CN115287207A - 一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌及其应用 - Google Patents

一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY‑S01(Bifidobacterium lactis TY‑S01)，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2020年11月27日，保藏编号为CGMCC No.21255。通过动物验证实验确定TY‑S01能改善盐酸洛哌丁胺诱导的小鼠便秘，缩短首次排出黑便的时间，提高粪便含水量，加速肠道蠕动；能够有效抑制小肠绒毛的损伤。此外，TY‑S01显著增加了小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平。最后，TY‑S01可通过提高肠道SCFAs水平缓解便秘。本发明提供的乳双歧杆菌TY‑S01可提高便秘小鼠肠道短链脂肪酸含量，从而缓解便秘，因其无副作用、效果良好，为便秘患者提供了一种新的治疗理念。

Description

一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株有助于便秘的乳双歧杆菌及其应用。
背景技术
便秘是一种常见的慢性疾病，也是临床上常见的消化系统疾病，其主要表现为排便量减少、粪便干结、排便困难和排便次数减少等，由于病程长，症状持续反复，给患者带来了极大痛苦。便秘在人群中的发生率高达27％，不同地区、不同性别和不同年龄的人群均有可能受其影响，长期的排便困难轻则引起痔疮、胀气、失眠、内分泌失调、肥胖和失血性贫血等，重则可能诱发或者加重其他疾病，如心血管疾病、肾脏疾病、帕金森氏病和结肠直肠癌等。
针对便秘症状，临床上通常使用药物或手术治疗便秘，药物治疗虽然有一定的作用，但是长期用药身体可能会产生抗药性、依赖性和其他并发症，例如药物依赖、恶心和严重腹泻；手术治疗立竿见影，但治标不治本，平时不注意很容易复发。
因此，在治疗便秘过程中，现有技术仍在存在上述不足，所以寻找一种安全性高，疗效好和毒副作用小的便秘治疗理念变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01。根据16S rDNA同源性分析结果显示TY-S01为乳双歧杆菌。通过验证实验确定TY-S01能改善盐酸洛哌丁胺诱导的便秘，缩短首次排出黑便的时间，提高粪便含水量，加速肠道蠕动；能够有效抑制小肠绒毛的损伤。此外，TY-S01显著增加了粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平。最后，TY-S01可通过提高肠道短链脂肪酸水平，从而缓解便秘。
乳双歧杆菌的分离纯化：收集无尿液污染的广西巴马长寿老人粪便样品，经过无菌生理盐水稀释，再涂布于添加了半胱氨酸的MRS固体培养基上，厌氧培养后，选取形态各异的单菌落采用平板划线法分离菌株，然后从划线纯化的平板上再挑取一个单菌落继续进行划线纯化，得到纯化的菌株。
分离菌株的菌落形态和细胞形态：菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，菌落形态一致，呈半球形，白色，表面光滑湿润，边缘平整。革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态，形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G+)。
PCR扩增16S rDNA序列：对纯化的菌株采用25μL反应体系进行PCR扩增，序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的PCR扩增产物进行测序，获得序列后，使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank中进行搜索和相似性比对。
菌株16S rDNA序列分析：在GenBank数据库中进行序列比对，16S rDNA同源性分析结果显示TY-S01为乳双歧杆菌。乳双歧杆菌TY-S01的16S rDNA基因扩增产物的序列如SEQID No.1所示。
保藏信息：
本发明所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01已经进行保藏，具体保存信息如下：
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2020年11月27日；
保藏编号：CGMCC No.21255；
分类命名：乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacterium lactis TY-S01)。
本发明的原理在于：一些微生物，如双歧杆菌和乳杆菌，具有副作用较低、有效和可使机体多方面受益的特点，因此成为便秘治疗中新的治疗理念。双歧杆菌作为结肠菌群的重要部分，其调节便秘的机制与自身代谢产物调节肠道蠕动、调节肠道菌群和其他影响肠腔环境的因素相关。短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是双歧杆菌等益生菌的代谢产物，SCFAs不仅与一些生理代谢过程有关，而且在维持肠道健康方面也发挥着不可替代的作用：一方面，SCFAs为酸性代谢产物，可降低肠腔内pH值，从而调节肠道正常蠕动。另一方面，不同的SCFAs在缓解便秘中具有不同的分工，乙酸是结肠黏膜细胞的主要能量来源，可以通过促进水和电解质的吸收来促进肠道蠕动；丙酸、丁酸和戊酸可以诱导结肠中端和远端的收缩并直接作用于平滑肌，从而缓解便秘。
本发明的有益效果在于：本发明提供的保藏编号为CGMCC No.21255的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01可提高肠道短链脂肪酸含量，从而缓解便秘，因其无副作用、效果良好，为便秘患者提供了一种新的治疗理念。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为分离菌株菌落形态图。
图2为革兰氏染结果图。
图3为气相色谱法检测小鼠粪便中的SCFAs含量时的标准色谱图。
图4为实验期间小鼠体重、摄食量及饮水量变化统计图。
图5为小鼠排便情况图，其中：
图5中的(A)图为各组首颗黑便时间对比图；
图5中的(B)图为各组粪便含水量对比图；
图5中的(C)图为各组小鼠活性炭推进距离对比图。
图6为各组小鼠小肠绒毛的完整对比图。
图7为小鼠实验期间肠道乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况图，其中：
图7中的(A)、(D)、(G)、(J)、(M)图分别为实验1-14d期间正常组与TY-S01组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况图；
图7中(B)、(E)、(H)、(K)、(N)图分别为实验14-17d期间便秘组与TY-S01组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况图；
图7中(C)、(F)、(I)、(L)、(O)图分别为在造模期最后一天(17d)各组小鼠乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
TY-S01的分离纯化及鉴定
1.实验材料
采集广西巴马长寿老人粪便样品：收集无尿液污染的粪便，用粪便取样器的勺子采集4-5勺(20克左右)粪便于装有20mL，且含30％甘油的粪便取样器中，拧紧盖子。
2.TY-S01的分离纯化
吸取1mL样品于9mL无菌生理盐水中获得10-1稀释液，然后吸取1mL10-1的稀释液于9mL灭菌生理盐水中，得到10-2稀释液，按此操作，依次得到10-3，10-4，10-5，10-6稀释液。
各取200μL不同稀释度样品(10-3，10-4，10-5，10-6)，分别涂布于添加了0.05％的半胱氨酸的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48-72h后，观察平板上的菌落形态，选取形态各异的单菌落采用平板划线法分离菌株，然后从划线纯化的平板上再挑取一个单菌落继续进行划线纯化，重复此划线操作，直至得到纯化的菌株，通过革兰氏染色进行形态学观察。
3.PCR扩增16S rDNA序列
采用25μL反应体系进行PCR扩增：模板1μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，用无菌超纯水补足至25μL。
PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃末端延伸10min。序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的PCR扩增产物进行测序，获得序列后，使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank中进行搜索和相似性比对。
4.实验结果与分析
4.1.分离菌株的菌落形态和细胞形态
菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，菌落形态一致，呈半球形，白色，表面光滑湿润，边缘平整。革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态，形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G+)。菌株的菌落形态和革兰氏染色结果如图1-图2所示，其中，图1为分离菌株菌落形态图；图2为革兰氏染结果图。
4.2.菌株16S rDNA序列分析
在GenBank数据库中进行序列比对，16S rDNA同源性分析结果显示TY-S01为乳双歧杆菌。乳双歧杆菌TY-S01的16S rDNA基因扩增产物的序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2
TY-S01对便秘的缓解作用
1.实验材料
有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01：分离自广西巴马长寿老人肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.21255。
2.动物验证实验
2.1.实验动物分组及处理
选取7周龄的BALB/c雄性小鼠(20g-25g)，饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。适应期结束后，小鼠随机分为正常组、便秘组、TY-S01组，每组10只。
实验周期为18d，1-14d为TY-S01干预期，正常组和便秘组灌胃10mL/kg.BW的生理盐水，TY-S01组灌胃109CFU/kg.BW的TY-S01菌液，灌胃容积同正常组和模型组。第15d开始进行便秘小鼠造模实验，除正常组外的各组均灌胃10mg/kg·BW盐酸洛哌丁胺溶液，正常组小鼠灌胃10mL/kg.BW的生理盐水；间隔1h后，正常组和模型组灌胃10mL/kg.BW的生理盐水，TY-S01组灌胃109CFU/kg.BW的TY-S01菌液，持续3d，直到实验的第17d天，灌胃结束后，所有小鼠开始禁食。禁食16h后(第18d)，所有小鼠灌胃10mL/kg.BW的活性炭溶液，每组小鼠取5只用于测定初次排出黑便所需时间(首粒黑便排出后立即解剖、取血和组织)，其余5只小鼠灌胃活性炭溶液30min后处死解剖，用于观察小鼠小肠推进距离。
2.2.实验期间小鼠生长性能监测
记录小鼠实验期17d内每天小鼠的体重、摄食量及饮水量。
2.3.小鼠粪便收集及粪便含水量测定
收集各组小鼠在益生菌干预期(1d、7d、14d)和便秘造模期(15d、16d、17d)内的粪便，用于粪便中SCFAs的测定，同时按照以下公式测定第17天的粪便含水量。
Figure BDA0003422930060000051
2.4.小肠组织病理切片观察
固定好的小肠组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色，最后在显微镜(50×)下观察组织病理形态变化。
2.5.气相色谱法检测小鼠粪便中的SCFAs含量
50mg小鼠粪便样品加入500μL饱和NaCl溶液，振荡至无明显块状物(组织破碎仪，60HZ，30s，反复5次)，加入40μL10％硫酸酸化，振荡混匀，随后加入1000μL的乙醚萃取，振荡混匀，12000rpm、15min、4℃条件下离心，取上清加入到装有0.25g的无水硫酸钠的EP管中，静置15min，同样条件离心，取上清加入气相小瓶，上机分析，气相色谱检测条件如下表1所示：
表1.气相色谱检测条件表
Figure BDA0003422930060000052
Figure BDA0003422930060000061
利用气相色谱法检测小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸的含量，SCFAs浓度通过外标法计算，标准品色谱如图3所示。
3.实验结果与分析
3.1.实验期间小鼠体重、摄食量及饮水量变化
小鼠的体重变化、摄食量变化及饮水量变化能在一定程度上反映其健康状况。实验期间小鼠体重、摄食量及饮水量变化统计图具体如图4所示。
由图4可知，在整个实验期间，各组小鼠的体重、摄食量及饮水量变化均无明显差异(P<0.05)，表明在盐酸洛哌丁胺构建小鼠便秘模型与TY-S01预防小鼠便秘过程中，小鼠生长性能良好，本次实验未影响小鼠的正常生活及生长。
3.2.TY-S01对盐酸洛哌丁胺诱导小鼠便秘的预防及改善作用
小鼠初次排出黑便的时间是衡量小鼠排便情况的重要指标，对小鼠便秘的评价具有重要作用，小鼠排便情况具体如图5所示。图5中标记的“*”代表两组之间存在统计学差异(p<0.05)。
图5中的(A)图为各组首颗黑便时间对比图，粪便干结是便秘的主要症状之一，是评价便秘程度的重要指标。通过图5中的(A)图可知，便秘组的首粒黑便排出时间显著多于正常组，表明盐酸洛哌丁胺诱导小鼠便秘模型成功，TY-S01能显著改善小鼠便秘，缩短首粒黑便排出时间(P<0.05)。
图5中的(B)图为各组粪便含水量对比图，小肠活性炭推进情况可直接反应机体的肠道蠕动功能。通过图5中的(B)图可知，TY-S01干预能显著增加粪便的含水量(P<0.05)，从而提高粪便的蓬松度。
图5中的(C)图为各组小鼠活性炭推进距离对比图，小肠活性炭推进情况可直接反应机体的肠道蠕动功能。通过图5中的(C)图可知，同一时间下，便秘小鼠相比于正常小鼠活性炭推进距离变短，而灌胃TY-S01则能扭转这一现象，使推进距离变长。
通上述各组小鼠排便情况的结果表明，盐酸洛哌丁胺能造成小鼠便秘，TY-S01则具有预防及改善便秘的功效。
3.3.TY-S01对便秘小鼠小肠绒毛的影响
肠道蠕动功能的好坏与小肠绒毛的完整性密切相关，便秘患者常伴有不同程度的小肠绒毛损伤。各组小鼠小肠绒毛的完整对比图如图6所示。
由图6可知，正常组小鼠的小肠绒毛均匀整齐、无损伤，而模型组小肠绒毛断裂、萎缩等损伤严重，而且肠腔内出现了炎性浸润现象；TY-S01干预后的小鼠，其小肠绒毛损伤均匀、整齐、完整，说明TY-S01干预可以有效抑制小肠绒毛的损伤，具有保护小肠绒毛的作用。
3.4.TY-S01对便秘小鼠肠道SCFAs水平的影响
SCFAs是不可消化的碳水化合物经细菌发酵后产生的最终代谢产物，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸等，其中90％以上的SCFAs为乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs参与人体正常生理活动，与血糖稳态、脂质代谢、食欲调节、免疫调节和神经调节相关，可以促使肠道蠕动正常化。因此，测定肠道SCFAs水平可以评估TY-S01对便秘小鼠肠道微环境的影响。不同的SCFAs在预防便秘中的功效也不同，乙酸是含量最大的SCFAs，作为肠道发酵的主要产物，乙酸可以增加肠道内渗透压，使水分进入肠道，从而使粪便含水量增加，刺激肠道蠕动使粪便排出；丁酸可能通过提高调节性T细胞的浓度来影响肠道运动；异丁酸水平的提高有助于肠蠕动的加快和粪便的排出；丙酸、丁酸和戊酸则可以通过诱导结肠中端和远端的收缩并直接作用于平滑肌来改善便秘。
图7为小鼠实验期间肠道乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况图，其中：
图7中的(A)、(D)、(G)、(J)、(M)图分别为实验1-14d期间正常组与TY-S01组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况。由图7中的(A)、(D)、(G)、(J)、(M)图可知，实验1-14d，小鼠未进行便秘造模，正常组小鼠在1-14d内乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平基本维持不变，而TY-S01干预组在此期间各SCFAs水平呈上升趋势，且始终高于正常组，表明小鼠在正常状态下连续补充TY-S01可提高肠道SCFAs水平，从而对健康产生有益的效果。
在实验周期的第15-17d，便秘组和TY-S01组小鼠开始灌胃便秘造模药物。
图7中(B)、(E)、(H)、(K)、(N)图分别为实验14-17d期间便秘组与TY-S01组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况。由图7中的(B)、(E)、(H)、(K)、(N)图可知，小鼠接受造模药物盐酸洛哌丁胺后，各组小鼠肠道SCFAs水平在第15d急剧下降，第16d、第17d便秘组小鼠乙酸水平略有上升的趋势，丙酸、异丁酸、戊酸基本维持在同一水平，丁酸则出现了一直下降的趋势，TY-S01组经过1天的适应期后，在第16d、第17dSCFAs水平均显著提高，且始终显著高于未进行TY-S01干预的组。
图7中(C)、(F)、(I)、(L)、(O)图分别为在造模期最后一天(17d)各组小鼠乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平。由图7中的(C)、(F)、(I)、(L)、(O)图可知，便秘组的乙酸、丁酸、戊酸水平显著低于正常组，而丙酸、异丁酸水平则不具有统计学差异(P<0.05)，TY-S01干预后，肠道各SCFAs水平均显著增加(P<0.05)，以上结果表明TY-S01不仅能显著提升便秘小鼠肠道SCFAs水平，也能在一定程度上增加健康正常小鼠肠道SCFAs水平，具有维持肠道健康的功效。
综合图7的小鼠实验期间肠道乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平的变化情况图可知，本发明公布的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01能够缓解盐酸洛哌丁胺诱导的小鼠便秘，且缓解的机制是通过增加便秘小鼠肠道SCFAs水平，本发明给深受便秘困扰的患者带来了福音，提供了一种无副作用的治疗理念。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表：
SEQ ID No.1乳双歧杆菌TY-S01的16S rDNA基因扩增产物的序列
Figure BDA0003422930060000081
Figure BDA0003422930060000091
Figure IDA0003422930150000011
Figure IDA0003422930150000021

Claims (7)

1.一株有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacterium lactis TY-S01)，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.21255，保藏日期为2020年11月27日。
2.根据权利要求1所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，应用于提高肠道内短链脂肪酸含量的药品或食品。
4.根据权利要求1或2所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，能改善盐酸洛哌丁胺诱导便秘的应用。
5.根据权利要求1或2所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，缩短首次排出黑便的时间，提高粪便含水量，加速肠道蠕动。
6.根据权利要求1或2所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，应用于抑制小肠绒毛损伤的药品或食品。
7.根据权利要求1或2所述的有助于缓解便秘的乳双歧杆菌TY-S01(Bifidobacteriumlactis TY-S01)，其特征在于，应用于预防或缓解便秘的药品或食品。
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