CN115895952A - 一株缓解便秘的动物双歧杆菌乳酸亚种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株缓解便秘的动物双歧杆菌乳酸亚种及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选出了一株动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278，此动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278具有便秘的作用，具体体现在：缓解便秘个体的粪便含水量、小肠推进率、首粒黑便时间；显著降低便秘个体血清中生长抑素的含量，增加胃泌素和水通道蛋白3含量；显著提高便秘个体结肠中水通道蛋白3和水通道蛋白8的表达；显著提高粪便中短链脂肪酸的含量，降低便秘个体粪便中Bilophila、Akkermansia的相对丰度。

Description

一株缓解便秘的动物双歧杆菌乳酸亚种及其应用

技术领域

本发明涉及一株缓解便秘的动物双歧杆菌乳酸亚种及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

便秘是一类常见的胃肠道疾病，其临床症状主要表现为：排便困难，存在排便不完全或阻塞感，在不使用泻剂的前提下，每周自发排便次数少于3次，粪便干硬等。目前，全球便秘疾病的患病率大概为14％，许多儿童与青少年也同样面临着便秘的风险。随着年龄的增长，患病率不断上升，老年人的患病率甚至高达20％。此外，便秘的发生还与性别相关，女性的患病率能够达到男性的2倍。因此，针对这种患病率高、波及人群较广的疾病，其预防与治疗仍旧需要重点关注。

便秘的诱因有很多，其中常见的因素主要包括：饮食与生活方式不当，长期食用干燥或深加工的食物，饮食中缺乏膳食纤维，生活中缺乏锻炼，没有形成良好的排便习惯；一些内分泌或代谢性疾病发病时所引起的并发症；药物副作用，比如非甾体类抗炎药、阿片类药物等镇痛药，钙通道阻滞剂等降压药，抗抑郁药物等可能会引起排便异常；长期高压引起的焦虑、抑郁等心理特征与特定行为障碍的出现，这与便秘的发展息息相关。根据发病原因不同，便秘可以分为继发性便秘和功能性便秘两类。继发性便秘主要是由各种代谢性和内分泌疾病引起的，如甲状腺功能减低、卟啉病、糖尿病等能够影响平滑肌功能的疾病。功能性便秘根据病理生理学机制又可以分为慢传输型便秘、出口梗阻型便秘和混合型便秘。

根据罗马Ⅳ标准，便秘患者的判断标准：至少25％的排便感到费力；至少25％的排便为干球状便或硬便；至少25％的排便有肛门直肠阻塞感或梗阻感；至少25％的排便需要手法帮助(如用手指助便、盆底支持)；便次<3次/周；在不使用泻药时很少出现稀便等现象。因此，针对便秘的不同表现，所采取的解决办法也会存在差异，比如展开保守治疗，改变行为及个人习惯。可以通过调整膳食结构，形成良好的生活习惯，培养正常的肠道习惯等方法改善便秘症状；也可以使用粪便软化剂、刺激性泻剂、渗透性泻剂和膨胀剂等药物，泻剂短期内使用十分有效，但长期使用可能会导致耐药性增加与作用效果减弱。而泻剂的副作用也是困扰患者的一大问题，例如腹部绞痛，胀气，电解质紊乱甚至是病情加重；较为严重者可以进行手术切除病变部位。因此，通过使用益生菌来缓解便秘的方法将会是一种可优先采取并且副作用较低的重要手段。

相较于其他益生菌，双歧杆菌可以显著增进便秘病患的排便频率、减少肠道转运时间以及软化粪便形态。随着年龄的增长，人体肠道内双歧杆菌比例降低的同时便秘的普遍程度反而增加。因此，双歧杆菌的丰度变化与便秘的发生可能存在一定的联系。而目前大多是采用双歧杆菌三联或者四联活菌等混菌益生菌共同作用来治疗便秘。

综合分析目前的研究应用现状，用于缓解便秘的双歧杆菌菌株还不够丰富，为应对个体、地域和便秘类型的差异，筛选出更多具有缓解便秘功效的双歧杆菌菌株十分必要。

发明内容

本发明经过动物实验体内研究获得一株具备预防便秘的动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CCFM1278，其具备提高粪便含水量与小肠推进率、加快首粒黑便时间、促进肠道蠕动并对胃肠调节肽和短链脂肪酸有调节作用。

本发明提供了一株动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CCFM1278，该菌株已于2022年9月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:62795。

本发明还提供了含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的组合物。

在一种实施方式中，所述组合物为食品、保健品或药物。

在一种实施方式中，所述组合物中动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的含量≥1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

本发明还提供含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的发酵剂。

在一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为：将所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。

在一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。

本发明还提供所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在制备预防和/或治疗便秘的药物中的应用。

在一种实施方式中，所述药物中动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的活菌数为不低于1×10⁹CFU/g。

在一种实施方式中，所述药物含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278、药物载体和/或药用辅料。

本发明还提供所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在制备有助于润肠通便的功能性食品或保健品中的应用。

在一种实施方式中，所述食品包括含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的保健食品。

在一种实施方式中，所述食品包括使用含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗便秘的药物，所述药物含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278。

在一种实施方式中，所述药物含有上述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278、药物载体和/或药用辅料。

本发明还提供动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在食品添加剂中的用途，特别地，所述用途是作为食品发酵剂。

有益效果：

(1)本发明证实动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278能够有效改善小鼠粪便含水量、首粒黑便时间、小肠推进率等症状，促进肠道蠕动并对胃肠调节肽和短链脂肪酸有调节作用，同时调节肠道菌群，表现出对便秘更好的治疗或预防效果，因此可以制备用于预防和治疗便秘的药物，或制备有助于润肠通便的益生菌食品、保健品，具有非常广泛的应用前景。

(2)动物双歧杆菌乳酸亚种是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278不会给便秘患者带来任何潜在的安全隐患。

(3)动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，与造价昂贵的生物制剂相比，不会对便秘患者带来太大的经济负担。

生物材料保藏

动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CCFM1278，分类命名为Bifidobacterium animalis subsp.Lactis，已于2022年9月15日广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:62795。

附图说明

图1为各组小鼠造模期间粪便含水量、小肠推进率、首粒黑便时间。

图2为各组对胃肠调节肽的影响；其中，A：生长抑素含量；B：血清胃泌素含量；C：血清水通道蛋白3含量。

图3为各组小鼠水通道蛋白8的表达水平。

图4为各组小鼠水通道蛋白3的表达水平。

图5为各组小鼠水通道蛋白4的表达水平。

图6为各组小鼠结肠中乙酸含量。

图7为各组小鼠结肠中丙酸含量。

图8为各组小鼠结肠中丁酸含量。

图9为各组小鼠粪便中差异菌属Bilophila、Akkermansia的示意图。

具体实施方式

本发明涉及以下培养基：

mMRS液体培养基是含0.05g/100mL半胱氨酸的MRS培养基，组分为：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温80 1mL与0.5g半胱氨酸，加水至1000mL。

mMRS固体培养基是在以上基础添加以液体培养基总重计1.5％琼脂得到的。

实施例1：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的筛选及菌种鉴定

1、筛选

来源于安徽芜湖地区的健康老人粪便样本保存于30％的甘油中放置在-80℃冰箱。将样本取出低温解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05g/100mL半胱氨酸的0.9g/100mL生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05g/100mL半胱氨酸的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含0.05g/100mL半胱氨酸)中进行培养，将培养得到的菌体于30％的甘油中保存，得到菌株CCFM1278。

2、鉴定

提取CCFM1278的基因组，将CCFM1278的16S rDNA进行扩增和测序(由华大基因科技有限公司进行，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌乳酸亚种，命名为动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278。

3、基因组草图信息

提取CCFM1278的基因组，在IlluminaHiseq测序平台进行基因组序列测序，得到全基因组草图原始数据。动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278基因组为1.92Mb，G+C％的含量为60.469％。

实施例2：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的培养

将实施例1获得的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278接入含0.05g/100mL半胱氨酸的MRS固体培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈现乳白色、表面光滑、圆形凸起。

将实施例1获得的动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CCFM1278接入含0.05g/100mL半胱氨酸的MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的含0.05g/100mL半胱氨酸的MRS液体培养基中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9g/100mL生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，加入30％甘油中，冻存在-80℃待用。

实施例3：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278改善便秘小鼠粪便含水量、首粒黑便时间和小肠推进率

1.实验动物

雄性SPF级BALB/c小鼠(6周龄，体重18-22g)，来自中国浙江维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养在聚丙烯笼子里，每组8只小鼠，笼子里装有食物和水，控制温度(22℃)，相对湿度(50±10％)，用标准饲料和任意的水喂养小鼠。

2.动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278培养

(1)活化培养：

采用mMRS液体培养基，37℃厌氧工作站中静置培养。

培养目标：取冷冻保存的菌体，挑单菌落于液体mMRS液体培养基中，在37℃厌氧工作站中静置培养约24h，活化动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278。

(2)一级培养：

采用mMRS液体培养基，37℃厌氧工作站中静置培养。

培养目标：将活化培养的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278以培养基体积计1％接种量转接至mMRS液体培养基，传两代。

(3)二级培养：

将活化3代后的菌液以2％(v/v)的接种量接种至1L MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得灌胃前备用菌液。以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用生理盐水重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始活菌数量。于-80℃，30％甘油中冻存一周后再次测定活菌数量。

实验结果：初始活菌数为4.9×10¹⁰cfu/mL，1周后活菌数为3.7×10¹⁰cfu/mL，数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。

3、实验方法

(1)便秘小鼠模型的建立

选择周龄为6周的BALB/c小鼠，本实验前7天为适应期，第8-21天为干预期，第22-28天为造模期。造模期每天灌胃20mg/kg的盐酸洛哌丁胺0.2mL。小鼠造模期间，每隔一天称量小鼠体重、饮食量饮水量。

(2)实验分组及给药

分为正常组、模型组、乳果糖组、BB12组、CCFM1278组、FJSSZ6M5组。动物双歧杆菌BB12为商业化菌株，来自于科汉森，具有公认的缓解便秘的良好效果；FJSSZ6M来自于江南大学生物技术中心菌种库。

灌胃前，从-80℃取出菌液，以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用生理盐水重悬菌液，浓度为3.7×10¹⁰cfu/mL。乳果糖溶液稀释为100mg/mL。

干预期：正常组整个干预期每天灌胃0.2mL无菌生理盐水，共灌胃14天。模型组、乳果糖组、阳性菌组均灌胃相对应的无菌生理盐水、菌悬液或者是乳果糖悬液。造模期间，正常组整个干预期每天灌胃无菌生理盐水，模型组、乳果糖组、BB12组、CCFM1278组、FJSSZ6M5组均先灌胃盐酸洛哌丁胺，1h后模型组灌胃0.2mL无菌生理盐水，乳果糖组灌胃0.2mL乳果糖悬液，BB12、CCFM1278、FJSSZ6M5组分别灌胃0.2mLBB12、CCFM1278、FJSSZ6M5组菌悬液，试验期间各组小鼠均饲喂标准饲料。在第27天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重。在第28天，空白组给予0.2mL生理盐水；模型组、乳果糖组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(20mg/kg b.w)，1h后，分别向每组灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间。第28天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第29天上午9点空白组给予0.2mL生理盐水，模型组、乳果糖组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，各组分别灌胃墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率：小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100。

便秘患者常会表现出粪便干硬的症状，而粪便含水量低会造成排便困难，甚至对肠壁有所损伤。因此，改善粪便状态也是便秘治疗的一项重大任务。首粒黑便时间是食糜从胃部开始经肠道后到达肛门，最终以粪便排出所用的总时间，能够反映出整个胃肠道的蠕动能力。因此，首粒黑便时间越长，小鼠胃肠道的推进作用越弱。小肠推进率主要反映小肠部分的推进能力，小肠推进率越高，则小肠蠕动能力越强。

粪便含水量、首粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图1所示，由图1可知，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278组相对于便秘模型组，灌胃动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278能显著提高小肠推进率、提高粪便含水量、降低首粒排便时间。其中灌胃动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278后小肠推进率可达71.35％，比便秘模型组(小肠推进率47.71％)提高了49.55％(P<0.01)，粪便含水量可达62.02％，比便秘模型组(粪便含水量为30.46％)提高了103.61％(P<0.0001)，首粒黑便时间145.25分钟，比便秘模型组(首粒黑便时间211.75分钟)加快了31.4％(P<0.05)；与对照小鼠相比，粪便含水量提高20.54％；与乳果糖组相比，粪便含水量提高了28.91％，首粒黑便时间加快了30.34％；与BB12组相比，粪便含水量提高了21.92％，首粒黑便时间加快了18.68％，表明动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278对粪便含水量、小肠推进率与首粒黑便时间的效果明显优于乳果糖和BB12。因此，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在恢复便秘小鼠粪便干硬与小肠蠕动缓慢的症状具有良好效果。

实施例4：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278降低便秘小鼠血清中生长抑素(SS)的含量

有研究表明生长抑素作为一种作用广泛的神经激素，它能够抑制各种胃肠激素的释放，例如，胃泌素、胃动素、胰高血糖素以及降钙素等，它对胃肠运动具有一定的抑制作用。

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。第29天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用生长抑素(SS)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中SS的浓度。

如图2A所示，模型组(SS含量为4.35ng/L)与空白组(SS含量为2.04ng/L)相比，SS有明显增加(P<0.0001)，BB12组(SS含量为2.21ng/L)相对于模型组SS含量显著降低(P<0.0001)。但是动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278组(含量为1.98ng/L)相比于模型组，SS的含量降低了54.48％，相比于乳果糖组(含量为3.91ng/L)，SS的含量降低了49.36％，相比于BB12组，SS的含量降低了10.41％。动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278对于SS的抑制效果优于BB12，更好地促进胃肠运动。

实施例5：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278可提高便秘小鼠血清中胃泌素(Gas)的含量

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

第29天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用胃泌素(Gas)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中Gas的浓度。结果如图2B所示，模型组与空白组相比，其血清中Gas出现了显著降低的现象，胃泌素(Gas)刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，促进消化道粘膜上皮的生长，促进胃肠道平滑肌的收缩和幽门括约肌的松弛。血清中Gas的含量越高，其对胃的收缩与肠道蠕动的促进作用就越强。从图2B中可以看出，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278能显著提升便秘小鼠血清中Gas的含量至79.96ng/L，比模型组(52.59ng/L)增加了52.04％；与乳果糖组(61.37ng/L)相比，增加了30.29％。因此，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278可以通过提高血清中Gas的含量，促进胃与肠道的收缩与蠕动，从而有效缓解便秘。

实施例6：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278降低便秘小鼠血清中水通道蛋白3(AQP3)的含量

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。第29天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用水通道蛋白3(AQP3)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中AQP3的浓度。AQPs在人体水液代谢方面扮演重要角色，为水的跨膜转运提供了快速通道。目前已发现的13个亚型(AQP0～AQP12)中有9个存在于消化道的上皮细胞和内皮细胞中，这些细胞与体液吸收、分泌密切相关。其中AQP1、3、4、8、11在结肠大量分布、表达活跃，介导肠道内水分子的跨膜运输。AQP3在结肠上皮的特异性分布，预示AQP3对结肠转运液体具有非常重要的意义。结果如图2C所示，模型组血清中AQP3含量为820.556ng/L，显著高于空白组(593.403ng/L)。相较于模型组，灌胃乳果糖、FJSSZ6M5、BB12虽能降低小鼠血清中AQP3的含量，但没有明显差异，而灌胃CCFM1278后，小鼠血清中AQP3含量降至626.771ng/L，显著降低了小鼠血清中AQP3的含量(P<0.05)。以上结果表明，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278很有可能通过下调结肠上皮细胞质膜上功能性AQP3数量，降低结肠吸收水分的效率，增加粪便含水量。

实施例7：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278降低便秘小鼠结肠组织中AQPs基因表达量

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

水通道蛋白(AQP)是指一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，其中，AQP8主要参与空肠和结肠大量水分子的转运，AQP8表达的异常会导致水分吸收及肠液分泌的异常。当AQP8的表达量增高时，结肠会对粪便中吸水增加，从而导致粪便含水量下降，粪便干结，不易排出。

AQPs基因的表达量的检测方法如下：采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定AQPs基因的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用TrizoL法提取总RNA，具体方法如下：将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据诺唯赞公司的HiScriptIII RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。

小鼠AQPs蛋白基因和内参基因mGAPDH基因引物如表1所示，表1小鼠AQPs蛋白基因和mGAPDH基因引物序列。

表1引物

用Bio-Rad CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。AQPs基因qRT-PCR反应条件为：95℃30s；95℃10S，60℃30S，共40个循环。以mGAPDH基因为内参基因，CFX96Manager软件分析结果。

如图3～5所示，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的AQPs蛋白表达量与空白组相比有显著上升(P_AQP8<0.05,P_AQP3<0.05，P_AQP4<0.05)，从而导致粪便中水分被过度吸收，使粪便干硬。灌胃动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278后，其AQP8蛋白表达量显著下降，此时的AQP8蛋白相对表达量为0.7431，与模型组(相对表达量为3.4115)相比，其AQP8蛋白表达量比模型组降低了78.22％(P<0.05)，而肠道中AQP3基因相对表达量(0.4393)较模型组降低了78％(P<0.0001)。此外，与乳果糖组(AQP8 2.145，AQP3 1.182)相比，其AQP8蛋白表达量降低了65.36％，AQP3相对表达量降低了62.83％。与BB12组(AQP8 2.334)相比，其AQP8蛋白表达量比降低了68.16％。以上结果表明，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278能够通过降低便秘小鼠结肠中AQP3和AQP8的表达量，避免粪便中水分的过度吸收，从而提高便秘小鼠的粪便含水量，使粪便更容易排出。

实施例8：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278提高便秘小鼠粪便中短链脂肪酸含量

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

通过GC-MS定量分析了粪便中的短链脂肪酸(SCFAs)，包括乙酸，丙酸，丁酸。对小鼠粪便中的SCFA进行提取和测定。具体步骤为：将50mg粪便样品浸入饱和NaCl溶液中，捣烂直至无明显团块。加入20μL H₂SO₄溶液进行酸化。然后加入1000μL无水乙醚进行萃取。将混合物以13000g离心15分钟，以获得上清液，将其转移至装有0.25g无水Na₂SO₄的Eppendorf管中，然后获得上层醚相，并移至样品瓶中进行GC-MS分析。

如图6～8所示，用洛哌丁胺造模后，模型组小鼠盲肠内容物中乙酸、丁酸与丙酸的含量与空白组相比都有一定程度的降低，其中模型组乙酸含量为22.6μmol/g，丁酸含量为7.52μmol/g，丙酸含量为12.79μmol/g，分别比空白组下降了44.58％、43.92％与36.43％(P<0.05)。乳果糖组中乙酸含量为35.53μmol/g，丁酸含量为9.04μmol/g，丙酸含量为16.48μmol/g，分别比模型组提高了57.21％，20.21％，28.85％。但灌胃动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278后，乙酸、丁酸与丙酸的含量分别为39.36μmol/g、11.72μmol/g与19.38μmol/g，分别上升了74.16％、55.85％与51.52％(P_乙酸<0.05，P_丁酸>0.05，P_丙酸>0.05)，且比乳果糖组的改善效果更好，分别较乳果糖组提高了10.78％、29.65％与17.6％，作用效果接近BB12。短链脂肪酸能够降低肠道pH值，促进肠道中钙镁离子的吸收，抑制有害菌的侵染，刺激肠道蠕动。在提高短链脂肪酸方面，CCFM1278与已公认的缓解便秘效果良好的商业化明星菌株BB12效果相当。

实施例9：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278降低便秘小鼠粪便中Akkermansia、Bilophila的相对丰度

BALB/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

试验结束后，提取粪便中基因组DNA，对V3-V4区进行特异性PCR扩增，16S rDNA测序，分析粪便菌群变化。如图9，结果表明与空白组相比，便秘小鼠粪便中Akkermansia、Bilophila相对丰度显著增加(P<0.05)。CCFM1278可显著性降低便秘小鼠粪便中Akkermansia、Bilophila的相对丰度(P<0.05)，而BB12仅可显著性降低便秘小鼠粪便中Akkermansia的相对丰度(P<0.05)，且作用效果逊于CCFM1278。Bilophila与肠道胆汁酸代谢异常、肠屏障功能障碍、炎症呈正相关，而Akkermansia可以降解肠道粘蛋白，可能导致粘蛋白缺少，粪便难以排出。

以上结果表明，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278能有效改善小鼠粪便含水量、首粒黑便时间、小肠推进率等便秘相关指标。通过调节生长抑素、胃泌素、水通道蛋白3水平促进肠蠕动，通过影响水通道蛋白3、水通道蛋白8的表达影响肠道对粪便水分的吸收，通过提高短链脂肪酸含量降低肠道pH值，促进肠道中钙镁离子的吸收，抑制有害菌的侵染，刺激肠道蠕动，通过调节肠道菌群恢复胆汁酸代谢、肠屏障功能从而缓解便秘小鼠粪便干硬难排的症状。

综上所述，动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278可显著改善小鼠便秘，它可以制备用于预防和治疗便秘的药物或保健品，或者生产益于肠道健康的食品，例如作为益生菌饮料、酸豆奶、发酵果冻、发酵茶饮料或乳制品(如酸奶、奶酪制品、乳酸菌、奶粉)的食品添加剂等。

实施例10：制备含有动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278菌剂的片剂

制作工艺基本步骤如下：菌种活化→扩大培养→收集菌体→菌悬液制备→冷冻干燥→总混→压片。

1、菌种活化：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278以培养基体积计1％的接种量在mMRS液体培养基中在37℃厌氧工作站中静置培养，连续活化两代。

2、扩大培养：将活化的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278以培养基体积计1％的接种量转接到1L mMRS液体培养基中进行扩大培养，在37℃厌氧工作站中静置培养24h。

3、收集菌体、制备菌悬液：扩大培养结束后，在4℃低温离心收集菌体，用PBS(pH7.4)洗涤两次后，用以重量计13％脱脂乳水溶液制成1×10⁹CFU/mL的菌悬液。

4、冷冻干燥：根据常规冷冻干燥工艺制成菌粉。

5、总混：加入以菌粉总重计2％硬脂酸作润滑剂，3％CMC-Na作粘合剂，混匀。

6、压片：根据常规压片工艺通过压片机压片。

实施例11：制备含有动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278菌剂的粉剂

制作工艺基本步骤如下：菌种活化→扩大培养→收集菌体→菌悬液制备→冷冻干燥。

1、菌种活化：动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278以培养基体积计1％的接种量在mMRS液体培养基中在37℃厌氧工作站中静置培养，连续活化两代。

2、扩大培养：将活化的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278以培养基体积计1％的接种量转接到1L mMRS液体培养基中进行扩大培养，在37℃厌氧工作站中静置培养24h。

3、收集菌体、制备菌悬液：扩大培养结束后，在4℃低温离心收集菌体，用PBS(pH7.4)洗涤两次后，用以重量计13％脱脂乳水溶液制成1×10⁹CFU/mL的菌悬液。

4、冷冻干燥：根据常规冷冻干燥工艺制成冻干菌体粉剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CCFM1278，已于2022年9月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62795。

2.含有权利要求1所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的组合物。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品、保健品或药物。

4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的含量≥1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

5.含有权利要求1所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的发酵剂。

6.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在制备预防和/或治疗便秘的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278、药物载体和/或药用辅料。

8.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在制备有助于润肠通便的功能性食品或保健品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品包括使用含有所述动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。

10.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳酸亚种CCFM1278在食品添加剂中的应用。

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