CN114711435A - 膳食纤维益生菌组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品技术领域，具体公开了膳食纤维益生菌组合物及其制备方法。该膳食纤维益生菌组合物，以人参膳食纤维、燕麦β‑葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌微胶囊为原料，各物质间相互作用，协同增效，有效调节肠道菌群、促进食物消化、增加肠蠕动，防止便秘。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，尤其涉及膳食纤维益生菌组合物及其制备方法。
背景技术
国际食品法典委员认为膳食纤维是由10个或以上单体链节的组成的碳水化合物，且一般不能够被人体小肠内生酶水解；美国谷物化学家协会则提出，膳食纤维是一种能抗人体小肠消化吸收，在人体大肠能部分或全部发酵的可食用的植物性成分，以及碳水化合物及其相类似物质的总和。膳食纤维按照其水溶性的不同，可以分为水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维两大类，根据膳食纤维的分类和来源，消费者可以根据自己的需要有目的性的选择，改善健康水平。研究表明膳食纤维具有多种生理功能，防止便秘、降低血压、降低胆固醇、预防癌症、清除毒素、保护口腔等功能。
益生菌是一类能调节人体肠道菌群结、增强有益菌数量增加和减少致病菌的活菌制剂。食用益生菌制品可以有效维持肠道微生物菌群数量，对人体的生理功能正常运行起到维持作用，达到预防疾病发生的目的。
目前，已有一些膳食纤维益生菌组合物被研发、应用，用于清除毒素、预防疾病等功能，但是益生菌在制备、储存过程中易受温度、氧气、其他物质的影响导致益生菌数量下降；在消化过程中易受胃酸、胆汁的影响导致益生菌难以在肠道内定植。
CN113854568A公开了一种复合益生菌膳食纤维组合物及其应用和保健食品，所述组合物用于缓解非典型抗精神病药物所致的体重增加，所述组合物由以下组分组成：膳食纤维和益生菌，所述益生菌和膳食纤维的质量比为1:30-40，所述膳食纤维包括可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维，所述可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维的质量比为8-10:1；所述益生菌的活菌数不低于5.0×107CFU/g。上述复合益生菌膳食纤维组合物的使用能够有效缓解非典型抗精神病药物所致的体重增加。但是本发明中采用的益生菌在制备、储存过程中易受温度、氧气、其他物质的影响导致益生菌数量下降；在消化过程中易受胃酸、胆汁的影响导致益生菌难以在肠道内定植，影响治疗效果。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了一种膳食纤维益生菌组合物及其制备方法。
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：10-15重量份人参膳食纤维、5-8重量份燕麦β-葡聚糖、3-6重量份蚕蛹蛋白肽、1-3重量份益生菌。
所述益生菌为短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌中的一种或两种以上混合物。优选的，所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比(1-3)：(1-3)：(1-3)混合而成。
燕麦β-葡聚糖是存在于燕麦胚乳和糊粉层细胞壁之间的一种非淀粉多糖，燕麦β-葡聚糖是一种水溶性多糖，具有良好的降血脂、降血糖、提高免疫力等作用，且在结肠内可被肠道内特定菌群分解为短链脂肪酸，从而在肠道内促进益生菌生长、调节肠道菌群的作用，且燕麦β-葡聚糖能够提高粪便持水力，起到润肠通便的作用。
本发明采用的人参膳食纤维为不可溶性膳食纤维，人参膳食纤维能够机械促进肠壁组织、促进肠蠕动，加快食物残渣在场内通过的时间，方便便秘。
短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌能够补充肠道内益生菌，且在肠道内形成天然生物屏障，减少致病菌的易位，同时能有效调节肠道pH值，减少内毒素的形成。燕麦β-葡聚糖、人善膳食纤维促进益生菌数量的同时改善益生菌的定植，起到润肠通便的能力。但是益生菌在储存过程中易受温度、氧气、其他物质的影响导致益生菌数量下降；在消化过程中易受胃酸、胆汁的影响导致益生菌难以在肠道内定植。
进一步优选的，膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：
10-15重量份不溶性膳食纤维、5-8重量份水溶性膳食纤维、1-3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以1-3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在32-37℃、以100-200r/min转速培养20-24h，然后在0-4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、壳聚糖、水的质量比为(5-10):(2-6):(80-120)；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为(3-7):(2-4):(80-100)；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以100-200r/min搅拌10-20min，然后加热至70-80℃反应10-20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为(1-3):1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为(1-2):1混合均匀。
发菜又称为发状念珠藻，发菜细胞在生长过程中向细胞外分泌大量胶状物质，包裹在发菜细胞外，形成胶质鞘，胶质鞘的主要成分是发菜多糖。发菜多糖是一种水溶性酸性杂多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等组成，具有抗氧化、抗病毒、抗凝血、促进免疫力等生物活性。大豆分离蛋白具有良好的成膜性，以大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖、海藻酸盐为壁材，益生菌为芯材，制备益生菌微胶囊，壁材中大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖通过不同分子间互相作用形成致密网络，改善益生菌活性、提高其在模拟胃酸环境中的存活率。
但是壳聚糖自身溶解性能差，不溶于水，极大的限制其应用，本发明采用对壳聚糖进行羧基化处理，大大改善了壳聚糖的溶解性、水溶性，但是氢键的大幅度降低，结构对称性破坏，稳定性降低，在上述基础上引入香草酸、熊果酸，得到两亲性壳聚糖，从而改善其稳定性，同时咖啡酸、熊果酸的引入有效降低肠道内大肠杆菌、肠球菌的数量，进而在肠道能释放益生菌，促进益生菌增殖，改善肠道性能。采用大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖、海藻酸盐为壁材对益生菌进行处理，制备益生菌微胶囊，提高益生菌在存活率及其生物利用度。
进一步优选的，所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以1-3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在32-37℃、以100-200r/min转速培养20-24h，然后在0-4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为(5-10):(2-6):(80-120)；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为(3-7):(2-4):(80-100)；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以100-200r/min搅拌10-20min，然后加热至70-80℃反应10-20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为(1-3):1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比比为(1-2):1混合均匀。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖、氢氧化钠加入15-20wt％的异丙醇水溶液中混合均匀，在20-25℃、以100-300r/min转速搅拌反应30-60min，得到壳聚糖混合溶液，所述壳聚糖、氢氧化钠、异丙醇水溶液的质量比为(1-3):(3-5):(50-80)；将一氯乙酸加入异丙醇中混合均匀，得到一氯乙酸溶液，所述一氯乙酸、异丙醇的质量比为(1-2):1；将一氯乙酸溶液加入壳聚糖混合溶液中混合均匀，在20-25℃、以100-300r/min转速继续搅拌反应3-4h，然后调节pH至中性，离心取上清液，再加入60-70wt％的乙醇水溶液，离心取沉淀，干燥，得到预处理壳聚糖，所述一氯乙酸溶液、壳聚糖混合溶液的质量比为1:(1-4)，所述壳聚糖混合溶液、乙醇水溶液的质量比为(1-3):(3-5)；
(2)将预处理壳聚糖加入0.1-0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到预处理壳聚糖溶液，所述预处理壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:(30-50)；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在0-4℃保持1-2h，得到改性剂溶液，所述改性剂、无水乙醇/MES缓冲液的质量比为1:(10-20)，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、0.1-0.2mol/L的MES缓冲液按质量比1：(6-9)混合而成，所述改性剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1-2):(0.5-1):(0.5-1)；将改性剂溶液加入预处理壳聚糖溶液中混合均匀，然后分别采用0.5-1mol/L的HCl、0.5-1mol/L的NaOH水溶液调节pH至5-7，在室温下以100-200r/min搅拌反应10-12h，再用0.5-1mol/L的HCl调节pH至5-6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖，所述改性剂溶液、预处理壳聚糖溶液的质量比为(1-3):(8-10)，所述预处理壳聚糖溶液、无水乙醇的质量比为1:(1-3)。
所述改性剂为咖啡酸、熊果酸中的一种或两种混合物。优选的，所述改性剂由咖啡酸、熊果酸按质量比(1-3)：(1-3)混合而成。
本发明还公开了一种膳食纤维益生菌组合物的制备方法。
膳食纤维益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：按重量份计，将人参膳食纤维、燕麦β-葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌/益生菌微胶囊加入到混合机中搅拌均匀，得到膳食纤维益生菌组合物。
本发明的有益效果：
1、本发明公开了一种膳食纤维益生菌组合物，以人参膳食纤维、燕麦β-葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌微胶囊为原料，各物质间相互作用，协同增效，有效调节肠道菌群、促进食物消化、增加肠蠕动，防止便秘。
2、本发明以大豆分离蛋白、发菜多糖、改性壳聚糖、海藻酸盐为壁材，益生菌为芯材，制备益生菌微胶囊，壁材中大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖通过不同分子间互相作用形成致密网络，改善益生菌活性、提高其在模拟胃酸环境中的存活率。同时采用香草酸、熊果酸对壳聚糖改性，一方面改善壳聚糖的稳定性，另一方面咖啡酸、熊果酸的引入有效降低肠道内大肠杆菌、肠球菌的数量，进而在肠道能释放益生菌，促进益生菌增殖，改善肠道性能。
3、本发明中各物质间相互作用，治疗效果明显，且能能很好地保留原料中的有效成分，制备简单，无毒副作用。
具体实施方式
实施例采用各物质的来源：
短双歧杆菌，Bifidobacterium breve，菌种编号：CGMCC1.3001，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
鼠李糖乳杆菌，Lactobacillus rhamnosus，菌种编号：CGMCC1.549，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
嗜热链球菌，Streptococcus thermophilus，菌种编号：CGMCC1.6472，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例中采用的人参膳食纤维的制备方法，包括以下步骤：将人参干燥、粉碎过100目筛，得到人参粉末；将人参粉末加入水中混合均匀，浸泡15h，离心取沉淀、干燥，得到人参膳食纤维，所述人参粉末、水的质量比为1:30。
发菜多糖，来源于发状念珠藻，外观：粉末疏松、无结块，无肉眼可见的杂质，粒度：80-120目，水分：≤5％，菌落总数：＜1000，购买自宁夏香草生物技术有限公司。
燕麦β-葡聚糖，货号：369，食品级，购买自山东豫之兴生物科技有限公司。
蚕蛹蛋白肽，货号：FM02-121510，购买自陕西飞米生物科技实力供应。
大豆分离蛋白，食品级，货号：54522021，购买自南京松冠生物科技有限公司。
MRS肉汤培养基，货号：A12726，购买自西亚化学科技(山东)有限公司。
实施例1
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
实施例2
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在37℃、以180r/min转速培养20h，然后在4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、壳聚糖、水的质量比为8:5:100；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为6:4:100；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以200r/min搅拌15min，然后加热至80℃反应20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为2:1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为2:1混合均匀。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
实施例3
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在37℃、以180r/min转速培养20h，然后在4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为8:5:100；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为6:4:100；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以200r/min搅拌15min，然后加热至80℃反应20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为2:1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为2:1混合均匀。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖、氢氧化钠加入20wt％的异丙醇水溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速搅拌反应60min，得到壳聚糖混合溶液，所述壳聚糖、氢氧化钠、异丙醇水溶液的质量比为2:3:50；将一氯乙酸加入异丙醇中混合均匀，得到一氯乙酸溶液，所述一氯乙酸、异丙醇的质量比为2:1；将一氯乙酸溶液加入壳聚糖混合溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速继续搅拌反应4h，然后调节pH至中性，离心取上清液，然后加入70wt％的乙醇水溶液，离心取沉淀，干燥，得到预处理壳聚糖，所述一氯乙酸溶液、壳聚糖混合溶液的质量比为1:4，所述壳聚糖混合溶液、乙醇水溶液的质量比为2:3；
(2)将预处理壳聚糖加入0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到预处理壳聚糖溶液，所述预处理壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:50；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在4℃保持1h，得到改性剂溶液，所述改性剂、无水乙醇/MES缓冲液的质量比为1:15，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、0.2mol/L的MES缓冲液按质量比1：9混合而成，所述改性剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5:0.5；将改性剂溶液加入预处理壳聚糖溶液中混合均匀，然后分别采用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH水溶液调节pH至6.5，在室温下以200r/min搅拌反应12h，再用1mol/LHCl调节pH至6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖，所述改性剂溶液、预处理壳聚糖溶液的质量比为3:10，所述预处理壳聚糖溶液、无水乙醇的质量比为1:2。所述改性剂由咖啡酸、熊果酸按质量比1：2混合而成。
实施例4
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在37℃、以180r/min转速培养20h，然后在4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为8:5:100；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为6:4:100；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以200r/min搅拌15min，然后加热至80℃反应20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为2:1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为2:1混合均匀。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖、氢氧化钠加入20wt％的异丙醇水溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速搅拌反应60min，得到壳聚糖混合溶液，所述壳聚糖、氢氧化钠、异丙醇水溶液的质量比为2:3:50；将一氯乙酸加入异丙醇中混合均匀，得到一氯乙酸溶液，所述一氯乙酸、异丙醇的质量比为2:1；将一氯乙酸溶液加入壳聚糖混合溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速继续搅拌反应4h，然后调节pH至中性，离心取上清液，然后加入70wt％的乙醇水溶液，离心取沉淀、干燥，得到预处理壳聚糖，所述一氯乙酸溶液、壳聚糖混合溶液的质量比为1:4，所述壳聚糖混合溶液、乙醇水溶液的质量比为2:3；
(2)将预处理壳聚糖加入0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到预处理壳聚糖溶液，所述预处理壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:50；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在4℃保持1h，得到改性剂溶液，所述改性剂、无水乙醇/MES缓冲液的质量比为1:15，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、0.2mol/L的MES缓冲液按质量比1：9混合而成，所述改性剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5:0.5；将改性剂溶液加入预处理壳聚糖溶液中混合均匀，然后分别采用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH水溶液调节pH至6.5，在室温下以200r/min搅拌反应12h，再用1mol/LHCl调节pH至6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖，所述改性剂溶液、预处理壳聚糖溶液的质量比为3:10，所述预处理壳聚糖溶液、无水乙醇的质量比为1:2。所述改性剂为咖啡酸。
实施例5
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在37℃、以180r/min转速培养20h，然后在4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为8:5:100；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为6:4:100；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以200r/min搅拌15min，然后加热至80℃反应20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为2:1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为2:1混合均匀。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖、氢氧化钠加入20wt％的异丙醇水溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速搅拌反应60min，得到壳聚糖混合溶液，所述壳聚糖、氢氧化钠、异丙醇水溶液的质量比为2:3:50；将一氯乙酸加入异丙醇中混合均匀，得到一氯乙酸溶液，所述一氯乙酸、异丙醇的质量比为2:1；将一氯乙酸溶液加入壳聚糖混合溶液中混合均匀，在25℃、以200r/min转速继续搅拌反应4h，然后调节pH至中性，离心取上清液，然后加入70wt％的乙醇水溶液，离心取沉淀，干燥，得到预处理壳聚糖，所述一氯乙酸溶液、壳聚糖混合溶液的质量比为1:4，所述壳聚糖混合溶液、乙醇水溶液的质量比为2:3；
(2)将预处理壳聚糖加入0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到预处理壳聚糖溶液，所述预处理壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:50；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在4℃保持1h，得到改性剂溶液，所述改性剂、无水乙醇/MES缓冲液的质量比为1:15，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、0.2mol/L的MES缓冲液按质量比1：9混合而成，所述改性剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5:0.5；将改性剂溶液加入预处理壳聚糖溶液中混合均匀，然后分别采用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH水溶液调节pH至6.5，在室温下以200r/min搅拌反应12h，再用1mol/L的HCl调节pH至6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖，所述改性剂溶液、预处理壳聚糖溶液的质量比为3:10，所述预处理壳聚糖溶液、无水乙醇的质量比为1:2。所述改性剂为熊果酸。
实施例6
膳食纤维益生菌组合物，由以下重量份原料组成：15重量份人参膳食纤维、8重量份燕麦β-葡聚糖、6重量份蚕蛹蛋白肽、3重量份益生菌微胶囊。
所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，在37℃、以180r/min转速培养20h，然后在4℃下离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为8:5:100；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为6:4:100；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中以200r/min搅拌15min，然后加热至80℃反应20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为2:1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为2:1混合均匀。
所述益生菌由短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌按质量比2：1：1混合而成。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖加入0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到壳聚糖溶液，所述壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:50；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在4℃保持1h，得到改性剂溶液，所述改性剂、无水乙醇/MES缓冲液的质量比为1:15，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、0.2mol/L的MES缓冲液按质量比1：9混合而成，所述改性剂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5:0.5；将改性剂溶液加入壳聚糖溶液中混合均匀，然后分别采用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH水溶液调节pH至6.5，在室温下以200r/min搅拌反应12h，再用1mol/L的HCl调节pH至6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖，所述改性剂溶液、壳聚糖溶液的质量比为3:10，所述壳聚糖溶液、无水乙醇的质量比为1:2。所述改性剂为熊果酸。
测试例1
耐胃酸测试：称取0.6g各实施例制备的益生菌微胶囊，将其分散于5mL模拟胃液中混合均匀，得到样品溶液；将样品溶液在温度37℃下震荡培养2.5h，并每隔30min移取0.5mL样品溶液于模拟胃液中震荡培养2h，使菌体释放完全，从中移取0.5mL进行梯度稀释，采用MRS琼脂培养基倾注培养法进行活菌计数。
模拟胃液的制备方法为：2.0g NaCl和7mL 36％的HCl溶液溶解于900mL去离子水中，调节pH值至1.2，加入3.2g胃蛋白酶，定容至1000mL，4℃贮存备用，得到模拟胃液。
表1益生菌微胶囊的耐胃酸测试结果
由表1可知，本发明制备的益生菌微胶囊在经过模拟胃酸处理后，活菌数仍能达到108CFU/g，因此本发明制备的益生菌微胶囊具有良好的耐酸性能。本发明以大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖、海藻酸盐为壁材，益生菌为芯材，制备益生菌微胶囊，壁材中大豆分离蛋白、发菜多糖、改性壳聚糖通过不同分子间互相作用形成致密网络，改善益生菌活性、提高其在模拟胃酸环境中的存活率。本发明采用咖啡酸、熊果酸对壳聚糖进行改性得到两亲性壳聚糖，咖啡酸、熊果酸中的疏水基团相互束缚，有效减少益生菌在酸性胃液中释放。
测试例2
将各实施例制备的益生菌微胶囊分别进行稳定性测试，测试方法为：在4.0℃下储存90天，测定活菌数。
表2益生菌微胶囊的稳定性测试结果
由表2可知，实施例3-4本发明制备的益生菌微胶囊的活菌数达到109CFU/g，具有良好的储存稳定性。实施例1中益生菌微胶囊储存90天后活菌数明显下降，其可能归因于储存环境、空气等因素影响，降低存活率。
测试例3
调节肠道菌群结构研究：选择18-22g的SPF级雄性小鼠70只，在22℃、相对湿度46-50％条件下适应性培养3天，将小鼠随机分为7组，分别为空白对照组、实施例1给药组、实施例2给药组、实施例3给药组、实施例4给药组、实施例5给药组、实施例6给药组，每组10只。于造模前1天上午禁食不禁水24h。按人体推荐量10g/d计算，各实施例膳食纤维益生菌组合物的给药量相当于人体推荐量的4倍，受试药物配制好后按BW体积给小鼠灌胃，空白对照组灌胃予以生理盐水，每天一次，连续14天后，无菌采集粪便，检测肠道菌群。
在给予受试药品之前，无菌采取小鼠粪便0.1g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上。培养后，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。最后一次给予受试样品之后24h，与实验前同样方式取直肠粪便，检测肠道菌群(n＝10，logCFU/g)。
表3调节肠道菌群(logCFU/g)测试结果
| 双歧杆菌 | 肠杆菌 | 肠球菌 | |
| 实施例1 | 8.31 | 12.81 | 12.54 |
| 实施例2 | 10.14 | 11.56 | 11.45 |
| 实施例3 | 13.25 | 8.74 | 8.23 |
| 实施例4 | 12.47 | 9.01 | 9.12 |
| 实施例5 | 12.02 | 9.69 | 9.78 |
| 实施例6 | 11.26 | 10.48 | 10.31 |
| 空白对照组 | 7.8 | 13.41 | 13.69 |
通过实施例3与实施例1进行对比发现，实施例3制备的膳食纤维益生菌组合物使的试验小鼠粪便中的双歧杆菌的数量增加，降低肠杆菌、肠球菌数量，具有良好的调节肠道菌群的效果，其可能的原因是：在壳聚糖上引入香草酸、熊果酸，得到两亲性壳聚糖，一方面改善益生菌微胶囊稳定性，另一方面咖啡酸、熊果酸协同效应，有效降低肠道内大肠杆菌、肠球菌的数量，进而在肠道能释放益生菌，促进益生菌增殖，改善肠道性能。采用大豆分离蛋白、发菜多糖、壳聚糖、海藻酸盐为壁材对益生菌进行处理，制备益生菌微胶囊，提高益生菌在存活率及其生物利用度。
测试例4
选取70位便秘患者，年龄30-55岁，符合便秘罗马Ⅲ标准；病程最少半年；近一周内未服用影响胃肠道动力药物；诊断IBS依据不足；结肠镜或结肠造影检查排除肠道器质性病变及由全身性疾病引起的便秘；近三月满足以下两项或两项以上症状：
①至少25％的排便感到费力；
②至少25％的排便为干球状便或硬便；
③至少25％的排便有不尽感；
④至少25％的排便有肛门直肠的阻塞感；
⑤排便次数每周少于3次。
按受试者的便秘症状随机分为7组，实施例1给药组、实施例2给药组、实施例3给药组、实施例4给药组、实施例5给药组、实施例6给药组、空白组，各组年龄、性别、日常饮食、便秘原因无统计学差异。空白组患者服用淀粉安慰剂，每日3次，每次5g，连续服用14日。
表4评判标准
改善率＝(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100％
改善率>50％为显效
改善率<50％且>25％为有效
改善率<25％为无效
总有效率＝显效+有效
表5膳食纤维益生菌组合物治疗效果的测试结果
由表5可知，采用本发明制备的膳食纤维益生菌组合物对便秘治疗效果的总有效率为96.1％，具有良好的润肠通便效果。本发明公开了的膳食纤维益生菌组合物，以人参膳食纤维、燕麦β-葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌微胶囊为原料，各物质间相互作用，协同增效，有效调节肠道菌群、促进食物消化、增加肠蠕动，防止便秘。
Claims (8)
1.膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：包括以下原料：人参膳食纤维、燕麦β-葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌或益生菌微胶囊。
2.如权利要求1所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：由以下重量份原料组成：10-15重量份人参膳食纤维、5-8重量份燕麦β-葡聚糖、3-6重量份蚕蛹蛋白肽、1-3重量份益生菌。
3.如权利要求1所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：由以下重量份原料组成：10-15重量份人参膳食纤维、5-8重量份燕麦β-葡聚糖、3-6重量份蚕蛹蛋白肽、1-3重量份益生菌微胶囊。
4.如权利要求3所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以1-3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，培养20-24h，然后离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、壳聚糖、水的质量比为(5-10):(2-6):(80-120)；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为(3-7):(2-4):(80-100)；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中搅拌10-20min，然后加热至70-80℃反应10-20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为(1-3):1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为(1-2):1混合均匀。
5.如权利要求4所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、将益生菌以1-3％接种量接种到MRS肉汤培养基上，培养20-24h，然后离心取菌泥，得到菌泥；
S2、将大豆分离蛋白、改性壳聚糖加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅰ，所述大豆分离蛋白、改性壳聚糖、水的质量比为(5-10):(2-6):(80-120)；将发菜多糖、海藻酸钠加入水中混合均匀，得到混合溶液Ⅱ，所述发菜多糖、海藻酸钠、水的质量比为(3-7):(2-4):(80-100)；将混合溶液Ⅰ加入混合溶液Ⅱ中搅拌10-20min，然后加热至70-80℃反应10-20min，得到凝胶，所述混合溶液Ⅰ、混合溶液Ⅱ的质量比为(1-3):1；将菌泥加入凝胶中混合均匀，然后洗涤、干燥，得到益生菌微胶囊，所述菌泥、凝胶的质量比为(1-2):1混合均匀。
6.如权利要求5所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖、氢氧化钠加入15-20wt％的异丙醇水溶液中混合均匀，在20-25℃搅拌反应30-60min，得到壳聚糖混合溶液；将一氯乙酸加入异丙醇中混合均匀，得到一氯乙酸溶液，所述一氯乙酸、异丙醇的质量比为(1-2):1；将一氯乙酸溶液加入壳聚糖混合溶液中混合均匀，在20-25℃搅拌反应3-4h，然后调节pH至中性，离心取上清液，再加入60-70wt％的乙醇水溶液，离心取沉淀，干燥，得到预处理壳聚糖；
(2)将预处理壳聚糖加入0.1-0.2mol/L的MES缓冲液中混合均匀，得到预处理壳聚糖溶液，所述预处理壳聚糖、MES缓冲液的质量比为1:(30-50)；将改性剂加入无水乙醇/MES缓冲液中混合均匀，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，在0-4℃保持1-2h，得到改性剂溶液，所述无水乙醇/MES缓冲液由无水乙醇、MES缓冲液按质量比1：(6-9)混合而成；将改性剂溶液加入预处理壳聚糖溶液中混合均匀，调节pH至5-7，在室温下搅拌反应10-12h，再调节pH至5-6，最后加入无水乙醇，离心取沉淀、洗涤、干燥，得到改性壳聚糖。
7.如权利要求6所述的膳食纤维益生菌组合物，其特征在于：所述改性剂为咖啡酸、熊果酸中的一种或两种的混合物。
8.如权利要求1-7任一项所述的膳食纤维益生菌组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：人参膳食纤维、燕麦β-葡聚糖、蚕蛹蛋白肽、益生菌/益生菌微胶囊混合均匀，得到膳食纤维益生菌组合物。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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