用基因组DNA试剂盒提取培养物菌种的基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，得到扩增产物，之后将扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，通过测序检测16SrDNA的全长，在Eztaxon数据库进行Blast比对，进行同源性比较，该菌种属于干酪乳杆菌属（Lactobacillus casei），其分类单元为：Bacteria;Firmicutes;Bacilli;Lactobacillales;Lactobacillaceae;Lactobacillus.，命名为LC-12，保藏中心是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCCNO.21372，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
实施例2
干酪乳杆菌LC-12的耐酸性能
通过体外人工模拟胃酸的存活率实验测定干酪乳杆菌LC-12的耐酸性能
1）菌种选取
选取菌种：干酪乳杆菌LC-12、ATCC7469、ATCC6117、CICC6104；
2）模拟胃酸液的配制
①取16.4mL浓度为9.5%的盐酸，然后加入蒸馏水对盐酸进行稀释，稀释至pH值为2.0时止，得到盐酸溶液；
②按每100mL的盐酸溶液中加入1.0g胃蛋白酶的加入量，在盐酸溶液中加入胃蛋白酶，混合均匀，然后通过0.22μm的无菌滤膜进行过滤，得到模拟胃酸液；
3）制备各菌种的模拟胃酸液
以干酪乳杆菌LC-12为例制备干酪乳杆菌LC-12不同培养时间的模拟胃酸液
在试管中加入9mL模拟胃酸液，37℃条件下预热2分钟，然后在含有9mL模拟胃酸液的试管中加入1g干酪乳杆菌LC-12，干酪乳杆菌LC-12的活菌数为100亿/g，在温度为37℃、转速为80r/min，分别培养0.5小时、1.5小时、2小时，得到培养0.5小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液、培养1.5小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液，培养2小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液，然后按10倍梯度分别对三组模拟胃酸液进行稀释，得到稀释后培养0.5小时的含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液、稀释后培养1.5小时的含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液、稀释后培养2小时的含有干酪乳杆菌LC-12的模拟胃酸液，备用；
按照制备干酪乳杆菌LC-12不同培养时间的模拟胃酸液的制备方法，依次制备ATCC7469不同培养时间的模拟胃酸液、ATCC6117不同培养时间的模拟胃酸液、CICC6104不同培养时间的模拟胃酸液；
3）对待检菌种进行存活率计数
将各菌种的待检模拟胃酸液进行活菌计数计算各菌种的存活率，即检测各菌种的耐酸性能，结果见表1及其图1；
表1、各菌种不同培养时间的存活率：
TimeLactobacillus 0.5小时 survivalrate(%) 1.5小时 survivalrate(%) 2小时 survivalrate(%)
LC-12 92 85 80
ATCC7469 58 27 20
ATCC6117 40 35 30
CICC6104 65 55 33
结果检测：由表1、图1可知，干酪乳杆菌LC-12菌株在模拟胃酸液试验时，存活率明显高于其他测试菌株,其存活率高达80%,在培养2个小时的存活率达80%，明显高于同期的其他菌种，表明干酪乳杆菌LC-12菌株具有很强的耐酸性能，其耐酸性能高于其他菌种。
实施例3
干酪乳杆菌LC-12的耐胆盐性能
通过体外人工模拟肠液的存活率实验测定干酪乳杆菌LC-12的耐胆盐性能
1）菌种选取
选取菌种：干酪乳杆菌LC-12、ATCC7469、ATCC6117、CICC6104；
2）模拟肠液的配制
①取6.8g的KH2PO4，加入500mL蒸馏水，使KH2PO4溶解，然后用浓度为4g/L的NaOH溶液调pH至6.8，用蒸馏水定容至1L，形成混合液，再加入胆盐使混合液中胆盐的浓度为0.3%，然后加入胰蛋白酶使混合液中胰蛋白酶的浓度为1%，混合均匀，然后通过0.22μm的无菌滤膜进行过滤，得到模拟肠液；
3）制备各菌种的模拟肠液
以干酪乳杆菌LC-12为例制备干酪乳杆菌LC-12不同培养时间的模拟肠液
在试管中加入9mL模拟肠液，37℃条件下预热2分钟，然后在含有9mL模拟肠液的试管中加入1g干酪乳杆菌LC-12，干酪乳杆菌LC-12的活菌数为100亿/g，在温度为37℃、转速为80r/min，分别培养0.5小时、1.5小时、2小时，得到培养0.5小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟肠液、培养1.5小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟肠液，培养2小时含有干酪乳杆菌LC-12的模拟肠液，然后按10倍梯度分别对三组模拟肠液进行稀释，得到稀释后培养0.5小时的含有干酪乳杆菌LC-12的模拟肠液、稀释后培养1.5小时的含有干酪乳杆菌LC-12的模拟肠液、稀释后培养2小时的含有干酪乳杆菌LC-12的肠液，备用；
按照制备干酪乳杆菌LC-12不同培养时间的模拟肠液的制备方法，依次制备ATCC7469不同培养时间的模拟肠液、ATCC6117不同培养时间的模拟肠液、CICC6104不同培养时间的模拟肠液；
3）对待检菌种进行存活率计数
将各菌种的待检模拟肠液进行活菌计数计算各菌种的存活率，即检测各菌种的耐胆盐性能，结果见表2及其图2；
表2、各菌种不同培养时间的存活率：
TimeLactobacillus 0.5小时 survivalrate(%) 1.5小时 survivalrate(%) 2小时 survivalrate(%)
LC-12 95 88 82
ATCC7469 51 36 33
ATCC6117 67 52 50
CICC6104 46 35 27
结果检测：由表2、图2可知，干酪乳杆菌LC-12菌株在模拟肠液试验时，存活率明显高于其他测试菌株,其存活率高达82%，在培养2个小时时的存活率达82%，明显高于同期的其他菌种，表明干酪乳杆菌LC-12菌株具有很强的耐胆盐性能，其耐胆盐性能高于其他菌种。
实施例4
干酪乳杆菌LC-12对小鼠肺部过敏反应的影响试验
1、试验组设计
1）试验分组：选取4周龄、SPF级的雌性小鼠90只，将小鼠随机分为6组，每组15只，即对照组（control）、模型组（Positive）、干酪乳杆菌LC-12组、ATCC7469组、ATCC6117组及CICC6104组；
2）各菌种菌悬液的制备
以干酪乳杆菌LC-12为例制备干酪乳杆菌LC-12菌悬液
①按重量百分比，将1%的干酪乳杆菌LC-12接种到MRS液体培养基中，37℃培养16h后，离心，得到菌体；
②用PBS缓冲液洗涤菌体两次，然后将菌体重悬于PBS缓冲液中形成干酪乳杆菌LC-12菌液，使干酪乳杆菌LC-12菌液的OD600控制在0.5~0.8，通过平板计数法确定干酪乳杆菌LC-12菌液在OD600（0.5~0.8）时与活菌数之间的线性关系，最终使干酪乳杆菌LC-12菌液中菌体的浓度为1×1010CFU/mL；
按照制备干酪乳杆菌LC-12菌悬液的制备方法，依次制备ATCC7469菌悬液、ATCC6117菌悬液、CICC6104菌悬液；
3）致敏混合的制备
HDM 提取液（HDM 提取液是致敏用的，肺部过敏模型是用HDM 提取液和吸入尘螨过敏原溶液共同作用导致的）: HDM 购自丹麦 ALK 公司, 主要成分是: Der p1 ( 49% ) 和Der p 2 ( 49% ) , 粉末状, 0.1mol/L PBS 稀释为 1mg/mL HDM 提取液, 0.22μm过滤器除菌。
4）试验处理：
对照组（control）：在试验的第1至14天时用无菌PBS缓冲液灌胃，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µL无菌PBS缓冲液，分别将第35天、第40天的对照组（control）小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
模型组（Positive）：在试验的第1至14天时用无菌PBS缓冲液灌胃，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µL HDM 提取液，分别将第35天、第40天的模型组（Positive）小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
干酪乳杆菌LC-12组：在试验的第1至14天时用干酪乳杆菌LC-12菌悬液灌胃，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µLHDM 提取液，分别将第35天、第40天的干酪乳杆菌LC-12组小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
ATCC7469组：在试验的第1至14天时用ATCC7469菌悬液，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µLHDM 提取液，分别将第35天、第40天的ATCC7469组小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
ATCC6117组：在试验的第1至14天时用ATCC6117菌悬液，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µLHDM 提取液，分别将第35天、第40天的ATCC6117组小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
CICC6104组：在试验的第1至14天时用CICC6104菌悬液，每日1次，每次计量为200µL，在第15天、第22天、第29天时分别腹腔注射200µLHDM 提取液，分别将第35天、第40天的CICC6104组小鼠置于密闭的环境中吸入雾化的屋尘螨过敏原溶液（雾化的屋尘螨过敏原溶液的浓度为0.1mg/mL），吸入时间为45分钟；
过敏原屋尘螨诱发的呼吸道过敏反应是一类较常见炎症反应，其典型症状包括咳嗽、气喘、呼吸困难等。研究发现哮喘发作时，炎症细胞会从周围的毛细血管向炎症部位（肺部）迁移，在此过程中乳酸菌的干预，可以明显减轻过敏引起肺部炎症反应。
5）小鼠血清及组织处理
以干酪乳杆菌LC-12组中的一只小鼠为例，对小鼠血清、小鼠肺泡灌洗液及组织进行处理
制备小鼠血清：取试验第45天的小鼠，小鼠经腹腔麻醉后摘取眼球取血0.5ml，室温静置2小时，在温度为4℃，转速为4000转/分钟，离心10分钟，收集上层血清，得到小鼠血清，-80℃保存，备用；
制备小鼠肺泡灌洗液：将摘取眼球后的小鼠处死，进行颈部解剖暴露气管，用0.8mL的PBS缓冲液反复冲洗气管三次，收回洗涤液，在温度为4℃，转速为2000转/分钟，离心10分钟，收集上清液，得到肺泡灌洗液，-80℃保存，备用；
制备小鼠肺部组织：分离出小鼠肺部组织，用生理盐水洗涤两次，用滤纸吸去肺部组织上的多余液体，后将其转入4%的甲醛溶液中固定24小时，用于病理学检查；
根据干酪乳杆菌LC-12组中的一只小鼠的血清、小鼠肺泡灌洗液及小鼠肺部组织的处理制备方法，依次制备干酪乳杆菌LC-12组其他小鼠的血清、小鼠肺泡灌洗液及小鼠肺部组织处理，同时依照此方法制备其他各组小鼠的血清、小鼠肺泡灌洗液及小鼠肺部组织处理，备用；
6）检测方法
血清中Derp2特异性抗体的检测
对干酪乳杆菌LC-12组中制备的小鼠血清进行Derp2特异性抗体检测，以干酪乳杆菌LC-12组中的一只小鼠为例进行Derp2特异性抗体的检测：
①包被：用包被缓冲液将纯化的Derp2稀释到浓度为10μg/mL的Derp2溶液，在96孔板中，每孔加入100μL的Derp2溶液，在温度4℃条件下、包被过夜，然后弃去上清液，用洗涤缓冲液反复洗涤3次，每次5分钟；
②封闭：用滤纸吸取96孔板上多余的液体，然后加入150μL的封闭液，在温度37℃条件下、反应2小时，最后用洗涤缓冲液反复洗涤3次，每次5分钟；
③加样：在步骤②的96孔板上的各个孔内加入20μL小鼠血清，在温度37℃条件下、反应1小时，最后用洗涤缓冲液反复洗涤3次，每次5分钟；
④加入二抗：在步骤③的96孔板上的各个孔内加入100μL稀释的二抗，在温度37℃条件下、反应1小时，再用洗涤缓冲液反复洗涤2次，每次5分钟，最后用不含Tween-20的TBS缓冲液洗涤5分钟，
⑤底物：在步骤④的96孔板上的各个孔内加入TMB显色底物，室温避光反应15分钟；
⑥终止：在步骤⑤的96孔板上的各个孔内加入50μL当量浓度为2的H2SO4溶液，终止反应，水平振荡混匀；
⑦读数：将步骤⑥的96孔板置于酶标仪中，在450nm条件下读数，记录检测结果，结果见图。
根据上述血清Derp2特异性抗体的检测方法，依次对干酪乳杆菌LC-12组中的其他小鼠以及其他各组小鼠进行血清Derp2特异性抗体，测得各组中小鼠体内特异性IgE的平均表达水平、小鼠体内特异性IgG2a的平均表达水平，检测结果见图3、图4：
由图3可知，干酪乳杆菌LC-12明显降低过敏源对小鼠体内特异性IgE的表达水平，并且干酪乳杆菌LC-12优于ATCC7469组、ATCC6117组及CICC6104组；
由图4可知，干酪乳杆菌LC-12明显提高过敏源对小鼠体内特异性IgG2a的表达水平，并且干酪乳杆菌LC-12优于ATCC7469组、ATCC6117组及CICC6104组。
肺泡灌洗液中细胞因子的检测
利用ELISA试剂盒分别对各组中的小鼠肺泡灌洗液进行IL-10表达水平的测定，测定各组中IL-10的平均表达水平，检测结果见图5，操作步骤按试剂盒说明进行操作；
由图5可知，干酪乳杆菌LC-12有效提高小鼠机体内IL-10的表达水平，并且干酪乳杆菌LC-12明显优于ATCC7469组、ATCC6117组及CICC6104组；
肺部组织切片
利用病理组织切片法对各组中的小鼠肺部组织进行肺部组织切片，以干酪乳杆菌LC-12组中的一只小鼠的肺部组织为例进行肺部组织切片；
取经过4%甲醛固定后的小鼠肺部组织，然后包埋、切片、HE染色后，在显微镜下观察并拍照，并记录结果，检测结果见图6（图6中为各组的组织切片以选取各组中最佳组织切片为代表）：
由图6可知，肺部的染色结果表明，在对照组中由于过敏源的介入使小鼠肺部组织中炎症细胞的浸润程度明显增加，四组乳酸菌的染色结果明显降低了肺部组织中炎症浸润的程度，干酪乳杆菌LC-12在降低肺部组织中炎症浸润的效果明显优于其他各组。
实施例5
干酪乳杆菌LC-12粉剂的制备
按体积百分比，将1%的干酪乳杆菌LC-12接种到99%的MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养12小时，吸取培养菌液，在1500转/分钟条件下、离心15分钟，冻干，得到沉淀物，然后按重量份数比，在1份沉淀物中加入0.5份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到干酪乳杆菌LC-12粉剂。
实施例6
以干酪乳杆菌LC-12菌粉作为主料制备内服乳酸粉剂，步骤如下：
按重量份数比，取1份麦芽糖、0.5份维生素C、0.2份西蓝花素、1份荨麻叶素，搅拌均匀，再加入3份干酪乳杆菌LC-12菌粉，混合均匀，粉碎、过筛，制得粉剂。
其中干酪乳杆菌LC-12在内服制剂中的活菌数为100亿/g。
实施例7
以干酪乳杆菌LC-12菌粉作为主料制备内服乳酸片剂，步骤如下：
按重量份数比，取1份麦芽糖、0.8份维生素C、0.5份西蓝花素、1份荨麻叶素、0.8份槲皮黄素，搅拌均匀，再加入2.5份干酪乳杆菌LC-12菌粉，混合均匀，过筛、经过制片机，制得内服乳酸片剂。
其中干酪乳杆菌LC-12在内服乳酸片剂中的活菌数为250亿/g。
实施例8
以干酪乳杆菌LC-12菌粉作为主料制备内服乳酸丸剂，步骤如下：
按重量份数比，取1份麦芽糖、0.8份维生素C、0.5份西蓝花素、1份荨麻叶素、1份槲皮黄素、3份干酪乳杆菌LC-12菌粉、2份淀粉、0.5份糊精、1.5份去离子水，混合均匀，过筛、制丸，干燥，制得内服乳酸丸剂。
其中干酪乳杆菌LC-12在内服乳酸丸剂中的活菌数为500亿/g。
实施例9
以干酪乳杆菌LC-12菌粉作为主料制备外用乳酸悬浊喷剂，步骤如下：
按重量份数比，取0.5份麦芽糖、1份维生素C、0.8份西蓝花素、0.5份荨麻叶素、0.8份槲皮黄素、1份维生素B，搅拌均匀，再加入3份干酪乳杆菌LC-12菌粉，混合均匀，最后加入无菌去离子水，分装，制得外用乳酸悬浊喷剂；
其中干酪乳杆菌LC-12在外用乳酸悬浊喷剂中的活菌数为500亿/mL；
其中外用乳酸悬浊喷剂在使用前进行摇匀，均匀喷在患者的过敏处。
临床试验
试验一内服制剂对过敏反应的效果
试验组：设置3个试验组，分别以实施例6-实施例8为试验组1、试验组2、试验组3；
药物组1：地氯雷他定（药店购买，厂家为海南普利制药有限公司，规格为0.5g2.5mg以地氯雷他定计）
药物组2：盐酸西替利嗪（药店购买，厂家为苏州东瑞制药有限公司，规格为5mg以西替利嗪计）
每组试验人数：选取150名患有哮喘的10岁儿童，平均分为5组，每组30人；
试验内容：试验组1-3中的每个成员在每天早晨饭后半小时，分别服用实施例6-8中的食品（试验组1服用实施例6中的食品，试验组2服用实施例7中的食品，试验组3服用实施例8中的食品），服用量按0.2g/10kg，每日一次，连续服用7天，以及药物组中的药物（服用按说明书服用），记录用药副作用、治愈率，详见表4；
治愈率的计算方法：治愈率=（治愈人数/试验人数）×100%
表3：为干酪乳杆菌LC-12、药物组1、药物组2对过敏性哮喘的检测指标
编号 用药副作用 治愈率
试验组1 无副作用 90%
试验组2 无副作用 93%
试验组3 无副作用 97%
药物组1 出现口干、头痛、眩晕等症状 70%
药物组2 出现口干、头痛等症状 67%
由表3可知，含有干酪乳杆菌LC-12的内服制剂在改善过敏性哮喘上有明显效果，且无副作用。
试验二外敷膏剂或乳酸悬浊喷剂对改善过敏反应的效果
试验组：以实施例9为试验组4
药物组3：糠酸莫米松软膏（药店购买，厂家为拜耳医药（上海）有限公司，规格为0.1%（5g：5mg）以糠酸莫米松计）
药物组4：多磺酸粘多糖软膏（药店购买，厂家为MobilatProduktionsGmbH，规格为（100g：300mg）以多磺酸粘多糖计）
每组试验人数：选取90名患有过敏反应的30岁成人，平均分为3组，每组30人；
试验内容：试验组4中的每个成员在每天早、晚各均匀喷洒实施例9中的外用乳酸悬浊喷剂（单次使用剂量为患者过敏部位在施药后一分钟内不干燥为宜）、连续用药7天，以及药物组中的药物（按说明书使用），连续用药7天，记录用药3天治愈率、5天治愈率、7天治愈率，详见表5；
治愈率的计算方法：治愈率=（治愈人数/试验人数）×100%
表4：为干酪乳杆菌LC-12对改善过敏反应的治愈率指标分析
编号 3天治愈率% 5天治愈率% 7天治愈率%
试验组4 7% 53% 90%
药物组3 7% 47% 73%
药物组4 7% 43% 67%
由表4可知，含有干酪乳杆菌LC-12的外用乳酸悬浊喷剂在改善过敏反应上有明显效果，在用药5天、7天时的治愈率明显高于药物组的治愈率。
试验三干酪乳杆菌LC-12的毒理试验
试验组5：干酪乳杆菌LC-12粉剂，将干酪乳杆菌LC-12用PBS缓冲液稀释成浓度为100亿/ml，形成干酪乳杆菌LC-12溶液；
空白对照组1：生理盐水
每组试验小白鼠：30只/组，体重为20g/只；
试验内容：
空白对照组1：灌胃生理盐水，每日1次，每次用量为0.1ml，连续喂服30天，记录一个月内每组小鼠的死亡率；
试验组5：灌胃干酪乳杆菌LC-12溶液，每日1次，每次计量为0.1ml，连续喂服30天，记录一个月内每组小鼠的死亡率；
死亡率=（死亡数/每组试验小白鼠只数）×100%
表5为试干酪乳杆菌LC-12的毒理试验指标分析
组别 试验组5 空白对照组1
死亡率 0% 0%
由表5可知，干酪乳杆菌LC-12相对于对比组没有任何毒副作用。
试验四 干酪乳杆菌LC-12对不同塑化剂皮肤暴露导致的小鼠过敏性皮炎的影响
试验组6：干酪乳杆菌LC-12粉剂，将干酪乳杆菌LC-12用PBS缓冲液稀释成浓度为10亿/ml，形成干酪乳杆菌LC-12溶液；
空白对照组2：生理盐水
模型组：邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）粉末，浓度为0.5％的FITC；
每组试验小白鼠：30只/组，体重为20g；
空白对照组2：背部不作任何处理，只灌胃生理盐水，每日1次，每次计量为0.1ml，连续27d，第28d检测双耳重量差和耳肿指数；
模型组：背部剃毛后，涂抹40mg/（kg·d）的 DINP +0.5％FITC 致敏，第0-20d涂抹40mg/（kg·d）的 DINP ，第21-22d涂抹浓度为0.5％的FITC，第26d涂抹0.5％FITC，第28d检测双耳重量差和耳肿指数；
试验组6：方法同模型组，同时灌胃干酪乳杆菌LC-12溶液，每日1次，每次计量为0.1ml，连续喂服27天，第28d检测双耳重量差和耳肿指数。
表6为干酪乳杆菌LC-12的耳肿胀程度的检测结果
分组 耳肿指数mm 双耳重量差mg
空白对照组2 0.08±0.02 0.17±0.01
模型组 0.37±0.02 0.72±0.02
试验组6 0.13±0.03 0.21±0.02
由表5可知，干酪乳杆菌LC-12可显著降低塑化剂接触导致的皮肤过敏症状。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种改善过敏的干酪乳杆菌LC-12及其产品、应用
<130> 2021.1.18
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1493
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌Lactobacillus casei
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gagttttggt cgatgaacgg 60
tgcttgcact gagattcaac ttaaaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120
ctgcccttaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta ataccgcata aatccaagaa 180
ccgcatggtt cttggctgaa agatggcgaa agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt 240
attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgatga tacgtagccg aactgagagg 300
ttgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 360
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc 420
gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga 480
cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540
ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga 600
tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaagc gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga 660
agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720
tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa 780
caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt 840
tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa 900
ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg 1020
tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgac tagttgccag cattgagttg 1140
ggcactctag taagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag 1260
accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc 1320
gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacacccg aagccggtgg 1440
cgtaaccctt ttagggagcg agccgtctaa ggtgggacaa atgattaggg tga 1493
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
序列表
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种改善过敏的干酪乳杆菌LC-12及其产品、应用
<130> 2021.1.18
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1493
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gagttttggt cgatgaacgg 60
tgcttgcact gagattcaac ttaaaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120
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catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag 1260
accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc 1320
gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc 1380
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
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<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.一种干酪乳杆菌LC-12，其特征在于，干酪乳杆菌的保藏号为：CGMCCNO.21372，保藏日期为2020年12月14日，菌种命名为LC-12，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌LC-12，其特征在于，所述干酪乳杆菌LC-12分离自新疆伊犁州健康婴儿粪便样本。
3.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌LC-12在降低特异性IgE的表达水平、提高特异性IgG2a的表达水平、提高白介素10的表达水平中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌LC-12在制备改善过敏产品中应用。
5.一种干酪乳杆菌LC-12产品，其特征在于，所述的产品包括内服制剂和/或外用制剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述的内服制剂和/或外用制剂中均含有干酪乳杆菌LC-12粉剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述内服制剂中干酪乳杆菌LC-12粉剂的活菌数﹥50亿/g；
所述外用制剂中干酪乳杆菌LC-12粉剂的活菌数﹥50亿/g。
8.一种干酪乳杆菌LC-12粉剂的制备方法，其特征在于，按体积百分比，将1%的干酪乳杆菌LC-12接种到99%的MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养12小时，吸取培养菌液，在1500转/分钟条件下、离心15分钟，冻干，得到沉淀物，然后按重量份数比，在1份沉淀物中加入0.5份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到干酪乳杆菌LC-12粉剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4•7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、CH3COONa•3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4•7H2O 0.2g、MnSO4•4H2O 0.05g、蒸馏水1000mL。
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