CN106011006A - 一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用 - Google Patents
一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28，其保藏编号为CGMCC No.11506。本发明还提供嗜酸乳杆菌La28在制备具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品中的应用。本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506具有良好的免疫调节功能和抗过敏的功能，能显著降低血清IL‑6水平，并能显著降低OVA致敏小鼠的血清总IgE水平，是一种效果很好的功能性乳酸菌，能很好的用于制备具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用。
背景技术
正常的情况下，当外来物质进入人体后大都面临两种命运，如果被机体识别为有用或无害物质，则这些物质将与人体和谐相处，最终将被吸收、利用或被自然排出。如这些物质被识别为有害物质时，机体的免疫系统则立即做出反应，将其驱除或消灭，这就是免疫应答发挥的保护作用。免疫应答是人的防卫体系重要的功能之一，但是如果这种应答超出了正常范围，即免疫系统对无害物质进行攻击时，这种情况称为变态反应。变态反应是一种疾病，因为无端的攻击也会损害正常的身体组织，甚至免疫系统居然有时对机体本身的组织进行攻击和破坏，对人体的健康非常不利。常见的过敏性疾病有过敏性哮喘、过敏性鼻炎、花粉病、某些皮炎等。
过敏的发病率很高，文献报道约有l/3的人在一生中患过过敏性疾病。根据我国北京地区的统计，在一般人群中过敏的发病率约为15%。太平洋有些地区的过敏性疾病甚至高达50%。进入21世纪以来，该病已成为最常见的全球性疾病之一。世界卫生组织（WHO）的数据表明，目前全球有22%-25%的人患有过敏性疾病，并以每10年23倍的速度增加，目前仅在我国就有两亿多人患病。因此过敏和抗过敏，是现代人面临的不可回避的严峻挑战。
益生菌是指有益于宿主健康及良好状态的微生物制剂或微生物的细胞成分，主要包括乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌等。研究表明益生菌具有多重健康促进功能，包括调节肠道菌群对病原微生物的抵抗作用、防止腹泻、调节免疫、减少血清胆固醇水平、预防过敏性疾病和癌症等。其中最被人们所关注的是其免疫调节功能。
近年来的研究显示，益生菌具有抗过敏的潜能。研究表明，乳酸杆菌可以促进巨噬细胞及其他免疫细胞的增殖，因而改善宿主的免疫功能，这表明乳酸杆菌对机体免疫细胞活性的调节存在一定联系。
发明内容
本发明提供了一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28，该菌具有免疫调节及抗过敏的功能。
本发明提供一株嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28，其保藏编号为CGMCC No.11506。
本发明的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28的保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年10月15日，保藏号为CGMCC No.11506。
本发明还提供嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28菌剂，是将上述的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506菌株扩大培养后得到的。
本发明的嗜酸乳杆菌La28的扩大培养方法可以参照现有技术中嗜酸乳杆菌的扩大培养方法，均能很好的扩大培养本发明的嗜酸乳杆菌。
本发明还提供上述嗜酸乳杆菌La28或嗜酸乳杆菌La28菌剂在制备具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品中的应用。
作为优选，所述食品为益生产品或乳制品；作为优选，所述食品包括嗜酸乳杆菌粉剂、嗜酸乳杆菌片剂、嗜酸乳杆菌颗粒剂、嗜酸乳杆菌胶囊剂、嗜酸乳杆菌乳制品、嗜酸乳杆菌饮料、嗜酸乳杆菌糖果或嗜酸乳杆菌果冻。
本发明的嗜酸乳杆菌La28可以制备成各种含有嗜酸乳杆菌的产品，包括粉剂、片剂、颗粒剂、乳制品、饮料、糖果、果冻。但不限于此，还包括本领域常见的其他产品形式，例如胶囊剂等等。本发明的含有嗜酸乳杆菌La28的粉剂、片剂、颗粒可以通过将嗜酸乳杆菌La28，按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的辅料制成。本发明的含有嗜酸乳杆菌La28的发酵果蔬汁及乳制品中，可将嗜酸乳杆菌La28直接添加使用，再按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的原料制成。
本发明还提供一种具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品，所述食品的功能性有效成分为权利要求1所述的嗜酸乳杆菌La28、权利要求2所述的嗜酸乳杆菌La28菌剂；所述功能性有效成分为免疫调节功能和抗过敏功能。
作为优选，所述食品包括嗜酸乳杆菌粉剂、嗜酸乳杆菌片剂、嗜酸乳杆菌颗粒剂、嗜酸乳杆菌胶囊剂、嗜酸乳杆菌乳制品、嗜酸乳杆菌饮料、嗜酸乳杆菌糖果或嗜酸乳杆菌果冻。
本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506具有良好的免疫调节功能和抗过敏的功能，能显著降低血清IL-6水平，并能显著降低OVA致敏小鼠的血清总IgE水平，是一种效果很好的功能性乳酸菌，能很好的用于制备具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的嗜酸乳杆菌La28的显微镜成像图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。百分含量如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1
1、本发明的嗜酸乳杆菌La28（YMC0253）的分离、鉴定
（1）菌株分离。
a、取从内蒙古采集的奶酪样品放入至50mL无菌离心管中，再加入20mL灭菌的生理盐水，振荡均匀。
b、用接菌环沾取上述稀释液，在已配置好的改良MRS琼脂培养基（在MRS培养基中加入0.5‰的半胱氨酸盐酸盐）上进行划线，将完成划线的平板置于37℃条件下恒温培养72小时。用接菌环挑取单菌落，接种于改良MRS液体培养基（在MRS培养基中加入0.5‰的半胱氨酸盐酸盐）中，置于37℃条件下恒温培养18小时。取菌液划线接种于改良MRS琼脂培养基（在MRS培养基中加入0.5‰的半胱氨酸盐酸盐），置于37℃下恒温培养72小时后，观察菌落形态并进行革兰氏染色，观察染色情况及细胞形态特征。将革兰氏染色呈阳性的短杆或棒状杆菌，进行编号并进一步纯化培养：重复上述划线步骤至少三次，得到菌落、菌体形态一致的菌株，进行保存，得到嗜酸乳杆菌La28。采用-80℃冻结保存或低温真空冷冻保存方法保存目标菌株。
（2）菌株鉴定。
将分离纯化的嗜酸乳杆菌La28进行生理生化鉴定及16SrDNA鉴定。嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus La28生物学特性如表1所示。该菌株的形态学特征为：革兰氏染色呈阳性的短杆或棒状杆菌。
将该菌株送至中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年10月15日，保藏号为CGMCC No.11506。
表1 嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus La28的生物学特性
嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus tuf基因序列测定结果如下：
TACATGCAGTCGAGCGAGCTGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCAATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTC
嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus hsp60基因序列测定结果
CTTGCTTAGATCTCAACTTCAGGTGACCAAGCTCGTGTGCTTGAAAAGCATGACTTCTCAAAGGGTCCTCTTAAGATGGTTTCCTGGTAAGGTATACCGTCGTGATGACGATGATGCGACTCACTCTCACCAATTTATGCAAATGGAAGGGTTAGTTATTGAAGCACGTTACTATGAGCGATTTAAAGGGTACTTTGGAAATGATCGCTAAGCACGTATTTGGGCAAGATAGAGCAACCCGTTCGTCCAAGTTATTTCCCCTTCACTGAACCATCTGTAGAAATGGATGTATCTTGTTTTAATTGTGATGGTAAAGGTTGTCCATTGTAAATACACGTTGTGGATTGAAGTATTAGGTGCTGGTATGGTTCACCCTAATGTTTTAGAAAATGCTGGTGTTGATTCACGTTTACGGTGGTTTTGC
将本发明的嗜酸乳杆菌按照现有技术中嗜酸乳杆菌常用的扩大培养方法进行培养，得到扩大培养后的嗜酸乳杆菌。
实施例2 应用本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506制备益生产品
应用本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506制备益生产品时，制备方法可以参照现有技术中的制备方法。以下是几种含有本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506的益生产品。
（1）嗜酸乳杆菌粉剂
目前粉剂是嗜酸乳杆菌相关制剂的主要产品形式。其生产最为便利，采用的设备也最为简单，同时具有携带及使用方便的特点。该类产品主要以本发明的嗜酸乳杆菌La28CGMCC No.11506冻干菌粉为主，添加如麦芽糊精、抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、乳糖醇、柠檬酸等食品原料、益生元及食品添加剂，还可以添加乳酸钙、乳酸锌、乳酸亚铁、维生素A、维生素C、维生素D等营养强化剂混合均匀，也可加入天然果蔬粉进行调味。产品可以根据不同的克重和活菌数进行规格的分类。
（2）嗜酸乳杆菌颗粒剂
颗粒剂也是嗜酸乳杆菌制品的一类。颗粒生产非常简单，不需要复杂的设备，携带和服用方便；服用时容易溶解、入口分散性很好。颗粒以菌粉、填充剂、稳定剂和调味剂等组成。本发明的嗜酸乳杆菌颗粒剂主料为本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506干燥菌粉，辅料为奶粉以及淀粉，根据产品要求还可加入一些常规的甜味剂、香精等调味剂，有的还加入一些营养强化剂。按照常规的比例，经过常规制粒法进行生产，产品可以根据不同的克重和活菌数进行规格的分类。
（3）嗜酸乳杆菌片剂
目前片剂产品是嗜酸乳杆菌制品的一类。该产品是利用本发明的嗜酸乳杆菌La28CGMCC No.11506，配合片剂领域的常用原辅材料，如：葡萄糖、乳糖、山梨糖醇、微晶纤维素、硬脂酸镁以及奶粉等，经常规制剂技术制成的片状制剂。片剂具有剂量准确，服用和携带方便，便于识别等优点。本发明的片剂制备是按常规的方法，将菌粉与常规的辅料按照常规的比例混合均匀，使其具有良好的流动性和可压性，然后通过压片机机械压成片。压片时可在适度的压力下压成硬度符合要求的片剂。
（4）嗜酸乳杆菌胶囊剂
胶囊剂也是嗜酸乳杆菌制品的一类，其分为固体胶囊剂以及液体胶囊剂，固体胶囊剂，是将嗜酸乳杆菌粉剂或者嗜酸乳杆菌颗粒剂，经胶囊机制作成为胶囊产品；液体胶囊剂，是将嗜酸乳杆菌菌粉与油脂混合，通过胶囊剂制作成软胶囊产品。以上两种产品均可以根据不同的克重和活菌数进行规格的分类。
（5）本发明嗜酸乳杆菌在制备乳制品中的应用
本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506可以在制备乳制品中使用，乳制品包括酸奶、乳饮料、冰淇淋等。但本发明的乳制品不限于此，还包括其他形式的乳制品。本发明的各种乳制品可以通过将本发明的嗜酸乳杆菌La28菌粉作为原料，按照本领域常规的方法，以常规的比例添加制成。
a、嗜酸乳杆菌乳饮料
鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳10%-15%。糖液：甜味剂（砂糖或葡萄糖或其他常用甜味剂）22%-30%，柠檬酸0.05%-0.1%，稳定剂（本领域任何常用的用于乳制品的稳定剂）0.1%-0.4%。发酵液、糖液与水比例为1:2:1。
将鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳用40-50℃去离子水混合料液，充分溶解后预热至60-65℃，20MPa压力下均质，在90-95℃温度下加热杀菌5-30分钟，冷却到42℃；然后在其中添加发酵剂Yo-C698-1（由河北一然生物科技有限公司生产，并已公开出售）0.003%-0.01%和嗜酸乳杆菌La28菌粉0.002%-0.004%，在42℃下培养，使其pH值为4.2-4.5，活菌数达到l08cfu/mL以上。
另外，将作为辅料的甜味剂、稳定剂、色素等，用60-80℃去离子水溶解配成糖浆，经95℃加热杀菌5-30分钟后冷却到42℃，将发酵乳与糖浆混合，必要时添加柠檬酸调节酸度；添加香料后，加一定量的冷却水定容，用10兆帕的压力均质，冷却至25℃，最后将制品灌装于容器中冷藏，其产品活菌数为3×106cfu/mL。
b、嗜酸乳杆菌酸乳
将鲜乳加热至50℃以上，加入6.5-8%白砂糖搅拌至完全溶解，预热至60-65 ℃，20Mpa压力均质，95℃左右杀菌5分钟，冷却至42-45℃，接种发酵剂Yo-C975（由河北一然生物科技有限公司生产，并已公开出售） 0.003%-0.01%和本发明嗜酸乳杆菌0.002%-0.004%。40-42℃发酵至pH 4.2-4.5，冷却、冷藏，制成凝固型酸乳或搅拌型酸乳。
c、嗜酸乳杆菌冰淇淋
制备1000kg冰淇淋，使用白砂糖75kg，全脂奶粉66kg，奶油32kg，椰子油23kg，糖浆26.5kg,稳定剂6kg，本发明的嗜酸乳杆菌菌粉0.002%-0.004%，其余为水。将除菌粉外的其他物料混合，预热至60℃-65℃，20Mpa下均质，70℃-85℃下杀菌10-30分钟，冷却至40℃-50℃，加入本发明的嗜酸乳杆菌菌粉，20-30Mpa下进行均质，在2℃-4℃下放置6小时，经凝冻硬化制成冰淇淋。
d、嗜酸乳杆菌粉剂
选用麦芽糊精、抗性糊精、乳粉等食品原料5%-30%、益生元（低聚果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、乳糖醇等）10%-30%、膳食纤维（菊粉等）5%-15%、果蔬粉5%-10%以及本发明的嗜酸乳杆菌菌粉5%-15%，按照一定比例混合，混合后经包装制成粉剂小条即可，终端产品每包活菌数可达100亿到300亿不等，可根据不同活菌数制定产品规格。
实施例3 本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506的免疫调节及抗过敏功能
实验材料
1.1实验菌株
本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506。
1.2实验动物
SPF级BALB/C小鼠，雄性，6-8周龄（体重18-20g），48只，购自四川省达硕实验动物有限责任公司（许可证号：SCYK（川）2015-030）。
1.3试剂与仪器
无菌生理盐水：自配；IL-6、IL-12、IFN-γ ELISA检测试剂盒：R&D公司，美国；离心机，酶标仪，洗板机。
2.实验方法
2.1动物饲养
动物购买回本实验室SPF级动物房后，适应性喂养1周（7天）。动物均饲养于塑料笼中，给予标准膳食，自由饮水。环境温度：24℃±1℃，湿度：55±10%。每天灌胃生理盐水或菌液。实验分两次处死动物，第一次于饲养2周（14天）后处死各组的一半（12只）动物，第二次于饲养4周（28天）后处死余下动物。
2.2动物分组及益生菌干预
将48只小鼠随机分为2组，每组24只，具体分组如下：
对照组：共24只，每只小鼠每天灌胃无菌生理盐水0.2mL；
嗜酸乳杆菌La28干预组：共24只，每只小鼠每天灌胃嗜酸乳杆菌La28菌液0.2mL（含菌量109cfu）。
2.3小鼠体重及免疫脏器系数(Immune organ index, IOI)的测定
实验开始时称取各组小鼠基础体重，并于实验过程中每隔7天称取一次体重以监测小鼠生长发育情况。处死小鼠前称取最后一次体重，用于计算脏器系数。处死时，无菌剥离小鼠胸腺及脾脏，去除周围结缔组织，用滤纸吸净脏器表面血液后称重，由公式IOI=胸腺或脾脏重量(mg)/体重(g)计算免疫脏器系数(Immune organ index, IOI)。
2.4血清细胞因子的测定
处死小鼠时，采用眼球取血法收集小鼠血液，室温静置30分钟后，离心1000r/min10min，收集上清液冻存于-80℃备用。
分别用IL-6、IL-12、IFN-γ ELISA试剂盒（R&D，美国）进行血清细胞因子的测定，具体测定步骤参照试剂盒说明书完成。
2.5统计学分析
用SPSS 17.0进行统计学分析，计量资料用表示，体重及脏器系数的各组间均数比较采用方差分析，血清细胞因子IL-6的实验组与对照组均数比较采用t检验。
3.实验结果
3.1体重及一般情况
实验结束时各组体重及各组体重增长结果如表2。实验结束时，各组体重无统计学差异，各组体重增长也无统计学差异。体重增长均为正，表明各组菌株对小鼠无毒性。实验期间小鼠生长状况良好，无明显腹泻等不良表现，未出现中毒症状及死亡。
表2 实验结束时体重及实验前后体重增长（单位：g）
3.2免疫脏器系数
实验测得免疫脏器系数如表3。实验结束时，各组间免疫脏器系数无统计学差异。
表3 免疫器官的脏器系数（单位：mg/g）
3.3血清细胞因子
实验测得血清细胞因子结果如表4、表5。14天及28天时各组血清IL-12、IFN-γ均低于试剂盒检测限，未检出。14天时，La28菌株组的血清IL-6浓度低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。28天时，La28菌株组的血清IL-6浓度低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
表4 14天时血清细胞因子浓度（单位：pg/mL）
注：*与空白对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05）；N.D表示未检出
表5 28天时血清细胞因子浓度（单位：pg/mL）
注：*与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）：N.D表示未检出
综上所述，在投用本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506 14天-28天后，可降低小鼠血清IL-6水平，IL-6主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生，其作用靶细胞较为复杂。实验结果显示嗜酸乳杆菌La28可降低血清IL-6水平，提示其可能抑制Th2细胞活性，说明本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506具有免疫调节作用。
实施例4 本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506抗过敏功能试验
1.实验材料
1.1实验菌株
本发明的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506。
1.2实验动物
SPF级BALB/C小鼠，雄性，6-8周龄（体重18-20g），36只，购自四川省达硕实验动物有限责任公司（许可证号：SCYK（川）2015-030）。
1.3试剂与仪器
卵清白蛋白（OVA）：sigma公司，美国；氢氧化铝：分析纯，sigmaV900163-500G，美国；无菌生理盐水：自配；IgE ELISA试剂盒：YAMASA公司，日本；离心机，酶标仪，洗板机。
2.实验方法
2.1动物饲养
动物购买回本实验室SPF级动物房后，适应性喂养1周（7天）。动物均饲养于塑料笼中，给予标准膳食，自由饮水。环境温度：24±1℃，湿度：55±10%。每2天灌胃一次生理盐水或菌液，于实验开始后第8天、第22天、第29天、第36天分别进行腹腔OVA注射，于最后一次腹腔OVA注射7天后处死动物。
2.2动物分组及益生菌干预
将36只小鼠随机分为3组，具体分组如下：
空白对照组：12只，每2天灌胃无菌生理盐水一次（0.2mL/次）；
OVA阳性对照组：12只，每2天灌胃0.2mL无菌生理盐水一次，进行3次腹腔OVA注射；
嗜酸乳杆菌La28菌株组：12只，每2天灌胃0.2mL La28菌液一次（含菌量109cfu），进行4次腹腔OVA注射。
2.3 OVA的配制及过敏反应激发
采用腹腔注射卵清白蛋白（OVA）的方式激发小鼠过敏反应。激发所用OVA需自行配制，配制方法如下：400μgOVA溶于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，400mg Al (OH)3 配于10mL磷酸盐缓冲液（PBS）中形成混悬液，并用超声破碎仪破碎10分钟，使用时将OVA溶液和Al(OH)3混悬液等体积混合，配得浓度为200μgOVA，20mgAl（OH）3/mL的混悬液，现配现用。
分别于实验开始后第8天、第22天、第29天、第36天对OVA阳性对照组和实验组小鼠进行腹腔OVA注射，每只小鼠每次注射0.1mL混悬液。
2.4小鼠体重测定
实验开始时称取各组小鼠基础体重，并于实验过程中每隔7天称取一次体重以监测小鼠生长发育情况。
2.5血清总IgE测定
于最后一次腹腔OVA注射7天后处死动物，分别测定各组小鼠体重血液总IgE浓度。实验开始时，采用尾部动脉法收集小鼠血液，实验结束处死小鼠时，采用眼球取血法收集小鼠血液，室温静置30分钟后，离心1000r/min 10min，收集血清冻存于-80℃备用。
血清总IgE的测定，采用小鼠血清总IgE ELISA试剂盒（YAMASA，日本）进行测定，具体测定步骤参照试剂盒说明书。
2.6统计学分析
用SPSS 17.0进行统计学分析，计量资料用表示，各组间均数比较采用方差分析，部分均数间两两比较采用Dunnett-t检验。
3.实验结果
3.1体重及一般情况
实验结束时各组体重及各组体重增长结果如表6。实验结束时，各组体重增长无统计学差异。体重增长均为正，表明菌株对小鼠无毒性。实验期间小鼠生长状况良好，无明显腹泻等不良表现。
表6实验结束时体重及实验前后体重增长（单位：g）
3.2血清总IgE浓度
根据试剂盒要求，在测定血清总IgE时，对血清进行25倍稀释后进行测定，所得结果如表7。实验前血清总IgE水平均较低或未检出，实验结束时，OVA阳性对照组及各菌株组血清总IgE高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。La28菌株组血清总IgE低于OVA阳性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
表7 实验前后血清总IgE浓度（单位：ng/mL）
注：未扩大倍数；a与b之间有统计学差异，P <0.05；a与c之间有统计学差异，P <0.05；b与c之间用统计学差异，P <0.05；N.D表示未检出。
综上所述，在OVA刺激小鼠后，血清IgE升高，小鼠发生超敏反应，而投用本发明的嗜酸乳杆菌La28后，可以降低由于超敏反应而升高的血清IgE水平，推测本发明的嗜酸乳杆菌La28具有抗过敏作用。在免疫调节作用实验中，嗜酸乳杆菌降低血清IL-6水平，表明其免疫调节机制为抑制Th2细胞的活性。
整体试验结果表明，本发明的嗜酸乳杆菌La28具有免疫调节作用，在投用14天-28天后可降低血清IL-6水平。嗜酸乳杆菌La28还具有抗过敏作用，可降低OVA致敏小鼠的血清总IgE水平，其潜在的抗过敏机制为抑制Th2细胞活性，从而影响Th1/Th2细胞平衡。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河北一然生物科技有限公司
<120> 一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌La28基因序列
<400> 1
tacatgcagt cgagcgagct gaaccaacag attcacttcg gtgatgacgt tgggaacgcg 60
agcggcggat gggtgagtaa cacgtgggga acctgcccca tagtctggga taccacttgg 120
aaacaggtgc taataccgga taagaaagca gatcgcatga tcagcttata aaaggcggcg 180
taagctgtcg caatgggatg gccccgcggt gcattagcta gttggtaggg taacggccta 240
ccaaggcaat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg actgagacac 300
ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttggtgaag 420
aaggatagag gtagtaactg gcctttattt gacggtaatc aaccagaaag tcacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540
taaagcgagc gcaggcggaa gaataagtct gatgtgaaag ccctcggctt aaccgaggaa 600
ctgcatcgga aactgttttt cttgagtgca gaagaggaga gtggaactcc atgtgtagcg 660
gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgcaac 720
tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttgggagg tttccgcctc tcagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatct agtgcaatcc gtagagatac ggagttccct tcggggacac taagacaggt 1020
ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgtc attagttgcc agcattaagt tgggcactct aatgagactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagtaca acgaggagca agcctgcgaa ggcaagcgaa tctcttaaag 1260
ctgttctcag ttcggactgc agtctgcaac tcgactgcac gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccatgggagt ctgcaatgcc caaagccggt ggcctaacct tcgggaagga gccgtc 1436
<210> 2
<211> 424
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌La28 hsp60基因序列
<400> 2
cttgcttaga tctcaacttc aggtgaccaa gctcgtgtgc ttgaaaagca tgacttctca 60
aagggtcctc ttaagatggt ttcctggtaa ggtataccgt cgtgatgacg atgatgcgac 120
tcactctcac caatttatgc aaatggaagg gttagttatt gaagcacgtt actatgagcg 180
atttaaaggg tactttggaa atgatcgcta agcacgtatt tgggcaagat agagcaaccc 240
gttcgtccaa gttatttccc cttcactgaa ccatctgtag aaatggatgt atcttgtttt 300
aattgtgatg gtaaaggttg tccattgtaa atacacgttg tggattgaag tattaggtgc 360
tggtatggtt caccctaatg ttttagaaaa tgctggtgtt gattcacgtt tacggtggtt 420
ttgc 424
Claims (6)
1.一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28，其保藏编号为CGMCC No.11506。
2.具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28菌剂，其特征在于：是将权利要求1所述的嗜酸乳杆菌La28 CGMCC No.11506菌株扩大培养后得到的。
3.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌La28或权利要求2所述的嗜酸乳杆菌La28菌剂在制备具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述食品为益生产品或乳制品；作为优选，所述食品包括嗜酸乳杆菌粉剂、嗜酸乳杆菌片剂、嗜酸乳杆菌颗粒剂、嗜酸乳杆菌胶囊剂、嗜酸乳杆菌乳制品、嗜酸乳杆菌饮料、嗜酸乳杆菌糖果或嗜酸乳杆菌果冻。
5.一种具有免疫调节功能和抗过敏功能的食品，其特征在于：所述食品的功能性有效成分为权利要求1所述的嗜酸乳杆菌La28、权利要求2所述的嗜酸乳杆菌La28菌剂；所述功能性有效成分为免疫调节功能和抗过敏功能。
6.根据权利要求5所述的食品，其特征在于：所述食品包括嗜酸乳杆菌粉剂、嗜酸乳杆菌片剂、嗜酸乳杆菌颗粒剂、嗜酸乳杆菌胶囊剂、嗜酸乳杆菌乳制品、嗜酸乳杆菌饮料、嗜酸乳杆菌糖果或嗜酸乳杆菌果冻。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610381849.7A CN106011006A (zh) | 2016-06-01 | 2016-06-01 | 一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610381849.7A CN106011006A (zh) | 2016-06-01 | 2016-06-01 | 一株具有免疫调节及抗过敏功能的嗜酸乳杆菌La28及其应用 |
Publications (1)
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