CN107893044A - 一株长双歧杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株长双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的长双歧杆菌已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15032，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的长双歧杆菌菌株具有良好的生长产酸耐酸性能和较强的粘附能力，能够显著提高便秘小鼠的粪便含水量和小肠推进率，缩短首次排黑便时间，缓解结肠粘膜的炎症，调节血清中便秘相关胃肠肽含量，其缓解便秘的效果与动物双歧杆菌BB12相当，但小肠推进率的效果却优于动物双歧杆菌BB12和酚酞。因此，本发明提供的长双歧杆菌菌株CCFM760可以被广泛的添加到各种食品或药品基质中，加以运用。

Description

一株长双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株长双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

便秘的普遍程度随着年龄的增长急剧上升，调查研究发现西方国家老年人中便秘比例为40％，养老院中高达70％；我国情况稍好，老年便秘患者占11.9％，养老院中便秘患者为45.53％。长期排便困难可诱发或加重其他疾病如痔疮、前列腺肥大、心肌梗塞或脑血管疾病等，严重者甚至可危及生命，成为一个公共卫生问题。

引发便秘的原因有遗传因素、精神心理因素、饮食因素、排便动力学异常、激素及神经递质等调节因子异常、肠道菌群失调等。然而只有少数患者(约25％)使用药物治疗，而相当大的比例转向替代疗法，如中草药、生物回馈法、益生菌等。肠道菌群对便秘的影响可以通过检查施用于便秘患者的益生菌的症状效应来评估。一些研究已经提出益生菌作为可替代的治疗剂，来避免其他治疗方式所带来的不利影响。特定益生菌在便秘患者的治疗中的治疗结果取决于多种因素，包括细菌菌株、治疗持续时间、给药形式、剂量以及宿主因素等。目前，由于缺乏数据，任何特定的益生菌是否更有效地治疗便秘仍然是不确定的。

便秘患者的粪便中主要表现为专性细菌(例如乳杆菌属、双歧杆菌属和拟杆菌属)的相对减少和潜在病原微生物(例如肠球菌、梭杆菌和大肠埃希菌)的平行增加。有研究发现老年便秘者粪便中梭杆菌、肠杆菌数呈显著性增加，双歧杆菌和类杆菌均呈非常显著性降低；成年便秘患者中双歧杆菌和乳杆菌的水平显著降低；便秘儿童的粪便中梭状芽孢杆菌属和大肠杆菌增加，而双歧杆菌减少；其中的共性是便秘患者肠道中的双歧杆菌均减少。结合年龄因素，双歧杆菌占肠道菌群的比例随年龄的增长而减少，而便秘的普遍程度随年龄的增长而增加，表明双歧杆菌这种益生菌在便秘中能够发挥一定的作用。

双歧杆菌具有多种益生功能，如：改善免疫系统紊乱导致的肠道疾病；抑制病原菌侵入肠道；清除自由基、提高宿主抗氧化酶活性、减少血清和肝脏丙二醛的含量，从而缓解机体的氧化损伤，延缓衰老；改善因肠道菌群失调引起的疾病，如便秘、腹泻等。近年来，国内外已有研究涉及双歧杆菌来缓解或治疗便秘，但主要以混菌、合生元的方式，仅用单一菌株进行研究的不多，此外，由于个体差异性和不同菌株之间的差异，双歧杆菌缓解便秘的效果还是存在一定的概率。因此，筛选以及开发新的双歧杆菌菌株用于缓解便秘具有很大的研究意义和应用价值。

目前，我国也有一些关于双歧杆菌缓解便秘的发明专利和专利申请，如：CN102845530A公开了一种有效缓解便秘的复合益生菌发酵豆乳饮，用于缓解便秘，其中涉及乳双歧杆菌。CN105079450A公开了缓解老年人阴虚型便秘的益生菌中药制剂及其制备方法和应用，用于制备食品和药物的组合物，缓解老年人阴虚型便秘，调节肠道菌群平衡，提高抵抗力，其中涉及青春双歧杆菌。CN105394773A公开了一种用于改善便秘的复合益生菌和膳食纤维制剂来预防或减轻便秘，其中涉及短双歧杆菌。CN103908585A公开了一种用于预防和治疗便秘的益生菌发酵组合物，特别是涉及中药提取物经肠道益生菌发酵，以提高和改善其预防和治疗便秘的方法，其中涉及两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。CN105997926A公开了一种双歧杆菌结肠溶软胶囊及其制备方法，用于润肠通便，解决便秘带来的痛苦，其中涉及青春双歧杆菌。CN106265876A公开了一种益生菌组合物及其在缓解或治疗便秘中的应用，最终达到缓解或治疗便秘的目的，其中涉及6种可食用的双歧杆菌。CN106264847A公开了具有润肠通便功能的酵素益生菌组合物、应用及加工制剂，有效缓解和治疗便秘，预防便秘复发其中涉及长双歧杆菌和动物双歧杆菌。CN106834187A公开了一种两歧双歧杆菌及其用途，能够预防和显著缓解便秘，涉及两歧双歧杆菌。

总的来说，目前已公开的专利或专利申请中，涉及长双歧杆菌的较少，且用于缓解或治疗便秘的方式多为混菌、合生元或与中药相结合。涉及单菌缓解便秘的只有一篇，且为两歧双歧杆菌。双歧杆菌菌株有着丰富的多样性，其中不乏潜在有开发价值的菌株，基于现状，从富含双歧杆菌的基质中分离或者筛选出具有缓解或治疗便秘功能的双歧杆菌具有非常重要的应用价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有显著缓解便秘功效的长双歧杆菌，为使用益生菌缓解和治疗便秘提供更多的选择。

本发明涉及的技术方案为：

本发明提供了一株长双歧杆菌CCFM 760，分类学命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.15032。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述组合物包含长双歧杆菌CGMCCNO.15032。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物还包含在药学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述的组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

在本发明的一种实施方式中，所述在药学上可接受的载体为填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌的用量大于1*10⁹cfu/mL。

本发明的第二个目的是提供所述的长双歧杆菌在医药或食品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述的长双歧杆菌缓解便秘。

本发明的第三个目的是提供所述的组合物在医药或食品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述的组合物缓解便秘。

所述长双歧杆菌CCFM760具有下述生物学特性：

1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动。菌体约0.5-1.3μm×1.5-8μm，外观变化不大的杆状体，其菌株的一般特征是棍棒状，单生、成对、有时呈链。

2)菌落特征：在含0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上划线培养48h后形成明显的菌落，直径在0.1-2.5mm之间，圆形，凸面，乳白色或白色，不透明，有光滑的柔软表面，不形成菌丝体。倾注法在培养基深层菌落的形态不定，大多为扁平椭圆形。

3)生长特性：该菌株最适生长温度为37℃，36-38℃生长良好。最适初始pH为6.6-7.0，在含有葡萄糖的培养液中厌氧培养生长良好，培养20h即进入对数期后期或稳定期前期，液体管呈混浊状态。

4)对人工模拟胃肠液具有较好的耐受能力。

5)粘附能力较强，能够较好的粘附在结肠癌细胞HT-29上。

7)具有较好的生长产酸能力。

8)能够显著提高便秘小鼠的粪便含水量和小肠推进率，缩短首次排黑便时间，缓解结肠粘膜的炎症，调节血清中便秘相关胃肠肽含量，其缓解便秘的效果与动物双歧杆菌BB12相当。

本发明有益效果

本发明的长双歧杆菌菌株CCFM760具有良好的生长产酸耐酸性能和较强的粘附能力，能够显著提高便秘小鼠的粪便含水量和小肠推进率，缩短首次排黑便时间，缓解结肠粘膜的炎症，调节血清中便秘相关胃肠肽含量，其缓解便秘的效果与动物双歧杆菌BB12相当，但小肠推进率的效果却优于动物双歧杆菌BB12和酚酞。因此，本发明提供的长双歧杆菌菌株CCFM760可作为缓解或治疗便秘的一种手段，且本发明提供的长双歧杆菌菌株CCFM760可以被广泛的添加到各种食品或药品基质中，加以运用。

生物材料保藏

一株长双歧杆菌CCFM 760，其分类学命名为长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum，已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15032，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为长双歧杆菌CCFM760对小鼠粪便含水量的影响；

图2为长双歧杆菌CCFM760对小鼠首次排黑便时间的影响；

图3为长双歧杆菌CCFM760对小鼠、小肠推进率的影响；

图4为长双歧杆菌CCFM760对小鼠结肠组织的影响；A为便秘模型组；B为正常对照组；C为CCFM760实验组；D为BB12对照组；E为酚酞对照组；

图5为长双歧杆菌CCFM760对HT-29细胞的粘附能力；A为CCFM760；B为BB12；C为空白对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1：长双歧杆菌CCFM 760的筛选

1)使用一次性无菌取便器采集江苏省无锡市滨湖区两岁幼女的新鲜粪便若干份，将粪便样品置于以低聚果糖为碳源的改良MRS液体试管中，于厌氧工作站(N₂:CO₂:H₂＝80:10:10)内进行双歧杆菌菌株的富集12h；

2)用无菌生理盐水进行梯度稀释，用移液器吸取100μL相应稀释度的样品涂布于含有0.02g/mL碳酸钙的改良MRS固体平板上，厌氧培养24-48h；

3)挑取有碳酸钙溶钙圈的单菌落，并且符合乳酸菌基本形态的单菌落在改良MRS固体培养基上进行划线分离，反复划线3次；

4)挑取单菌落转接液体管，培养24h后进行革兰氏染色；

5)选取革兰氏阳性菌株进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)试验；

6)选取F6PPK阳性的菌株，提取菌株基因组DNA，进行16S rDNA的PCR扩增；

7)PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳验证，将剩余产物进行测序，将测得的16SrDNA序列在NCBI核酸数据库中进行BLAST搜索与其相似性最高的序列，确定其种属。该菌已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15032，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2：长双歧杆菌CCFM760菌悬液的制备

实验方法：将活化3代后的菌液以2％的接种量接种至1L改良MRS培养基中，振荡混匀之后于37℃厌氧培养20h。于5000rpm、4℃条件下离心15分钟，弃上清，用无菌生理盐水清洗2次，以相同条件离心，用15mL无菌30％蔗糖水重悬。振荡均匀后，用平板倾注法测活菌数，于-80℃冰箱冻存1周。其中，改良MRS培养基配方为：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；MnSO₄·H₂O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K₂HPO₄·3H₂O 2.6g；吐温-801mL；L-半胱氨酸盐酸盐1g；调节pH为6.8±0.2；定容至1L。115℃，灭菌20min。

实验结果：初始活菌数为3.3±0.1×10¹⁰CFU/mL，1周后活菌数为1.3±0.2×10¹⁰CFU/mL，数量级没有变化，说明-80℃冻存对活菌数无影响，可用于动物实验。

实施例3：长双歧杆菌CCFM760对小鼠便秘的缓解作用

实验方法：以实施例1具有缓解便秘功能的CCFM760菌悬液为实验组，以动物双歧杆菌BB12和酚酞为阳性对照，分别对正常小鼠和便秘小鼠进行对比实验。通过对比各组小鼠的粪便含水量、首次排黑便时间、小肠推进率、结肠组织切片和血清中便秘相关胃肠肽含量，评价长双歧杆菌CCFM760对小鼠便秘的缓解作用。

取体重22-26g的健康BALB/c雄性小鼠25只(7周龄)，随机分为5组(正常对照组、便秘模型组、CCFM760实验组、BB12对照组、酚酞对照组)，每组小鼠均为5只。适应1周后进行实验，实验周期为15天。除正常对照组基础饲料正常喂养以外，其余4组每天灌胃0.2mL洛哌丁胺10mg/kg小鼠体重，1h后正常对照组和便秘模型组灌胃0.1mL的3％蔗糖水，CCFM760实验组灌胃0.1mL的实施例1菌悬液(10⁹CFU)，BB12对照组灌胃0.1mL的BB12菌悬液(10⁹CFU)，酚酞对照组灌胃0.1mL的70mg/kg小鼠体重的酚酞，重复14天。

第14天，收集小鼠的粪便，用于计算小鼠粪便含水量的计算，并进行首次排黑便时间的实验。

第15天，头天晚上8点左右对小鼠禁食，正常饮水。禁食12h后，灌胃0.2mL 10mg/kg小鼠体重的洛哌丁胺，1h后灌胃墨汁，进行小肠推进实验。30min后收集小鼠血清并处死小鼠，使用南京森贝伽生物科技有限公司的ELISA试剂盒检测小鼠血清中的胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、内皮素(ET)、生长抑素(SS)、P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)含量。此外，收集结肠组织进行HE染色。

实验结果：长双歧杆菌CCFM760对粪便含水量、首次排黑便时间、小肠推进率、结肠组织的影响见附图1，2，3，4；对血清中便秘相关胃肠肽含量的影响见表1。由表1可以看出，虽然各组之间的结果没有显著性差异，但相比于便秘模型组，CCFM760实验组的血清兴奋性递质SP、ET、MTL、Gas呈增加趋势，而血清抑制性递质SS、VIP呈下降趋势。与阳性菌和阳性药物相比，CCFM760实验组调节的血清水平更接近与正常水平。

表1长双歧杆菌CCFM760对血清中便秘相关胃肠肽含量的影响

实验结论：实施例1的CCFM760菌悬液能够显著提高便秘小鼠的粪便含水量和小肠推进率，缩短首次排黑便时间，缓解结肠粘膜的炎症，调节血清中便秘相关胃肠肽偏向正常水平。表明，该菌可显著促进小鼠的肠道蠕动，有效缓解便秘症状。

实施例4：长双歧杆菌CCFM760对人工模拟胃肠液的耐受能力

实验方案：将实验菌株以2％的接种量接种至改良MRS培养基中，37℃培养20h，进行平板计数，之后取菌液于3000r/min条件下离心10min，用生理盐水清洗沉淀两次后重悬至5mL pH＝3.00的人工胃液中，调节其中菌液浓度为10⁹CFU/mL左右，混合均匀之后于37℃培养，3h后取样进行平板计数，同时取1mL菌液离心，用5mL pH＝8.00的人工肠液重悬，混合均匀后于37℃培养，2、4、8h后进行平板计数。菌的存活率计算公式如下：

存活率X＝(lgN₁/lgN₀)×100％

式中N₀为原始菌液的活菌CFU数；N₁为人工胃液或肠液处理后的活菌CFU数。

实验结果：由表2可以见，长双歧杆菌CCFM760对人工模拟胃肠液具有较好的耐受性。

表2双歧杆菌对模拟胃液和小肠液的耐受性

实施例5：长双歧杆菌CCFM760对HT-29细胞的粘附能力

实验方案：于6孔培养板中每孔预先加入无菌酸洗玻璃盖玻片，用含1％抗生素和5％胎牛血清的RPMI Medium 1640basic调整HT-29细胞浓度为2×10⁵个/mL，向6孔板中每孔各加2mL，在5％CO₂和95％的空气、37℃环境培养，培养过夜，模拟的肠上皮单层细胞即可形成。用预冷的无菌PBS(pH 7.8)洗涤2次，以除去培养液中含有的抗生素。

菌株在改良MRS培养基中37℃培养20h。取1mL双歧杆菌悬浮液(10⁸CFU/mL)，加入1mL新鲜RPMI Medium 1640basic，制成2mL悬浊液。将接种的培养物在37℃，5％CO₂和95％空气中孵育2h。处理的细胞用无菌PBS(pH 7.8)洗涤2次，加入2mL甲醇，室温固定1h，弃甲醇并革兰染色，在显微镜下观察。随机选取20个不同视野中100个细胞所粘附的菌数，平均每个细胞上的粘附双歧杆菌数量为粘附指标。此外，100个细胞上细菌数目低于40说明不粘附，在40-100之间说明粘附能力较弱，大于100说明粘附能力很强。其中，新鲜RPMI Medium1640basic为不加抗生素的培养基。

实验结果：由表3及图5可以看出CCFM760的粘附能力高于BB12，而且CCFM760的粘附能力很强。

表3双歧杆菌对HT-29细胞的粘附情况

菌株	粘附指数(个)	菌株	粘附指数(个)
				CCFM760	8.9±0.4	BB12	1.5±0.6

实施例6：长双歧杆菌CCFM760对不同低聚糖的利用能力

实验方案：以等量的低聚糖代替改良MRS培养基配方中的葡萄糖，配制液体培养基，调整培养基的pH值均为6.80，之后按照2％的接种量将活化好的双歧杆菌接种到相应的培养基中，培养20h后测定菌悬液的pH值。分别以改良MRS培养基和不含糖的MRS培养基作为阳性和阴性对照。

实验结果：由表4可以看出，长双歧杆菌CCFM760对低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LS)、乳酮糖和葡萄糖的利用能力高于BB12，对牛乳低聚糖(BMOs)和低聚异麦芽糖(IOS)的利用能力低于BB12。

表4双歧杆菌对低聚糖的利用情况

*结果为pH值，以平均值±方差的形式表示

实施例6：长双歧杆菌CCFM760的生长和产酸能力

实验方案：将培养20h后的双歧杆菌液以2％的接种量至改良MRS培养基中，振荡混匀之后于37℃的恒温厌氧工作中培养20h，测定培养结束后发酵液的pH。此外，采用平板涂布的方法进行菌落计数检测该发酵液中的活菌数。pH的高低反映了双歧杆菌产酸能力的强弱，活菌数代表该菌株的最大生长量。

实验结果：由表5可以得出，CCFM760具有良好的生长和产酸能力。

表5双歧杆菌的生长产酸情况

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌CCFM760，分类学命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.15032。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含长双歧杆菌CGMCC NO.15032。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含在药学上可接受的载体。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述在药学上可接受的载体为填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

6.根据权利要求2-5任一所述的组合物，其特征在于，所述长双歧杆菌的用量大于1*10⁹cfu/mL。

7.权利要求1所述的长双歧杆菌在医药或食品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是利用权利要求1所述的长双歧杆菌缓解便秘。

9.权利要求2所述的组合物在医药或食品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是利用权利要求2所述的组合物缓解便秘。