CN113142301A - 一种可提高机体免疫力的乳制品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可提高机体免疫力的乳制品及其制备方法，所述乳制品中接种了乳双歧杆菌TY‑S01和/或副干酪乳杆菌L9，乳制品形式包括酸奶和乳酸菌饮料。以添加了乳双歧杆菌TY‑S01和/或副干酪乳杆菌L9的乳制品为原料，通过饲喂小鼠后并测定巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力、NK细胞的杀伤能力、脾淋巴细胞的增殖能力、血清IgG的浓度，考察产品对小鼠系统免疫的影响。结果表明，高脂饲喂的小鼠免疫功能较维持饲料饲喂的小鼠免疫功能显著降低，乳双歧杆菌TY‑S01能从先天性免疫功能方面增强机体系统免疫能力，副干酪乳杆菌L9既能从先天性免疫功能，也能从获得性免疫功能两个方面增强机体系统免疫能力。

Description

一种可提高机体免疫力的乳制品及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，特别涉及一种可提高机体免疫力的乳制品及 其制备方法。

背景技术

免疫系统是机体抵御病原菌的重要防线，它包括先天性免疫和获得性免疫， 这两种免疫形式共同作用，保护机体免受外部和内部的损害。研究显示，益生菌 对免疫反应有调节作用，能刺激免疫系统，强化机体对外来病原菌的早期防御。 然而，益生菌的免疫调节功能具有菌株特异性，并非所有益生菌均具有免疫调节 功能。研究显示，通过某些化学修饰可以导致益生菌获得免疫调节能力，但化学 修饰后的益生菌添加到食品中的安全性仍有待研究。因此，如何筛选获得具有显 著免疫调节功能的天然益生菌，应用到食品制备中，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高机体免疫力的乳制品及其制备方法，以添加 乳双歧杆菌TY-S01的酸奶和副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料为原料，通过饲喂 小鼠后，考察乳制品对小鼠系统免疫的影响，确定所述乳双歧杆菌TY-S01和副 干酪乳杆菌L9，均能增强机体系统免疫能力。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

乳双歧杆菌TY-S01和/或副干酪乳杆菌L9在制备保健食品中的用途，所述 保健食品用于增强机体系统免疫能力；所述乳双歧杆菌TY-S01于2020年11月 27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其菌种保藏号为 CGMCC 21255，所述副干酪乳杆菌L9于2014年10月22日保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其菌种保藏号为CGMCC 9800。

进一步的，添加乳双歧杆菌TY-S01的保健食品用于提高巨噬细胞的吞噬能 力，增强机体的先天免疫反应功能。

进一步的，，添加副干酪乳杆菌L9的保健食品用于提高巨噬细胞的吞噬能 力，增强机体的先天免疫反应功能，同时促进皮淋巴细胞增值能力，提高血清IgG 水平，增强机体的获得性免疫功能。

本发明的另一方面：

一种可提高机体免疫力的乳制品，所述乳制品中接种乳双歧杆菌TY-S01和 /或副干酪乳杆菌L9。

进一步的，，所述乳制品为添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶，原料及其重量 份数比为：

所述酸奶的制备方法包括以下步骤：

步骤1，化料：将鲜牛奶温度升至45℃～50℃，将白砂糖和/或聚葡萄糖干混 均匀，投入鲜牛奶中缓慢搅拌，水合20min～40min；

步骤2，均质：均质一次，均质的一级压力4～6MPa，二级压力18～20MPa， 均质温度为60℃～70℃；

步骤3，巴氏杀菌：95℃±2℃维持4min～6min；

步骤4，冷却：巴氏杀菌后的牛奶冷却至40℃～45℃；

步骤5，接种：在43℃～44℃温度条件下接种嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌， 接种后搅拌均匀，同时加入乳双歧杆菌TY-S01菌粉；

步骤6，发酵：发酵温度为43℃，发酵4h～6h；

步骤7，终止发酵：迅速冷却至4℃以下，放置4℃冷库；

步骤8，后熟：酸奶置于4℃条件下后熟12h～36h，即得到可提高机体免疫 力的酸奶。

进一步的，所述添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶中，还包括以下原料：

β-葡聚糖10～20；

制备时所述β-葡聚糖与白砂糖和/或聚葡萄糖一同干混均匀，再投入鲜牛奶 中缓慢搅拌。

进一步的，所述乳制品为添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料，原料及其重 量份数比为：

所述乳酸菌饮料的制备方法包括以下步骤：

将奶粉、白砂糖充分溶解，并经均质、杀菌处理后，按照上述比例加入所述 副干酪乳杆菌L9菌粉，发酵48h～72h后即得到所述乳酸菌饮料。

进一步的，所述添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料中，还包括以下原料：

β-葡聚糖10～20；

制备时所述β-葡聚糖与奶粉、白砂糖一同用水充分溶解。

本发明相比现有技术的有益效果：

1、通过本发明的研究发现，所述乳双歧杆菌TY-S01能从先天性免疫功能 (腹腔巨噬细胞吞噬能力)方面增强机体系统免疫能力，副干酪乳杆菌L9既能 从先天性免疫功能，也能从获得性免疫功能(脾淋巴细胞增殖能力和血清IgG) 两个方面增强机体系统免疫能力，TY-S01和L9均为具有开发前景的功能菌株；

2、本发明所述的添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶和添加副干酪乳杆菌L9的 乳酸菌饮料，均是可提高机体免疫力的乳制品。

附图说明

图1为巨噬细胞吞噬鸡红细胞的实验镜检照片；

图2为ELISA法测定血清IgG浓度的标准曲线；

图3为乳双歧杆菌TY-S01、聚葡萄糖及高脂饲料对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 率的影响；

图4为乳双歧杆菌TY-S01、聚葡萄糖及高脂饲料对NK细胞活性的影响；

图5为乳双歧杆菌TY-S01、聚葡萄糖及高脂饲料对脾淋巴细胞增殖能力的 影响；

图6为空白、模型及乳双歧杆菌TY-S01组小鼠血清中IgG浓度；

图7为副干酪乳杆菌L9对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响；

图8为副干酪乳杆菌L9对NK细胞活性的影响；

图9为副干酪乳杆菌L9对脾淋巴细胞增殖能力的影响；

图10为空白、模型及副干酪乳杆菌L9组小鼠血清中IgG浓度。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶，原料及其添加量为：

鲜牛奶 910kg

白砂糖 60kg

乳双歧杆菌TY-S01菌粉 0.2kg；

所述酸奶的制备方法包括以下步骤：

步骤1，化料：将鲜牛奶温度升至45℃～50℃，将白砂糖投入鲜牛奶中缓慢 搅拌，水合30min；

步骤2，均质：均质一次，均质的一级压力4～6MPa，二级压力18～20MPa， 均质温度为65℃；

步骤3，巴氏杀菌：95℃±2℃维持5min；

步骤4，冷却：巴氏杀菌后的牛奶冷却至42℃；

步骤5，接种：在43℃～44℃温度条件下接种嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌， 接种后搅拌均匀，同时加入乳双歧杆菌TY-S01菌粉；

步骤6，发酵：发酵温度为43℃，发酵5h；

步骤7，终止发酵：迅速冷却至4℃以下，放置4℃冷库；

步骤8，后熟：酸奶置于4℃条件下后熟24h，即得到可提高机体免疫力的 酸奶。

实施例2

本实施例提供了一种添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶，原料及其添加量为：

其制备方法参照实施例1，其中聚葡萄糖与白砂糖预先干混均匀后，一起添 加到所述鲜牛奶中。

利用实施例1、2所述酸奶灌胃小鼠，利用免疫学方法测定其对小鼠系统免 疫指标的影响，包括巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力、NK细胞的杀伤能力、脾 淋巴细胞增殖能力、ELISA法测定血清IgG浓度。

购入雄性C57BL/6J小鼠(4周龄)后，适应性喂养1周后，随机分成以下 5组，每组12只小鼠，分别为：

(1)空白组(NC)：维持饲料；

(2)模型组(HFC)：高脂饲料+普通酸奶/安慰剂；

(3)TY-S01酸奶+高脂饲料组：高脂饲料+含TY-S01的酸奶(实施例1)；

(4)TY-S01酸奶+维持饲料组：维持饲料+含TY-S01的酸奶(实施例1)；

(5)TY-S01+聚葡萄糖酸奶+维持饲料组：维持饲料+含TY-S01和聚葡萄 糖的酸奶(实施例2)。

所测定的指标及测定方法为：

(1)体重及摄食量测定

自由采食饲料，每天灌胃0.1g样品，样品给予时间8-10周。每周记录给食 量、撒食量、剩食量，摄入总量(摄食量×每公斤饲料热量)、食物利用率、称 量体重1次。

(2)免疫指标的测定

试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，解剖。免疫 指标包括巨噬细胞吞噬能力、NK细胞杀伤能力、抗体IgG生成能力。

①血清样品制备

小鼠处死前摘取眼球取血。血液样品在室温下放置3h凝血，随后置于4℃ 过夜。样品以1000rpm离心10min，收集血清。于-20℃保存待测。

②巨噬细胞悬液的制备

小鼠处死后，在超净台中分离腹腔细胞液。

③脾淋巴细胞悬液的制备

无菌取小鼠脾脏，置于200目金属筛网上，筛网浸没在含RPMI-1640培养 基的培养皿中。用玻璃注射器内芯轻轻研磨脾组织，使其通过200目筛网，得到 单细胞悬液。向单细胞悬液中添加1ml无菌水，轻晃20s以裂解其中的红细胞， 随后立即加入2×Hank’s液恢复原液压，此时溶液中出现黄白色组织团块，此为 裂解的红细胞，以吸管除去已裂解的红细胞，剩余的细胞用RPMI-1640培养基 洗涤两次后重悬于RPMI-1640培养基中，制得脾淋巴细胞悬液。

④巨噬细胞吞噬能力

如上所述，取小鼠腹腔巨噬细胞，制备巨噬细胞悬液。以巨噬细胞吞噬鸡红 细胞法检测小鼠巨噬细胞吞噬能力，具体方法如下：将巨噬细胞液与1％鸡红细 胞(CRBC)等体积混合，吹打均匀后滴加到载玻片上的封闭圈内。将载玻片置于 370℃，5％CO₂培养箱中孵育20min，培养结束后迅速用生理盐水将未贴壁的巨 噬细胞和未被吞噬的CRBC冲掉，滴加甲醇固定1min。Giemsa原液用PBS缓 冲液稀释8倍，均匀滴加到载玻片上，染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干。 100倍显微镜下观察计数，吞噬率为吞噬CRBC的巨噬细胞占总巨噬细胞数的百 分比。

巨噬细胞是先天免疫的重要效应细胞。当病原体入侵时，巨噬细胞在早期做 出关键的防御反应。研究显示服用特定的益生菌能够增强腹腔巨噬细胞的吞噬能 力，增强机体先天性免疫反应。细胞涂片中巨噬细胞、鸡红细胞和吞噬细胞吞噬 鸡红细胞的形态，如图1所示。

⑤NK细胞活性

使用LDH法测定NK细胞杀伤活性。制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度 为5×10⁶个/mL。以Yac-1细胞作为靶细胞，并调整其细胞悬液浓度为5×10⁴个/mL。取96孔板，试验孔加入Yac-1细胞悬液和脾淋巴细胞悬液各100μL； 靶细胞自然释放孔加入靶细胞和培养基各100μL；靶细胞最大释放孔加入靶细胞 和2.5％Triton各100μL。细胞在37℃、5％CO₂含量的培养箱中培养4h。培养 结束后，吸取100μL上清置于新的培养板中，每孔加入100μL LDH基质液，室 温下反应30min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL终止反应。用酶标仪在490nm 波长下测定样品的OD值。NK细胞杀伤活性由下列公式计算得到。

杀伤率＝(试验孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD) ×100％

⑥脾淋巴细胞增殖能力

使用改良的MTT法测定脾淋巴细胞增殖能力。具体方法为：取96孔板， 每孔加入100μL浓度为2×10⁶个/mL的脾淋巴细胞悬液，以10μL终浓度为1.5 μg/mL的ConA刺激，对照孔不加ConA。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中培养 72h。距离培养结束前4h，各孔加入10μLCCK-8试剂。培养结束后用酶标仪在 490nm波长下测定吸光值。脾淋巴细胞增殖率用如下公式计算：

增殖率＝(OD_conA-OD_control)/(OD_conA ^--OD_control)×100％

OD_conA：含细胞、CCK-8和ConA孔的吸光值

OD_control：含CCK-8孔的吸光值

OD_conA-：含细胞和CCK-8孔的吸光值

⑦血清IgG浓度测定

用ELISA试剂盒检测IgG含量。

图2为IgG标品的标准曲线。

以实施例1、实施例2所述酸奶灌胃，高脂饲料或维持饲料喂养小鼠9周后， 首先，如图3所示，高脂饲料喂养的模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬 活性显著低于维持饲料喂养的空白组，肥胖诱导小鼠脂肪组织中炎症因子显著表 达，促使细胞分泌传导紊乱，导致炎症级联发生，即小鼠脂肪组织内JAK2、p- JAK2、Akt和p-Akt蛋白表达显著升高；同时，iNOS和NF-κB蛋白表达也显著 升高。NF-κB进一步诱导巨噬细胞产生i NOS，释放大量细胞毒性，反过来又会 引起巨噬细胞吞噬率降低。其次，无论是高脂饲料喂养的小鼠，还是低脂饲料喂 养的小鼠，灌胃乳双歧杆菌TY-S01均能提高巨噬细胞的吞噬率。再次，TY-S01组和TY-S01+聚葡组相比较，聚葡萄糖略微降低了巨噬细胞的吞噬活性，但差异 不显著(p>0.05)。

NK细胞是先天免疫系统中的一种细胞毒淋巴细胞，能够识别和控制多种病 原菌，包括病毒，细菌和细胞内寄生虫。不同组小鼠NK细胞活性如图4所示。 高脂饲料饲喂小鼠显著降低了NK细胞活性(p<0.05)，使小鼠先天免疫能力降 低。而灌胃含TY-S01的酸奶的小鼠在NK细胞杀伤Yac-1细胞方面虽然未表现 出显著差异(p>0.05)，但通过比较还是可以发现，TY-S01略微提高了NK细 胞活性。

T细胞是获得性免疫中细胞免疫的重要效应细胞，当外来抗原入侵时，淋巴 细胞通过增殖分化等做出响应。脾淋巴细胞中的T细胞在ConA的刺激下增殖， 其增殖程度反映T细胞的活性。以改良的MTT法测定脾淋巴细胞在ConA刺激 下的增殖能力如图5所示，由图可知，高脂饲料与维持饲料饲喂的小鼠，其脾淋 巴细胞增值率差异不显著(p>0.05)，另外，空白组脾淋巴细胞增殖率为22.65 ±3.27％，而TY-S01组脾淋巴细胞增殖率为22.91±4.44％，TY-S01+聚葡组脾淋 巴细胞增殖率为22.16±3.82％，表明TY-S01和聚葡萄糖对脾淋巴细胞活性的影 响不显著。

B细胞是获得性免疫中体液免疫的主要效应细胞，抗原提呈细胞识别抗原之 后，B细胞被活化并分化成抗体分泌型浆细胞，产生IgG。图2为IgG标品的标 准曲线。通过测定血清中IgG水平，反映受试产品对小鼠机体体液免疫的影响， 结果如图6所示。由图6可知，高脂饲料饲喂的小鼠与维持饲料饲喂的小鼠血清 中IgG浓度差异显著(p<0.05)，但乳双歧杆菌TY-S01对小鼠血清中IgG浓度 影响不显著，空白组小鼠血清中IgG浓度为46.44±5.65mg/mL，TY-S01组小鼠 血清中IgG浓度为48.95±5.81mg/mL，而TY-S01+聚葡组小鼠血清中IgG浓度 (38.42±4.49mg/mL)反而略低于空白组。

实施例3

本实施例提供了一种添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶，原料及其添加量为：

其制备方法参照实施例1，其中聚葡萄糖、β-葡聚糖与白砂糖预先干混均匀 后，一起添加到所述鲜牛奶中。

经过检测发现添加β-葡聚糖后的酸奶，增强机体系统免疫能力大幅度提升， 免疫球蛋白具有各种免疫功能，血清中的免疫球蛋白主要包括IgG、IgA、IgM 等，是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物。β-葡聚糖本身作为一种外源物 质中的病原体相关分子模式物质，其发挥免疫调控作用主要是促进IL-1、IL-6 的表达，提高血清中IgA和IgG含量。

实施例4

本实施例提供了一种添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料，原料及其添加量 为：

所述乳酸菌饮料的制备方法包括以下步骤：

将奶粉、白砂糖用水充分溶解，并经均质、杀菌处理后，按照上述比例加入 所述副干酪乳杆菌L9菌粉，发酵72h后即得到所述乳酸菌饮料。

同样购入雄性C57BL/6J小鼠(4周龄)后，适应性喂养1周后，随机分成 以下4组，每组12只小鼠，分别为：

(1)空白组(NC)：维持饲料；

(2)模型组(HFC)：高脂饲料+普通酸奶/安慰剂；

(3)L9饮料+普通饲料组：普通饲料+含L9的乳饮料；

(4)L9饮料+高脂饲料组：高脂饲料+含L9的乳饮料。

参照上述方法，测定小鼠的体重及摄食量、各免疫指标。结果如下：

图7为本实施例不同处理组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬活性，如图 可知，副干酪乳杆菌L9能提高巨噬细胞的吞噬能力，增强机体的先天免疫反应。

图8为本实施例不同处理组小鼠NK细胞活性，结合以上TY-S01酸奶的实 验数据进行分析，灌胃含L9的饮料和TY-S01的酸奶的小鼠在NK细胞杀伤Yac-1 细胞方面虽然未表现出显著差异(p>0.05)，但通过比较还是可以发现，TY-S01 和L9略微提高了NK细胞活性。

图9示出了本实施例不同处理组小鼠脾淋巴细胞在ConA刺激下的增殖能 力，L9能显著提高脾淋巴细胞的增值率，L9+维持饲料组脾淋巴细胞增殖率达到 28.93±2.29％。表明副干酪乳杆菌L9具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。

如图10所示，L9能显著提高血清中IgG含量，L9+维持饲料组小鼠血清中IgG浓度达到58.05±5.09mg/mL。

综上，高脂饲喂的小鼠免疫功能较维持饲料饲喂的小鼠免疫功能显著降低， 乳双歧杆菌TY-S01能从先天性免疫功能(腹腔巨噬细胞吞噬能力)方面增强机 体系统免疫能力，副干酪乳杆菌L9既能从先天性免疫功能，也能从获得性免疫 功能(脾淋巴细胞增殖能力和血清IgG)两个方面增强机体系统免疫能力。

实施例5

本实施例提供了一种添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料，原料及其添加量 为：

所述乳酸菌饮料的制备方法包括以下步骤：

将奶粉、白砂糖和β-葡聚糖用水充分溶解，并经均质、杀菌处理后，按照 上述比例加入所述副干酪乳杆菌L9菌粉，发酵72h后即得到所述乳酸菌饮料。

经过检测发现添加β-葡聚糖后的乳酸菌饮料，增强机体系统免疫能力大幅度 提升。免疫球蛋白具有各种免疫功能，血清中的免疫球蛋白主要包括IgG、IgA、 IgM等，是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物。葡聚糖本身作为一种外源 物质中的病原体相关分子模式物质，其发挥免疫调控作用主要是促进IL-1、IL-6 的表达，提高血清中IgA和IgG含量。

Claims (8)

1.乳双歧杆菌TY-S01和/或副干酪乳杆菌L9在制备保健食品中的用途，所述保健食品用于增强机体系统免疫能力；所述乳双歧杆菌TY-S01于2020年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其菌种保藏号为CGMCC 21255，所述副干酪乳杆菌L9于2014年10月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其菌种保藏号为CGMCC9800。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，添加乳双歧杆菌TY-S01的保健食品用于提高巨噬细胞的吞噬能力，增强机体的先天免疫反应功能。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，添加副干酪乳杆菌L9的保健食品用于提高巨噬细胞的吞噬能力，增强机体的先天免疫反应功能，同时促进皮淋巴细胞增值能力，提高血清IgG水平，增强机体的获得性免疫功能。

4.一种可提高机体免疫力的乳制品，其特征在于，所述乳制品中接种乳双歧杆菌TY-S01和/或副干酪乳杆菌L9。

5.根据权利要求4所述的乳制品，其特征在于，所述乳制品为添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶，原料及其重量份数比为：

所述酸奶的制备方法包括以下步骤：

步骤1，化料：将鲜牛奶温度升至45℃～50℃，将白砂糖和/或聚葡萄糖干混均匀，投入鲜牛奶中缓慢搅拌，水合20min～40min；

步骤2，均质：均质一次，均质的一级压力4～6MPa，二级压力18～20MPa，均质温度为60℃～70℃；

步骤3，巴氏杀菌：95℃±2℃维持4min～6min；

步骤4，冷却：巴氏杀菌后的牛奶冷却至40℃～45℃；

步骤5，接种：在43℃～44℃温度条件下接种嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌，接种后搅拌均匀，同时加入乳双歧杆菌TY-S01菌粉；

步骤6，发酵：发酵温度为43℃，发酵4h～6h；

步骤7，终止发酵：迅速冷却至4℃以下，放置4℃冷库；

步骤8，后熟：酸奶置于4℃条件下后熟12h～36h，即得到可提高机体免疫力的酸奶。

6.根据权利要求5所述的乳制品，其特征在于，所述添加乳双歧杆菌TY-S01的酸奶中，还包括以下原料：

β-葡聚糖 10～20；

制备时所述β-葡聚糖与白砂糖和/或聚葡萄糖一同干混均匀，再投入鲜牛奶中缓慢搅拌。

7.根据权利要求4所述的乳制品，其特征在于，所述乳制品为添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料，原料及其重量份数比为：

所述乳酸菌饮料的制备方法包括以下步骤：

将奶粉、白砂糖用水充分溶解，并经均质、杀菌处理后，按照上述比例加入所述副干酪乳杆菌L9菌粉，发酵48h～72h后即得到所述乳酸菌饮料。

8.根据权利要求7所述的乳制品，其特征在于，所述添加副干酪乳杆菌L9的乳酸菌饮料中，还包括以下原料：

β-葡聚糖 10～20；

制备时所述β-葡聚糖与奶粉、白砂糖一同用水充分溶解。

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