CN115919961B - 一种天佛参口服液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种天佛参口服液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种天佛参口服液及其制备方法和应用,属于口服液技术领域。将西洋参、天冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手分别经过水提取得到水提取物和经过乙醇提取得到乙醇提取物,水提取物经过酶解,发酵,加入富硒酵母粉,得到含硒组合物;将蟾酥经过乙醇提取得到蟾酥乙醇提取物,将乙醇提取物、含硒组合物和蟾酥乙醇提取物与锌盐、铁盐反应制得Zn‑Fe‑Se复合中药组合物,通过包埋,加入助剂,制得得到天佛参口服液。本发明制得的天佛参口服液具有很好的增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及口服液技术领域,具体涉及一种天佛参口服液及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病。恶性肿瘤病因主要包括:机体在环境污染,化学污染,如化学毒素,电离辐射,自由基毒素,微生物,如细菌、真菌、病毒等及其代谢毒素,遗传特性,内分泌失衡,免疫功能紊乱等等各种致癌物质,致癌因素的作用下导致身体正常细胞发生癌变的结果。常表现为:局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块,癌症是机体正常细胞在多原因,多阶段与多次突变所引起的一大类疾病。
癌细胞的特点是:无限制、无止境地增生,使患者体内的营养物质被大量消耗,癌细胞释放出多种毒素,使人体产生一系列症状,癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖,导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。与之相对的有良性肿瘤,良性肿瘤则容易清除干净,一般不转移,不复发,对器官,组织只有挤压和阻塞作用,但癌症(恶性肿瘤)还可破坏组织,器官的结构和功能,引起坏死出血合并感染,患者最终由于器官功能衰竭而死亡。
目前治疗恶性肿瘤有许多种手段和方法,比如外科手术、化学药物治疗、放射治疗、免疫治疗等等,这些治疗手段对恶性肿瘤有一定疗效,但是同时也存在严重的不良反应,并且有疗效局限等缺点。
天佛参口服液是关中名医李新民的抗癌经验方,由西洋参、蟾酥、天冬、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘、土贝母、佛手等组成,具有养阴益气,解毒散结的作用,具有显著的抗肿瘤效果,但由于其含糖量较高,不适合伴有糖尿病的肿瘤患者使用,同时由于糖量较高密度较大所以黏性也大,不方便较为虚弱的肿瘤患者吸服,且处方中的蟾蜍存在麻辣感,余味苦且持久,难以服用,影响其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提出一种天佛参口服液及其制备方法和应用,具有很好的增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,各组分之间协同增效,采用本发明酶解、发酵的方法,不仅解决了口服液中多糖含量高的问题,还能对蟾酥乙醇提取物的麻辣口感起到很好的掩蔽作用,制得的天佛参口服液能够与化疗药物联合用药,增强抗肿瘤效果,减少化疗药物的副作用,具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供一种天佛参口服液的制备方法,将西洋参、天冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手分别经过水提取得到水提取物和经过乙醇提取得到乙醇提取物,将水提取物经过复合糖酶酶解,加入丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌发酵,进一步加入富硒酵母粉,从而得到含硒组合物;将蟾酥经过乙醇提取得到蟾酥乙醇提取物,将乙醇提取物、含硒组合物和蟾酥乙醇提取物混合溶于乙醇水溶液中,加入可溶性锌盐和可溶性铁盐,反应制得Zn-Fe-Se复合中药组合物,进一步通过海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素钠包埋,加入助剂,调节pH值为中性,加水,过滤,灌封,灭菌,得到天佛参口服液。
作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将西洋参、天冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,加热沸腾提取,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,加热提取,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将步骤S1制得的水提取物溶于水中,加入复合糖酶,酶解反应,灭酶,得到酶解液;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,活化培养,得到菌种种子液;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,发酵培养,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将向步骤S5制得的发酵液中加入富硒酵母粉,发酵反应,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,加热提取,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将柠檬酸锌、柠檬酸铁溶于乙醇水溶液中,加入步骤S2制得的乙醇提取物、步骤S6制得的含硒组合物、步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合均匀,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素钠溶于去离子水中,加入步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、食品级乳化剂和乙酸乙酯,乳化,滴加氯化钙溶液,常温固化,得到包埋纳米颗粒,继续加入食品级乳化剂,搅拌使得包埋纳米颗粒不聚沉;
S10.天佛参口服液的制备:向步骤S9中的体系中加入甜菊糖苷、山梨醇和木糖醇,调节pH值,加水,过滤,灌封,灭菌,得到天佛参口服液。
作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述西洋参、天冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手的质量比为40-60:150-160:180-220:570-630:900-1100:300-350:150-170,所述中药粉和水的固液比为1:5-10g/mL,每次加热沸腾提取时间为1-3h;步骤S2中滤渣和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,每次加热提取的温度为50-70℃,时间为0.5-1h;步骤S3中所述复合糖酶选自纤维素酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶中的至少两种,所述水提取物和复合糖酶的质量比为10:1-2,所述酶解反应的温度为40-60℃,时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进,所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为3-5:2。
作为本发明的进一步改进,步骤S4中所述活化培养的温度为36-38℃,转速为50-70r/min,时间为12-18h,所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL;步骤S5中所述丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的接种量分别为3-5%、3-4%、1-2%,所述发酵培养的温度为36-38℃,转速为50-70r/min,时间为56-72h;步骤S6中所述发酵液和富硒酵母粉的质量比为100:5-7,所述发酵反应的温度为35-40℃,转速为50-70r/min,时间为18-24h。
作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述蟾酥和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,所述加热提取的温度为50-70℃,时间为0.5-1h;步骤S8中所述柠檬酸锌、柠檬酸铁、乙醇提取物、含硒组合物、蟾酥乙醇提取物的质量比为2-4:3-5:15-20:20-30:5-10;所述乙醇水溶液中乙醇含量为30-40wt%。
作为本发明的进一步改进,步骤S9中所述海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖、羧甲基纤维素钠、Zn-Fe-Se复合中药组合物和食品级乳化剂的质量比为5-10:3-7:4-8:10-12:3-5,所述乳化的转速为12000-15000r/min,时间为3-5min,所述氯化钙溶液的浓缩为3-5wt%,所述常温固化的时间为20-30min,所述食品级乳化剂选自硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、双乙酰酒石酸单甘油酯、蔗糖脂肪酯、蒸馏单甘酯中的至少一种;步骤S10中所述步骤S9中的体系、甜菊糖苷、山梨醇和木糖醇的质量比为1000:2-4:20-30:80-120;所述调节pH值为6.7-7,所述灭菌方法为100-105℃灭菌30-40min。
作为本发明的进一步改进,具体包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将40-60重量份西洋参、150-160重量份天冬、180-220重量份土贝母、570-630重量份倒卵叶五加、900-1100重量份猕猴桃根、300-350重量份沙棘果、150-170重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5-10g/mL,加热沸腾提取1-3h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,加热至50-70℃提取0.5-1h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入10-20重量份复合糖酶,40-60℃酶解反应2-4h,1000W微波灭酶3-5min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为3-5:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,36-38℃,50-70r/min,活化培养12-18h,得到菌种种子液,含菌量为108-109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为3-5%、3-4%、1-2%,36-38℃,50-70r/min,发酵培养56-72h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入5-7重量份富硒酵母粉,35-40℃,50-70r/min,发酵反应18-24h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,加热至50-70℃提取0.5-1h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将4-7重量份柠檬酸锌、6-10重量份柠檬酸铁溶于100重量份30-40wt%的乙醇水溶液中,加入15-20重量份步骤S2制得的乙醇提取物、20-30重量份步骤S6制得的含硒组合物、5-10重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合30-40min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将5-10重量份海藻酸钠、3-7重量份羧甲基茯苓多糖和4-8重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入10-12重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物和0.5-1重量份重量份食品级乳化剂,12000-15000r/min乳化3-5min,滴加3-5wt%氯化钙溶液,常温固化20-30min,得到包埋纳米颗粒,继续加入2.5-4重量份食品级乳化剂,搅拌20-30min;
S10.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S9中的体系中加入2-4重量份甜菊糖苷、20-30重量份山梨醇和80-120重量份木糖醇,调节pH值为6.7-7,加水至1200重量份,过滤,灌封,100-105℃灭菌30-40min,得到天佛参口服液。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的天佛参口服液。
本发明进一步保护一种上述天佛参口服液在制备增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤产品中的应用。
本发明具有如下有益效果:
本发明水提取物中含有丰富的水溶性多糖、醇等活性物质,其中,水溶性多糖在复合糖酶的作用下酶解成小分子寡糖、单糖等,复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,两者均为非淀粉多糖酶,能够破坏植物性饲料的细胞壁,释放营养物质,把可溶性非淀粉多糖切割成小分子,将聚糖降解为寡糖的作用;其中,β-甘露聚糖酶是能够水解含β-1,4-甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶;果胶酶包括半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶,能起到高效的分解果胶;两者协同增效,能起到将大部分多糖酶解成小分子寡糖、单糖的效果,酶解后的酶解液含有丰富的单糖、蛋白质、维生素、微量元素等,通过接种益生菌后,能够提供益生菌丰富的营养,促进益生菌发酵增殖;
本发明益生菌发酵作用下,能够将酶解液中大量的多糖、小分子寡糖、单糖等人类食用后易造成升糖的糖类物质进行分解利用发酵,产生有利于人体健康的短链脂肪酸(丙酸、丁酸等)以及其他营养因子,从而使得进入人体后不易造成血糖明显升高,糖尿病人也可以正常食用,不会对健康造成负面作用;
益生菌可通过调节体内微生物群、减少细菌易位、增强肠道屏障、调节免疫、提升抗炎抗菌机能等机制来预防或治疗癌症,同时,组合使用益生菌的抗肿瘤效果优于单一使用某种益生菌,本发明益生菌包括丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌,嗜酸乳杆菌可提升后续的荷瘤生存率,同时机体内IFN-γ/IL-4的比率也有所升高;可以通过分泌具有抗癌活性的胞外多糖或下调癌细胞内NF-κB相关通路的表达来直接诱导肿瘤细胞凋亡,还具有清除活性氧并中和自由基,以抑制肠道抗坏血酸盐的自氧化和相关酶活,从而抑制肿瘤细胞的增殖与转移;通过与免疫细胞相互作用及促进抗炎细胞因子释放的方式缓解相关炎症,改善肿瘤的不良进展。丁酸梭菌可抑制癌细胞增殖,引起细胞周期停滞,促进细胞凋亡。枯草芽孢杆菌可以拮抗因抗生素产生的免疫细胞减少,促进靶器官微生态环境的恢复,并可以在应用化疗药物的同时,联合使用益生菌,达到增加某些化疗药物的治疗效果,减轻化疗药物产生的副作用。三者的结合能够起到预防肿瘤的作用,诱导肿瘤细胞凋亡,其代谢产物可使致癌物失活,通过增强肠道菌群和宿主饮食中的有效成分间的相互作用来降低患癌风险。
本发明益生菌通过发酵,产生大量的自身及代谢产物影响肠道菌群,通过肺-肠轴的作用调节肺部免疫稳态,改善肺部炎症状态,其中,丁酸作为一种短链脂肪酸,是肠道菌群产生的一类代谢产物,同时也是重要的益生菌代谢产物,能够影响单核细胞等免疫细胞的生成,这些单核细胞迁移到肺部,变成树突状细胞,抑制幼稚T细胞向Th2细胞分化,抑制炎症反应,促进其分化为Treg细胞,维持机体免疫平衡。
进一步,向发酵液中加入富硒酵母菌,通过发酵作用下,产生大量的硒-复合物,硒可以增强人体的抗氧化性,减少机体受到氧化损害,并对人体心肌代谢及人体心血管具有积极作用,并且能够保护细胞膜,调节人体对维生素的吸收以及利用率,可以增强人体的免疫力,能够预防和抑制肿瘤的发生和生长。
同时,硒与金属的结合能力较强,乙醇提取物、含硒组合物和蟾酥乙醇提取物中含有的羧基、羟基、氨基等结构能够通过螯合作用固定锌、铁离子,从而制得Zn-Fe-Se复合中药组合物,能够明显提高机体免疫力,促进机体生长,增强胸腺、脾脏和淋巴的免疫功能,提高T细胞的杀伤活力,增强吞噬细胞功能,从而提高机体对癌细胞的反抗能力。
进一步地,本发明将通过海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素钠复合壳层对制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物进行包埋,形成纳米颗粒,钙离子起到交联剂的作用,从而使得上述复合材料能够形成稳定的壳层,且该壳层能够起到很好的耐酸性能,在胃酸环境中保持完整的形态,而进入碱性的肠道环境中,能够稳定的释放活性物质,从而能够促进益生菌在肠道定植,提高益生菌的存活率,并且将蛋白类活性物质靶向输送至肠道中,制备的包埋纳米颗粒还能够将麻辣口感的和蟾酥乙醇提取物包埋在颗粒内,从而不会使其暴露在外,从而起到很好的口感掩蔽的效果。继续加入表面活性剂后,使得颗粒表面带有相同的电荷,从而相互排斥,能够稳定的悬浮于溶液中,能够稳定、均一的制备成天佛参口服液。
本发明制得的天佛参口服液具有很好的增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,各组分之间协同增效,采用本发明酶解、发酵的方法,不仅解决了口服液中多糖含量高的问题,还能对蟾酥乙醇提取物的麻辣口感起到很好的掩蔽作用,制得的天佛参口服液能够与化疗药物联合用药,增强抗肿瘤效果,减少化疗药物的副作用,具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中各组存活率的对比图;
图2为本发明测试例1中各组释放率的对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
β-甘露聚糖酶,1万U/g,购于郑州奇华顿化工产品有限公司,果胶酶,2.5万U/g,购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。丁酸梭菌,50亿cfu/g,购于洛阳欧科拜克生物技术股份有限公司;枯草芽孢杆菌,200亿CFU/g。购于山东益昊生物科技有限公司;嗜酸乳杆菌,100亿CFU/g。购于西安冰禾生物科技有限公司。富硒酵母粉购于安琪酵母股份有限公司。
实施例1
本实施例提供一种天佛参口服液的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将40重量份西洋参、150重量份天冬、180重量份土贝母、570重量份倒卵叶五加、900重量份猕猴桃根、300重量份沙棘果、150重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5g/mL,加热沸腾提取1h,重复1次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:3g/mL,加热至50℃提取0.5h,重复1次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入10重量份复合糖酶,40℃酶解反应2h,1000W微波灭酶3min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为3:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,36℃,50r/min,活化培养12h,得到菌种种子液,含菌量为108cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为3%、3%、1%,36℃,50r/min,发酵培养56h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入5重量份富硒酵母粉,35℃,50r/min,发酵反应18h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:3g/mL,加热至50℃提取0.5h,重复1次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将4重量份柠檬酸锌、6重量份柠檬酸铁溶于100重量份30wt%的乙醇水溶液中,加入15重量份步骤S2制得的乙醇提取物、20重量份步骤S6制得的含硒组合物、5重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合30min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将5重量份海藻酸钠、3重量份羧甲基茯苓多糖和4重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入10重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.5重量份重量份硬脂酰乳酸钠和120重量份乙酸乙酯,12000r/min乳化3min,滴加3wt%氯化钙溶液,常温固化20min,得到包埋纳米颗粒,继续加入2.5重量份硬脂酰乳酸钠,搅拌20min;
S10.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S9中的体系中加入2重量份甜菊糖苷、20重量份山梨醇和80重量份木糖醇,调节pH值为6.7,加水至1200重量份,过滤,灌封,100℃灭菌30min,得到天佛参口服液。
实施例2
本实施例提供一种天佛参口服液的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将60重量份西洋参、160重量份天冬、220重量份土贝母、630重量份倒卵叶五加、1100重量份猕猴桃根、350重量份沙棘果、170重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:10g/mL,加热沸腾提取3h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:5g/mL,加热至70℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入20重量份复合糖酶,60℃酶解反应4h,1000W微波灭酶5min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为5:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,38℃,70r/min,活化培养18h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为5%、4%、2%,38℃,70r/min,发酵培养72h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入7重量份富硒酵母粉,40℃,70r/min,发酵反应24h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:5g/mL,加热至70℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将7重量份柠檬酸锌、10重量份柠檬酸铁溶于100重量份40wt%的乙醇水溶液中,加入20重量份步骤S2制得的乙醇提取物、30重量份步骤S6制得的含硒组合物、10重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合40min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将10重量份海藻酸钠、7重量份羧甲基茯苓多糖和8重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入12重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、1重量份重量份双乙酰酒石酸单甘油酯和120重量份乙酸乙酯,15000r/min乳化5min,滴加5wt%氯化钙溶液,常温固化30min,得到包埋纳米颗粒,继续加入4重量份双乙酰酒石酸单甘油酯,搅拌30min;
S10.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S9中的体系中加入4重量份甜菊糖苷、30重量份山梨醇和120重量份木糖醇,调节pH值为7,加水至1200重量份,过滤,灌封,105℃灭菌40min,得到天佛参口服液。
实施例3
本实施例提供一种天佛参口服液的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S6制得的含硒组合物、7重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S10.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S9中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
实施例4
与实施例3相比,不同之处在于,复合糖酶为单一的β-甘露聚糖酶。
实施例5
与实施例3相比,不同之处在于,复合糖酶为单一的果胶酶。
对比例1
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S1、S3、S4、S5、S6。
具体如下:
S1.乙醇提取物的制备:将将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入乙醇中,所述中药粉和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S2.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S3.Zn-Fe复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S1制得的乙醇提取物、7重量份步骤S2制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe复合中药组合物;
S4.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S3制得的Zn-Fe复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S5.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S4中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例2
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S2。
具体包括:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S3.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S4.益生菌发酵:将步骤S3制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S2中的酶解液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S5.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S4制得的发酵液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S6.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S7.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入25重量份步骤S5制得的含硒组合物、7重量份步骤S6制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S8.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S7制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S9.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S8中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例3
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S3。
具体如下:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S4.益生菌发酵:将100重量份水提取物溶于500重量份去离子水中,将步骤S3制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至上述溶液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S5.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S4制得的发酵液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S6.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S7.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S5制得的含硒组合物、7重量份步骤S6制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S8.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S7制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S9.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S8中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例4
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中发酵菌仅为丁酸梭菌。
具体如下:
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为8.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液。
对比例5
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中发酵菌仅为枯草芽孢杆菌。
具体如下:
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的枯草芽孢杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为8.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液。
对比例6
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中发酵菌仅为嗜酸乳杆菌。
具体如下:
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为8.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液。
对比例7
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S4、S5。
具体如下:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S4.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S3制得的酶解液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S5.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S6.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S4制得的含硒组合物、7重量份步骤S5制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S7.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S6制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S8.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S7中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例8
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S6。
具体如下:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S6.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S7.Zn-Fe复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S5制得的发酵液、7重量份步骤S6制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe复合中药组合物;
S8.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S7制得的Zn-Fe复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S9.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S8中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例9
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S8中未添加柠檬酸锌。
具体如下:
S8.Fe-Se复合中药组合物的制备:将13重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S6制得的含硒组合物、7重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Fe-Se复合中药组合物。
对比例10
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S8中未添加柠檬酸铁。
具体如下:
S8.Zn-Se复合中药组合物的制备:将13重量份柠檬酸锌溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S6制得的含硒组合物、7重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Se复合中药组合物。
对比例11
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S8。
具体如下:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.包埋:将7重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基茯苓多糖和6重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份组合物(包括步骤S2制得的乙醇提取物、步骤S6制得的含硒组合物、步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物的质量比为17:25:7)、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min;
S9.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S8中的体系中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
对比例12
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S9中仅添加了海藻酸钠。
具体如下:
S9.包埋:将18重量份海藻酸钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min。
对比例13
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S9中仅添加了羧甲基茯苓多糖。
具体如下:
S9.包埋:将18重量份羧甲基茯苓多糖溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min。
对比例14
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S9中仅添加了羧甲基纤维素钠。
具体如下:
S9.包埋:将18重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入11重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.7重量份重量份硬脂酰乳酸钙和120重量份乙酸乙酯,13500r/min乳化4min,滴加4wt%氯化钙溶液,常温固化25min,得到包埋纳米颗粒,继续加入3重量份硬脂酰乳酸钙,搅拌25min。
对比例15
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S9。
具体如下:
S1.水提取物的制备:将50重量份西洋参、155重量份天冬、200重量份土贝母、600重量份倒卵叶五加、1000重量份猕猴桃根、320重量份沙棘果、160重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取2h,重复2次,过滤,合并滤液,有机膜浓缩,70℃干燥2h,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,70℃干燥2h,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入15重量份复合糖酶,50℃酶解反应3h,1000W微波灭酶4min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为4:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,37℃,60r/min,活化培养16h,得到菌种种子液,含菌量为109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为4%、3%、1.5%,37℃,60r/min,发酵培养64h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:将100重量份向步骤S5制得的发酵液中加入6重量份富硒酵母粉,37℃,60r/min,发酵反应22h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,重复2次,过滤,合并滤液,陶瓷膜浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将5重量份柠檬酸锌、8重量份柠檬酸铁溶于100重量份35wt%的乙醇水溶液中,加入17重量份步骤S2制得的乙醇提取物、25重量份步骤S6制得的含硒组合物、7重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合35min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.天佛参口服液的制备:将11重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物溶于100重量份水中,制成溶液,向1000重量份溶液中加入3重量份甜菊糖苷、25重量份山梨醇和100重量份木糖醇,调节pH值为6.8,加水至1200重量份,过滤,灌封,102℃灭菌35min,得到天佛参口服液。
测试例1
将1g实施例1-3和对比例12-14制得的包埋纳米颗粒分别加入到10mL人工模拟胃液和10mL人工模拟肠液中,在37℃、50r/min条件下分别搅拌反应2h和3h,另外,取1g包埋纳米颗粒加入到10mL人工模拟胃液中,先置于摇床中,在37℃、50r/min条件下搅拌反应2h后,离心,再加入10mL人工模拟肠液继续搅拌反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数和称重。
其中:
人工胃液配置:胃蛋白酶10g,稀盐酸16.4mL,定容至1L,调pH为1.2;
人工肠液配置:磷酸二氢钾6.8g,加水500mL,用0.1mol/L的氢氧化钠调pH6.8,加胰蛋白酶10g,定容至1L。
按照以下公式计算存活率:
存活率(%)=Nt/N0×100%
式中,Nt为在体外人工孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g),N0为添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。
按照以下公式计算释放率:
释放率(%)=(Wt-W0)/W0×100%
式中,Wt为样品起始重量;W0为样品在体外孵育一定时间后重量。
结果见图1和图2。本发明实施例1-3制得的包埋纳米颗粒在酸性的人工模拟胃液中能保持较完整的形态,在碱性的人工模拟肠液中,颗粒的壳层发生崩塌,说明该包埋纳米颗粒具有pH响应性,能够耐受胃酸的侵蚀,将活性活性组分靶向输送至肠道环境中,从而提高能够促进益生菌在肠道定植,提高益生菌的存活率,并且提高活性物质的吸收率。
测试例2抗炎效果试验
用含10%FBS,1%双抗的DMEM完全培养基培养RAW264.7细胞,胰酶(含EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入162μL细胞悬液,每组4个复孔。24h后,除对照组孔外,每孔加入18μLLPS(1μg/mL),同时每孔分别加入实施例1-5和对比例1-15制得的天佛参口服液(包埋纳米颗粒经过破碎处理)配制成100μL/mL,取20μL,模型组添加等量去离子水,孵育24h后收集细胞上清,检测细胞上清中NO和TNF-α的水平。
结果见表1。
表1
组别 | NO含量(μmmol/L) | TNF-α含量(pg/mL) |
对照组 | 4.8±0.24 | 125.7±14.2 |
模型组 | 9.7±0.36* | 245.2±40.4* |
实施例1 | 5.7±0.25# | 137.2±23.5# |
实施例2 | 5.6±0.21# | 135.9±19.5## |
实施例3 | 5.3±0.19## | 134.7±22.7## |
实施例4 | 6.1±0.22 | 142.2±19.5 |
实施例5 | 6.2±0.17 | 143.1±21.4 |
对比例1 | 8.4±0.24 | 180.5±20.4 |
对比例2 | 7.6±0.21 | 175.4±23.5 |
对比例3 | 6.4±0.25 | 147.5±21.6 |
对比例4 | 6.6±0.20 | 160.2±19.5 |
对比例5 | 6.4±0.17 | 152.4±17.8 |
对比例6 | 6.5±0.24 | 155.7±18.4 |
对比例7 | 6.9±0.26 | 169.7±18.9 |
对比例8 | 6.3±0.25 | 143.6±20.2 |
对比例9 | 6.4±0.21 | 149.7±21.0 |
对比例10 | 6.2±0.18 | 147.8±24.5 |
对比例11 | 6.1±0.16 | 152.2±23.9 |
对比例12 | 6.0±0.24 | 140.2±25.1 |
对比例13 | 6.1±0.22 | 143.2±24.2 |
对比例14 | 5.9±0.15 | 139.7±19.5 |
对比例15 | 6.3±0.27 | 145.7±19.1 |
注释:*为与对照组相比,P<0.05,#为与模型组相比,P<0.05,##为与模型组相比。
由上表可知,本发明实施例1-3制得的天佛参口服液具有较好的抗炎效果。
测试例3清除羟基自由基能力测定
取具塞试管,分别加入0.2mL的FeSO4-EDTA混合液(10mM)、0.2mL的a-脱氧核糖溶液DR(20mM),然后加入实施例1-5和对比例1-15制得的天佛参口服液(包埋纳米颗粒经过破碎处理)0.2mL,并用PBS缓冲溶液补充至1.8mL,最后加入0.2mL的过氧化氢(10mM),37度水浴1h,以苯甲酸(1mg/mL)和抗坏血酸(1mg/mL)为对照组;加入1mL 10%的三氯乙酸终止反应,在加入1mL1%的硫代巴比妥酸,混匀后沸水浴中加热10min,冷却后离心,取上清,于532nm处测定吸光度。
羟基自由基的清除率%=(A对照-A样品)/A对照*100%
结果见表2。
表2
由上表可知,本发明实施例1-3制得的天佛参口服液具有较好的抗氧化效果。
测试例4对巨噬细胞吞噬能力的影响
用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养巨噬细胞(Raw264.7),调整细胞浓度,将其接种于96孔细胞培养板中,使得细胞浓度为2×104个/孔,每组4个复孔,然后加入实施例1-5和对比例1-15制得的天佛参口服液(包埋纳米颗粒经过破碎处理)配制成100μL/mL,取20μL和10μg/mL的脂多糖(购于美国Sigma-Aldrich公司)20μL。以不加药组为对照。培养24h后吸去培养基,用PBS洗涤多余的培养基,加入0.33%中性红,37℃下,5%CO2孵育30min,PBS缓冲液洗净多余中性红,加细胞裂解液(无水乙醇∶冰醋酸=1∶1,体积比),震荡15mim后,在酶标仪上540nm处测吸光度值,通过吸光值的大小评价样品促进巨噬细胞吞噬中性红能力。
结果见表3
注释:*为与对照组相比,P<0.05,**为与对照组相比,P<0.01。
由上表可知,本发明实施例1-3制得的天佛参口服液具有较好的促进巨噬细胞吞噬中性红能力,从而证明该口服液具有较好的提高免疫力的作用。
测试例5
用含10%FBS、1%双抗的DMEM高糖培养基培养肺癌A549、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3、结肠癌HT-29、肝癌HepG2,取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化、计数后种96孔板,每孔细胞数104个,细胞悬液135μL,每组4个复孔。96孔板置于培养箱常规培养24h后加药,设置空白对照组、实施例1-5和对比例1-15组和阿霉素组,每孔加不同浓度受试物15μL,天佛参口服液中包埋纳米颗粒经过破碎处理。药物孵育24h后,每孔加入MTT溶液20μL(5mg/mL),继续培养4h,然后加入三联裂解液,每孔100μL,于37℃过夜后,酶标仪检测OD570,计算每组对五种肿瘤细胞生长的抑制率,并计算IC50。
结果见表4。
表4
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由上表可知,本发明实施例1-3制得的天佛参口服液具有较好的抗肿瘤活性。
测试例6非小细胞肺癌转移抑制效果
SPF级雄性BALB/c裸鼠,4-6周龄,体质量18-20g,购自北京维通利华技术实验有限公司。将BALB/C裸鼠适应性喂养7d后,随机分为空白组、模型组、阳性药组(吉非替尼用生理盐水稀释成32.5mg/mL溶液动物给药,药物均现配现用)、实施例1-5和对比例1-15组(8mL/kg),每组5只。造模当天取对数生长期的A549细胞胰酶消化,细胞计数后以预冷的0.9%的氯化钠溶液制备成5×105/mL细胞悬液备用。通过裸鼠尾静脉注射0.2mL A549细胞悬液19,造模后24h开始给药,造模后3-4周解剖小鼠,肉眼可见肝脏转移。以给药当天为第1天,各给药组灌胃给予相应的药物,模型组灌胃等体积的生理盐水,1次/d,连续30d。动物给药第35d进行安乐死,剥离肺脏称定质量,计算抑瘤率。
抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量*100%
结果见表5。
表5
组别 | 肺质量(g) | 抑制率(%) |
模型组 | 0.922±0.10 | / |
阳性对照组 | 0.206±0.02* | 77.5±5.7* |
实施例1 | 0.245±0.03* | 72.4±6.4** |
实施例2 | 0.241±0.01** | 73.6±5.2** |
实施例3 | 0.237±0.02** | 74.2±5.9** |
实施例4 | 0.265±0.04 | 69.7±4.7 |
实施例5 | 0.269±0.03 | 68.9±5.1 |
对比例1 | 0.454±0.01 | 42.7±4.4 |
对比例2 | 0.395±0.02 | 47.3±5.2 |
对比例3 | 0.275±0.03 | 65.7±5.7 |
对比例4 | 0.321±0.05 | 55.5±4.8 |
对比例5 | 0.312±0.03 | 56.4±4.4 |
对比例6 | 0.305±0.02 | 54.7±5.5 |
对比例7 | 0.375±0.04 | 52.2±5.2 |
对比例8 | 0.345±0.01 | 50.7±3.7 |
对比例9 | 0.297±0.02 | 56.6±4.2 |
对比例10 | 0.289±0.04 | 57.5±4.0 |
对比例11 | 0.307±0.03 | 54.2±4.8 |
对比例12 | 0.332±0.05 | 52.4±5.9 |
对比例13 | 0.342±0.02 | 51.9±5.1 |
对比例14 | 0.349±0.01 | 51.5±4.7 |
对比例15 | 0.357±0.03 | 49.8±5.0 |
注释:*为与模型组相比,P<0.05,**为与模型组相比,P<0.01。
由上表可知,本发明实施例1-3制得的天佛参口服液对裸鼠移植瘤模型肿瘤生长均具有一定的抑制作用。
实施例4、5与实施例3相比,不同之处在于,复合糖酶为单一的β-甘露聚糖酶或果胶酶。对比例3与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S3,其消炎、抗氧化、增强免疫力、抗癌效果稍有下降,这是因此,没有酶解足够的单糖为益生菌提供发酵原料,从而产生的活性代谢产物量减少。本发明水提取物中含有丰富的水溶性多糖、醇等活性物质,其中,水溶性多糖在复合糖酶的作用下酶解成小分子寡糖、单糖等,复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,两者均为非淀粉多糖酶,能够破坏植物性饲料的细胞壁,释放营养物质,把可溶性非淀粉多糖切割成小分子,将聚糖降解为寡糖的作用;其中,β-甘露聚糖酶是能够水解含β-1,4-甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶;果胶酶包括半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶,能起到高效的分解果胶;两者协同增效,能起到将大部分多糖酶解成小分子寡糖、单糖的效果,酶解后的酶解液含有丰富的单糖、蛋白质、维生素、微量元素等,通过接种益生菌后,能够提供益生菌丰富的营养,促进益生菌发酵增殖。
对比例1与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S1、S3、S4、S5、S6。对比例2与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S2,其消炎、抗氧化、增强免疫力、抗癌效果下降,这是因为水提取物和乙醇提取物均含有丰富的活性物质起到很好的效果。本发明制得的天佛参口服液具有很好的增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,各组分之间协同增效,采用本发明酶解、发酵的方法,不仅解决了口服液中多糖含量高的问题,还能对蟾酥乙醇提取物的麻辣口感起到很好的掩蔽作用,制得的天佛参口服液能够与化疗药物联合用药,增强抗肿瘤效果,减少化疗药物的副作用,具有广阔的应用前景。
对比例4、5、6与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中发酵菌仅为丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌或嗜酸乳杆菌。对比例7与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S4、S5,其消炎、抗氧化、增强免疫力、抗癌效果下降。益生菌可通过调节体内微生物群、减少细菌易位、增强肠道屏障、调节免疫、提升抗炎抗菌机能等机制来预防或治疗癌症,同时,组合使用益生菌的抗肿瘤效果优于单一使用某种益生菌,本发明益生菌包括丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌,嗜酸乳杆菌可提升后续的荷瘤生存率,同时机体内IFN-γ/IL-4的比率也有所升高;可以通过分泌具有抗癌活性的胞外多糖或下调癌细胞内NF-κB相关通路的表达来直接诱导肿瘤细胞凋亡,还具有清除活性氧并中和自由基,以抑制肠道抗坏血酸盐的自氧化和相关酶活,从而抑制肿瘤细胞的增殖与转移;通过与免疫细胞相互作用及促进抗炎细胞因子释放的方式缓解相关炎症,改善肿瘤的不良进展。丁酸梭菌可抑制癌细胞增殖,引起细胞周期停滞,促进细胞凋亡。枯草芽孢杆菌可以拮抗因抗生素产生的免疫细胞减少,促进靶器官微生态环境的恢复,并可以在应用化疗药物的同时,联合使用益生菌,达到增加某些化疗药物的治疗效果,减轻化疗药物产生的副作用。三者的结合能够起到预防肿瘤的作用,诱导肿瘤细胞凋亡,其代谢产物可使致癌物失活,通过增强肠道菌群和宿主饮食中的有效成分间的相互作用来降低患癌风险。
对比例8与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S6,其抗氧化、增强免疫力、抗癌效果下降。向发酵液中加入富硒酵母菌,通过发酵作用下,产生大量的硒-复合物,硒可以增强人体的抗氧化性,减少机体受到氧化损害,并对人体心肌代谢及人体心血管具有积极作用,并且能够保护细胞膜,调节人体对维生素的吸收以及利用率,可以增强人体的免疫力,能够预防和抑制肿瘤的发生和生长。
对比例9、10与实施例3相比,不同之处在于,步骤S8中未添加柠檬酸锌或柠檬酸铁。对比例11与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S8,其抗氧化、增强免疫力效果下降。硒与金属的结合能力较强,乙醇提取物、含硒组合物和蟾酥乙醇提取物中含有的羧基、羟基、氨基等结构能够通过螯合作用固定锌、铁离子,从而制得Zn-Fe-Se复合中药组合物,能够明显提高机体免疫力,促进机体生长,增强胸腺、脾脏和淋巴的免疫功能,提高T细胞的杀伤活力,增强吞噬细胞功能,从而提高机体对癌细胞的反抗能力。
对比例12、13、14与实施例3相比,不同之处在于,步骤S9中仅添加了海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖或羧甲基纤维素钠。对比例15与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S9,其消炎、抗氧化、增强免疫力、MTT试验中细胞试验效果变化不明显,但体内抗癌效果明显下降。本发明将通过海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖和羧甲基纤维素钠复合壳层对制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物进行包埋,形成纳米颗粒,钙离子起到交联剂的作用,从而使得上述复合材料能够形成稳定的壳层,且该壳层能够起到很好的耐酸性能,在胃酸环境中保持完整的形态,而进入碱性的肠道环境中,能够稳定的释放活性物质,从而能够促进益生菌在肠道定植,提高益生菌的存活率,并且将蛋白类活性物质靶向输送至肠道中,制备的包埋纳米颗粒还能够将麻辣口感的和蟾酥乙醇提取物包埋在颗粒内,从而不会使其暴露在外,从而起到很好的口感掩蔽的效果。继续加入表面活性剂后,使得颗粒表面带有相同的电荷,从而相互排斥,能够稳定的悬浮于溶液中,能够稳定、均一的制备成天佛参口服液。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种天佛参口服液的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1.水提取物的制备:将40-60重量份西洋参、150-160重量份天冬、180-220重量份土贝母、570-630重量份倒卵叶五加、900-1100重量份猕猴桃根、300-350重量份沙棘果、150-170重量份佛手晒干,混合,粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5-10g/mL,加热沸腾提取1-3h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到水提取物;
S2.乙醇提取物的制备:将步骤S1中滤渣加入乙醇中,所述滤渣和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,加热至50-70℃提取0.5-1h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩干燥,得到乙醇提取物;
S3.多糖酶解:将100重量份步骤S1制得的水提取物溶于500重量份水中,加入10-20重量份复合糖酶,40-60℃酶解反应2-4h,1000W微波灭酶3-5min,得到酶解液;
所述复合糖酶为β-甘露聚糖酶和果胶酶的混合物,质量比为3-5:2;
S4.益生菌活化:将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌分别接种至高氏培养基中,36-38℃,50-70r/min,活化培养12-18h,得到菌种种子液,含菌量为108-109cfu/mL;
S5.益生菌发酵:将步骤S4制得的丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3中的酶解液中,接种量分别为3-5%、3-4%、1-2%,36-38℃,50-70r/min,发酵培养56-72h,得到发酵液;
S6.含硒组合物的制备:向100重量份步骤S5制得的发酵液中加入5-7重量份富硒酵母粉,35-40℃,50-70r/min,发酵反应18-24h,得到含硒组合物;
S7.蟾酥乙醇提取物的制备:将蟾酥粉碎,加入乙醇中,所述蟾酥和乙醇的固液比为1:3-5g/mL,加热至50-70℃提取0.5-1h,重复1-2次,过滤,合并滤液,浓缩,得到蟾酥乙醇提取物;
S8.Zn-Fe-Se复合中药组合物的制备:将4-7重量份柠檬酸锌、6-10重量份柠檬酸铁溶于100重量份30-40wt%的乙醇水溶液中,加入15-20重量份步骤S2制得的乙醇提取物、20-30重量份步骤S6制得的含硒组合物、5-10重量份步骤S7制得的蟾酥乙醇提取物,搅拌混合30-40min,冷冻干燥,得到Zn-Fe-Se复合中药组合物;
S9.包埋:将5-10重量份海藻酸钠、3-7重量份羧甲基茯苓多糖和4-8重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份去离子水中,加入10-12重量份步骤S8制得的Zn-Fe-Se复合中药组合物、0.5-1重量份食品级乳化剂和120重量份乙酸乙酯,12000-15000r/min乳化3-5min,滴加3-5wt%氯化钙溶液,常温固化20-30min,得到包埋纳米颗粒,继续加入2.5-4重量份食品级乳化剂,搅拌20-30min;
S10.天佛参口服液的制备:向1000重量份步骤S9中的体系中加入2-4重量份甜菊糖苷、20-30重量份山梨醇和80-120重量份木糖醇,调节pH值为6.7-7,加水至1200重量份,过滤,灌封,100-105℃灭菌30-40min,得到天佛参口服液。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的天佛参口服液。
3.一种如权利要求2所述天佛参口服液在制备增强免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤产品中的应用。
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