CN112940980A - 缓解便秘的两歧双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂 - Google Patents

缓解便秘的两歧双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了缓解便秘的两歧双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂，属于微生物技术领域。本发明提供的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167能够有效缓解便秘小鼠的首粒黑便时间、肠道推进率以及粪便含水量，具有明显改善便秘表观病理指标的作用；在理化指标的检测中，两歧双歧杆菌还能够影响胃肠活性肽的含量，进而影响肠道蠕动；两歧双歧杆菌还能够有效缓解结肠组织的病理损伤，从而有效缓解便秘症状，并且与长双歧杆菌GDMCC NO:60941相比，对MTL含量有更加显著的影响，进而对小肠推进率增加的效果更为明显，更加适合针对小肠推进较弱的便秘患者。

Description

缓解便秘的两歧双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂
技术领域
本发明涉及缓解便秘的两歧双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂，属于微生物领 域。
背景技术
据不完全统计，世界范围内便秘的患病率约为20.0％，我国成年人的便秘患病率为 7.0％-20.3％。同时，亚太地区的患病率8.75％，西方国家的患病率高达27％；儿童和青少年 患病率为0.7-29.6％，老年人患病率为15-50％。由此可以见得，便秘不仅仅是一种患病率高 的疾病，波及的范围还极其广泛。
随着饮食结构变化及生活节奏的改变，便秘患者的数量越来越多，虽然便秘不会直接威 胁人们的生命安全，但是这种疾病所带来的危害却是不容忽视的。具体体现在：便秘可以加 重原有的消化道症状，如消化功能进一步紊乱、导致和加重肛门直肠疾病，长期便秘可能导 致结肠恶性肿瘤；便秘患者用力排便可诱发心脑血管事件；部分肠道内代谢产物可影响大脑 功能；便秘患者生活质量明显下降，并且患者可能出现情绪障碍。
根据罗马Ⅳ标准，便秘患者的判断标准：至少25％的排便感到费力；至少25％的排便为 干球状便或硬便；至少25％的排便有肛门直肠阻塞感或梗阻感；至少25％的排便需要手法帮 助(如用手指助便、盆底支持)；便次<3次/周；在不使用泻药时很少出现稀便等现象。
便秘的病因机制可能是多因素的，例如部分药物治疗的副作用，本身生活的不规律、不 健康，或是由炎症、分泌功能障碍、胃肠道运动障碍和胃肠道神经支配改变等多种原因共同 作用，从而使肠道组织发生病理损伤，减缓肠道蠕动，或是肠道对粪便中水分的重吸收有所 增加，使粪便的排泄时间与排便频率得到很大程度的改变。
正是由于便秘这种疾病的多种特点，疾病的治疗越来越得到众多的关注。其中治疗的手 段包括食物中多添加富含膳食纤维的食物，增加自己的运动量，改善不良作息，症状严重者 可以使用渗透性或刺激性泻药，如聚乙二醇、乳果糖或蒽醌衍生物等，但是这类泻药常会引 起依赖性，甚至恶心、腹痛、腹泻等副作用。现阶段，利用益生菌来缓解便秘是一种新兴的、 效果良好且副作用较小的一种方法，但其具体的缓解机制等还需要得到更深入的研究。
虽然有研究人员通过qPCR法检测便秘患者粪便标本及结肠黏膜菌群后发现，便秘患者 结肠黏膜及粪便标本中双歧杆菌属水平较正常人群相比均降低，同时粪便标本中乳酸杆菌属 比例也有所减少(参见钟方红等，“中药对高尿酸血症患者肠道菌群影响的研究进展”)，但是 具体采用何种双歧杆菌能够有效的缓解便秘，还需要研究。
而目前大多是采用双歧杆菌三联或者四联活菌来治疗便秘，双歧杆菌三联或者四联活菌 是一种混菌益生菌，需要多种益生菌共同作用。
目前，针对双歧杆菌相关的生理特性与功能特性等研究已有国内外的学者正在进行，但 仍旧存在一些不清晰的途径与机制，需要继续探究下去。无论是将其直接食用还是制成其他 功能性食品，都有非常大的应用前景，不仅能够预防便秘疾病的发生还能缓解便秘的症状， 还能调节肠道菌群的组成。通过对双歧杆菌缓解便秘进行研究，将会对食品科学、微生物学 以及预防医学等各方面产生巨大的影响，由于现有技术所面临的具有缓解便秘作用的双歧杆 菌功能单一且部分功能较不突出，因此，需要进行双歧杆菌对便秘缓解作用的研究。
发明内容
技术问题
本发明要解决的技术问题是，提供一株主要针对胃肠活性肽、微生物的代谢产物及相关 受体表达从而能够有效缓解便秘的两歧双歧杆菌，比酚酞药物改善粪便含水量、小肠推进率、 MTL、SS等的效果更为显著，并且提供该菌株的应用。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)，能 够显著提高粪便含水量与肠道推进作用，甚至粪便含水量比对照组提高12.45％，首粒黑便时 间减少了1.32％，该菌株与GDMCC NO：60941相比(与模型组进行归一化后)，胃动素的含 量增加28.63％，小肠推进率增加71.0％，提供相应益生菌制剂、发酵食品以及功能性食品， 从而预防便秘，或使便秘患者能逐步摆脱药物治疗的副作用与局限性。
本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，所述两歧双歧杆菌于2021年 1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号 楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：61482。
所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)是从一女性的粪便中分离筛选出的，该菌株经 测序分析，将测序得到的序列在NCBI Standard Nucleotide BLAST中进行核酸序列比对，结 果显示与双歧杆菌属的核酸序列相似度为100％；结果显示菌株为两歧双歧杆菌，将其命名为 两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167。
在本发明的一种实施方式中，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167具 有下述生物学特性：
(1)菌体特征：为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌，菌体约0.5-1.3μm×1.5-8μm，多形性 明显。
(2)菌落特征：在含0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上划线培养48h后形成明显 的菌落，直径在0.2-2.5mm之间，圆形，凸面或透镜状，微白，不透明，有平滑至粘液状的柔软表面，不形成菌丝体。
(3)生长特性：该菌株最适生长温度为36-38℃，32-38℃生长良好，但是能够在45℃ 下进行生长，成活率高。最适初始pH为6-7，pH 5.5或以下生长较少。在含有葡萄糖的培养 液中厌氧培养生长良好，培养20h即进入对数期后期或稳定期前期，液体管混浊，最终pH为4.0-4.8。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。
(5)具有粘附性，能够较好的粘附在结肠癌细胞HT-29上。
(6)能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、降低首粒黑便时间以及增加小肠推进率，其中， 与对照组相比，粪便含水量提高12.45％，首粒黑便时间减少1.32％，有效恢复至健康水平。 还能够促进微生物代谢产物的生成，将盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸的含量分别显著提高 了65.1％、88.97％、62.9％。同时，调节血清中兴奋型与抑制型胃肠活性肽的含量，作用于结 肠组织相关蛋白或受体来缓解便秘，且效果良好。
(7)与经过归一化的GDMCC NO.60941相比，胃动素的含量能够增加23.40％，小肠推 进率能够显著增加70.95％。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂含有所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167的湿菌体或冻干后的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167在 微生物菌剂中的添加量不低于1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
本发明还提供了一种可缓解便秘的产品，所述产品中含有两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167，或上述微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为通过所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) CCFM1167或含有微生物制剂发酵制备得到的发酵食品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括固态发酵食品、液态发酵食品、半固态 发酵食品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述乳制品包括发酵乳制品、含乳饮料以及乳粉；所述豆 制品包括豆奶、豆乳饮料、豆乳粉；所述果蔬制品包括甜菜、白菜、胡萝卜、白萝卜、海带、 黄瓜、黄桃、荔枝、杨梅制品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum) CCFM1167、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润 湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸 剂或口服液。
本发明还提供了上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167，或上述微生物菌 剂在制备含有缓解便秘的产品中的应用。
本发明还提供了上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167，或上述微生物菌 剂在制备具有如下至少一种功能的药物或功能性食品中的应用：
(a)促进肠道蠕动，显著提高粪便含水量；
(b)下调血清中生长抑素、上调血清中胃动素、上调结肠组织中干细胞因子受体、下调 药品结肠组织中水通道蛋白的基因表达；
(c)显著增加盲肠内容物中短链脂肪酸的含量；
(d)显著提高双歧杆菌属的丰度。
本发明还提供了一种益生菌制剂，所述菌剂包含≥108CFU/g的活性两歧双歧杆菌CCFM1167，主要为将含有两歧双歧杆菌CCFM1167的菌液冷冻干燥所得。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌制剂制备方法包括，将培育在含0.08％L-半胱 氨酸盐酸盐的MRS培养基中的两歧双歧杆菌CCFM1167，以接种量2％(v/v)于同样培养基 中活化后，用pH为6.8～7.2磷酸盐缓冲液清洗2次，使用冻干保护剂进行重悬，其菌液浓度 大于1010CFU/mL，于37℃厌氧条件下预培养50～70min，再在-15～(-20)℃预冻8～14h，真空 冷冻干燥制得。
在本发明的一种实施方式中，使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L～150g/L脱 脂奶粉、20g/L蔗糖、20g/L海藻糖、余量为水，经过巴氏杀菌后所得。
有益效果
(1)本发明的两歧双歧杆菌GDMCC No：61482活力较好，且具有一定的耐酸碱性与粘 附性，能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、降低首粒黑便时间以及增加小肠推进率，将便秘 小鼠粪便含水量提高至对照小鼠的12.45％，首粒黑便时间比对照组减少1.32％，有效改善便 秘症状，达到治疗便秘的最终目的。同时，上调血清中胃动素(MTL)，下调血清中生长抑素 (SS)，将SS的含量有效恢复至健康水平，略低于对照小鼠8.15％，显著提高盲肠内容物中 乙酸、丙酸、丁酸的含量，下调结肠组织中水通道蛋白8(AQP8)的基因表达，上调结肠组 织中干细胞因子受体(C-kit)的基因表达，显著增加粪便中双歧杆菌属的丰度。此外，两歧 双歧杆菌GDMCC No：61482比酚酞药物改善粪便含水量、小肠推进率、MTL、SS等的效果 更为显著。
(2)两歧双歧杆菌GDMCC No：61482与GDMCC NO:60941相比，能够明显增加MTL 的含量以及小肠推进率，不仅能够增加缓解便秘的效果，并且可以避免一些泻药存在的副作用，因此，本发明可以视为一种缓解或治疗便秘的药物，还可以应用于药品或者是一些发酵食品中，从而广泛发挥其作用，具有非常有价值的应用前景。
生物材料保藏
一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167，其分类学命名为Bifidobacterium bifidum，已于2021年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No： 61482，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
一株长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CCFM1114，其分类学命名 为Bifidobacterium longum subsp.longum，已于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保 藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60941，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5 楼广东省微生物研究所。
附图说明
图1：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株对用洛哌丁胺诱导产生便秘 的小鼠缓解便秘相关指标(排首粒黑便时间、粪便含水量、小肠推进率)的示意图。
图2：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠血清中生长抑素(SS)含量变化示意图。
图3：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠血清中胃动素(MTL)含量变化示意图。
图4：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠结肠中干细胞因子受体(C-KIT)表达量变化示意图。
图5：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠结肠中水通道蛋白8(AQP8)表达量变化示意图。
图6：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量变化示意图。
图7：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠结肠组织的H&E染色示意图。
图8：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘 的小鼠粪便中双歧杆菌属丰度的变化示意图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO4·7H2O 0.1g；MnSO4·H2O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K2HPO4·3H2O 2.6g；吐温80 1mL；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g；调节pH为6.8±0.2；定容至1L。高压灭菌115℃20min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2％琼脂粉。
MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基：在MRS液体培养基的基础上 添加0.08％半胱氨酸盐酸盐。
下述实施例中所涉及的两歧双歧杆菌菌悬液的制备
将两歧双歧杆菌划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落， 将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；
将活化3代后的菌液以2％(v/v)的接种量接种至1L MRS液体培养基中，振荡混匀后 于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心， 去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得灌胃前备用菌液，-80℃冰箱冻存一周。
在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌液取出，以6000r/min离心5min，再用无菌生理 盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的 活菌数量。
实验结果：初始活菌数为6.8×109cfu/mL，1周后活菌数为3.7×109cfu/mL，数量级并没 有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
下述实施例中所涉及的C-KIT的表达量的检测方法如下：
用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定这种受体C-KIT的表达量，首先去要从 新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反 复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL 无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静 置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离 心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制 的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发 干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA 浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维 世纪公司的HiFiScript gDNA RemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合 成cDNA，-20℃下保存。
小鼠C-KIT基因和内参基因mGAPDH基因引物如表1所示：
表1小鼠C-KIT基因和mGAPDH基因引物序列
Figure BDA0002990817920000071
qRT-PCR反应体系及条件：
用
Figure BDA0002990817920000072
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0002990817920000073
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃30s；95℃10s，60℃30s，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。
下述实施例中所涉及的AQP8的表达量的检测方法如下：
采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定介导肠道分泌的AQP8的表达量，首 先去要从新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反 复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL 无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静 置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离 心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制 的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发 干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA 浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维 世纪公司的HiFiScript gDNA RemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合 成cDNA，-20℃下保存。
小鼠AQP8基因和内参基因mGAPDH基因引物如表2所示：
表2小鼠AQP8基因和mGAPDH基因引物序列
Figure BDA0002990817920000081
qRT-PCR反应体系及条件：
用
Figure BDA0002990817920000082
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0002990817920000083
AQP8基因qRT-PCR反应条件为：
95℃30s；95℃10S，60℃30S，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。
下述实施例中所涉及的盲肠内容物中短链脂肪酸的浓度的检测方法如下：
将实验结束前所收集的盲肠内容进行冷冻干燥，计算出盲肠内容物的干重，并冻存于 -80℃。具体方法如下：
称取20mg盲肠内容物，用500μL饱和NaCL溶液重悬，加入20μL 10％H2SO4溶液；加入1000μL无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后12000rpm 4℃离心15min；取上层乙醚 相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置30min后12000rpm 4℃离心5min取上层乙醚相， 利用GC-MS测定小鼠冻干盲肠内容物中的短链脂肪酸含量。使用Rtx-Wax柱(柱长30m， 内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL,按7.5℃/min升温至140℃，然后 按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标 法测得标准曲线，从而计算出各种短链脂肪酸的浓度。
下述实施例中所涉及的粪便中双歧杆菌属的丰度的检测方法如下：
从-80℃冰箱中取出小鼠粪便200mg，按照Fast DNA Spin Kit for Feces(MPBiomedicals, catalog No.6570200)试剂盒的相关说明书进行提取，从而获得宏基因组DNA，并将所得的 DNA进行PCR。
50μL的PCR的体系为：2Taq Plus MasterMix(Dye)25μL，上游引物(10μmoL/L)1μL，下游引物(10μmoL/L)1μL，cDNA模板1μL，ddH2O 22μL；
PCR反应条件为：
95℃5min；95℃30s,52℃30s，72℃30s,共40个循环；72℃7min；12℃5min。
PCR后，于4％核酸染料，1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，将所得的条带分装于2ml的EP 管中，使用DNA Gel/PCR Purification Miniprep Kit(Biomiga,BW-DC3511-01)按照相关说明 进行纯化回收。通过NanoDrop测定所提取的DNA浓度，将样品进行等浓度混样，并建立相 应文库用MiSeq测序器测序(Illumina,Santiago,CA,USA)。
实施例1：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167的获得
具体步骤如下：
1、双歧杆菌菌株的分离筛选：
(1)使用一次性无菌取便器采集一女性的粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+质 量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基中，于厌氧培养箱(N2:CO2:H2＝80:10:10) 中富集12h；
(2)将粪便样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于添加了无菌的100μg/mL莫匹罗 星、50U/mL制霉菌素的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)L-半胱氨酸盐酸盐的固体平板上， 培养24-48h；
(3)选取符合双歧杆菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出双歧杆菌所选 菌株；
(4)将上述单菌落培养于液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养液中培 养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏两歧双歧杆阳性菌进行后续试验。
2、双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(1)将步骤1所筛选得到的双歧杆菌乳酸菌在液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％) 半胱氨酸培养基中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度 为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200μL 15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCl；
(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。
3、双歧杆菌的分子生物学鉴定
(1)取步骤2筛选出并且活化3代的菌体(培养12-48h)1mL用于菌种鉴定，6000r/min 离心3min，弃上清得菌体。
(2)加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板。
(3)16S rDNA PCR体系：
A.细菌16S rDNA，20μLPCR反应体系：
27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，1μL；模板，1μL；ddH20，8μL。
B.PCR条件：
94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃2min；72℃10min；step2-4 30×；12℃2min。
(4)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×Loading buffer混合，上样量2μL， 120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(5)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，并将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，将其命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167，-80℃保藏备用。
实施例2：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167对洛哌丁胺诱导产生便秘 相关症状的缓解
具体步骤如下：
(1)两歧双歧杆菌CCFM1167菌悬液的制备
将两歧双歧杆菌CCFM1167菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS固体培养基中，37℃ 培养48h，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃培养24h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培 养24h，按照同样的方式再次培养一代，制备得到两歧双歧杆菌CCFM1167发酵液；
然后将制备得到两歧双歧杆菌CCFM1167发酵液在6000r/min、4℃条件下离心5min， 然后用质量体积比为10％的脱脂乳进行重悬，制得菌悬液，用于动物实验。
(2)取6周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠25只，适应环境1周，随机分为5组：对照组、模型组、酚酞组(治疗组)、两歧双歧杆菌组CCFM668(该菌株公开于“Bifidobacteria exertspecies-specific effects on constipation in BALB/c mice.Food&Function,2017, 8(10):3587-3600”的文章中)、两歧双歧杆菌干预组CCFM1167，每组含小鼠5只，灌胃菌悬 液的剂量为5×109CFU/mL，每天早上9点开始灌胃，每次0.2mL。
实验动物分组及处理方法见表3：
表3实验动物分组
Figure BDA0002990817920000111
Figure BDA0002990817920000121
在第38天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿 重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重。
在第39天，空白对照组给予0.2mL生理盐水、模型组、酚酞组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，1h后，分别向每组灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间。
第39天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第40天上午9点空白对照组给予0.2mL生理盐水， 模型组、酚酞组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，各组 分别灌胃墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100粪便含水量、排首 粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图1所示，由图1可知，两歧双歧杆菌CCFM1167组相对于便秘模型组，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167后能显著提高小肠推进率、提高粪便含水量，其中灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167后小肠推进率可达90.25％，比便秘模型组提高了190.10％ (P<0.0001)，粪便含水量可达65.4％，比便秘模型组提高了36.59％(P<0.0001)；灌胃两歧 双歧杆菌CCFM1167后在一定程度上缩短排首粒黑便时间(为134.8min)，比便秘模型组缩 短了29.72％(P＝0.0011)。同时，两歧双歧杆菌CCFM1167干预后，粪便含水量比对照组还 提高了12.45％，小肠推进率只与对照组相差7.76％，首粒黑便时间比对照组还减少了1.32％， 同时与酚酞组(粪便含水量53.84％，小肠推进率44.47％，首粒黑便时间189min)相比，粪 便含水量提高了21.47％，小肠推进率提高了102.95％，首粒黑便时间降低了28.68％，表明两 歧双歧杆菌CCFM1167的效果明显优于酚酞药物。因此，两歧双歧杆菌CCFM1167能够很好 地将便秘小鼠恢复至健康水平，具有优良的治疗效果。
其中小肠推进率与首粒黑便时间这两项指标都明显优于两歧双歧杆菌CCFM668，但粪便 含水量与CCFM668相近(P<0.0001)，都对肠道水分分泌与吸收有很好的作用效果。综上， 两歧双歧杆菌CCFM1167能够具有一定缓解便秘的效果。
实施例3：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167降低便秘小鼠血清中生长 抑素(SS)的含量
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)第40天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用生长抑素(SS)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中SS 的浓度。
有研究表明生长抑素能够抑制胃肠运动以及消化道激素的分泌。
实验结果如图2所示，模型组(生长抑素SS的含量为6.410ng/L)较对照组有上升趋势 (P＝0.0330)，而两歧双歧杆菌CCFM1167组(生长抑素SS的含量为5.266ng/L)相比于模型 组，两歧双歧杆菌CCFM1167能显著下调便秘小鼠血清SS的含量(P＝0.0009)，使之下降约 1.144ng/L，SS的含量降低了17.85％。与对照组相比，两歧双歧杆菌CCFM1167略低于8.15％， 已接近正常小鼠水平，具有良好的治疗效果。此外，与酚酞组(生长抑素SS的含量为6.106ng/L) 相比，两歧双歧杆菌CCFM1167显著下调13.76％。由实验结果可知，两歧双歧杆菌CCFM1167 能通过下调血清中SS的含量加速胃肠道动力，降低对其他一些消化道激素分泌的抑制作用， 从而缓解肠道蠕动减慢的症状。
实施例4：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167提高便秘小鼠血清中胃动 素(MTL)的含量
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。
(2)第40天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清， 采用小鼠胃动素MTL检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中MTL的浓 度。
实验结果如图3所示，从图3中可以看出，模型组(小鼠血清中MTL的含量为219.4ng/L) 比对照组的小鼠血清中MTL的含量显著降低(P＝0.0002)，降低了46.44％，而灌胃两歧双歧杆 菌CCFM1167(小鼠血清中MTL的含量为299.6ng/L)能够显著增加便秘小鼠血清中MTL的含 量(P＝0.0020)，相对于模型组提高了36.55％。此外，两歧双歧杆菌CCFM1167与酚酞组(小 鼠血清中MTL的含量为225.6ng/L)相比，显著提高32.80％。
从文献中可知，胃动素(MTL)能够增强结肠的压力和电活动，促进胃肠内容物的推进 作用，是一种重要的兴奋型胃肠活性肽。这说明两歧双歧杆菌CCFM1167可以通过增加血清 中MTL的含量来刺激结肠的电位活动以及胃肠蠕动的。
实施例5：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167增加便秘小鼠结肠组织中 干细胞因子受体(C-KIT)表达量
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
Cajal间质细胞是结肠上控制慢波运动的起搏器细胞，而它的形成与发育离不开C-KIT的 作用，因此检测C-KIT基因(干细胞因子受体)的表达对于判断肠道平滑肌的收缩情况是很 好的依据。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定这种受体C-KIT的表达量。
实验结果如图4所示，由图4可知，使用洛哌丁胺进行造模后，模型组小鼠的C-KIT相对 表达量(相对表达量为0.8311)与空白小鼠相比显著降低了1.033倍(P＝0.1050)，这表明便秘 小鼠结肠部分平滑肌的慢波活动有所抑制，从而使肠道蠕动减慢。
而灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167后，肠道中C-KIT基因的表达量(相对表达量为3.826) 比便秘小鼠明显增加了3.604倍，相比于模型组提高了360.4％(P<0.0001)，相比于酚酞组(相 对表达量为0.8455)提高了352.51％。这表明两歧双歧杆菌CCFM1167可以通过作用于相应的 C-KIT来调节肠道平滑肌收缩，从而缓解便秘症状。
实施例6：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167提高便秘小鼠结肠组织中 水通道蛋白8(AQP8)表达量
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
水通道蛋白(AQP)是指一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，其中，AQP8 主要参与空肠和结肠大量水分子的转运，AQP8表达的异常会导致水分的过度吸收及肠液分泌 的减少。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定介导肠道分泌的AQP8的表达量。
实验结果如图5所示，由图5可知，灌胃洛哌丁胺后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的 AQP8相对表达量(相对表达量为1.256)显著上升4.09倍，模型组与对照组相比，增加了409.3％ (P＝0.0001)，说明便秘模型小鼠结肠中AQP8表达量的增加使结肠部分对粪便水分的吸收有 明显增加，导致粪便含水量存在明显下降。
但灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167的小鼠，其肠道中AQP8基因相对表达量(相对表达量为 0.3060)较模型组降低了3.105倍，与模型组相比，降低了310.5％(P＝0.0002)。同时，与酚酞 组相比(相对表达量为0.9559)，降低了67.99％。
结果表明两歧双歧杆菌CCFM1167能够通过降低结肠组织中AQP8的表达量来减少结肠 对粪便中水分的过度吸收。从表观指标上看，粪便含水量有明显的上升，从而避免粪便硬结， 缓解便秘症状。
实施例7：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167提高便秘小鼠盲肠内容物 中短链脂肪酸含量
具体步骤如下：
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
将实验结束前所收集的盲肠内容进行冷冻干燥，计算出盲肠内容物的干重，并冻存于 -80℃。计算出盲肠内容物中各种短链脂肪酸的浓度。
实验结果如图6所示，用洛哌丁胺造模后，模型组小鼠盲肠内容物中乙酸、丁酸与丙酸的 含量(分别为73.79μmol/g、15.59μmol/g、17.74μmol/g)都有一定程度的降低，相对于对照组 分别降低了40.49％、29.80％、26.14％(P乙酸＝0.0006,P丁酸＝0.0806，P丙酸＝0.0370)。其中，最为明 显的是乙酸的含量，与对照组相比含量降低了50.21μmol/g(P＝0.0023)。便秘模型组小鼠乙酸、 丁酸、丙酸含量显著低于空白对照组。酚酞组中乙酸含量为69.10μmol/g，丁酸含量为17.83 μmol/g，丙酸含量为16.97μmol/g，只有丁酸含量比模型组提高了14.37％(P乙酸＝0.7094，P丁酸＝0.5404，P丙酸＝0.7855)。
而灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167后，小鼠盲肠内容物中乙酸、丁酸与丙酸的含量(分别 为121.8μmol/g、29.46μmol/g、28.9μmol/g)都有上升(P乙酸＝0.0010,P丁酸＝0.0010，P丙酸＝0.0008)， 分别较模型组显著提高了65.1％、88.97％、62.9％，分别较酚酞组提高了76.27％、65.23％、 70.30％，并且明显高于两歧双歧杆菌CCFM668组，与两歧双歧杆菌CCFM668组相比，分别提 高了72.20％、70.50％，并向空白对照组的含量靠拢。
乙酸、丁酸与丙酸这些短链脂肪酸能够降低肠道pH值，促进肠道中钙镁离子的吸收，抑 制有害菌的侵染，刺激肠道蠕动。因此，两歧双歧杆菌CCFM1167的干预对盲肠内容物中SCFA 的增加有显著效果，能够通过增加乙酸、丙酸、戊酸这几种短链脂肪酸的含量来缓解便秘。
实施例8：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167降低便秘所导致的结肠组 织病理损伤
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)小鼠解剖后取新鲜组织放入多聚甲醛固定液，浸泡后，过夜冲洗。将样品依次经70％、 80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min进行脱水。放 入1/2纯酒精，1/2二甲苯等量混合液15min，二甲苯前洗液15min、二甲苯后洗液15min至透明 为止。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟来除 去透明剂。将处理好的样品进行包埋切片、展片、烤片、H&E染色与封片。
观察小鼠结肠组织的病理切片，如图7所示，模型组与对照组相比，模型组小鼠的结肠 组织存在黏液层变薄，隐窝结构缩短，杯状细胞减少，并且存在炎症浸润的现象。酚酞药物 与CCFM668也从一定程度上改善了便秘所导致的黏液层变薄的情况，但是灌胃两歧双歧杆 菌CCFM1167后，小鼠结肠组织中的病理情况出现了更明显的改善，具体表现为组织黏液层 变厚，杯状细胞的界限清晰明了，同时平滑肌结构也较为完整。从结果中可以看出，两歧双 歧杆菌CCFM1167能够缓解便秘所导致的结肠病理损伤。
实施例9：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167提高显著小鼠粪便中双歧 杆菌属的丰度
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)将下机数据进行分析后，如图8所示，模型组与酚酞组小鼠粪便中几乎不存在双歧 杆菌属，而对照组则存在一些双歧杆菌属，其丰度为0.3873％(P＝0.1919)。
灌胃两歧双歧杆菌CCFM668与CCFM1167后，双歧杆菌属的丰度有明显增加，两者双歧杆菌属的丰度分别为0.7324％与1.866％，其中，两歧双歧杆菌CCFM1167增长的最为显著(PCCFM668＝0.0186，PCCFM1167<0.0001)。因此，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1167后，对于粪便中 双歧杆菌属丰度的增加有很好的效果，能够通过弥补便秘小鼠所缺失的双歧杆菌属来调节肠道菌群，维持肠道菌群的稳态，从而缓解便秘。
实施例10：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1167能够比GDMCCNO.60941 更好地增加血清中MTL的含量，且对小肠蠕动的推进作用更为显著
将动物实验中CCFM1167与GDMCC NO:60941的结果与其模型组进行归一化后进行比 较(造模及动物处理方法同实施例2，且MTL与小肠推进率的测定方法完全相同)，结果如表4所示：
表4 CCFM1167与GDMCC NO:60941的结果比较
Figure BDA0002990817920000161
从结果可以看出，两歧双歧杆菌CCFM1167比GDMCC NO:60941更能显著提高血清中MTL的含量，发挥出MTL对胃的消化收缩与肠道运输的作用，从而能够更加显著地提高小 肠推进率，有效缓解便秘。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于，所述两歧双歧杆菌于2021年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61482。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的两歧双歧杆菌。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述两歧双歧杆菌在微生物菌剂中的添加量不低于1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
4.如权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
5.一种可缓解便秘的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的两歧双歧杆菌，或权利要求2～4任一所述的微生物制剂。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为食品或药品。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述食品为通过所述两歧双歧杆菌或含有微生物制剂发酵制备得到的发酵食品，包括固态发酵食品、液态发酵食品、半固态发酵食品；优选的，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品；优选的，所述乳制品包括发酵乳制品、含乳饮料以及乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳饮料、豆乳粉；所述果蔬制品包括甜菜、白菜、胡萝卜、白萝卜、海带、黄瓜、黄桃、荔枝、杨梅制品。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述两歧双歧杆菌、药物载体和/或药用辅料。
9.权利要求1所述的两歧双歧杆菌或权利要求2～4任一所述的微生物菌剂在制备含有缓解便秘的产品中的应用。
10.权利要求1所述的两歧双歧杆菌或权利要求2～4任一所述的微生物菌剂在制备具有如下至少一种功能的药物或功能性食品中的应用：
(a)促进肠道蠕动，提高粪便含水量；
(b)下调血清中生长抑素、上调血清中胃动素、上调结肠组织中干细胞因子受体、下调药品结肠组织中水通道蛋白的基因表达；
(c)增加盲肠内容物中短链脂肪酸的含量；
(d)显著提高双歧杆菌属的丰度。
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