CN115969957A - 一种炎性肠病复合益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种炎性肠病复合益生菌制剂及其制备方法，属于益生菌技术领域，将浆果榨汁得到浆果多酚；将大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽与糖反应得到蛋白肽美拉德产物；将浆果多酚、蛋白肽美拉德产物加入发酵培养基中，接种布拉德酵母菌发酵，加入益生元，接种罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌发酵，加入色氨酸和维生素B，二次发酵，得到二级发酵产物螯合锌，与乙酸、丙酸、丁酸一起被聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠包埋，壳聚糖涂覆，得到炎性肠病复合益生菌制剂。本发明制得的炎性肠病复合益生菌制剂能明显改善肠炎引发的体质量下降、肠上皮损伤、组织损伤等症状，提高机体免疫力，调控肠道菌群，保护细胞免受氧化应激，具有广阔的应用前景。

Description

一种炎性肠病复合益生菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种炎性肠病复合益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

炎症是免疫系统的复杂反应，其涉及在感染、毒素暴露或细胞损伤部位的白细胞和血浆蛋白的积累和活化。虽然炎症在控制感染和促进组织修复中起到保护作用，但它也造成组织损伤和疾病。炎性肠炎(Inflammatory Bowel Disease，简称IBD)是一组不明原因的慢性肠道炎症性疾病，临床主要表现为腹胀、腹痛、腹泻、粘液血便、粘膜脓便；包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，以持续性肠道非特异性炎症为特征，通常反复发作、迁延不愈，临床上仍无特效性的治疗手段。近年来越来越多的研究报道肠道菌群及其代谢产物、宿主基因易感性及肠道黏膜免疫三方面共同参与了IBD的发病机制，且已证实IBD患者的肠道菌群组成与正常人明显不同。不受控制的炎症也可以驱动肠中肿瘤发生，并且患有IBD的患者发生结肠直肠癌的风险增加。

人体肠道中含有多达10¹³-10¹⁴个、共15000-36000种微生物，其数量为人体细胞的10倍，是人体最大的贮菌库，肠道菌群是维持人体健康运转的重要“伙伴”，在营养物质合成、吸收，免疫力构建等诸多方面发挥重要作用。在遗传易感性的基础上，当外界因素和肠道菌群引起免疫失衡时可引起IBD。早期研究发现免疫缺陷的小鼠在肠道无菌的条件下，不会发生肠道炎症。动物实验及临床研究也表明抗生素及生态制剂对部分IBD患者有效。因此，肠道菌群在IBD发生、发展及预后中扮演着重要角色。

开发益生菌制剂，重建肠道微生态，恢复肠道菌群稳态，有望成为治疗炎性肠炎的一个有效手段。益生菌能通过殖民抵抗的机制，与病原菌竞争粘附位置，抵抗病原菌侵袭，调节宿主免疫反应，保护人体免疫系统。另外，益生菌比致病菌更耐酸，其可以产生有机酸等酸性物质，营造酸性微环境，从而抑制致病菌的生长。益生菌的使用可以对抗IBD患者肠道菌群的失调，从而恢复疾病导致的肠菌生态失衡，减少细菌引起的炎症、遗传毒性、致癌途径等。然而，目前益生菌的靶向治疗方法尚未在IBD中进行深入的研究。而且，益生菌种类繁多，并不是所有的菌株均具有调节肠胃的功能，也不是所有的益生菌一起使用均能发挥出各自的功效，更不是所有的益生菌联合使用都能达到协同增效的作用。

中国专利CN110101722B公开了一种复合益生菌菌剂用于制备治疗溃疡性结肠炎产品的用途，所述复合益生菌菌剂包含4株益生乳酸菌株，分别为干酪乳杆菌Zhang、动物双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和植物乳杆菌C2，其选用的益生菌并非都来源于人体，进入宿主体内后，很难与宿主适应，定殖能力较差，功效有限；其次，适用范围有限，不能针对不同中国人的体质。因此，开发益生菌药物有重大的意义，也面临着急剧的挑战。

中国专利申请CN105454966A公开了一种改善胃肠道且提高免疫力的益生菌固体饮料，包括(按质量分数计)：10％-30％益生菌微囊粉、20％-60％益生元、1％-20％牛初乳粉，1％-5％酵母β葡聚糖、20％-60％抗性糊精，其中，益生菌微囊粉中包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或几种，益生元为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、菊粉、低聚木糖中的一种或几种。虽然该益生菌产品对肠道微生物平衡有一定的改善作用，在一定程度上提高了人体的免疫力，但是其对肠道炎症性疾病的改善作用非常有限。

发明内容

本发明的目的在于提出一种炎性肠病复合益生菌制剂及其制备方法，能明显改善肠炎引发的体质量下降、肠上皮损伤、组织损伤等症状，维持肠道的免疫耐受，提高机体免疫力，通过调控肠道菌群，减少有害菌定植，抑制有害菌生长，减少炎症因子的产生，保护细胞免受氧化应激，具有较好的抗菌、抗氧化、抗病毒的效果，提高人体免疫力，同时能够靶向释放活性物质和益生菌，大大提高了作用效果，具有广阔的应用前景。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种炎性肠病复合益生菌制剂的制备方法，将黑枸杞、石榴、桑葚混合榨汁，干燥，得到浆果多酚；将大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽与葡萄糖和木糖发生美拉德反应，得到蛋白肽美拉德产物；将碳源、氮源、无机盐、浆果多酚、蛋白肽美拉德产物和水混合制得发酵培养基，并接种活化后的布拉德酵母菌发酵，加入槲皮素、β-葡聚糖，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌发酵，加入色氨酸和维生素B，二次发酵，得到二级发酵产物，加入葡萄糖酸锌混合反应，得到螯合锌的发酵产物，所述螯合锌的发酵产物与乙酸、丙酸、丁酸混合溶于水中，加入乳化剂和聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠，得到的溶液滴加入食用油中乳化，滴加氯化钙固化，在壳聚糖溶液中涂覆，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将黑枸杞、石榴、桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，经过冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽混合加入水中，分散均匀，加入葡萄糖和木糖，加热反应，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将碳源、氮源、无机盐、步骤S1制得的浆果多酚、步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和水混合均匀，灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中进行发酵培养，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将槲皮素、β-葡聚糖混合均匀，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将步骤S5制得的益生元加入步骤S4制得的酵母发酵产物中，混合均匀，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，发酵培养，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入色氨酸和维生素B，发酵培养，得到二级发酵产物；

S8.短链脂肪酸的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向步骤S7制得的二级发酵产物中加入葡萄糖酸锌，搅拌混合均匀，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将丙烯酸钠和引发剂加入海藻酸钠溶液中，加热反应，调节溶液pH值，透析，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、步骤S8制得的短链脂肪酸、步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、乳化剂溶于水中，得到水相；将水相滴加入食用油中，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，离心，固体转移到壳聚糖溶液中涂覆，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述黑枸杞、石榴、桑葚的质量比为3-5∶2-4∶1-3；步骤S2中所述大豆分离蛋白粉、玉米低聚肽、葡萄糖和木糖的质量比为5-10∶3-7∶2-4∶1-3，所述加热反应的温度为60-80℃，时间为50-70min。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述碳源、氮源、无机盐、浆果多酚、蛋白肽美拉德产物和水的质量比为7-12∶5-10∶3-5∶5-7∶3-5∶70-100，所述灭菌为紫外线灭菌；步骤S4中所述活化后的布拉德酵母菌的接种量为1-2％，所述发酵培养的温度为37-39℃，时间为24-36h，转速为50-70r/min。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述槲皮素、β-葡聚糖的质量比为3-5∶2-4；步骤S6中所述益生元、酵母发酵产物的质量比为3-5∶15-20，所述活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的接种量分别为2-4％和2-3％，所述发酵培养的温度为34-36℃，时间为24-48h，转速为50-70r/min。

作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述益生菌发酵产物、色氨酸和维生素B的质量比为100∶5-10∶1-2，所述维生素B选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12中的至少一种，优选地，为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为3-5∶1，所述发酵培养的温度为35-37℃，转速为50-70r/min，时间为18-30h；步骤S8中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为5-7∶3-5∶1-2。

作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述二级发酵产物和葡萄糖酸锌的质量比为100∶3-5，所述搅拌混合时间为30-50min；步骤S10中所述丙烯酸钠、引发剂和海藻酸钠溶液的质量比为1∶0.01-0.02∶30-50，所述海藻酸钠溶液的含量为5-10wt％，所述加热反应的温度为60-70℃，时间为1-2h，所述调节溶液pH值为7.2-7.5，所述透析时间为2-4天，所述聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、短链脂肪酸、发酵产物、乳化剂的质量比为100∶7-12∶40-70∶3-5，所述乳化条件为12000-15000r/min，时间为3-5min，所述氯化钙溶液的含量为3-5wt％，所述常温固化的时间为30-40min，所述壳聚糖溶液为pH＝5.5-6的0.5-1wt％的壳聚糖溶液，所述涂覆时间为10-20min。

作为本发明的进一步改进，布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，50-70r/min转速下，35-37℃活化培养12-18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸-10⁹cfu/mL。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将3-5重量份黑枸杞、2-4重量份石榴、1-3重量份桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，经过冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将5-10重量份大豆分离蛋白粉和3-7重量份玉米低聚肽混合加入100重量份水中，分散均匀，加入2-4重量份葡萄糖和1-3重量份木糖，加热至60-80℃，反应50-70min，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将7-12重量份碳源、5-10重量份氮源、3-5重量份无机盐、5-7重量份步骤S1制得的浆果多酚、3-5重量份步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和70-100重量份水搅拌混合10-20min，紫外线灭菌，得到发酵培养基；

优选地，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的至少一种；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸、蛋白胨、鱼骨粉中的至少一种，所述铵盐选自氯化铵、硝酸铵、硫酸铵中的至少一种，所述硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾中的至少一种；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸中的至少一种，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸铁、氯化亚铁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种。

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中，接种量为1-2％，37-39℃，50-70r/min，发酵培养24-36h，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将3-5重量份槲皮素、2-4重量份β-葡聚糖搅拌混合10-20min，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将3-5重量份步骤S5制得的益生元加入15-20重量份步骤S4制得的酵母发酵产物中，混合均匀，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，接种量分别为2-4％和2-3％，34-36℃，50-70r/min，发酵培养24-48h，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向100重量份步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入5-10重量份色氨酸和1-2重量份维生素B，35-37℃，50-70r/min，发酵培养18-30h，得到二级发酵产物；

所述维生素B为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为3-5∶1；

S8.短链脂肪酸的制备：将5-7重量份乙酸、3-5重量份丙酸、1-2重量份丁酸搅拌混合10-20min，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向100重量份步骤S7制得的二级发酵产物中加入3-5重量份葡萄糖酸锌，搅拌混合30-50min，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将1重量份丙烯酸钠和0.01-0.02重量份引发剂加入30-50重量份5-10wt％的海藻酸钠溶液中，加热至60-70℃，反应1-2h，调节溶液pH值为7.2-7.5，透析2-4天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、7-12重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、40-70重量份步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、3-5重量份乳化剂溶于水中，得到水相；将30-50重量份水相滴加入70重量份食用油中，12000-15000r/min乳化3-5min，滴加15-20重量份3-5wt％氯化钙溶液，常温固化30-40min，离心，固体转移到pH＝5.5-6的0.5-1wt％的壳聚糖溶液中涂覆10-20min，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂；

优选地，所述乳化剂选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的至少一种；所述食用油选自花生油、大豆油、玉米油、橄榄油、亚麻籽油、菜籽油、芝麻油中的至少一种；所述引发剂选自过硫酸钠、过硫酸钾、过硫酸铵中的至少一种。

布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，50-70r/min转速下，35-37℃活化培养12-18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸-10⁹cfu/mL。

本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的炎性肠病复合益生菌制剂。

本发明具有如下有益效果：本发明采用富含多酚类物质的浆果，包括黑枸杞、石榴、桑葚，以花青素为主，在肠道中复合多酚被代谢成小分子多酚，调节微生物种群，促进肠道益生菌罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌生长，并通过调节促炎细胞因子来减轻肠道炎症。

本发明采用大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽与葡萄糖和木糖发生美拉德反应得到的蛋白肽美拉德反应产物能够有效影响微生物群落结构，促进双歧杆菌生长，有效抑制病原菌活性，同时，还具有很好的抗菌，清除自由基及抗突变作用。大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽的添加还能够促进蛋白质吸收，增强机体免疫力的效果，保肝护肝的作用。

益生菌有助于维持肠道微生态平衡，增强免疫能力，减少病原体的定植，促进有益微生物的生长。本发明益生菌包括布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，其中：

肠源性致病菌通过甘露聚糖黏附在细胞上，而酵母菌细胞壁中甘露聚糖含量高，因此，酵母菌可以通过与肠源性致病菌竞争粘附在肠壁上，抑制肠源性致病菌的定值，可以起到保护作用。

布拉氏酵母菌的细胞壁厚，最内层β-葡聚糖含量高，具有良好的耐温性能。另外，布拉氏酵母菌可以有效抑制念珠菌，一，通过降低丝状化，减少生物膜的形成进行抑菌；二，通过分泌的代谢物具有抗黏附性，其分泌物包括癸酸、2-苯乙醇，葵酸对菌丝形成具有显著抑制效果，同时，高浓度癸酸可以杀死念珠菌。2-苯乙醇对菌丝形成有抑制作用；三，通过分泌抗毒素蛋白及抗菌物质进行抑菌，包括胞外蛋白酶、碱性磷酸酶、表面蛋白黏附素、脂肪酸、抗菌物质多胺等，其中，胞外蛋白酶能降解艰难梭菌产生的毒素(包括毒素A和毒素B)，减少毒素对肠细胞表面的结合，保护肠道免受毒素侵害；碱性磷酸酶通过去磷酸化作用抑制大肠杆菌内毒素活性，表面蛋白黏附素通过中和霍乱弧菌产生的霍乱毒素，抑制霍乱毒素对肠细胞腺苷酸环化酶的激活，降低环腺苷酸过度分泌，减少氯离子流失，维持体细胞正常渗透压，避免水分大量流失，减少腹泻的症状发生；脂肪酸，包括十一烯酸、月桂酸和癸酸等，可以起到较好的抑菌效果；抗菌物质多胺，包括如精胺和亚精胺等，通过提高刷状缘膜酶(乳糖酶、d-葡萄糖苷酶和碱性磷酸酶)的含量，改善机体吸收营养能力，参与多种生理过程并保护细胞免受活性氧累积；四、通过抑制促炎因子(如白介素8、肿瘤坏死因子α等)表达进而减缓炎症反应的进行；五，通过分泌的抗氧化物质具有较好的抗氧化活性，缓解肠炎症状，产生的硫化氢具有保护细胞免受氧化应激的功能。

罗伊氏乳杆菌可分泌广谱抗菌物质罗伊氏菌素，进而有效抑制有害菌种的生长，提高机体免疫力。罗伊氏乳杆菌进入人体后可产生乙酸及罗伊氏菌素，乙酸可降低肠道pH值，破坏有害菌的生长环境，抑制病原体的产生，阻止病毒的继续入侵及炎症信号的传导；罗伊氏菌素则引起病原体氧化应激，激活机体CD4⁺细胞，诱导IgG、IgA等免疫球蛋白的产生，增强患儿免疫功能。罗伊氏乳杆菌通过进入肠道后迅速定居增殖，修正肠道菌群失调，阻止轮状病毒对肠道上皮细胞的损伤，促进正常肠道菌群重建，短时间内恢复肠道微生态平衡，降低患儿胃肠激素水平，有效控制腹泻症状，促使胃肠激素水平恢复正常。

两歧双歧杆菌具有极好的抗炎作用，通过改变肠道微生物群从而达到缓解IBD、调节氧化应激和炎症介质的目的，可以明显改善肠炎引发的体质量下降、肠上皮损伤、组织损伤等症状，维持肠道的免疫耐受。两歧双歧杆菌还可以通过调节Treg细胞的比例，控制抗炎因子和促炎因子的表达，促进IL-10等抗炎细胞因子的表达，抑制IL-12、IL-17和IL-23等促炎因子的表达。两歧双歧杆菌的代谢产物包括共轭亚油酸、胞外多糖，共轭亚油酸通过抑制炎症细胞能够达到以下效果：1)调节小鼠肠道菌群，如类杆菌数量减少，双歧杆菌数量增多；2)作用于肠上皮细胞，维持肠道屏障；3)调节炎症因子，减轻炎症反应。胞外多糖是一种肠道某些微生物的营养物质，导致微生物代谢和代谢产物的改变，显著增加肠道中双歧杆菌等益生菌的数量，减少产气荚膜梭菌等有害微生物的数量，维持肠道菌群平衡。

罗伊氏乳杆菌与两歧双歧杆菌联合使用，可加速肠蠕动，促进肠道吸收功能的恢复，加速宿主肠道微生物群的恢复，维持肠道正常蠕动及水、电解质平衡，有效缓解腹泻症状，胃肠激素水平降低，联合使用具有协同作用。

益生元是不易消化的食品成分，通过选择性刺激结肠中一种或多种细菌的生长和活性，为宿主提供健康益处。本发明益生元包括槲皮素和β-葡聚糖，不仅具有促进益生菌生长的作用，另外，槲皮素是能促进青春双歧杆菌分泌抗炎物质，β-葡聚糖可以降低过氧化物酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的水平，改善免疫球蛋白水平，两者的添加具有协同增效的作用。

短链脂肪酸是肠道细菌从内源或饮食来源发酵碳水化合物和蛋白质的最终产物。主要由2-6个碳的饱和脂肪酸组成，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸，其中乙酸、丙酸、丁酸的含量高，效果好。本发明添加了包括乙酸、丙酸、丁酸组合的短链脂肪酸，与益生菌生理活动产生的短链脂肪酸一起，参与调节性T细胞(Tregs)的发育并影响巨噬细胞的活性，以及抗炎细胞因子如IL-10、IL-4的产生，血浆B细胞的增殖，抑制组蛋白去乙酰化酶和激活GPR109A、GPR43、GPR41等，通过调节免疫细胞趋化性、活性氧释放以及细胞因子释放发挥抗炎功能，对微生物病原体产生耐受性。

色氨酸是人类不能自己合成，必须通过外界获得的芳香族氨基酸，可以通过肠道微生物群代谢产生吲哚、芳烃受体和孕烷X受体激动剂，对粘膜免疫力和体内平衡具有多种作用，本发明在发酵底物中添加色氨酸，在发酵过程中，益生菌已经将部分色氨酸发酵产生吲哚、芳烃受体和孕烷X受体激动剂，进入人体后可以直接参与人体反应，另一部分色氨酸继续被体内益生菌利用，发挥长效的调节作用，另外，本发明添加的维生素B，包括维生素B1和维生素B6，能够较好的促进益生菌的生长生殖，其中维生素B1可以提高益生菌的抗性，维生素B6可以延长益生菌稳定期，从而提高益生菌的存活率，提高有益产物的生产生成。

锌是人体内多种酶的辅酶，可增强免疫力，加快胃肠黏膜修复，改善肠炎症状促进肠黏膜细胞再生，进而修复肠道黏膜组织，利于肠道对水、电解质的重吸收，缓解临床症状。同时，锌进入人体后可升高肠道免疫球蛋白，提高人体免疫功能，抑制胃蛋白酶分解蛋自质，提高胃黏膜分泌和上皮细胞寿命，进而抑制胃蛋白酶、胃酸的渗透，起到修复胃黏膜的作用。

本发明通过聚丙烯酸钠接枝到海藻酸钠主链上，将螯合锌的发酵产物与短链脂肪酸混合后，通过乳化形成小液滴，在钙离子的存在下交联形成壳层，从而将益生菌和营养物质进行有效包埋，通过聚丙烯酸钠的接枝使得壳层的孔隙大大缩小，壳层更密实，进一步与壳聚糖涂层的相互作用后得到的微胶囊具有很好的耐胃酸、耐胆碱的作用，并在肠道中结构会发生崩塌，形成松散的结构，有利于益生菌和活性物质在肠道的靶向释放。

本发明制得的炎性肠病复合益生菌制剂能明显改善肠炎引发的体质量下降、肠上皮损伤、组织损伤等症状，维持肠道的免疫耐受，提高机体免疫力，通过调控肠道菌群，减少有害菌定植，抑制有害菌生长，减少炎症因子的产生，保护细胞免受氧化应激，具有较好的抗菌、抗氧化、抗病毒的效果，提高人体免疫力，同时能够靶向释放活性物质和益生菌，大大提高了作用效果，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制得的炎性肠病复合益生菌制剂的SEM图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

槲皮素，含量大于98％，购于西安绿天生物技术有限公司；β-葡聚糖，含量大于90％，购于徐州赛奇生物技术有限公司；大豆分离蛋白粉，含量大于90％，购于江苏仟泊生物工程有限公司；玉米低聚肽，含量大于99％，购于陕西云奇生物科技有限公司。

罗伊氏乳杆菌，货号XKJZ0742，100亿cfu/g，购于上海晅科生物科技有限公司；两歧双歧杆菌，货号XKJZ0672，100亿cfu/g，购于上海

科生物科技有限公司；布拉德酵母菌，200亿cfu/g，购于西安明朗生物科技有限公司。

实施例1

本实施例提供一种炎性肠病复合益生菌制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将3重量份黑枸杞、2重量份石榴、1重量份桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将5重量份大豆分离蛋白粉和3重量份玉米低聚肽混合加入100重量份水中，1000W超声分散20mmin，加入2重量份葡萄糖和1重量份木糖，加热至60℃，反应50min，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将7重量份葡萄糖、5重量份蛋白胨、2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.2重量份硫酸镁、0.3重量份氯化铁、5重量份步骤S1制得的浆果多酚、3重量份步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和70重量份水搅拌混合10min，紫外线灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中，接种量为1％，37℃，50r/min，发酵培养24h，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将3重量份槲皮素、2重量份β-葡聚糖搅拌混合10min，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将3重量份步骤S5制得的益生元加入15重量份步骤S4制得的酵母发酵产物中，搅拌混合20min，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，接种量分别为2％和2％，34℃，50r/min，发酵培养24h，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向100重量份步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入5重量份色氨酸和1重量份维生素B，35℃，50r/min，发酵培养18h，得到二级发酵产物；

所述维生素B为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为3∶1；

S8.短链脂肪酸的制备：将5重量份乙酸、3重量份丙酸、1重量份丁酸搅拌混合10min，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向100重量份步骤S7制得的二级发酵产物中加入3重量份葡萄糖酸锌，搅拌混合30min，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将1重量份丙烯酸钠和0.01重量份过硫酸铵加入30重量份5wt％的海藻酸钠溶液中，加热至60℃，反应1h，调节溶液pH值为7.2，透析2天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、7重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、40重量份步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、3重量份吐温-20溶于100重量份水中，得到水相；将30重量份水相滴加入70重量份花生油中，12000r/min乳化3min，滴加15重量份3wt％氯化钙溶液，常温固化30min，3000r/min离心15min，固体转移到pH＝5.5的0.5wt％的壳聚糖溶液中涂覆10min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂，图1为制得的炎性肠病复合益生菌制剂的SEM图，由图可知，该微胶囊表面光滑；

布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，50r/min转速下，35℃活化培养12h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸cfu/mL。

实施例2

本实施例提供一种炎性肠病复合益生菌制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将5重量份黑枸杞、4重量份石榴、3重量份桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将10重量份大豆分离蛋白粉和7重量份玉米低聚肽混合加入100重量份水中，1000W超声分散20mmin，加入4重量份葡萄糖和3重量份木糖，加热至80℃，反应70min，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将6重量份麦芽糖、6重量份乳糖、8重量份尿素、2重量份鱼骨粉、3重量份氯化钾、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁、0.5重量份硫酸锌、7重量份步骤S1制得的浆果多酚、5重量份步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和100重量份水搅拌混合20min，紫外线灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中，接种量为2％，39℃，70r/min，发酵培养36h，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将5重量份槲皮素、4重量份β-葡聚糖搅拌混合20min，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将5重量份步骤S5制得的益生元加入20重量份步骤S4制得的酵母发酵产物中，搅拌混合20min，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，接种量分别为4％和3％，36℃，70r/min，发酵培养48h，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向100重量份步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入10重量份色氨酸和2重量份维生素B，37℃，70r/min，发酵培养30h，得到二级发酵产物；

所述维生素B为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为5∶1；

S8.短链脂肪酸的制备：将7重量份乙酸、5重量份丙酸、2重量份丁酸搅拌混合20min，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向100重量份步骤S7制得的二级发酵产物中加入5重量份葡萄糖酸锌，搅拌混合50min，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将1重量份丙烯酸钠和0.02重量份过硫酸钾加入50重量份10wt％的海藻酸钠溶液中，加热至70℃，反应2h，调节溶液pH值为7.5，透析4天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、12重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、70重量份步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、5重量份吐温-40溶于100重量份水中，得到水相；将50重量份水相滴加入70重量份玉米油中，15000r/min乳化5min，滴加20重量份5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，3000r/min离心15min，固体转移到pH＝6的1wt％的壳聚糖溶液中涂覆20min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂；

布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，70r/min转速下，37℃活化培养18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁹cfu/mL。

实施例3

本实施例提供一种炎性肠病复合益生菌制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将4重量份黑枸杞、3重量份石榴、2重量份桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将7重量份大豆分离蛋白粉和5重量份玉米低聚肽混合加入100重量份水中，1000W超声分散20mmin，加入3重量份葡萄糖和2重量份木糖，加热至70℃，反应60min，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将5重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、2重量份果糖、3重量份尿素、2重量份蛋白胨、1重量份亮氨酸、1重量份苯丙氨酸、2重量份氯化钠、0.4重量份氯化锌、0.4重量份氯化铜、0.4重量份氯化钙、0.4重量份硫酸镁、0.4重量份氯化铁、6重量份步骤S1制得的浆果多酚、4重量份步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和85重量份水搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中，接种量为1.5％，38C，60r/min，发酵培养30h，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将4重量份槲皮素、3重量份β-葡聚糖搅拌混合15min，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将4重量份步骤S5制得的益生元加入17重量份步骤S4制得的酵母发酵产物中，搅拌混合20min，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，接种量分别为3％和2.5％，35℃，60r/min，发酵培养36h，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向100重量份步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入7重量份色氨酸和1.5重量份维生素B，36C，60r/min，发酵培养22h，得到二级发酵产物；

所述维生素B为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为4∶1；

S8.短链脂肪酸的制备：将6重量份乙酸、4重量份丙酸、1.5重量份丁酸搅拌混合15min，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向100重量份步骤s7制得的二级发酵产物中加入4重量份葡萄糖酸锌，搅拌混合40min，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将1重量份丙烯酸钠和0.015重量份过硫酸钠加入40重量份7wt％的海藻酸钠溶液中，加热至65℃，反应1.5h，调节溶液pH值为7.4，透析3天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、10重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、55重量份步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、4重量份吐温-80溶于100重量份水中，得到水相；将40重量份水相滴加入70重量份菜籽油中，13500r/min乳化4min，滴加17重量份4wt％氯化钙溶液，常温固化35min，3000r/min离心15min，固体转移到pH＝5.7的0.7wt％的壳聚糖溶液中涂覆15min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂；

布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，60r/min转速下，36℃活化培养15h，得到菌种种子液，含菌量为10⁹cfu/mL。

实施例4

与实施例3相比，不同之处在于，维生素B为单一的维生素B1。

实施例5

与实施例3相比，不同之处在于，维生素B为单一的维生素B6。

对比例1

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S1，步骤S3中未添加浆果多酚。

对比例2

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2，步骤S3中未添加蛋白肽美拉德产物。

对比例3

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加浆果多酚和蛋白肽美拉德产物。

对比例4

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。

对比例5

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加槲皮素。

对比例6

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加β-葡聚糖。

对比例7

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5，步骤S6中未添加益生元。

对比例8

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中仅接种了单一的罗伊氏乳杆菌。

对比例9

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中仅接种了单一的两歧双歧杆菌。

对比例10

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加色氨酸。

对比例11

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加维生素B。

对比例12

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加色氨酸和维生素B。

对比例13

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S7。

对比例14

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6、S7。

对比例15

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S8，步骤S10中未添加短链脂肪酸。

对比例16

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S9，步骤S10中添加的螯合锌的发酵产物为步骤S7制得的二级发酵产物。

对比例17

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未进行聚丙烯酸钠接枝。

具体如下：

将100重量份海藻酸钠、10重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、55重量份步骤S9制得的发酵产物、4重量份吐温-80溶于100重量份水中，得到水相；将40重量份水相滴加入70重量份菜籽油中，13500r/min乳化4min，滴加17重量份4wt％氯化钙溶液，常温固化35min，3000r/min离心15min，固体转移到pH＝5.7的0.7wt％的壳聚糖溶液中涂覆15min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

对比例18

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未进行壳聚糖溶液涂覆。

具体如下：

将1重量份丙烯酸钠和0.015重量份过硫酸钠加入40重量份7wt％的海藻酸钠溶液中，加热至65℃，反应1.5h，调节溶液pH值为7.4，透析3天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、10重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、55重量份步骤S9制得的发酵产物、4重量份吐温-80溶于100重量份水中，得到水相；将40重量份水相滴加入70重量份菜籽油中，13500r/min乳化4min，滴加17重量份4wt％氯化钙溶液，常温固化35min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

对比例19

与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中仅用海藻酸钠经过钙离子交联得到包覆壳层。

具体如下：

将100重量份海藻酸钠、10重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、55重量份步骤S9制得的发酵产物、4重量份吐温-80溶于100重量份水中，得到水相；将40重量份水相滴加入70重量份菜籽油中，13500r/min乳化4min，滴加17重量份4wt％氯化钙溶液，常温固化35min，3000r/min离心15min，清水洗涤，60℃干燥2h，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

对比例20

与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S10。

测试例1缓控释试验

将1g本发明实施例1-3和对比例17-20制得的炎性肠病复合益生菌制剂分别加入到9mL人工模拟胃液和9mL人工模拟肠液中，在37℃、70r/min条件下，在人工模拟胃液中反应2h，在人工模拟肠液中反应2-3h，另外，取1g炎性肠病复合益生菌制剂加入到9mL人工模拟胃液中，先置于摇床中，在37℃、70r/min条件下反应2h后，离心，再加入9mL人工模拟肠液继续反应3h。

其中：

人工胃液配制：胃蛋白酶10g，稀盐酸16.4mL，定容至1L，稀盐酸是234mL浓盐酸稀释至1L制得的9.5-10.5％的稀盐酸；

人工肠液配制：磷酸二氢钾6.8g，加水500mL，用0.1mol/L的氢氧化钠调pH6.8，加胰蛋白酶10g，溶解，定容至1L。

测定微胶囊的平均粒径变化，反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率：

存活率(％)＝N_t/N₀×100％

式中，N_t为在体外人工模拟胃液或人工模拟肠液中孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N₀为人工模拟胃液或人工模拟肠液中添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。

按照以下公式计算释放率：

释放率(％)＝(W_t-W₀)/W₀×100％

式中，Wt为样品起始重量；W₀为样品在体外模拟人工模拟胃液和人工模拟肠液中孵育一定时间后重量。

结果见表1和表2。

表1平均粒径变化

表2

由上表可知，本发明实施例1-3制得的炎性肠病复合益生菌制剂在人工模拟胃液中能保持较好的完整性，且粒径变化不大，转移至人工模拟肠液中后，粒径迅速增大，微胶囊结构发生崩塌，变为更松散的结构，释放益生菌，说明该微胶囊能抵抗胃酸的特性，具有较好的肠道靶向输送益生菌和活性组分的效果。

测试例2

将24只8周龄C57BL/6N小鼠随机分为27组，每组6只，即对照组、模型组、美沙拉秦组、实施例1-5组、对比例1-20组。适应性饲养1周后，对照组小鼠自由饮水，其余各组饮用水换为含有30g/L葡聚糖硫酸钠的饮用水自由饮用7d诱导小鼠IBD模型。对照组及模型组每天用生理盐水灌胃0.2mL/d，美沙拉秦组将美沙拉秦溶于生理盐水中，按30mg/kg灌胃小鼠实施例1-5组和对比例1-20组，将制得的炎性肠病复合益生菌制剂，按100mg/kg灌胃小鼠其余饲养条件如温度、湿度、光照、饲料均一致，每天监测体质量，大便性状以及大便隐血情况，第8天处死小鼠，整个实验过程持续1周。

大便情况疾病活动度(DAI)评分：检测各组小鼠大便情况疾病活动度，按评分表(表3分析各组的病症情况。

表3

评分	大便性状	隐血或血便
			0分	正常	阴性
1分	软便	阴性
			2分	软便	隐血阳性
3分	腹泻	隐血阳性

肠黏膜损伤评价：给予受试样品8d后，剪取盲肠末端至肛门的完整结肠、直肠肠管，观察各组小鼠结肠变化，制作石蜡切片，进行HE染色后观察病理组织学变化，并按肠黏膜损伤评分表(表4)进行评分。

表4

肠黏膜损伤程度	肠黏膜组织结构变化
		1级	正常肠黏膜绒毛
2级	上皮下间隙扩大，通常在长绒毛顶端，常有上皮充血
		3级	上皮下间隙扩张，伴有中等程度的上皮层从肠黏膜固有层脱落
4级	肠黏膜侧面大块上皮脱落，大顶端部分长绒毛变光滑
		5级	肠绒毛变光滑，毛细血管扩张，肠黏膜固有层细胞构成增加
6级	肠黏膜固有层消化和分界，出血和出现溃疡

结果见表5。

表5

注：*为与对照组相比，P＜0.05；#为与模型组相比，P＜0.05。

由上表可知，本发明实施例1-3制得的炎性肠病复合益生菌制剂能明显改善肠炎症状，修复肠黏膜组织损伤，有较好的抗炎作用。

血清炎症因子检测：小鼠眼眶采血，4℃下3000r/min离心15min，取上清，采用ELISA试剂盒测定血清中IL-10、IL-6、IL-1β、IL-17水平。

结果见表6。

表6

注：*为与对照组相比，P＜0.05；#为与模型组相比，P＜0.05。

由上表可知，本发明实施例1-3制得的炎性肠病复合益生菌制剂能明显降低小鼠血清中炎症因子的水平，具有良好的抗炎效果。

实施例4、5与实施例3相比，维生素B为单一的维生素B1或维生素B6。对比例10、11与实施例3相比，步骤S7中未添加色氨酸或维生素B。对比例12与实施例3相比，步骤S7中未添加色氨酸和维生素B，DAI评分和肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。色氨酸是人类不能自己合成，必须通过外界获得的芳香族氨基酸，可以通过肠道微生物群代谢产生吲哚、芳烃受体和孕烷x受体激动剂，对粘膜免疫力和体内平衡具有多种作用，本发明在发酵底物中添加色氨酸，在发酵过程中，益生菌已经将部分色氨酸发酵产生吲哚、芳烃受体和孕烷X受体激动剂，进入人体后可以直接参与人体反应，另一部分色氨酸继续被体内益生菌利用，发挥长效的调节作用，另外，本发明添加的维生素B，包括维生素B1和维生素B6，能够较好的促进益生菌的生长生殖，其中维生素B1可以提高益生菌的抗性，维生素B6可以延长益生菌稳定期，从而提高益生菌的存活率，提高有益产物的生产生成。

对比例1、2与实施例3相比，未进行步骤S1，步骤S3中未添加浆果多酚，或者，未进行步骤S2，步骤S3中未添加蛋白肽美拉德产物，DAI评分和肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。对比例3与实施例3相比，步骤S3中未添加浆果多酚和蛋白肽美拉德产物。本发明采用富含多酚类物质的浆果，包括黑枸杞、石榴、桑葚，以花青素为主，在肠道中复合多酚被代谢成小分子多酚，调节微生物种群，促进肠道益生菌罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌生长，并通过调节促炎细胞因子来减轻肠道炎症。本发明采用大豆蛋白粉和玉米低聚肽与葡萄糖和木糖发生美拉德反应得到的蛋白肽美拉德反应产物能够有效影响微生物群落结构，促进双歧杆菌生长，有效抑制病原菌活性，同时，还具有很好的抗菌，清除自由基及抗突变作用。大豆蛋白粉和玉米低聚肽的添加还能够促进蛋白质吸收，增强机体免疫力的效果，保肝护肝的作用。

对比例4与实施例3相比，未进行步骤S4，DAI评分和肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。布拉氏酵母菌的细胞壁厚，最内层β-葡聚糖含量高，具有良好的耐温性能。另外，布拉氏酵母菌可以有效抑制念珠菌，一，通过降低丝状化，减少生物膜的形成进行抑菌；二，通过分泌的代谢物具有抗黏附性，其分泌物包括癸酸、2-苯乙醇，葵酸对菌丝形成具有显著抑制效果，同时，高浓度癸酸可以杀死念珠菌。2-苯乙醇对菌丝形成有抑制作用；三，通过分泌抗毒素蛋白及抗菌物质进行抑菌，包括胞外蛋白酶、碱性磷酸酶、表面蛋白黏附素、脂肪酸、抗菌物质多胺等，其中，胞外蛋白酶能降解艰难梭菌产生的毒素(包括毒素A和毒素B)，减少毒素对肠细胞表面的结合，保护肠道免受毒素侵害；碱性磷酸酶通过去磷酸化作用抑制大肠杆菌内毒素活性，表面蛋白黏附素通过中和霍乱弧菌产生的霍乱毒素，抑制霍乱毒素对肠细胞腺苷酸环化酶的激活，降低环腺苷酸过度分泌，减少氯离子流失，维持体细胞正常渗透压，避免水分大量流失，减少腹泻的症状发生；脂肪酸，包括十一烯酸、月桂酸和癸酸等，可以起到较好的抑菌效果；抗菌物质多胺，包括如精胺和亚精胺等，通过提高刷状缘膜酶(乳糖酶、α-葡萄糖苷酶和碱性磷酸酶)的含量，改善机体吸收营养能力，参与多种生理过程并保护细胞免受活性氧累积；四、通过抑制促炎因子(如白介素8、肿瘤坏死因子d等)表达进而减缓炎症反应的进行；五，通过分泌的抗氧化物质具有较好的抗氧化活性，缓解肠炎症状，产生的硫化氢具有保护细胞免受氧化应激的功能。

对比例5、6与实施例3相比，步骤S5中未添加槲皮素或β-葡聚糖。对比例7与实施例3相比，未进行步骤S5，步骤S6中未添加益生元，DAI评分和肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。益生元是不易消化的食品成分，通过选择性刺激结肠中一种或多种细菌的生长和活性，为宿主提供健康益处。本发明益生元包括槲皮素和β-葡聚糖，不仅具有促进益生菌生长的作用，另外，槲皮素是能促进青春双歧杆菌分泌抗炎物质，β-葡聚糖可以降低过氧化物酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的水平，改善免疫球蛋白水平，两者的添加具有协同增效的作用。

对比例8、9与实施例3相比，步骤S6中仅接种了单一的罗伊氏乳杆菌或两歧双歧杆菌，肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。对比例13与实施例3相比，未进行步骤S7。对比例14与实施例3相比，未进行步骤S6、S7。罗伊氏乳杆菌可分泌广谱抗菌物质罗伊氏菌素，进而有效抑制有害菌种的生长，提高机体免疫力。罗伊氏乳杆菌进入人体后可产生乙酸及罗伊氏菌素，乙酸可降低肠道pH值，破坏有害菌的生长环境，抑制病原体的产生，阻止病毒的继续入侵及炎症信号的传导；罗伊氏菌素则引起病原体氧化应激，激活机体CD4⁺细胞，诱导IgG、IgA等免疫球蛋白的产生，增强患儿免疫功能。罗伊氏乳杆菌通过进入肠道后迅速定居增殖，修正肠道菌群失调，阻止轮状病毒对肠道上皮细胞的损伤，促进正常肠道菌群重建，短时间内恢复肠道微生态平衡，降低患儿胃肠激素水平，有效控制腹泻症状，促使胃肠激素水平恢复正常。两歧双歧杆菌具有极好的抗炎作用，通过改变肠道微生物群从而达到缓解IBD、调节氧化应激和炎症介质的目的，可以明显改善肠炎引发的体质量下降、肠上皮损伤、组织损伤等症状，维持肠道的免疫耐受。两歧双歧杆菌还可以通过调节Treg细胞的比例，控制抗炎因子和促炎因子的表达，促进IL-10等抗炎细胞因子的表达，抑制IL-12、IL-17和IL-23等促炎因子的表达。两歧双歧杆菌的代谢产物包括共轭亚油酸、胞外多糖，共轭亚油酸通过抑制炎症细胞能够达到以下效果：1)调节小鼠肠道菌群，如类杆菌数量减少，双歧杆菌数量增多；2)作用于肠上皮细胞，维持肠道屏障；3)调节炎症因子，减轻炎症反应。胞外多糖是一种肠道某些微生物的营养物质，导致微生物代谢和代谢产物的改变，显著增加肠道中双歧杆菌等益生菌的数量，减少产气荚膜梭菌等有害微生物的数量，维持肠道菌群平衡。罗伊氏乳杆菌与两歧双歧杆菌联合使用，可加速肠蠕动，促进肠道吸收功能的恢复，加速宿主肠道微生物群的恢复，维持肠道正常蠕动及水、电解质平衡，有效缓解腹泻症状，胃肠激素水平降低，联合使用具有协同作用。

对比例15与实施例3相比，未进行步骤S8，步骤S10中未添加短链脂肪酸，肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。短链脂肪酸是肠道细菌从内源或饮食来源发酵碳水化合物和蛋白质的最终产物。主要由2-6个碳的饱和脂肪酸组成，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸，其中乙酸、丙酸、丁酸的含量高，效果好。本发明添加了包括乙酸、丙酸、丁酸组合的短链脂肪酸，与益生菌生理活动产生的短链脂肪酸一起，参与调节性T细胞(Tregs)的发育并影响巨噬细胞的活性，以及抗炎细胞因子如IL-10、IL-4的产生，血浆B细胞的增殖，抑制组蛋白去乙酰化酶和激活GPR109A、GPR43、GPR41等，通过调节免疫细胞趋化性、活性氧释放以及细胞因子释放发挥抗炎功能，对微生物病原体产生耐受性。

对比例16与实施例3相比，未进行步骤S9，步骤S10中添加的螯合锌的发酵产物为步骤S7制得的二级发酵产物，肠黏膜损伤评分提高，炎症因子水平提高。锌是人体内多种酶的辅酶，可增强免疫力，加快胃肠黏膜修复，改善肠炎症状促进肠黏膜细胞再生，进而修复肠道黏膜组织，利于肠道对水、电解质的重吸收，缓解临床症状。同时，锌进入人体后可升高肠道免疫球蛋白，提高人体免疫功能，抑制胃蛋白酶分解蛋白质，提高胃黏膜分泌和上皮细胞寿命，进而抑制胃蛋白酶、胃酸的渗透，起到修复胃黏膜的作用。

对比例17与实施例3相比，步骤S10中未进行聚丙烯酸钠接枝。对比例18与实施例3相比，步骤S10中未进行壳聚糖溶液涂覆。对比例19与实施例3相比，步骤S10中仅用海藻酸钠经过钙离子交联得到包覆壳层。对比例20与实施例3相比，未进行步骤S10，DAI评分和肠黏膜损伤评分明显提高，炎症因子水平明显提高。益生菌存活率下降，释放率提高，粒径增大。本发明通过聚丙烯酸钠接枝到海藻酸钠主链上，将螯合锌的发酵产物与短链脂肪酸混合后，通过乳化形成小液滴，在钙离子的存在下交联形成壳层，从而将益生菌和营养物质进行有效包埋，通过聚丙烯酸钠的接枝使得壳层的孔隙大大缩小，壳层更密实，进一步与壳聚糖涂层的相互作用后得到的微胶囊具有很好的耐胃酸、耐胆碱的作用，并在肠道中结构会发生崩塌，形成松散的结构，有利于益生菌和活性物质在肠道的靶向释放。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种炎性肠病复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，将黑枸杞、石榴、桑葚混合榨汁，干燥，得到浆果多酚；将大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽与葡萄糖和木糖发生美拉德反应，得到蛋白肽美拉德产物；将碳源、氮源、无机盐、浆果多酚、蛋白肽美拉德产物和水混合制得发酵培养基，并接种活化后的布拉德酵母菌发酵，加入槲皮素、β-葡聚糖，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌发酵，加入色氨酸和维生素B，二次发酵，得到二级发酵产物，加入葡萄糖酸锌混合反应，得到螯合锌的发酵产物，所述螯合锌的发酵产物与乙酸、丙酸、丁酸混合溶于水中，加入乳化剂和聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠，得到的溶液滴加入食用油中乳化，滴加氯化钙固化，在壳聚糖溶液中涂覆，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将黑枸杞、石榴、桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，经过冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将大豆分离蛋白粉和玉米低聚肽混合加入水中，分散均匀，加入葡萄糖和木糖，加热反应，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将碳源、氮源、无机盐、步骤S1制得的浆果多酚、步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和水混合均匀，灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中进行发酵培养，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将槲皮素、β-葡聚糖混合均匀，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将步骤S5制得的益生元加入步骤S4制得的酵母发酵产物中，混合均匀，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，发酵培养，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入色氨酸和维生素B，发酵培养，得到二级发酵产物；

S8.短链脂肪酸的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向步骤S7制得的二级发酵产物中加入葡萄糖酸锌，搅拌混合均匀，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将丙烯酸钠和引发剂加入海藻酸钠溶液中，加热反应，调节溶液pH值，透析，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、步骤S8制得的短链脂肪酸、步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、乳化剂溶于水中，得到水相；将水相滴加入食用油中，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，离心，固体转移到壳聚糖溶液中涂覆，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述黑枸杞、石榴、桑葚的质量比为3-5∶2-4∶1-3；步骤S2中所述大豆分离蛋白粉、玉米低聚肽、葡萄糖和木糖的质量比为5-10∶3-7∶2-4∶1-3，所述加热反应的温度为60-80℃，时间为50-70min。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述碳源、氮源、无机盐、浆果多酚、蛋白肽美拉德产物和水的质量比为7-12∶5-10∶3-5∶5-7∶3-5∶70-100，所述灭菌为紫外线灭菌；步骤S4中所述活化后的布拉德酵母菌的接种量为1-2％，所述发酵培养的温度为37-39℃，时间为24-36h，转速为50-70r/min。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述槲皮素、β-葡聚糖的质量比为3-5∶2-4；步骤S6中所述益生元、酵母发酵产物的质量比为3-5∶15-20，所述活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的接种量分别为2-4％和2-3％，所述发酵培养的温度为34-36℃，时间为24-48h，转速为50-70r/min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述益生菌发酵产物、色氨酸和维生素B的质量比为100∶5-10∶1-2，所述维生素B选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12中的至少一种，优选地，为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为3-5∶1，所述发酵培养的温度为35-37℃，转速为50-70r/min，时间为18-30h；步骤S8中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为5-7∶3-5∶1-2。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S9中所述二级发酵产物和葡萄糖酸锌的质量比为100∶3-5，所述搅拌混合时间为30-50min；步骤S10中所述丙烯酸钠、引发剂和海藻酸钠溶液的质量比为1∶0.01-0.02∶30-50，所述海藻酸钠溶液的含量为5-10wt％，所述加热反应的温度为60-70℃，时间为1-2h，所述调节溶液pH值为7.2-7.5，所述透析时间为2-4天，所述聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、短链脂肪酸、发酵产物、乳化剂的质量比为100∶7-12：40-70∶3-5，所述乳化条件为12000-15000r/min，时间为3-5min，所述氯化钙溶液的含量为3-5wt％，所述常温固化的时间为30-40min，所述壳聚糖溶液为pH＝5.5-6的0.5-1wt％的壳聚糖溶液，所述涂覆时间为10-20min。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，50-70r/min转速下，35-37℃活化培养12-18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸-10⁹cfu/mL。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1.浆果多酚的制得：将3-5重量份黑枸杞、2-4重量份石榴、1-3重量份桑葚混合后榨汁，过滤，得到浆果汁，经过冷冻干燥，得到浆果多酚；

S2.蛋白肽的美拉德反应：将5-10重量份大豆分离蛋白粉和3-7重量份玉米低聚肽混合加入100重量份水中，分散均匀，加入2-4重量份葡萄糖和1-3重量份木糖，加热至60-80℃，反应50-70min，冷冻干燥，得到蛋白肽美拉德产物；

S3.发酵培养基的制备：将7-12重量份碳源、5-10重量份氮源、3-5重量份无机盐、5-7重量份步骤S1制得的浆果多酚、3-5重量份步骤S2制得的蛋白肽美拉德产物和70-100重量份水搅拌混合10-20min，紫外线灭菌，得到发酵培养基；

S4.布拉德酵母菌的发酵：将活化后的布拉德酵母菌接种至步骤S3制得的发酵培养基中，接种量为1-2％，37-39℃，50-70r/min，发酵培养24-36h，得到酵母发酵产物；

S5.益生元的制备：将3-5重量份槲皮素、2-4重量份β-葡聚糖搅拌混合10-20min，得到益生元；

S6.益生菌的发酵：将3-5重量份步骤S5制得的益生元加入15-20重量份步骤S4制得的酵母发酵产物中，混合均匀，接种活化的罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌，接种量分别为2-4％和2-3％，34-36℃，50-70r/min，发酵培养24-48h，得到益生菌发酵产物；

S7.二级发酵：向100重量份步骤S6制得的益生菌发酵产物中加入5-10重量份色氨酸和1-2重量份维生素B，35-37℃，50-70r/min，发酵培养18-30h，得到二级发酵产物；

所述维生素B为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为3-5∶1；

S8.短链脂肪酸的制备：将5-7重量份乙酸、3-5重量份丙酸、1-2重量份丁酸搅拌混合10-20min，制得短链脂肪酸；

S9.锌的螯合：向100重量份步骤S7制得的二级发酵产物中加入3-5重量份葡萄糖酸锌，搅拌混合30-50min，得到螯合锌的发酵产物；

S10.包埋：将1重量份丙烯酸钠和0.01-0.02重量份引发剂加入30-50重量份5-10wt％的海藻酸钠溶液中，加热至60-70℃，反应1-2h，调节溶液pH值为7.2-7.5，透析2-4天，得到聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠；将100重量份聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠、7-12重量份步骤S8制得的短链脂肪酸、40-70重量份步骤S9制得的螯合锌的发酵产物、3-5重量份乳化剂溶于水中，得到水相；将30-50重量份水相滴加入70重量份食用油中，12000-15000r/min乳化3-5min，滴加15-20重量份3-5wt％氯化钙溶液，常温固化30-40min，离心，固体转移到pH＝5.5-6的0.5-1wt％的壳聚糖溶液中涂覆10-20min，离心，洗涤，干燥，得到炎性肠病复合益生菌制剂；

布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的活化方法为将布拉德酵母菌、罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种至高氏培养基中，50-70r/min转速下，35-37℃活化培养12-18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸-10⁹cfu/mL。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的炎性肠病复合益生菌制剂。

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