CN116004483A

CN116004483A - 一种预防或治疗腹泻的格氏乳球菌及其应用

Info

Publication number: CN116004483A
Application number: CN202310219616.7A
Authority: CN
Inventors: 李璟欣; 崔雅倩; 傅芳; 金美玉; 梁嘉钰; 王腾; 项晨; 肖源灵; 向益
Original assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-09
Filing date: 2023-03-09
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2043-03-09
Also published as: CN116004483B

Abstract

本发明公开一种预防或治疗腹泻的格氏乳球菌及其应用，属于微生物医药技术领域。所述格氏乳球菌具有较好的安全性，而且能从抑制多种致病菌、缓解屏障功能障碍、抑制促炎因子表达、增加水通道蛋白的表达等多方面发挥改善化疗相关性腹泻的作用，对需要长期用药的肿瘤患者提供了疗效确切、毒副作用低且适宜长期使用的潜在治疗方案。

Description

一种预防或治疗腹泻的格氏乳球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物医药技术领域，具体涉及一种用于预防/治疗腹泻、特别是化疗相关性腹泻的格氏乳球菌及其应用。

背景技术

腹泻是指排便次数明显超过平时习惯（>3次/d），粪质稀薄，含水量增加（>85%），大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物。腹泻作为一种常规疾病广泛地发生在各年龄段人群中。

化疗相关性腹泻（Chemotherapy induced diarrhea，CID）是肿瘤患者因化疗引起的一种常见消化道毒副反应，轻度腹泻可使患者的生活质量下降，频繁性的严重腹泻可能会导致患者脱水、感染、休克、甚至死亡。因此，严重腹泻患者需要减少化疗药物的剂量甚至中断化疗，影响肿瘤的治疗。流行病学数据显示全球肿瘤患者人数每年大幅增加，预计到2040年，约有300~700万人受化疗相关副作用困扰。

在引起CID的化疗药物中，对于不同的患者，虽然CID发生的广度和严重程度差异很大，但是其中以氟尿嘧啶类（Fluorouracil）和伊立替康（Irinotecan , CPT-11）引起的腹泻发生率最高，可达80%。据报道，CID的发病并非由单一机制造成，组织病理学有证据显示 CID 是一个多因素影响的过程，可能包括肠道运动改变、结肠隐窝损伤、肠道菌群改变、营养代谢改变等多种因素。

CID发病机制至今还不是很明确，比较公认的机制有以下几个方面：1）化疗药物会破坏快速生长的细胞的DNA，导致ROS（活性氧）的产生和细胞凋亡；2）ROS诱导NF-κB激活，进一步上调促炎细胞因子的表达，导致上皮、内皮和结缔组织的损伤。促炎细胞因子，如TNF-α可以进一步影响NF-κB的激活，放大其作用，加重炎症反应；3）肠屏障功能受损，黏膜的完整性受到损害，有害细菌（如艰难梭菌等）定植，造成进一步感染和腹泻。

目前，临床上治疗化疗相关性腹泻，多以阿片类药物、生长抑素类似物、糖皮质激素、胆汁酸螯合剂、抗生素等药物对症治疗，但机制单一，副作用大。例如，阿片类药物（派洛丁胺）大剂量使用时可能引起麻痹性肠梗阻的风险；生长抑素类似物（奥曲肽）可引发胆结石、高血糖、糖耐量异常等副作用；糖皮质激素可能产生系统性影响，增加感染风险，加剧病毒或细菌感染等；胆汁酸螯合剂适用于由胆汁酸吸收不良或脂质过多引起的腹泻，但会出现腹胀、胃肠胀气、便秘等胃肠道副作用。目前治疗方案缺乏专用特效药及预防措施，难以满足不断增长的临床需求。

肠道微生态系统是机体最庞大最重要的微生态系统，肠道微生态失衡与多种疾病的发病机制密切相关。大量研究表明肠道益生菌可通过肠神经、免疫系统、肠内分泌信号等途径调节机体组织、器官功能及行为，进而有益于宿主健康。目前，市场上仅有以双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌和酪酸梭菌等为代表的益生菌可以缓解腹泻症状。然而，对于益生菌防治放化疗相关腹泻的疗效，近年来缺乏大规模高质量前瞻性随机对照试验，且目前系统分析所纳入的研究具有明显异质性，尚不能形成有力的确定性证据，仍需后续进行严谨的临床研究以明确。要针对CID复杂发病机制起到治疗作用，还亟需开发对腹泻、病理、炎症、肠屏障修复等指标具有多重改善作用的益生菌，更加针对性的进行治疗。

格氏乳球菌是兼性厌氧菌，属于厚壁菌门，乳球菌属。该属细菌形态为球形或卵圆形，在液体培养基中成对或形成短链, 不产芽胞，革兰阳性，无动力，无荚膜，发酵碳水化合物而产酸, 不产气，触酶和氧化酶阴性。针对格氏乳球菌，目前仅有少量文献研究其在腹泻中的应用，如专利CN103320351B将其用于饲料添加剂领域，能够降低动物腹泻率和死亡率，减少抗生素类药物的使用，根据16S rDNA比对，本发明的格氏乳球菌与其不同，该专利菌株也未公开具有治疗化疗相关性腹泻的功能。CN108135944A公开一种减少肠道、皮肤、乳糜泻等相关炎症的益生菌及其组合物，并在说明书列举大量包括格氏乳球菌在内的已知菌种，不涉及新的菌株，同样也未公开具有治疗化学相关性腹泻的功能。

因此，研究开发新型益生菌，克服已有药物毒副作用大、治疗机制单一的缺陷，为CID患者提供有效治疗方案仍是医药生物领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明针对目前腹泻特别是化疗相关性腹泻治疗存在的不足，提供了一种能够从多方面改善腹泻的益生菌治疗方案。

为此，作为本发明的第一方面，本发明提供了一种格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其与保藏号为CCTCC No.M20221760的菌株具有99.85%以上的平均核苷酸相似性。

在一些具体实施方式中，所述格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1与保藏号为CCTCC No.M20221760的菌株具有99.90%以上的相似性。

在一些具体实施方式中，所述格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1与保藏号为CCTCC No.M20221760的菌株具有99.95%以上的相似性。

在一些具体实施方式中，所述格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1与保藏号为CCTCC No.M20221760的菌株具有99.97%、99.98%或99.99%以上的相似性。

在一些具体实施方式中，上述的格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1，还具有如下鉴别特征：

1）外形呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润；

2）不具有致病性毒力因子；

3）非溶血；

4）对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、副溶血性弧菌和艰难梭菌中至少5种具有抑菌活性；

5）对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、四环素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素和链霉素中的至少5种抗生素敏感；

6）能改善、减轻或缓解化疗相关性腹泻。

在一些具体实施方式中，本发明前述的格氏乳球菌Lgarv-1，对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、副溶血性弧菌和艰难梭菌中至少6种、7种或8种致病菌具有抑菌活性。

在一些具体实施方式中，本发明前述的格氏乳球菌Lgarv-1，对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、四环素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素和链霉素中的至少6种、7种或8种抗生素敏感。

在一些具体实施方式中，本发明前述的格氏乳球菌Lgarv-1，还具有如下至少一种特征：

7）能缓解或减轻炎症因子（如IFN-γ、TNF-α）造成的屏障功能障碍；

8）能抑制促炎因子TNF-α和IL-6的表达；

9）能增加水通道蛋白AQP8的表达；

10）能耐胃酸（pH3.0）；

11）能减少腹泻造成的体重减轻。

在一些具体实施方式中，本发明前述的格氏乳球菌Lgarv-1，具有上述7）~11）中至少两种、三种、四种或五种特征。

在一些具体实施方式中，本发明所述的格氏乳球菌Lgarv-1，其保藏号为CCTCCNo.M20221760。

作为本发明的第二方面，本发明提供了一种组合物，其含有前述任意一种实施方式所述的格氏乳球菌Lgarv-1，以及添加剂和/或辅料。

本发明所述的格氏乳球菌Lgarv-1可以根据需要添加其他成分，如添加剂和/或辅料形成组合物，并配制成便于使用的产品，如食品、保健品或药品。这些添加剂和/或辅料是食品、保健品和药品领域熟知的并可被接受的成分，如常见的矫味剂、填充剂、润滑剂、冻干保护剂、抗氧化剂和赋型剂等。

在一些具体实施方式中，本发明所述的组合物还包括其他功能成分，如具有治疗作用的活性成分，和/或具有营养、膳食补充作用的营养成分、膳食纤维、益生元成分等。

在一些具体实施方式中，本发明所述的组合物为粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊或液体剂。

在一些具体实施方式中，本发明所述的组合物，单次使用剂量中含有10²~10¹⁵CFU、10⁴~10¹³CFU或10⁵~10¹²CFU的格氏乳球菌Lgarv-1。

在一些具体实施方式中，本发明所述的组合物，其中的格氏乳球菌Lgarv-1先制备为冻干菌粉。

作为本发明的第三方面，本发明还提供了前述任一技术方案所述的格氏乳球菌Lgarv-1在制备预防/治疗腹泻的药物中的用途。本发明的格氏乳球菌Lgarv-1从改善炎症指标、恢复肠道屏障、抑制多种致病菌和促进肠道水分重吸收等多方面治疗腹泻，是更有潜力的新型治疗方案。

在一些实施方式中，所述腹泻为化疗相关性腹泻，包括但不限于阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、洛铂、环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、培美曲塞、阿糖胞苷等相关性腹泻。

在一些实施方式中，所述腹泻为感染性腹泻，包括但不限于选自铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、副溶血性弧菌和艰难梭菌的一种或多种致病菌引起的腹泻。

本发明所述腹泻是指排便次数明显超过平时习惯（>3次/d），粪质稀薄，含水量增加（>85%），大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物的一种临床症状，在本发明中其含义覆盖抗生素相关性腹泻、化疗相关性腹泻、功能性腹泻、感染性腹泻等。

本发明所述化疗相关性腹泻是指因化疗药物的消化道毒副反应引起的腹泻，所述化疗药物包括但不限于抗生素类化疗药，如阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素及其衍生物，紫杉醇类化疗药，如紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇及其衍生物等；铂类化疗药，如顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂及其衍生物等；烷化剂类化疗药，如环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀及其衍生物等；喜树碱类化疗药，如喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康及其衍生物等；抗代谢化疗药，如卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、培美曲塞、阿糖胞苷及其衍生物等。

本发明的有益效果：

1、本发明的格氏乳球菌Lgarv-1无毒力因子、非溶血、对多种抗生素敏感，具有较好的安全性；

2、对多种致病菌具有抑制作用，能缓解或减轻炎症因子造成的屏障功能障碍，抑制促炎因子的表达，增加水通道蛋白AQP8的表达以促进肠道水分重吸收，减少腹泻造成的体重减轻，针对不同机制从多方面发挥改善腹泻的疗效；

3、本发明的格氏乳球菌Lgarv-1在多个指标中达到与洛哌丁胺相当、甚至更优的效果，洛派丁胺等化药会抑制胃肠道蠕动，影响正常胃肠道功能，对需要长期用药的肿瘤患者容易不耐受，而本发明则很好的弥补了这方面的不足，经试验证实其疗效确切，且适宜长期用药，因而对化疗相关性腹泻更显优势。

保藏信息如下：

菌株名称：格氏乳球菌（ Lactococcus garvieae）Lgarv-1

保藏日期：2022年11月10日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052

保藏编号：CCTCC No.M20221760。

附图说明

图 1 是本发明的格氏乳球菌Lgarv-1菌落形态正面照片；

图 2 是实施例6中格氏乳球菌Lgarv-1对多种致病菌的抑菌试验结果；

图 3 是实施例7中不同实验组的屏障修复试验结果；

图 4 是实施例8中不同实验组体外细胞炎症抑制试验结果，A是对IL-6表达的影响结果，B是对TNF-α表达的影响结果；

图 5是实施例9中不同实验组对腹泻小鼠的治疗效果，其中，A是第1-9天各组腹泻评分曲线，B是第9天各组腹泻评分图，C是各组腹泻总分图，D是第9天各组体重变化率，E是各组IL-6 mRNA相对转录水平，F是各组AQP8 mRNA相对转录水平。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用到的培养基配制方法如下：

YCFA液体培养基的配制：称取酪蛋白胨10.0 g，酵母提取物2.5 g，MgSO₄·7H₂O0.45 mL（10%的母液），CaCl₂ 0.45 mL（10%的母液），TE141 10 mL，K₂HPO₄ 0.45 g，KH₂PO₄0.45 g，NaCl 0.90 g，VFA-mix 3.2 mL，溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧并分装，121 ℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放，备用。

TE141的配制：称取Nitrilotriacetic acid 1.50 g加入到200 mL纯水中，加入适量NaOH至溶液变澄清，之后加水800 mL，用50% HCl调节pH值为5.5，之后依次称取MgSO₄·7H₂O 3.00 g，MnSO₄·H₂O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO₄·7H₂O 0.10 g，CoSO₄·7H₂O 0.18g，CaCl₂·2H₂O 0.10 g，ZnSO₄·7H₂O 0.18 g，CuSO₄·5H₂O 0.006 g，KAl(SO₄)₂·12H₂O0.02 g，H₃BO₃ 0.01 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01 g，NiCl₂·6H₂O 0.03 g，Na₂SeO₃·5H₂O 0.03mL（10 mg/mL母液），Na₂WO₄·2H₂O 0.03 mL（10 mg/mL母液）加入上述试液中，加入过程不断搅拌，保持溶液澄清，备用。

VFA-mix的配制：量取乙酸90 mL，丙酸30 mL，正戊酸10 mL，异丁酸10 mL，丁酸10mL混匀备用，使用前用5 M 浓度 NaOH调至中性。

三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-5）19.25 g，MRS肉汤粉末（广东环凯生物科技有限公司，027312）13.5 g，改良 GAM肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8518-3）15 g （配置三混固体培养基时再加入琼脂粉12 g），溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。

二混培养基（BHI+MRS）的配制：称取BHI肉汤粉末19.25 g，MRS肉汤粉末27.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（峨眉龙腾生物）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，进行除氧分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。

MRS肉汤的配制：称取MRS肉汤粉末54.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（峨眉龙腾生物）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧，121℃灭菌15 min。

人工胃液的配制：取10%稀盐酸16.4 mL，定容至1 L。称取胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司，S10028）10 g，溶解混匀后调节pH至3.0。手套箱内0.22 μm滤器除菌，备用。4℃保存不超过30 d。

MRS固体培养基、GAM固体培养基、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤，青岛海博生物技术有限公司，HB4114）、TSA（胰蛋白胨大豆琼脂，青岛海博生物技术有限公司，HB4138）培养基的配制均按照说明书进行称量溶解，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。

实施例1 格氏乳球菌的分离鉴定

格氏乳球菌 Lactococcus garvieae Lgarv-1的筛选分离方法如下：

采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量厌氧PBS重悬，震荡，以样本完全充分重悬为宜。在N₂保护下，经纱布过滤两次后，滤液分装至50 mL离心管， 10000 rpm离心20min弃去上清液。加入适量厌氧PBS将离心下来的菌体重悬，再加入等体积的50%厌氧甘油充分混匀，分装至2 mL螺帽管，每支0.5 mL。分装后套袋抽真空-80℃冰箱保存备用。

分离时取出冻存的样本管1支，按照1：10的比例将解冻后的样本重悬于厌氧PBS中，涡旋振荡5 min后，传入厌氧手套箱，取0.5 mL菌悬液于 4.5 mL厌氧PBS中振荡混匀，梯度稀释至10^-6，取适当菌液梯度与YCFA培养基混匀后分装到384孔板中培养一周。挑取已生长孔位菌液进行转接，培养48 h后，一份利用MALDI-TOF-MS检测，初步对分离菌株进行分类，另一份根据质谱结果，再次转接到96孔板中，一式两份，培养48 h后一个板进行 16S rDNA基因扩增并送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司测序，另一板加入50%甘油1：1混合临时保藏，待PCR结果确认后使用。

对 16S rDNA基因测序结果进行分析，将序列与NCBI nt库做比对，结果显示与一株格氏乳球菌 Lactococcus garvieae的序列相似度最高（> 99%），由此初步鉴定其为 Lactococcus garvieae，命名为格氏乳球菌Lgarv-1。其菌落形态呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1，该菌株已于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），该菌株保藏号为：CCTCC No.M20221760。

实施例2 格氏乳球菌的全基因组分析

将格氏乳球菌Lgarv-1按2%接种量接种至5 mL厌氧三混培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA，利用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行全基因组测序。组装及注释后，将蛋白序列输入毒力基因库Virulence Factor Databases（VFDB）进行毒力因子分析。具体参数为“-evalue0.000001-word_size3”。比对后的结果按照“coverage>70%,identity>70%”阈值进行筛选，得到最终的毒力因子鉴定结果。综合现有文献研究认为该菌不具有致病性毒力因子。

利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，从中找到了62个已公开的 Lactococcus garvieae全基因组，通过fastANI（v1.33）比较发现，与本格氏乳球菌Lgarv-1全基因组最相近的两个菌株分别为GCA_011365245.1（ANI=99.79%）和GCA_011365045.1（ANI=99.72%），均低于99.9%，故可认为格氏乳球菌Lgarv-1为新菌株。

实施例3 格氏乳球菌的溶血试验

将保藏的格氏乳球菌Lgarv-1按2%接种量接种至5 mL厌氧三混培养基r（BHI+MRS+改良GAM）中，以粪肠球菌（β溶血，CICC23658，购自至中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照。所有菌株均在厌氧三混培养基中37℃厌氧培养12 h，得到活化菌株。各取2.5 μL活化菌株接种至哥伦比亚血平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），每株菌3个平行。37℃厌氧培养48 h后观察培养后的血平板，阳性菌株菌落周围形成界限明显、完全透明的溶血环，为β溶血；格氏乳球菌Lgarv-1菌落周围的培养基没有变化，为γ溶血，即不溶血。

实施例4 格氏乳球菌的抗生素敏感试验

根据《中国药典》（2020版）第三部“微生态活菌制剂总论”中抗生素敏感性试验的要求，采用琼脂扩散纸片法测定菌株对抗生素的敏感性，根据抑菌圈的大小判断菌株对抗生素敏感性级别。

活化及划线：格氏乳球菌Lgarv-1在三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中活化，37 ℃厌氧培养24 h，挑取一环菌液于MRS固体培养基上划线，将平皿于37 ℃厌氧培养；金黄色葡萄球菌于TSB液体培养基中活化，37 ℃好氧培养24 h，挑取一环菌液于TSA固体培养基上划线，将平皿于37 ℃好氧培养。

菌悬液制备：从培养好的固体平板上挑取数个单个菌落接种至生理盐水制成菌悬液，调整悬液的浊度至0.5麦氏浓度。

接种平皿：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去；在MRS平板（格氏乳球菌）或TSA平板（金黄色葡萄球菌）表面均匀涂布 3 次，每次旋转平皿 60°，最后沿平皿内琼脂边缘涂抹一周，15 min内完成。

贴抗菌药物纸片：用药敏纸片分配器将药敏纸片分配放置在平板上，每个平板上放置3张药敏纸片，格氏乳球菌Lgarv-1在37℃厌氧培养24 h，金黄色葡萄球菌37℃好氧培养24 h，实验共计14种药敏纸片（均为温州市康泰生物科技有限公司），信息如下：

纸片中文名

货号

含量

质控菌质控药敏范围

耐药

中介

敏感

参考菌

青霉素

Z51031

10 units

26-37

≤14

-

≥15

肠球菌属

氨苄西林

Z21011

10 μg

27-35

≤16

-

≥17

肠球菌属

亚胺培南

Z21049

10 μg

-

≥16

嗜血杆菌属

万古霉素

Z21026

30 μg

17-21

≤14

15-16

≥17

肠球菌属

头孢曲松

Z21002

30 μg

22-28

≤13

14-20

≥21

肠杆菌科

四环素

Z21036

30 μg

24-30

≤14

15-18

≥19

肠球菌属

红霉素

Z21030

15 μg

22-30

≤13

14-22

≥23

肠球菌属

克林霉素

Z21029

2 μg

26-32

≤15

16-18

≥19

肺炎链球菌

左氧氟沙星

Z21014

5 μg

25-30

≤13

14-16

≥17

肠球菌属

甲氧苄啶

Z21045

25 μg

/

≤10

-

≥16

葡萄球菌属

呋喃妥因

Z21047

300 μg

18-22

≤14

15-16

≥17

肠球菌属

高浓度庆大霉素

Z22021

120 μg

/

6

7-9

≥10

肠球菌属

链霉素

Z21035

300 μg

/

6

7-9

≥10

肠球菌属

利福平

Z21037

15 μg

26-34

≤16

17-19

≥20

葡萄球菌属

结果：金黄色葡萄球菌作为质控菌株，结果均符合药敏范围。格氏乳球菌Lgarv-1对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、四环素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素、链霉素这8种抗生素敏感；对红霉素、克林霉素、甲氧苄啶这3种抗生素耐药；对万古霉素、头孢曲松、利福平这3种抗生素中介。

实施例5 格氏乳球菌的耐人工胃液（pH 3.0）试验

格氏乳球菌Lgarv-1经活化后，取1mL菌液离心洗涤后，用1 mL无氧无刃天青PBS将其重悬。吸取其中100 μL菌液加入900 μL无氧人工胃液（pH 3.0）混匀作为实验组，100 μL菌液加入900 μL无氧无刃天青PBS混匀作为对照组。37℃静置孵育6 h后，吸取适量菌液用PBS进行梯度稀释，选择合适的稀释梯度进行平板计数实验。37℃培养至单菌落长出后计数。菌株耐胃液存活率 = 实验组活菌数/对照组活菌数×100%。结果表明，格氏乳球菌Lgarv-1的耐人工胃液存活率为72.5±7.5%，具有较好的耐胃液能力。

实施例6 格氏乳球菌对致病菌的抑菌能力

本实施例选取8种常见的导致腹泻的致病菌进行抑菌能力检测，致病菌株来源信息如下：

铜绿假单胞菌（CMCC(B)10104），中国食品药品检定研究院

志贺氏菌（CMCC(B)51252），中国食品药品检定研究院

大肠杆菌（CMCC(B)44102），中国食品药品检定研究院

乙型副伤寒沙门氏菌（CMCC(B)50094），中国食品药品检定研究院

小肠结肠炎耶尔森菌（CMCC(B)52204），中国食品药品检定研究院

具核梭杆菌具核亚种（ATCC 25586），美国微生物菌株保藏中心

副溶血性弧菌（ATCC 17802），美国微生物菌株保藏中心

艰难梭菌（CICC 22951），中国工业微生物菌种保藏管理中心

格氏乳球菌发酵液获得：格氏乳球菌Lgarv-1经活化后，按2%的接种量接种于无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中37℃厌氧培养48 h，获得发酵液。

病原菌制备与涂布：铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种和副溶血性弧菌为好氧菌，经TSB肉汤培养基活化后，于TSB肉汤培养基中稀释50倍达到合适浓度，取0.2 mL稀释好的菌液于TSA固体培养基上涂布。艰难梭菌为厌氧菌，经活化转接后，于无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中稀释50倍，取0.2 mL稀释好的病原菌菌液涂布于无菌无氧GAM固体培养基（添加5%马血清）。

格氏乳球菌与病原菌共培：将涂布好的病原菌平板上放置3支灭菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2 mL格氏乳球菌发酵液。放入厌氧培养盒（厌氧病原菌加厌氧产气袋），平皿正置培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。

结果如图2所示：格氏乳球菌对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、副溶血性弧菌、艰难梭菌均有抑菌能力，且对艰难梭菌抑菌能力较强。

实施例7 格氏乳球菌的体外屏障修复试验

Caco-2细胞种入Transwell：Caco-2为贴壁细胞，需使用37℃预热的胰酶细胞消化液消化细胞。用含10% FBS和1% PS的DMEM培养基（DMEM培养基，购于Gibco，货号C11995500BT； FBS，购于Gibco，货号16000-044；PS，购于Gibco，货号15140-122）以1.1×10⁵/孔的接种密度将Caco-2细胞接种于24孔的Transwell中，5％ CO₂，37℃静置培养21 d。

菌株培养：从菌保管中接种格氏乳球菌Lgarv-1菌液200 μL至5 mL MRS&BHI（v/v=1）二混培养基中（相关试剂提前除氧），37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。传代接种一次，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，12000 rpm/min，离心3 min。用含10% FBS的DMEM培养基稀释菌株至10⁷ CFU/mL，待用。菌株 Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）作为阳性对照，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 6141）。

格氏乳球菌Lgarv-1对Caco-2细胞模型中肠上皮屏障功能的影响：本实验使用炎症因子IFN-γ（Pepro Tech，AF-300-02）和TNF-α（Pepro Tech，300-01A）构建屏障损伤模型。培养21d，待Caco-2细胞分化形成致密单层细胞后，吸去下室旧培养基，正常对照组下室加入800 μL DMEM培养基，屏障损伤组、LGG阳性对照组以及格氏乳球菌Lgarv-1组下室加入800 μL IFN-γ溶液。置于5％二氧化碳培养箱中， 37℃静置培养22 h后，吸去上室及下室溶液，正常对照组上室加入200 μL DMEM培养基，下室加入800 μL DMEM培养基；屏障损伤组上室加入200 μL DMEM培养基；LGG阳性对照组，上室加入200 μL LGG阳性菌液；Lgarv-1组上室加入200 μL 格氏乳球菌Lgarv-1菌液；屏障损伤组、LGG阳性对照组和Lgarv-1组下室加入800 μL TNF-α溶液。置于5％二氧化碳培养箱中， 37℃静置培养5 h后，检测各组别细胞单层跨膜电阻（TEER）值。

结果：本试验选用LGG为阳性对照，与屏障损伤组相比，LGG可显著增加TEER值，对细胞屏障损伤具有明显的修复作用。同样，与屏障损伤组相比，格氏乳球菌Lgarv-1也可以显著增加TEER值，且与阳参LGG效果相当(图3)。结果表明格氏乳球菌Lgarv-1可有效缓解炎症因子（如IFN-γ、TNF-α）造成的屏障功能障碍。

实施例8 格氏乳球菌的体外细胞炎症抑制试验

THP-1细胞极化：THP-1为悬浮细胞，使用PMA (佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate1 3-acetate，购于Sigma-Aldrich Company，P1585) 诱导THP-1使其极化为成熟巨噬细胞。在此基础上，进一步使用LPS（购于Sigma-Aldrich Company，L3024）和IFN-γ组合诱导成熟巨噬细胞极化为炎症型巨噬细胞。使用含10% FBS和终浓度为100 ng/mL PMA的RPMI-1640（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，C11875500BT）培养基，以1×10⁵/孔的接种密度将THP-1细胞接种于96孔板中，置于5％ CO₂培养箱中，37℃培养24 h后，更换含10% FBS，终浓度为50 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ的RPMI-1640培养基，置于5％ CO₂培养箱中，37℃培养24 h。

菌株培养：从菌保管中接种格氏乳球菌Lgarv-1菌液200 μL至5 mL MRS&BHI（v/v=1）二混培养基中（相关试剂提前除氧），37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。转接一次后，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，5000 rpm/min，离心15 min。用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释菌株至1.5×10⁶ CFU/mL备用。

格氏乳球菌Lgarv-1对THP-1细胞表达TNF-α和IL-6的影响：经PMA极化后的成熟THP-1细胞，吸去培养基。正常对照组，添加200 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基；THP-1细胞添加终浓度为50 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ的RPMI-1640培养基为炎症模型组；THP-1细胞添加200 μL含10% FBS和终浓度为25 μg/mL的地塞米松（购于Sigma-AldrichCompany，D4902-25）的RPMI-1640培养基作为阳性对照组；实验组添加200 μL前期制备好的格氏乳球菌Lgarv-1菌液。置于5％ CO₂培养箱，37℃培养24 h。吸取80 μL细胞培养液，4℃，5000 rpm/min，离心15 min，收集上清液，使用Human TNF-α (Tumor Necrosis FactorAlpha) ELISA试剂盒检测TNF-α含量（购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-H0109c），使用Human IL-6 (Interleukin 6) ELISA试剂盒（购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-H6156) 检测IL-6含量。

实验结果：如图4所示，炎症模型组细胞TNF-α和IL-6的表达显著高于正常对照组；阳性对照地塞米松与格氏乳球菌Lgarv-1均能够显著抑制THP-1细胞中促炎因子IL-6（图4A）和TNF-α（图4B）的表达，表明该菌株在体外具有非常明显的抗炎作用。

实施例9 格氏乳球菌对5-氟尿嘧啶（5-FU）致腹泻小鼠的治疗效果

冻干保护剂配制：称取海藻糖10 g，低聚果糖5 g，脱脂乳粉10 g，溶解于70 g纯化水中，115℃灭菌20 min。使用前再添加抗坏血酸钠5 g。

菌粉制备：将保藏的格氏乳球菌Lgarv-1按10%接种量接种至无氧二混培养基中（BHI+MRS），37℃厌氧静置培养10 - 15 h，得到一级种子液（OD₆₀₀值≥1.2）。随后，按1.5%接种量转接至无氧二混培养基中（BHI+MRS），37℃厌氧静置培养8 - 15 h。得到二级种子液（OD₆₀₀值≥1.2）。二级种子按7.5%接种量用蠕动泵泵入配制有MRS肉汤的发酵罐中，设置发酵参数（温度37℃，pH=6，转速150 rpm）开始发酵培养。发酵菌液OD₆₀₀值≥1.9或OD₆₀₀值增长≤0.1时停止发酵，对菌液进行菌体收集。菌液分装至离心桶中，离心弃上清。按菌泥和冻干保护剂重量比1:2添加冻干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液，放入降温至-40℃的冷冻干燥机的板层上冻干，冻干程序结束后取出菌饼，粉碎后即得菌粉。动物给药前使用0.2mL生理盐水将1×10⁹ CFU菌粉配置成菌悬液。

试验动物：20只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。根据小鼠初始体重随机分为4组，每组5只。

试验设计：采用5-FU（购自天津金耀药业有限公司，规格10 mL/支，0.25 g/10 mL）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型，4组分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照洛哌丁胺组和格氏乳球菌Lgarv-1组。除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组别均进行5-FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量为350 mg/kg。所有组别给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂；阳性对照组灌胃20 mg/kg洛派丁胺（购自西安杨森制药有限公司）；Lgarv-1组灌胃1×10⁹ CFU格氏乳球菌。总体实验周期为9 d，记为D1-D9。D1-D5连续灌胃给药5天，D3进行5-FU单次造模处理，在D5给药结束后，连续观察4天。具体实验分组和给药方案见表1。

腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。实验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分。腹泻总分为每天腹泻评分的总和。

体重检测及体重变化率：实验周期内，每天称量小鼠体重，计算体重变化率，体重变化率 =（检测体重-初始体重）/初始体重×100%。

炎性因子及水通道蛋白检测：实验结束后，解剖所有小鼠，采集结肠中段，提取mRNA，采用RT-PCR反转录cDNA后采用qPCR检测IL-6和水通道蛋白AQP8的相对基因表达水平。

表1 试验分组和给药方案

组别

数量

造模剂

造模剂量

受试物

给药体积

给药剂量

给药天数

正常对照组

5

生理盐水

/

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

模型对照组

5

5-FU

350mg/kg

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

洛哌丁胺

5

5-FU

350mg/kg

洛哌丁胺

10 mL/kg

20 mg/kg/只

5 d

Lgarv-1

5

5-FU

350mg/kg

Lgarv-1菌悬液

0.2 mL/只

<![CDATA[1×10<sup>9</sup> CFU/只]]>

5 d

注：5-FU:5-氟尿嘧啶；CFU:菌落形成单位；d: 天

试验结果：如图5所示，与模型对照组相比，格氏乳球菌Lgarv-1给药组对5-FU导致的腹泻具有明显改善作用，与阳性对照咯哌丁胺效果相当（图5A）；D9 腹泻评分与模型对照组相比显著降低（P<0.05）（图5B）；洛哌丁胺和格氏乳球菌Lgarv-1均可极显著降低腹泻总分（P<0.01）（图5C）。从造模第二天开始，除正常对照组持续增长外，其余各组的体重均逐渐降低，但洛哌丁胺和格氏乳球菌Lgarv-1组D9的体重变化率极显著低于模型对照组（P<0.01）（图5D），对体重减轻具有一定的改善作用。此外，与模型对照组相比，格氏乳球菌Lgarv-1给药组能极显著降低IL-6的相对基因表达量（P<0.01）（图E），极显著增加AQP8的相对基因表达量（P<0.01）（图5F）。以上结果说明本发明的格氏乳球菌Lgarv-1能通过降低炎性因子水平，提高水分子重吸收能力以改善5-FU所引起的腹泻症状。

结论：本发明的格氏乳球菌Lgarv-1能够从多个方面改善腹泻症状，对腹泻特别是化疗相关性腹泻提供有效治疗。

Claims

1.一种格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其与保藏号为CCTCCNo.M20221760的菌株具有99.90%以上的平均核苷酸相似性。

2.根据权利要求1所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其与保藏号为CCTCC No.M20221760的菌株具有99.95%以上的平均核苷酸相似性。

3.根据权利要求1所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其还具有如下特征：

1）外形：呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润；

2）不具有致病性毒力因子；

3）非溶血；

6）能改善、减轻或缓解化疗相关性腹泻。

4.根据权利要求3所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其特征在于，对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、副溶血性弧菌和艰难梭菌中至少6种致病菌具有抑菌活性。

5.根据权利要求3所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其特征在于，对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、四环素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素和链霉素中的至少6种抗生素敏感。

6.根据权利要求1所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，还具有如下至少一种特征：

7）能缓解或减轻炎症因子IFN-γ和TNF-α造成的屏障功能障碍；

8）能抑制促炎因子TNF-α和IL-6的表达；

9）能增加水通道蛋白AQP8的表达；

10）能耐胃酸；

11）能减少腹泻造成的体重减轻。

7.根据权利要求6所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其特征在于，具有如权利要求6所述的至少两种特征。

8.一种格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，其保藏号为CCTCCNo.M20221760。

9.一种药物组合物，其含有权利要求1-8任意一项所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

10.权利要求1-8任意一项所述的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）Lgarv-1在制备预防或治疗化疗相关性腹泻或感染性腹泻的药物中的用途。