CN116139180B - 一种抗pedv的组合物、制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种抗PEDV的组合物、制剂及其制备方法和应用。本发明提供的抗PEDV的组合物，其原料包括或由植物乳杆菌和茯苓组成，其中，所述植物乳杆菌为重组植物乳杆菌NC8‑pSIP409‑pgsA’‑S‑Dcpep。本发明共发酵重组植物乳杆菌NC8‑pSIP409‑pgsA’‑S‑Dcpep和茯苓获得组合物能够有效缓解猪感染PEDV后的临床症状，维持猪正常体温、体重和正常采食，有效激活体液免疫和细胞免疫、缓解炎症；并且能够有效降低病毒载量，并对小肠组织和盲肠组织具有良好的保护作用。
Description
技术领域
本申请涉及微生物发酵领域，具体涉及一种抗PEDV的组合物、制剂及其制备方法和应用。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起仔猪呕吐、腹泻、脱水和高致死率的病原体。猪流行性腹泻(PEDV)是一种急性、高度传染性的肠道疾病。新生仔猪和哺乳仔猪因PEDV导致的死亡率可接近100％，给世界养猪业带来重大经济损失。
仔猪最常见的腹泻是由病原微生物感染引起的，主要致病因子是病毒、细菌和寄生虫，其中仔猪流行性腹泻病毒(PEDV)在养猪生产中最为常见。PEDV可引起所有年龄组猪的发病，以仔猪发病率最高。临床上以仔猪呕吐、腹泻、脱水为特征，死亡率甚至高达100％。1970年代在英国首次发现后，疾病传播到欧洲国家。2010年，中国报道了高发病率的新变种，美国、加拿大、墨西哥、巴西等许多其他国家也有相同毒株的新报道。PEDV属于冠状病毒科的α冠状病毒属。PEDV基因组是一个长度约为28kb的正链单链RNA。它包括四个结构蛋白，即刺突蛋白(S)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白，以及三种非结构蛋白，即复制酶1a、复制酶1b和ORF3。PEDV经过粪口传播进入体内，但是消化道传播并不是该病唯一的传播途径，有研究检测到带毒母猪的乳汁存在PEDV。精液、乳汁中也可携带一定数量的病毒，也是PEDV潜在的传播途径。不仅病猪呼吸道分泌物可以感染易感猪群，有研究发现PEDV气溶胶同样具有感染性。仔猪流行性腹泻正在对中国的养猪行业发展产生严重影响。
长期以来，为了控制PEDV的传播，构建了大多数种类疫苗，如氢氧化铝佐剂灭活疫苗、二价灭活传染性胃肠炎病毒(TGEV)和PEDV疫苗和PEDV减毒疫苗。虽然这些疫苗在控制PED方面发挥了重要作用，但它们都存在缺陷。灭活疫苗不能激活细胞免疫反应，减毒疫苗也不是很安全，它们都不能诱导产生足够的粘膜免疫反应的病毒特异性IgA抗体。因此，研究出一种科学性、合理性、有效性，全新的治疗仔猪流行性腹泻的方法仍是世界各地学者今后的主要目标和巨大挑战。
本发明的目的在于克服或改善现有技术中的至少一个缺点，或提供一个有用的替代方案。除非上下文有明确的要求，否则在整个说明书和权利要求中，“包括”、“包含”等词应从包容性的角度来解释，而不是从排他性或详尽性的角度来解释；也就是说，从“包括，但不限于”的角度来解释。
发明内容
本发明提供了一种抗PEDV的组合物，包含该组合物的药物制剂或饲料添加剂，以及该具有抗PEDV作用的组合物的制备方法。本发明所述的组合物对感染PEDV的猪具有良好的免疫效果，能够显著缓解感染PEDV产生的临床不适症状，显著激活体液免疫和细胞免疫、保护肠道组织健康，以及能够显著提升干扰素水平、显著降低猪体内的病毒量，表现出对猪流行性腹泻的良好的防治作用，和对PEDV的抗病毒作用。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种抗PEDV的组合物，其原料包括或由植物乳杆菌和茯苓组成，其中，所述植物乳杆菌为重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep，重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep由吉林农业大学(吉林省动物微生态制剂工程研究中心)保存并提供。该重组植物乳杆菌已在学术论文Huang Ke-Yan,YangGui-Lian,Jin Yu-Bei et al.Construction and immunogenicity analysis ofLactobacillus plantarum expressing a porcine epidemic diarrhea virus S genefused to a DC-targeting peptide.[J].Virus Res,2018,247:84-93中公开，可根据论文中所述方法构建获得，其中，该重组植物乳杆菌中的融合基因S-Dcpep的序列如Seq_1中所示。
在本发明的实施方式中，所述组合物由重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓共发酵制得。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面所述的抗PEDV的组合物的方法，其包括共发酵重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓。
在本发明的实施方式中，所述共发酵包括将茯苓添加到培养基中灭菌，然后接种重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep，发酵培养。
在本发明的一些实施方式中，所述共发酵包括将茯苓添加到液体培养基中，调节初始pH为5.5-7后进行灭菌处理，然后接种重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep，发酵培养。
其中，所述重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep的接种量为0.5-5％。
其中，所述共发酵的培养时间为16-20h；
其中，所述共发酵的温度为30-45℃。
在上述发酵培养条件下能够在获得更理想的发酵效果，尤其是，在下述发酵条件下进行时，所述共发酵重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓的方法包括：在液体培养基(比如MRS培养基)中添加6％的茯苓，将培养基pH值调节至6.5，高压灭菌后，接种5％重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep菌液，37℃下，静置发酵培养20h。
在本发明的一些实施方式中，所述茯苓为茯苓中药液。
在本发明的实施方式中，提供了茯苓中药液的制备方法，其包括：取茯苓中药材加水煮沸，静置取上清液后离心并过滤，取滤液加热浓缩，即得茯苓中药液。
在上述制备方法中，滤液加热浓缩时宜采用水浴加热方式，水浴加热温度以80-90℃为宜；优选地，茯苓中药液进行灭菌处理。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种具有抗PEDV作用的复合制剂，所述复合制剂包含上述第一方面中所述的组合物。
在本发明的一些实施方式中，所述复合制剂为药物或饲料添加剂。
在本发明的一些实施方式中，所述复合制剂为液体制剂或固体制剂。所述液体制剂或固体制剂中可包含健康无害的制剂辅料，比如，制备成固体制剂时，可采用喷干或冻干的方式，可加入保护剂，比如奶粉等。
在本发明的第四方面，本发明提供了上述第一方面中所述的组合物或上述第三方面中所述的复合制剂在制备防治猪流行性腹泻的药物或者饲料添加剂中的应用。
在本发明的实施方式中，已经证实重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓的共发酵产物能够减轻感染PEDV引发的仔猪腹泻，保护体重下降，增强外周血肿T/B淋巴细胞，巨噬细胞和NK细胞的活化水平以及外周淋巴器官包括脾脏，肠系膜淋巴结，固有层中效应T/B细胞的数量百分比从而建立抗病毒细胞免疫；以及提升宿主抗病毒水平，降低炎症反应。
特别是，重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓的共发酵产物能够显著降低病毒载量，能够有效地清除PEDV，保护肠道组织健康。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面中所述的组合物或上述第三方面中所述的复合制剂在制备抗PEDV病毒的药物或者饲料添加剂中的应用。所述抗PEDV病毒主要指能够清除PEDV，降低PEDV病毒载量。
在本发明的实施方式中，重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓的共发酵产物能够极其显著地提升ISG15和ISG56基因的表达水平(***P＜0.001)(根据实验结果，可参见图11，茯苓中药液相较于对照组能够提升ISG15的表达，但是降低ISG56的表达，但是该提升或者降低相较于对照组无明显差异，即茯苓中药液对ISG15和ISG56的表达基本无影响)，相较于其他各组，表现出良好的抗病毒效果，以及，在对攻毒后仔猪血清中PEDV的载量进行定量，重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓的共发酵液相较于其他各组能够特别显著降低病毒载量(**P＜0.01)(特别是根据实验结果，可参见图11，茯苓中药液不仅未降低病毒载量，其相较于对照组病毒载量反而有所增长)，能够有效且更快地清除PEDV。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种治疗猪流行性腹泻或抗PEDV病毒的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的上述第一方面中所述的组合物或上述第三方面中所述的复合制剂。
所述“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，在本发明的实施方式中，主要指猪，尤其指断奶仔猪。
所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明共发酵重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓，以其共发酵物对PEDV攻毒仔猪进行免疫，结果表明其共发酵物能够有效缓解PEDV感染仔猪的临床症状，维持仔猪正常体温、体重和正常采食；攻毒后，ELISA结果显示与对照组相比口服共发酵产物，仔猪在感染PEDV血清中IFN-β的分泌显著增加，相反TNF-α的分泌降低。流式分析结果显示，与对照组相比口服共发酵产物，感染PEDV仔猪外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞和CD21+IgA+B细胞显著增加；巨噬细胞和NK细胞数量百分比上调；脾脏中IL-4+CD4+T细胞和IgA+CD21+B细胞增加；肠系膜淋巴结中IFN-γ+CD8+T细胞和IgA+CD21+B细胞增加；肠道固有层中CD3+CD8+T细胞增加；以上表明共发酵产物能够显著提升体液免疫和细胞免疫，减轻炎症，增强抗病毒能力。以及，对攻毒后各组仔猪血清中的ISG15和ISG56基因进行定量，共发酵产物能够显著提升ISG15和ISG56基因的表达水平，说这明血清中的干扰素水平升高，进一步增强了抗病毒效果。病理组织切片结果表明，共发酵产物能够保护仔猪肠道，其病理变化效果显著好于其他试验组。上述数据都支持重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep与茯苓共发酵的产物能够拮抗PEDV感染，并对PEDV感染导致的猪流行性腹泻具有良好的防治作用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
下图中，ns：无显著差异；*：P＜0.05、**：P＜0.01、***：P＜0.001、****：P＜0.0001。
图1：中药液对Vero细胞毒性作用的测试结果，纵坐标为测试孔中OD值；A：山楂；B：苍术；C：木香；D：党参；E：茯苓；F：葛根；G：黄芪；H：厚朴；I：穿心莲；J：白头翁；K：甘草；L：大黄；M：金银花。
图2：中药液在Vero细胞上的筛选结果。
图3：茯苓、大黄、金银花分别与重组乳酸菌共发酵产物在Vero细胞上的筛选结果。
图4：攻毒前与攻毒后仔猪日增重情况。
图5：分别示出了仔猪β干扰素(IFN-β)的含量和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量；
图6：试验各组仔猪外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+T，以及脾脏、肠道固有层和肠系膜淋巴结中CD3+CD8+T细胞含量情况。
图7：试验各组仔猪外周血、脾脏、肠系膜淋巴结中CD21+IgA+B细胞含量情况。
图8：试验各组仔猪肠系膜淋巴结中CD8+IFN-γ+细胞含量情况。
图9：试验各组仔猪脾脏中CD4+IL-4+细胞含量情况。
图10：试验各组仔猪外周血中NK细胞CD335+、巨噬细胞CD163+细胞含量。
图11：试验各组仔猪外周血中ISG15、ISG56和病毒水平定量。
图12：各组仔猪小肠病理组织切片(比例尺200μm)：
图13：各组盲肠病理组织切片(比例尺200μm)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1抗病毒药物的筛选
1、试验材料：根据古籍文献记载，挑选13味具有清热解毒，固本止泻功能的中药：黄芪，苍术，木香，葛根，厚朴，茯苓，山楂，党参，穿心莲，甘草，白头翁，大黄，金银花。以上所有中药均购自于长春市百草大药房。
细胞：Vero细胞由吉林农业大学(吉林省动物微生态制剂工程研究中心)保存。
病毒：仔猪腹泻病毒PEDV c777株(在本发明实施例中简称为PEDV)由吉林农业大学(吉林省动物微生态制剂工程研究中心)保存并提供。
菌株：重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep由吉林农业大学(吉林省动物微生态制剂工程研究中心)保存并提供，该菌株已在学术论文Huang Ke-Yan,Yang Gui-Lian,Jin Yu-Bei etal.Construction and immunogenicity analysis ofLactobacillus plantarum expressing a porcine epidemic diarrhea virus S genefused to a DC-targeting peptide.[J].Virus Res,2018,247:84-93中公开，可根据论文中公开的构建方法进行构建。即重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep的构建方法：使用限制性酶在XbaI和HindIII位点对pM18-T-S-Dcpep(即DC肽，FYPSYHSTPQRP)质粒进行切割，在37℃下进行3-4小时。接下来，消化后的S基因片段(2240bp)[Spike Protein GeneGenBank:JQ257007.1(source:75–2313)/Spike Protein GenBank:AEW24858.1(source:26–771)]和DCpep(S-DCpep)用T4 DNA连接酶在16℃下连接到pSIP409-pgsA'中过夜。检测重组的pSIP409-pgsA'-S-DCpep质粒，并使用凝胶提取试剂盒(Axygen)进行纯化。将重组质粒电转化入植物杆菌NC8(L.plantarum NC8)中，筛选耐红霉素的菌株。其中，该重组植物乳杆菌中融合基因S-Dcpep的序列如Seq_1中所示。
2、主要试剂：MTT试剂盒购自于南京迅贝生物科技有限公司。
3、主要仪器：全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；-80℃超低温冰箱DW-86L626(海尔公司)；分析天平ME204E(瑞士梅特勒公司)；制冷型金属浴(TANGEN公司)。全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；CO2培养箱Heratherm IGS180(美国ThermoScientific公司)；
4、实验方法
1)中药药液的制备
本实验选择了具有泻火解毒、开胃健脾、固肠止泻的13味单味中药进行该试验,13为中药材包括黄芪，苍术，木香，葛根，厚朴，茯苓，山楂，党参，穿心莲，甘草，白头翁，大黄，金银花。
称取每种草药15g放入蒸馏瓶中，加入8倍体积的蒸馏水并煮沸，2h后取出液体并静置，取出上清液并放入离心机中进行离心分离(4000r/min、12min)；取出中药液，取上清用滤纸进行过滤；将中药滤液放入水浴锅内90℃加热，将过滤好的中药液浓缩至1g/mL；最后将浓缩后的中药液高压灭菌(115℃、25min)，放4℃冰箱保存待用。
2)中药液对Vero细胞毒性作用的测试
本实验用5种不同浓度的药液给予细胞，测试5种不同浓度药液对细胞的毒性作用进行测试，确定中药液对Vero细胞的最大安全浓度。
具体方法如下：首先将生长良好的Vero细胞制备于96孔板中。13种单味中药的溶液用细胞维持液1：1稀释。将五种不同浓度的稀释单味中药溶液添加到96孔板中的单层Vero细胞中。每个稀释度设置3个重复，同时准备了空细胞对照孔和中草药对照孔。空细胞对照孔加入配好的细胞维持液，中药对照孔中加入稀释好的5种不同浓度的中药液。无菌PBS填充96孔板的周围孔。所有中药液及试剂加好后放置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养。每日观察以及记录结果。Vero细胞培养48小时后，即可在显微镜下观察Vero细胞病变情况，最后用MTT法测定细胞活力。
3)病毒在Vero细胞上的毒力测定
采用TCID50微量法对PEDV进行毒力测定。细胞的准备：取生长良好Vero细胞一瓶，首先倒掉细胞培养液，PBS洗一次，然后用胰酶消化分散Vero细胞，制备细胞悬液，将细胞接至96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，然后放置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养。当Vero细胞培养至70％细胞单层即可用于试验。用细胞维持液以10倍倍比稀释病毒，加入96孔板Vero细胞单层，每种稀释度设置8个重复孔。对照孔设置8孔并加入细胞维持液。置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。每天进行观察细胞病变并记录结果，至不再出现细胞病变。用Reed-Muench公式计算病毒滴度。
4)抗病毒中药在Vero细胞上的筛选
首先将生长良好的Vero细胞制备于96孔板中，当Vero细胞培养至70％细胞单层即可用于试验。用配好细胞维持液分别将13种中药液稀释至最大安全浓度，将中药液加入制备好的96孔板中，每种中药液设置6个重复，每孔加入100μL中药液，设置病毒对照组、正常Vero细胞对照。病毒对照孔中加入的是100TCID50病毒液；在含有正常Vero细胞的对照孔中加入细胞维持液。96孔板在37℃下，5％ CO2培养箱中培养12h。取出后，将病毒加入到细胞中，在37℃下吸附2小时。然后弃去病毒液，将含有药物的维持液加入到细胞孔中。放入37℃、5％ CO2培养箱中继续培养，每日观察并记录细胞病变情况，待细胞不发生细胞病变后作MTT试验。根据药物对病毒感染的抵抗作用，筛选具有抗病毒作用的药物。
5、结果
1)中药液对Vero细胞毒性作用的测试结果：
以山楂为例，随药液浓度降低，测试孔中OD值(与细胞存活率正相关)升高，当药液浓度至75mg/mL浓度时，测试孔OD值高于空细胞对照组或相比差异无统计学意义，以此确定75mg/mL为药物山楂在VERO细胞上的最大安全浓度。实验结果显示13味中药于Vero细胞上的安全浓度分别为：山楂75mg/mL；苍术300mg/mL；党参75mg/mL；茯苓37.5mg/mL；葛根300mg/mL；厚朴150mg/mL；穿心莲18.75mg/mL；白头翁300mg/mL；甘草75mg/mL；大黄150mg/mL；金银花37.5mg/mL，黄芪和木香所有浓度均对Vero细胞有毒性副作用，因此选用山楂、苍术、党参、茯苓、葛根、厚朴、穿心莲、白头翁、甘草、大黄、金银花作为后续实验材料。结果如图1所示。
2)PEDV在Vero细胞上的毒力测定：
表1 PEDV在Vero细胞上的毒力测定情况
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)，即距离比例＝(100-50)/(100-37.5)＝0.8
TCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数，即TCID50＝0.8×(-1)+(-3)＝-3.8
最终确定病毒的TCID50滴度为10-3.8。
3)抗病毒中药在Vero细胞上的筛选结果：
对于生长良好的细胞单层，参考图1结果，根据获得的11味中药的浓度，采取给药处理12h，再感染病毒，病毒吸附2h后，弃去病毒液，补充细胞生长维持液，利用MTT法测定，结果如图2。结果表明：与对照组相比感染PEDV的Vero细胞在第3天出现死亡与脱落，OD560值显著降低；而分别给予金银花、大黄、茯苓的中药液组表现出增强细胞活性、预防PEDV感染的作用，尤以金银花和大黄组表现最为优异，其他中药液组在该测试中均未有表现出有益作用。
实施例2重组植物乳杆菌的发酵
1、材料和菌株：中药材茯苓、大黄、金银花，实验时，中药材按实施例1方式制备中药液。重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep来源同实施例1。
2、主要试剂：诱导肽Sppip由吉林农业大学微生态制剂工程研究中心保存并提供。
3、主要仪器：全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；-80℃超低温冰箱DW-86L626(海尔公司)；分析天平ME204E(瑞士梅特勒公司)；制冷型金属浴(TANGEN公司)。全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；CO2培养箱Heratherm IGS180(美国ThermoScientific公司)；
4、配置LB培养基：NaCl 10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g。121℃高温灭菌20min。
配置MRS培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物0.05g，吐温-80 1.0g，磷酸氢钾2.0g，柠檬酸三胺2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰5.0g，蒸馏水1L。115℃高温灭菌15min。配置固体培养基需按照50:0.75的比例向液体培养基里加入琼脂粉。
红霉素溶液(10mg/mL)：红霉素(Erm)粉末200mg，无水乙醇定容至20mL，涡旋至彻底溶解，使用0.22μm滤器除菌，无菌分装，保存在-20℃冰箱。
5、实验方法
以重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep分别发酵中药材(中药液)，并对发酵时间、发酵温度、发酵初始pH和菌株接种量进行优化，以获取最佳发酵方式，并将发酵获得的菌株发酵液进行抗病毒实验。
按照实施例1的方法发酵中药材制备中药液，将其浓缩至其最大安全浓度，使用前对中药液高压灭菌(115℃、25min)，即以茯苓、大黄、金银花的最大安全浓度进行下述实验，其中茯苓中药液浓度37.5mg/mL、大黄中药液浓度150mg/mL、金银花中药液浓度37.5mg/mL。
重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep菌液中每毫升乳酸菌的数量为1×109CFU。
1)发酵时间优化：
在50mL MRS液体培养基中添加6％的中药液(浓度37.5mg/mL,体积3mL)，121℃高压灭菌25min，接种5％菌液(浓度1×109CFU/mL，体积2.5mL)。37℃静置发酵12h、16h、20h、24h、28h、32h。测定发酵前后pH变化及各组活菌数，以益生菌活菌数为评价指标筛选较优发酵时间
2)发酵温度优化：
在50mL MRS液体培养基中添加6％的中药液(浓度37.5mg/mL,体积3mL)，121℃高压灭菌25min，接种5％菌液(浓度1×109CFU/mL，体积2.5mL)。按照筛选出的较优发酵时间，分别置于30℃、33℃、37℃、40℃、43℃，静置培养。测定发酵前后pH变化及各组活菌数，以益生菌活菌数为评价指标筛选较优发酵温度。
3)发酵初始pH优化：
在50mL MRS液体培养基中添加6％的中药液(浓度37.5mg/mL,体积3mL)，用0.5NNaOH和0.5N HCl将培养基pH值分别调为7.5、7、6.5、5.5，121℃高压灭菌25min，接种5％菌液(浓度1×109CFU/mL，体积2.5mL)。按照筛选出的较优发酵时间、较优发酵温度，静置发酵。测定发酵前后pH变化及活菌数，以益生菌活菌数为评价指标筛选较优发酵初始pH。
4)菌种接种量优化：
在50mL MRS液体培养基中添加6％的中药液(浓度37.5mg/mL,体积3mL)，121℃灭菌25min，将发酵液分别接种0.05％、0.5％、5％、50％的菌液(浓度1×109CFU/mL)。按照筛选出的较优发酵时间、较优发酵温度，和较优发酵初始pH，静置发酵。测定发酵前后pH变化及活菌数，以益生菌活菌数为评价指标筛选较优菌种接种量。。
5)三种抗病毒中药在Vero细胞上的筛选
首先将生长良好的Vero细胞制备于96孔板中，当Vero细胞培养至70％细胞单层即可用于试验。用配好细胞维持液分别将3种较优发酵方式下获得的菌株中药发酵液稀释至最大安全浓度，将发酵液分别加入制备好的96孔板中，每种发酵液设置6个重复，每孔加入100μL，设置病毒对照组、正常Vero细胞对照。病毒对照孔中加入的是100TCID50病毒液；在含有正常Vero细胞的对照孔中加入细胞维持液。96孔板在37℃下，5％CO2培养箱中培养12h。取出后，将病毒加入到细胞中，在37℃下吸附2小时。然后弃去病毒液，将含有发酵液的维持液加入到细胞孔中。放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每日观察并记录细胞病变情况，待细胞不发生细胞病变后作MTT试验。根据药物对病毒感染的抵抗作用，筛选具有抗病毒作用的药物。
6、结果
1)发酵时间的优化：
当茯苓中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，茯苓发酵液在37℃静置发酵时间20h，活菌数最高，故确定茯苓发酵时间20h为较优发酵时间。
表2菌株发酵茯苓中药不同培养时间对活菌数的影响
当大黄中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，大黄发酵液在37℃静置发酵时间24h，活菌数最高，故确定大黄发酵时间24h为较优发酵时间。
表3菌株发酵大黄中药不同培养时间对活菌数的影响
当金银花中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，金银花发酵液在37℃静置发酵时间20h，活菌数最高，故确定金银花发酵时间20h为较优发酵时间。
表4菌株发酵金银花中药不同培养时间对活菌数的影响
2)发酵温度的优化
当茯苓中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，茯苓发酵液在37℃静置发酵时间20h，活菌数最高，故确定发酵温度37℃为较优发酵温度。
表5菌株发酵茯苓中药不同培养温度对活菌数的影响
当大黄中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，大黄发酵液在37℃静置发酵时间20h，活菌数最高，故确定发酵温度37℃为较优发酵温度。
表6菌株发酵大黄不同培养温度对活菌数的影响
当金银花中药添加量为6％，菌液接种量为5％条件下，金银花发酵液在37℃静置发酵时间20h，活菌数最高，故确定发酵温度37℃为较优发酵温度。
表7乳酸菌发酵金银花中药不同培养温度对活菌数的影响
3)发酵pH的筛选
当茯苓中药添加量为6％，菌液接种量为5％，37℃静置发酵20h条件下，茯苓发酵液在初始pH值为6.5时，活菌数最高，故确定发酵pH6.5为较优初始发酵pH。
表8不同初始pH对活菌数的影响
当大黄中药添加量为6％，菌液接种量为5％，37℃静置发酵20h条件下，大黄发酵液在初始pH值为6.5时，活菌数最高，故确定发酵pH6.5为较优初始发酵pH。
表9不同初始pH对活菌数的影响
当金银花中药添加量为6％，菌液接种量为5％，37℃静置发酵20h条件下，金银花发酵液在初始pH值为6.5时，活菌数最高，故确定发酵pH6.5为较优初始发酵pH。
表10不同初始pH对活菌数的影响
4)菌液接种量的筛选
茯苓发酵液在接种量为5％时，发酵效果最好，故确定菌液接种量5％为较优接种量。
表11不同种子液接种量对活菌数的影响
大黄发酵液在接种量为5％时，发酵效果最好，故确定菌液接种量5％为较优接种量。
表12不同种子液接种量对活菌数的影响
金银花发酵液在接种量为5％时，发酵效果最好，故确定菌液接种量5％为较优接种量。
表13不同种子液接种量对活菌数的影响
综上所述，分别通过发酵时间、发酵温度、发酵PH值以及接种量的比较，筛选出茯苓、大黄和金银花的最佳发酵条件，通过的各组的活菌数的比较，最终确定了茯苓的在各种条件下的活菌数均优于大黄和金银花，因此，最终选择茯苓中药进行接下来的动物实验，最终最优的发酵条件为发酵时间20h、发酵温度37℃、发酵pH值为6.5、乳酸菌接种量为5％。
5)重组植物乳杆菌的中药发酵液在Vero细胞上的筛选结果：利用MTT法测定，结果如图3。结果表明：相较于对照组，PEDV组的OD560值显著降低，而分别给予菌株发酵液的组别，相较于对照组，OD560值的降低明显更少，表现出增强细胞活性、预防PEDV感染的作用，尤其是，菌株茯苓的发酵液相较于大黄和金银花组表现更为优异。该结果表现出与以单中药液测试时不同的结果，单以中药液发挥更为有优势的金银花和大黄在利用重组植物乳杆菌分别发酵后的效果反而有所降低，这表明茯苓更适宜与重组植物乳杆菌进行发酵，茯苓与重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep共发酵会产生正向协同作用或可能产生了更为有利的物质促进效果的发挥
实施例3重组乳酸菌与茯苓共发酵抗仔猪PEDV保护效果研究
本实施例以中药茯苓与重组乳酸菌(NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep)共发酵(共发酵组)，并与PBS组、重组乳酸菌(NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep)组、茯苓组分别饲喂仔猪并进行攻毒保护试验。通过ELISA、Flow Cytometry和H&E染色等检测方法，对仔猪体重变化、血清中IFN-β、TNF-α、IL-1β含量、机体免疫器官和免疫细胞的活化、以及仔猪小肠病理变化等指标进行检测分析，研究茯苓与重组乳酸菌共发酵产物对仔猪流行性腹泻的保护效果。
按实施例1的方法制备茯苓中药液，将茯苓中药液浓缩至其最大安全浓度即37.5mg/mL，然后高压灭菌(115℃、25min)后使用。
重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep菌液浓度为每毫升乳酸菌的数量为1×109CFU。
茯苓与重组乳酸菌(NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep)共发酵：在50mL MRS液体培养基中添加6％的茯苓中药液(浓度37.5mg/mL,体积3mL)，用0.5N NaOH和0.5N HCl将培养基pH值调为6.5，121℃灭菌25min，接种5％的重组植物乳杆菌菌液(浓度1×109CFU/mL，体积2.5mL)，置于37℃静置发酵20h，获得共发酵液。
1、实验菌株：
重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-DCpep来源同实施例1。
2、实验动物
选取12头健康的3日龄新生仔猪，随机分为4组，每组3只，隔离饲养，每天8：00、14：00、20：00喂食饮水。
3、试剂
猪白细胞介素1β(IL-1β)、猪β干扰素(IFN-β)、猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购买于酶免(江苏)实业有限公司。猪源CD3-PE-Cy7抗体、CD4-PE抗体、CD8-FITC抗体(BD公司)；1640细胞培养液(Hyclone)；封闭小鼠血清由实验室保存；抗体稀释液：1％ BSA；红细胞裂解液、Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技术有限公司)；FACS溶液(1000mL培养细胞用PBS，10mL FBS，0.9g叠氮钠)；AXYGEN PCR STRIP TUBES(美国康宁公司)；Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver5.0(Code No.9766Takara)；封闭用山羊血清；DAPI染液；抗淬灭封片剂；4％多聚甲醛溶液；柠檬酸钠抗原修复液；
4、主要实验器材：
ABI Prism7500QT-qPCR仪器(美国)ABI公司；肝素钠抗凝管、促凝管购于(江苏)康健医疗用品有限公司；组织包埋机、石蜡切片机、DMi8荧光倒置显微镜购于(德国)徕卡仪器有限公司；组织匀浆机国产。
5、实验方法：
1)实验方案
实验动物分组：PBS组(n＝3)、重组植物乳杆菌组(n＝3)、茯苓组(n＝3)、共发酵组(n＝3)，公母随机分配，分组见下表14：
表14动物试验分组
免疫及攻毒程序：分别在1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d对仔猪进行相应药物的灌胃免疫，每天对仔猪进行一次体重测量，记录数据计算平均日增重；每隔两天对仔猪的粪便进行一次观察，观察后对其进行评分。分别在16d、17d、18d、19d、20d、21d进行PEDV的攻毒，攻毒剂量为104CID50，每日采取粪便，每隔三天进行取血并观察记录存活率。待对照组全部腹泻后全部宰杀，对各项指标进行检测。
其中各组免疫剂量：PBS组的每头猪免疫20ml的PBS。重组植物乳杆菌组的每头猪免疫2.5×109CFU/mL的乳酸菌20ml。茯苓组的每头猪免疫茯苓中药液20mL。共发酵组的每头猪免疫共发酵液浓缩液20ml(共发酵液浓缩液的制备方法：取1000mL的共发酵液高速离心后，取下层沉淀，用20mL PBS重悬)。
2)生长性能指标检测
体重：仔猪每天称重一次，记录体重变化数据并绘制体重变化曲线。
3)免疫指标IFN-β、TNF-α、IL-1β检测方法
在攻毒前和攻毒后，分别从每组仔猪的前腔静脉取血。从每头仔猪身上采集5mL血液，用离心管离心，分离出血清并储存在-80。用ELISA方法检测血清中IFN-β、TNF-α、IL-1β的含量。
4)单细胞悬液的制备
脾脏单细胞悬液制备：取脾脏部分通过轻柔研磨获得单细胞悬液，过200目滤网至对应15mL离心管内，配平，1650rpm，4℃，5min离心。弃净上清，1mL红细胞裂解液重悬细胞，冰上裂解10min，中间5min时取出，摇晃30s。加入10mL PBS缓冲液终止，配平，1650rpm，4℃，5min离心。弃上清，lmL FACS缓冲液重悬细胞，计数。肠系膜淋巴结单细胞悬液制备：淋巴结全部小心轻柔研磨成单细胞悬液，过200目滤网至对应15mL离心管内，配平，1650rpm，4℃，5min离心。弃上清，0.2mL FACS缓冲液重悬细胞，计数。
胸腺单细胞悬液制备：胸腺组织除部分4％多聚甲醛固定外，其余全部研磨成单细胞悬液，过200目滤网至对应15mL离心管内，配平，1650rpm，4℃，5min离心。弃上清，1mLFACS缓冲液重悬细胞，计数。
5)流式细胞术检测
流式抗体染色
(1)将上述各单细胞悬液分管，保证每管1×106个细胞(外周血保证5×105)，总体积为100μL；
(2)根据抗体滴度，加入相应体积的细胞表面标志物的流式抗体。
(3)震荡混匀后，避光、4℃放置30min
(4)标记完成后，在管中加入冰的FACS缓冲液3.5mL，1650rpm，4℃离心5min，弃掉上清，用少量FACS缓冲液重悬细胞。
(5)重复步骤(4)一次，充分去除为结合的抗体，减少细胞表面非特异性染色。检测样品使用BD流式细胞仪，数据分析及图形处理使用FlowJo_v10.6.2软件。
6)攻毒血清中ISG15、ISG56及PEDV载量检测
血清样品的处理与RNA提取：将-80℃冰箱中冻存的血清取出，低温解冻后，按照提取病毒RNA说明书提取样品中病毒RNA，测定浓度后，通过反转录，获取cDNA。使用荧光定量试剂盒(Perfect Start Green qPCR Super Mix DyeII)对血清样品cDNA和各组织样品cDNA进行定量分析，
7)H&E染色检测肠道病理变化
为了进一步观察仔猪肠段的病理变化，获取仔猪小肠中段，每组肠断取相同部位，放置于4％多聚甲醛液中固定，固定时间在两天以上，再将固定后的组织切整齐，进行包埋、切片、H&E染色，步骤如下：
(1)脱水：将样品按顺序依次放入70％酒精，80％酒精，85％的酒精各脱水2h，90％酒精进行脱水过夜，95％ I酒精和95％ II酒精各脱水1h，100％ I酒精和100％ II酒精各脱水1h。
(2)透明：把样品按顺序放入二甲苯I液和二甲苯II液种，透明时间各为5min，直至肉眼能看到发红的肉皮样即透明结束。
(3)浸蜡：将组织块按顺序依次放置在蜡I、蜡II、蜡Ⅲ，在56℃条件下分别浸蜡1h后将组织块置于包埋盒中进行包埋。
(4)切片，将每个包埋块切出厚度3.5μm的组织片，在41℃水浴中展片在洁净载玻片上。将载玻片置于80℃的干燥箱中烤玻片1h后，进行H&E染色。
(5)H&E染色程序如下：将样品依次放在二甲苯I和二甲苯II中8min，然后在100％酒精I、100％酒精II、95％酒精、80％酒精和70％酒精中1min，并放在超纯水中冲洗掉超过酒精的部分。然后用苏木精染色，超纯水冲洗，在酒精浴中用0,5％的盐酸分化5s，然后冲洗，然后在轻氨水中2min，然后用水冲洗，放至0,5％的伊红水溶液染色5min，再用水冲洗，在80％的酒精浴中冲洗，观察伊红染色情况，将样品按顺序依次在95％、100％ I、100％ II的酒精浴中反复提取5次，然后按顺序依次在二甲苯I和二甲苯II中1-2min，用中性树胶封片。
6、实验结果：
1)生长性能指标检测结果
实验期间隔天记录体重变化，结果发现重组乳酸菌与茯苓的共发酵液可以保护仔猪耐受PEDV感染，减轻体重的降幅。其中饲喂PBS的仔猪体重降幅较大，单独饲喂茯苓组和单独饲喂重组乳酸菌组虽然可以一定程度的缓解体重的骤降，但是与饲喂重组乳酸菌与茯苓共发酵液的仔猪体重变化差异显著，体重的变化提示重组乳酸菌与茯苓共发酵液组饲喂的仔猪可以在一定程度上抵抗了PEDV的感染并且很大程度上缓解了由于PEDV造成的体重骤减的症状，结果见图4。
2)免疫指标IFN-β、TNF-α检测结果
IFN-β是重要的抗病毒因子，PEDV能被肠上皮细胞的模式识别受体(PRRs)感知，诱导下游信号分子活化最终激活干扰素对抗病毒。因此将收集的血清利用EILSA检测细胞因子IFN-β，TNF-α的分泌。结果表明在仔猪攻毒后第六天重组乳酸菌组和共发酵组与对照组差异显著，这说明了饲喂重组乳酸菌与茯苓共发酵液的仔猪血液中的IFN-β含量相比于对照组有显著增加并且优于单独给予茯苓或重组乳酸菌组，表明发酵液能显著提高了仔猪的抗病毒能力。结果如图5所示。
病毒没有得到有效控制在中晚期大量的炎性因子聚集导致剧烈炎症反应。结果显示在攻毒6天后，饲喂重组乳酸菌、茯苓中药液或重组乳酸菌与茯苓共发酵液的仔猪血液中TNF-α的含量与对照组差异显著，并且无论单独饲喂重组乳酸菌或其共发酵液都能更高水平降低TNF-α表达，表示重组乳酸菌与茯苓共发酵液能有效缓解炎症。结果如图5所示。
3)重组乳酸菌茯苓共发酵产物对T细胞影响
PEDV的感染不仅仅诱导天然免疫的激活，还能激活细胞免疫对抗病毒在感染后期。淋巴细胞的活化代机体免疫的提升，因此通过流式细胞术检测了外周血、脾脏、肠道固有层、肠系膜淋巴结中活化T细胞数量百分比，结果表明在攻毒前对于外周血中淋巴细胞的流式检测结果发现，饲喂重组乳酸菌与茯苓共发酵液组的仔猪机体免疫显著增强，口服重组乳酸菌或茯苓中药发酵液仔猪PBL中CD3+CD4+T细胞显著上升；而茯苓中药液使CD3+CD8+T细胞的含量的占比显著上升。感染PEDV后重组乳酸菌、茯苓中药液、重组乳酸菌茯苓共发酵液均能上调脾脏、肠道固有层和肠系膜淋巴结中CD3+CD8+T细胞数量百分比，结果如图6。
4)重组乳酸菌茯苓共发酵产物对B细胞影响
B细胞是参与体液免疫和肠道黏膜免疫的重要组成部分，其产生IgA能力在对抗病原与塑造免疫环境发挥至关重要的作用。因此检测了外周血，脾脏，肠系膜淋巴结中B细胞的活化水平。结果显示在攻毒之前无论口服重组乳酸菌或重组乳酸菌茯苓共发酵液均能增加外周血中IgA+CD21+B细胞数量百分比；同时在感染病毒后重组乳酸菌茯苓共发酵液仍然保持脾脏和肠系膜淋巴结中B细胞产生IgA能力从而保护机体，且重组乳酸菌、茯苓中药液与重组乳酸菌茯苓共发酵液对于外周淋巴器官的激活能力更强，结果如图7。
5)重组乳酸菌茯苓共发酵产物对TH1应答影响
杀伤性T细胞通过分泌IFN-γ产生TH1免疫应答，因此检测了肠系膜淋巴结中IFN-γ的分泌水平。结果表明感染病毒后重组乳酸菌、茯苓中药液与重组乳酸菌茯苓共发酵液能激活CD3+CD8+T细胞分泌更高水平IFN-γ抑制病毒，且重组乳酸菌与茯苓共发酵液效果更佳显著，结果如图8。
6)重组乳酸菌茯苓共发酵产物对TH2应答影响
TH2型细胞免疫通过分泌IL-4，IL-5或IL-13参与体液免疫，同时是辅助B细胞活化的关键信号。于是检测了脾脏中TH2细胞的活化水平，结果表明感染病毒后重组乳酸菌，茯苓中药液和重组乳酸菌茯苓共发酵液均能激活CD4+T细胞分泌IL-4，重要的是重组乳酸菌与其茯苓发酵液能刺激更高水平的IL-4且协同发酵免疫保护效果最好，结果如图9。
7)重组乳酸菌茯苓共发酵产物对巨噬细胞和NK细胞影响
外周血中吞噬细胞是通过直接杀伤清除病原微生物关键细胞群体，检测了NK细胞核巨噬细胞数量百分比。实验结果发现口服重组乳酸菌(*P＜0.05)、茯苓中药液(*P＜0.05)和重组乳酸菌茯苓共发酵液(**P＜0.01)能提高NK细胞(CD335+)在血液中的占比，且协同发酵优于其他对照组；同时巨噬细胞(CD163+)在血液中的占比的提升依赖重组乳酸菌茯苓共发酵液(*P＜0.05)而其他组(ns)激活效果不显著，结果如图10。
8)攻毒血清中ISG15、ISG56及PEDV载量检测结果
对攻毒后各组仔猪血清中的ISG15和ISG56基因进行定量，结果显示：茯苓中药液组(ns)对ISG15和ISG56无明显影响，与PBS对照组相比，重组乳酸菌组(**P＜0.01)和重组乳酸菌与茯苓发酵液组(***P＜0.001)的ISG15和ISG56基因的表达水平显著升高，尤其共发酵液组的升高更为显著，而ISG15和ISG56为干扰素刺激基因，干扰素具有抗病毒的能力，ISG15和ISG56基因可以间接反映干扰素的表达，重组乳酸菌组(**P＜0.01)和重组乳酸菌与茯苓发酵液组(***P＜0.001)的ISG15和ISG56基因的表达水平显著升高，说明血清中的干扰素水平升高，从而实现抗病毒效果，共发酵液组的升高更为显著，说明重组乳酸菌与茯苓共发酵能够促进ISG15和ISG56的表达，显著提升抗病毒效果(***P＜0.001)，结果见图11。
对攻毒后各组仔猪血清中PEDV的载量进行定量，结果显示，与PBS对照组相比，茯苓中药液(ns)不仅不会降低病毒载量，还会引起病毒载量的上升，但是该上升相较于PBS组并不显著，重组乳酸菌(*P＜0.05)与茯苓发酵液组(**P＜0.01)的病毒载量显著降低，说明其感染的病毒明显减少，尤其共发酵液组的病毒载量下降更为明显(**P＜0.01)，这表明重组乳酸菌与茯苓共发酵能够促进病毒载量的下降，能够更快的清除病毒，结果见图11。
9)小肠组织病理切片结果
PBS组十二指肠病理变化严重，可见部分肠道绒毛断裂，肠道绒毛上皮细胞脱落，肠腔中可见脱落的组织和细胞碎片，红色箭头可见少量炎性细胞；茯苓中药液组十二指肠病理变化相对较轻，仅可见部分肠道绒毛上皮细胞缺失；重组乳酸菌组和重组乳酸菌与茯苓发酵液组十二指肠均未见明显病理组织学变化，红色箭头处上皮不完整。PBS组空肠红色箭头可见肠道绒毛脱落严重，大部分消失不见，肠腔中混有脱落的碎片；茯苓中药液组空肠红色箭头处可见肠道绒毛断裂脱落，肠腔中混有散在的肠绒毛和碎片；重组乳酸菌组和重组乳酸菌与茯苓发酵液组空肠未见明显病理组织学变化，可见炎性细胞略增多。PBS组回肠红色箭头为淋巴集结，可见肠道绒毛脱落严重，几乎消失不见，肠腔中混有脱落的碎片，绿色箭头为内含炎性细胞；茯苓中药液组、重组乳酸菌组和重组乳酸菌与茯苓发酵液组回肠均未见明显病理组织学变化，红色箭头为淋巴集结，图中的多处裂痕-绿色箭头为人为操作导致。结果表明重组乳酸菌组和重组乳酸菌与茯苓发酵液组保护仔猪小肠病理变化效果好于PBS组和茯苓发酵液组，结果见图12。
10)盲肠组织病理切片结果
PBS组盲肠可见按粘膜层充血，炎性细胞增多；茯苓中药液组、重组乳酸菌组和重组乳酸菌与茯苓发酵液组均未见病理组织学变化，结果见图13。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种抗PEDV的组合物，其原料由植物乳杆菌和茯苓组成，其中，所述植物乳杆菌为重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep；
所述组合物由重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓共发酵制得；
所述抗PEDV的组合物的制备方法，其包括共发酵重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓；
所述共发酵包括将茯苓添加到培养基中灭菌，然后接种重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep，发酵培养；
将茯苓添加至培养基中后调节初始pH为5.5-7后进行灭菌处理；
所述重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep的接种量为0.5-5％；
所述共发酵的培养时间为16-20h；
所述共发酵的温度为30-45℃。
2.一种制备权利要求1所述的抗PEDV的组合物的方法，其包括共发酵重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep和茯苓；
所述共发酵包括将茯苓添加到培养基中灭菌，然后接种重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep，发酵培养；
将茯苓添加至培养基中后调节初始pH为5.5-7后进行灭菌处理；
所述重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA'-S-Dcpep的接种量为0.5-5％；
所述共发酵的培养时间为16-20h；
所述共发酵的温度为30-45℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述茯苓为茯苓中药液，其制备方法包括：取茯苓中药材加水煮沸，静置取上清液后离心并过滤，取滤液加热浓缩，即得茯苓中药液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，滤液加热浓缩时采用水浴加热方式，水浴加热温度为80-90℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，茯苓中药液进行灭菌处理。
6.一种具有抗PEDV作用的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包含权利要求1中所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂为药物或饲料添加剂。
8.根据权利要求6所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂为液体制剂或固体制剂。
9.权利要求1所述的组合物或权利要求6-8任一项中所述的复合制剂在制备防治猪流行性腹泻的药物或者饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1所述的组合物或权利要求6-8任一项中所述的复合制剂在制备抗病毒药物或者饲料添加剂中的应用；
其中，所述病毒为PEDV。
11.权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物为降低PEDV病毒载量的药物。
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