CN116121154A

CN116121154A - 一种乳明串珠菌及其应用

Info

Publication number: CN116121154A
Application number: CN202310369070.3A
Authority: CN
Inventors: 李璟欣; 金美玉; 崔雅倩; 傅芳; 肖源灵; 税君瑞
Original assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-10
Filing date: 2023-04-10
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2043-04-10
Also published as: CN116121154B

Abstract

本发明属于微生物药物领域，具体涉及一种乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）及其应用。所述乳明串珠菌具有安全、能抑制多种致病菌、缓解屏障功能障碍、抑制促炎因子表达等功效，能显著改善化疗相关性腹泻，而且基本无毒副作用，对需要长期用药的肿瘤患者提供了更佳的治疗方案。

Description

一种乳明串珠菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物药物领域，具体涉及一种乳明串珠菌及其应用。

背景技术

腹泻是指排便次数明显超过平日习惯的频率，粪质稀薄，水分增加，每日排便量超过200 g，或含未消化食物或脓血、黏液。腹泻常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等症状。腹泻作为一种常规疾病广泛地发生在各年龄段人群中。

腹泻常用药物包括：1）收敛性药物如蒙脱石散，能够吸收水分和毒素、减少腹泻次数；2）益生菌类药物，如双歧杆菌、乳酸菌和丁酸梭菌等，主要是调节肠道菌群，改善肠道菌群紊乱，从而改善腹泻；3）化药类如洛哌丁胺、消旋卡多曲等，抑制肠胃蠕动，延长肠内容物滞留时间，减少排便量和次数；4）抗生素药物如喹诺酮类和头孢类等，主要针对细菌感染性腹泻。此外，还有通过调理脾胃、促进消化的中药类止泻药。

化疗相关性腹泻（Chemotherapy induced diarrhea，CID）是肿瘤患者因化疗引起的一种常见消化道毒副反应，轻度腹泻可使患者的生活质量下降，频繁性的严重腹泻可能会导致患者脱水、感染、休克、甚至死亡。因此，严重腹泻患者需要减少化疗药物的剂量甚至中断化疗，影响肿瘤的治疗。流行病学数据显示全球肿瘤患者人数每年大幅增加，预计到2040年，约有300~700万人受化疗相关副作用困扰。在引起CID的化疗药物中，对于不同的患者，虽然CID发生的广度和严重程度差异很大，但是其中以氟尿嘧啶类（Fluorouracil）和伊立替康（Irinotecan , CPT-11）引起的腹泻发生率最高，可达80%。

CID与普通腹泻虽然都有腹泻症状，但发病机制和病理指征有所差异。组织病理学有证据显示 CID 是一个多因素影响的过程，可能包括肠道运动改变、结肠隐窝损伤、肠道菌群改变、营养代谢改变等多种因素。

目前临床上缺乏治疗化疗相关性腹泻的针对性药物，都是以如阿片类药物、生长抑素类似物、糖皮质激素、胆汁酸螯合剂、抗生素等药物对症治疗，但这些药物作用机制单一，长期使用副作用大。例如，阿片类药物（派洛丁胺）大剂量使用时可能引起麻痹性肠梗阻的风险；生长抑素类似物（奥曲肽）可引发胆结石、高血糖、糖耐量异常等副作用；糖皮质激素可能产生系统性影响，增加感染风险，加剧病毒或细菌感染等；胆汁酸螯合剂适用于由胆汁酸吸收不良或脂质过多引起的腹泻，但会出现腹胀、胃肠胀气、便秘等胃肠道副作用。

新一代益生菌是指通过科学技术手段筛选出来的，具有更强的耐受性和生存能力的益生菌。与传统的益生菌相比，新一代益生菌具有更好的抗胃酸、胆汁、胰液等消化液的能力，并且可以在肠道内更好地存活和繁殖，从而发挥更好的益生作用，促进肠道健康。同时，新一代益生菌还可以更准确地定位对应的肠道问题和症状，达到更精准的治疗效果，其功能已经超出传统益生菌的范畴，在抗感染、抗肿瘤、治疗代谢性疾病和免疫相关疾病等方面发挥重要作用。

专利TW202108154A已经介绍了一株分离自生牛乳中的嗜热链球菌具有治疗5-FU（5-氟尿嘧啶）所致的胃肠道副作用的潜力。

但仍有必要研究开发更多更有效的新一代益生菌，克服已有药物毒副作用大、治疗机制单一的缺陷，为CID患者提供治疗选择。

发明内容

本发明针对现有临床治疗存在的不足，提供了一种治疗腹泻特别是化疗相关性腹泻的益生菌治疗方案。本发明的益生菌安全，能抑制致病菌和促炎因子，修复肠道屏障，并减轻结肠组织炎性浸润，从而达到有效治疗腹泻的效果。

首先，本发明提供了一种乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis），其全基因组与保藏号为CCTCC NO：M 20222028的菌株具有99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%以上或100%的平均核苷酸相似性。

在一些具体实施方案中，所述的乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis），其全基因组与保藏号为CCTCC NO：M 20222028的菌株具有99.9%以上的平均核苷酸相似性。

在一些具体实施方案中，所述的乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis），所述乳明串珠菌是保藏号为CCTCC NO：M 20222028的乳明串珠菌Llact-1或其子代菌株。

本发明还提供了前述任一技术方案所述的乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis）的生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物。

本发明还提供了一种药物组合物，其含前述任意一项所述的乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis）或生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明还提供了前述任意一项所述的乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis）或生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物在制备治疗或预防腹泻的药物中的用途。

在一些具体实施方案中，所述药物用于治疗或预防化疗相关性腹泻或致病菌引起的腹泻。

在一些具体实施方案中，所述致病菌选自铜绿假单胞菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种和艰难梭菌中的一种或多种。

在一些具体实施方案中，所述乳明串珠菌还具有如下至少一种特征：

1）能缓解或减轻炎症因子IFN-γ或TNF-α造成的屏障功能障碍；

2）能抑制促炎因子IL-6的表达；

3）能减轻结肠组织炎性浸润程度。

在一些具体实施方案中，化疗所用的药物选自阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇、顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂、环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、培美曲塞、阿糖胞苷中的一种或几种。

在一些具体实施方案中，本发明所述的组合物制备为粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊或液体剂。

在一些具体实施方案中，本发明所述的组合物，单次使用剂量中含有10²~10¹⁵CFU、10⁴~10¹³CFU或10⁵~10¹²CFU的乳明串珠菌。

在一些具体实施方案中，本发明所述的组合物，其中的乳明串珠菌Llact-1先制备为冻干菌粉。

本发明的有益效果：

1、本发明的乳明串珠菌Llact-1无毒力因子、非溶血，具有较好的安全性；

2、对多种致病菌具有抑制作用，能调节肠道菌群，抑制致病菌生长；

3、能缓解或减轻炎症因子造成的屏障功能障碍，对药物性腹泻造成的屏障损伤具有修复作用；

4、抑制促炎因子的表达，减轻肠道炎症反应；

5、本发明的乳明串珠菌Llact-1在腹泻指标中达到与化药洛哌丁胺相当、甚至更优的效果，而且不存在抑制胃肠道蠕动的副作用，能满足肿瘤患者需要长期服用的需求。

保藏信息如下：

菌株名称：乳明串珠菌（ Leuconostoc lactis）Llact-1

保藏日期：2022年12月23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052

保藏编号：CCTCC NO：M 20222028。

附图说明

图 1 是本发明的乳明串珠菌Llact-1菌落形态正面照片；

图 2 是实施例4中乳明串珠菌Llact-1对多种致病菌的抑菌试验结果；

图 3 是实施例5中不同实验组的屏障修复试验结果；

图 4 是实施例6中不同实验组体外对IL-6细胞炎症抑制试验结果；

图5 是实施例7中不同实验组对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果。A是第1-9天各组腹泻评分曲线；B是第8天各组腹泻评分图；C是各组腹泻总分图。

图6 是实施例8中不同实验组对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠结肠病理损伤情况的影响。A是各组HE染色结果，a：正常对照组，b：模型对照组，c：洛哌丁胺，d：Llact-1；B是各组炎性浸润评分。

具体实施方式

除非有特别说明，本文中使用的术语具有生物医药领域通用的含义。

本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

腹泻是指排便次数明显超过平时习惯（>3次/d），粪质稀薄，含水量增加（>85%），大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物的一种临床症状，在本发明中其含义覆盖抗生素相关性腹泻、化疗相关性腹泻、功能性腹泻、感染性腹泻等。

化疗是指使用药物手段杀灭肿瘤细胞达到治疗目的，是除了手术、放疗外对肿瘤治疗的主要手段。

化疗相关性腹泻是指因化疗药物的消化道毒副反应引起的腹泻，所述化疗药物包括但不限于非靶向小分子药物、靶向小分子药物、生物大分子药物、核酸类药物和细胞治疗药物。这些药物的实例包括但不限于抗生素类化疗药，如阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素及其衍生物，紫杉醇类化疗药，如紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇及其衍生物等；铂类化疗药，如顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂及其衍生物等；烷化剂类化疗药，如环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀及其衍生物等；喜树碱类化疗药，如喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康及其衍生物等；抗代谢化疗药，如卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、培美曲塞、阿糖胞苷及其衍生物等；靶向药物如阿帕替尼、阿西替尼、卡博替尼、索拉非尼、舒尼替尼等；抗PD-1 PD-/L1抗体如纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等。

几种或多种是指两种及两种以上且为整数的种类，如两种、三种、四种、五种、六种、七种……等。

本发明的乳明串珠菌 Leuconostoc lactis可以是活菌，也可以是经灭活处理的菌体，还可以是菌体的纯培养物、裂解物、培养液(例如上清液)或者从培养物中提取到的成分。

在一些实施方式中，乳明串珠菌 Leuconostoc lactis为活菌、灭活菌或者其组合（即活菌和灭活菌的组合)。灭活菌可以为形态结构完整的灭活菌、形态结构不完整的灭活菌或者其组合。

本发明所述的乳明串珠菌 Leuconostoc lactis包括保藏编号为CCTCC NO: M20222028的菌株 Leuconostoc lactis Llact-1，及其子代菌株（后代）或从原始菌株培养（亚克隆）的菌株。所述子代菌株和亚克隆的菌株具有与Llact-1相似的活性。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗或预防有效量的乳明串珠菌 Leuconostoc lactis Llact-1，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。所述药物组合物用于腹泻的治疗与预防。进一步地，所述药物组合物用于化疗相关性腹泻的治疗与预防。

所述治疗有效量或预防有效量是在临床上能够实现所需治疗性或预防性结果的用量。在一些实施方案中，治疗有效量不诱导或不引起不希望的副作用。在一些实施方案中，治疗有效量诱发或引起副作用，但仅引起鉴于患者的病症治疗临床医师可接受的副作用。在一些实施方案中，单次使用剂量或单次有效量中含有10²~10¹⁵CFU、10³~10¹⁴CFU、10⁴~10¹³CFU、10⁵~10¹²CFU、10⁶~10¹²CFU的乳明串珠菌。

药学上可接受的载体是指不对受试者引起显著刺激且不消除所施用的益生菌的生物活性及特性的药学载体。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除非常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗性或药物组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。

赋形剂是指添加至药物组合物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。

本发明还提供了一种保健品组合物，所述组合物含有本发明的乳明串珠菌 Leuconostoc lactis Llact-1，以及可食用原辅料。可食用原辅料的举例如食糖，果糖，蜂蜜，葡萄糖，淀粉，维生素，有益微量元素和中量元素(如钙粉)，大豆粉，绿豆粉，麦芽糊精，奶粉，蔬菜汁，水果汁，香料、香精等。

本发明的药物组合物、和保健品组合物还可以进一步含有第二种有益的活性成分，例如另一种具有止泻功能的益生菌、益生元或药物等，益生元通过对肠道内益生菌的促生长，帮助调节肠道内环境，从而间接发挥止泻作用。第二种有益的活性成分的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚甘露糖、菊粉、水苏糖、大豆低聚糖、β葡聚糖、低聚乳果糖等。

在一些实施方案中，药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂或粉剂等。

在一些实施方案中，保健品组合物为饮品、固体饮料、粉剂、胶囊、颗粒等形式。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用到的培养基配制方法如下：

YCFA液体培养基的配制：称取酪蛋白胨10.0 g，酵母提取物2.5 g，MgSO₄·7H₂O0.45 mL（10%的母液），CaCl₂ 0.45 mL（10%的母液），TE141 10 mL，K₂HPO₄ 0.45 g，KH₂PO₄0.45 g，NaCl 0.90 g，VFA-mix 3.2 mL，溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧并分装，121 ℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放，备用。

TE141的配制：称取Nitrilotriacetic acid 1.50 g加入到200 mL纯水中，加入适量NaOH至溶液变澄清，之后加水800 mL，用50% HCl调节pH值为5.5，之后依次称取MgSO₄·7H₂O 3.00 g，MnSO₄·H₂O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO₄·7H₂O 0.10 g，CoSO₄·7H₂O 0.18g，CaCl₂·2H₂O 0.10 g，ZnSO₄·7H₂O 0.18 g，CuSO₄·5H₂O 0.006 g，KAl(SO₄)₂·12H₂O0.02 g，H₃BO₃ 0.01 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01 g，NiCl₂·6H₂O 0.03 g，Na₂SeO₃·5H₂O 0.03mL（10 mg/mL母液），Na₂WO₄·2H₂O 0.03 mL（10 mg/mL母液）加入上述试液中，加入过程不断搅拌，保持溶液澄清，备用。

VFA-mix的配制：量取乙酸90 mL，丙酸30 mL，正戊酸10 mL，异丁酸10 mL，丁酸10mL混匀备用，使用前用5 M 浓度 NaOH调至中性。

三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-5）19.25 g，MRS肉汤粉末（广东环凯生物科技有限公司，027312）13.5 g，改良 GAM肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8518-3）15 g （配置三混固体培养基时再加入琼脂粉12 g），溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。

二混培养基（BHI+MRS）的配制：称取BHI肉汤粉末19.25 g，MRS肉汤粉末27.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（龙腾生物科技公司）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，进行除氧分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。

GAM固体培养基、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤，青岛海博生物技术有限公司，HB4114）、TSA（胰蛋白胨大豆琼脂，青岛海博生物技术有限公司，HB4138）培养基的配制均按照说明书进行称量溶解，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。

菌粉制备发酵培养基：称取无水葡萄糖20 g，大豆蛋白胨 10 g，酵母粉10 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.3 g，吐温80 1mL，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，溶解于1 L的纯化水中。N₂置换除氧，分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。

实施例1 乳明串珠菌的分离鉴定

乳明串珠菌 Leuconostoc lactis Llact-1的筛选分离方法如下：

采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量厌氧PBS重悬，震荡，以样本完全充分重悬为宜。在N₂保护下，经纱布过滤两次后，滤液分装至50 mL离心管，10000 rpm离心20min弃去上清液。加入适量厌氧PBS将离心下来的菌体重悬，再加入等体积的50%厌氧甘油充分混匀，分装至2 mL螺帽管，每支0.5 mL。分装后套袋抽真空-80℃冰箱保存备用。

分离时取出冻存的样本管1支，按照1：10的比例将解冻后的样本重悬于厌氧PBS中，涡旋振荡5 min后，传入厌氧手套箱，取0.5 mL菌悬液于 4.5 mL厌氧PBS中振荡混匀，梯度稀释至10^-6，取适当菌液梯度与YCFA培养基混匀后分装到384孔板中培养一周。挑取已生长孔位菌液进行转接，培养48 h后，一份利用MALDI-TOF-MS检测，初步对分离菌株进行分类，另一份根据质谱结果，再次转接到96孔板中，一式两份，培养48 h后一个板进行 16S rRNA基因扩增并送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司测序，另一板加入50%甘油1：1混合临时保藏，待PCR结果确认后使用。

对 16S rRNA基因测序结果进行分析，将序列与NCBI nt库做比对，结果显示与一株乳明串珠菌 Leuconostoc lactis的序列相似度最高（> 99%），由此初步鉴定其为 Leuconostoc lactis，命名为乳明串珠菌Llact-1。其菌落形态呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1，该菌株已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），该菌株保藏号为：CCTCC NO：M 20222028。

实施例2 乳明串珠菌的全基因组分析

将乳明串珠菌Llact-1按2%接种量接种至5 mL厌氧三混培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA，利用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行全基因组测序。组装及注释后，将蛋白序列输入毒力基因库Virulence Factor Databases（VFDB）进行毒力因子分析。结果显示，该菌不具有毒力因子。

利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，从中找到了34个已公开的 Leuconostoc lactis全基因组，通过fastANI（v1.33）比较发现，与本乳明串珠菌Llact-1全基因组最相近的两个菌株分别为GCA_000709265.1（ANI=98.48%）和GCA_009795665.1（ANI=98.21%），故可认为乳明串珠菌Llact-1为新菌株。

实施例3 乳明串珠菌的溶血试验

将保藏的乳明串珠菌Llact-1按2%接种量接种至5 mL厌氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中，以粪肠球菌（β溶血，CICC23658，购自至中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照。所有菌株均在厌氧三混培养基中37℃厌氧培养12 h，得到活化菌株。各取2.5 μL活化菌株接种至哥伦比亚血平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），每株菌3个平行。37℃厌氧培养48 h后观察培养后的血平板，阳性菌株菌落周围形成界限明显、完全透明的溶血环，为β溶血；乳明串珠菌Llact-1菌落周围的培养基没有变化，为γ溶血，即不溶血。

实施例4 乳明串珠菌对致病菌的抑菌能力

本实施例选取5种常见的导致腹泻的致病菌进行抑菌能力检测，致病菌株来源信息如下：

铜绿假单胞菌（CMCC(B)10104），中国食品药品检定研究院

大肠杆菌（CMCC(B)44102），中国食品药品检定研究院

小肠结肠炎耶尔森菌（CMCC(B)52204），中国食品药品检定研究院

具核梭杆菌具核亚种（ATCC 25586），美国微生物菌株保藏中心

艰难梭菌（CICC 22951），中国工业微生物菌种保藏管理中心

乳明串珠菌发酵液获得：乳明串珠菌Llact-1经活化后，按2%的接种量接种于无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中37℃厌氧培养48 h，获得发酵液。

病原菌制备与涂布：铜绿假单胞菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和具核梭杆菌具核亚种为好氧菌，经TSB肉汤培养基活化后，于TSB肉汤培养基中稀释50倍达到合适浓度，取0.2 mL稀释好的菌液于TSA固体培养基上涂布。艰难梭菌为厌氧菌，经活化转接后，于无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中稀释50倍，取0.2 mL稀释好的病原菌菌液涂布于无菌无氧GAM固体培养基（添加5%马血清）。

乳明串珠菌与病原菌共培：将涂布好的病原菌平板上放置3支灭菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2 mL乳明串珠菌发酵液。放入厌氧培养盒（厌氧病原菌加厌氧产气袋），平皿正置培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。

结果如图2所示：乳明串珠菌对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种、艰难梭菌均有抑菌能力，且对艰难梭菌抑菌能力较强。

实施例5 乳明串珠菌的体外屏障修复试验

Caco-2细胞接种： 37℃预热的胰酶细胞消化液将Caco-2细胞消化后，用含10%FBS和1% PS的DMEM培养基（DMEM培养基，购于Gibco，货号C11995500BT； FBS，购于Gibco，货号16000-044；PS，购于Gibco，货号15140-122）以1.1×10⁵/孔的接种密度将Caco-2细胞接种于24孔的Transwell中，5％ CO₂，37℃静置培养21 d。

菌株培养：从菌保管中接种乳明串珠菌Llact-1菌液200 μL至5 mL无氧二混培养基中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。传代接种一次，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，12000rpm/min，离心3 min。用含10% FBS的DMEM培养基稀释菌株至10⁷ CFU/mL，待用。菌株 Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）作为阳性对照，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 6141）。

肠上皮屏障功能检测：本实验使用炎症因子IFN-γ（Pepro Tech，AF-300-02）和TNF-α（Pepro Tech，300-01A）构建屏障损伤模型。培养21d，待Caco-2细胞分化形成致密单层细胞后，吸去下室旧培养基，正常对照组下室加入800 μL DMEM培养基，屏障损伤组、LGG阳性对照组以及乳明串珠菌Llact-1组下室加入800 μL IFN-γ溶液。置于5％二氧化碳培养箱中， 37℃静置培养22 h后，吸去上室及下室溶液，正常对照组上室加入200 μL DMEM培养基，下室加入800 μL DMEM培养基；屏障损伤组上室加入200 μL DMEM培养基；LGG阳性对照组，上室加入200 μL LGG阳性菌液；Llact-1组上室加入200 μL 乳明串珠菌Llact-1菌液；屏障损伤组、LGG阳性对照组和Llact-1组下室分别加入800 μL TNF-α溶液。置于5％二氧化碳培养箱中， 37℃静置培养5 h后，检测各组别细胞单层跨膜电阻（TEER）值。

结果：本试验选用LGG为阳性对照，与屏障损伤组相比，LGG可显著增加TEER值，对细胞屏障损伤具有明显的修复作用。同样，与屏障损伤组相比，乳明串珠菌Llact-1也可以显著增加TEER值，且效果优于阳性对照LGG（图3）。结果表明乳明串珠菌Llact-1可有效缓解炎症因子（如IFN-γ、TNF-α）造成的屏障功能障碍。

实施例6 乳明串珠菌的体外细胞炎症抑制试验

THP-1细胞极化：THP-1为悬浮细胞，使用PMA (佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate1 3-acetate，购于Sigma-Aldrich Company，P1585) 诱导THP-1使其极化为成熟巨噬细胞。在此基础上，进一步使用LPS（购于Sigma-Aldrich Company，L3024）和IFN-γ组合诱导成熟巨噬细胞极化为炎症型巨噬细胞。使用含10% FBS和终浓度为100 ng/mL PMA的RPMI-1640（购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，C11875500BT）培养基，以1×10⁵/孔的接种密度将THP-1细胞接种于96孔板中，置于5% CO₂培养箱中，37℃培养24 h后，更换含10% FBS，终浓度为100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ的RPMI-1640培养基，置于5％ CO₂培养箱中，37℃培养24 h。

菌株培养：从菌保管中接种乳明串珠菌Llact-1菌液200 μL至5 mL无氧二混培养基中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。转接一次后，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，5000rpm/min，离心15 min。用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释菌株至2×10⁶ CFU/mL备用。

乳明串珠菌Llact-1对THP-1细胞表达IL-6的影响：经PMA极化后的成熟THP-1细胞，吸去培养基。正常对照组，添加100 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基；THP-1细胞添加100 μL终浓度为100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ的RPMI-1640培养基为模型对照组；THP-1细胞添加100 μL含10% FBS和终浓度为25 μg/mL的地塞米松（购于Sigma-AldrichCompany，D4902-25）的RPMI-1640培养基作为阳性对照组；实验Llact-1组添加100 μL前期制备好的乳明串珠菌Llact-1菌液。置于5％ CO₂培养箱，37℃培养24 h。吸取80 μL细胞培养液，4℃，5000 rpm/min，离心15 min，收集上清液，使用Human IL-6 (Interleukin 6)ELISA试剂盒（购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-H6156) 检测IL-6含量。

实验结果：如图4所示，模型对照组细胞IL-6的表达显著高于正常对照组（P<0.01）；阳性对照地塞米松组能够显著抑制THP-1细胞中促炎因子IL-6（图4）的表达（P<0.01）；乳明串珠菌Llact-1组与模型组相比也能够降低促炎因子IL-6的表达（P<0.05），表明该菌株在体外具有一定的抗炎作用。

实施例7 乳明串珠菌对5-氟尿嘧啶（5-FU）致腹泻小鼠的治疗效果

冻干保护剂配制：

A液：蔗糖8 g，海藻糖8 g，黄原胶0.15 g，纯化水43.85 g，115℃灭菌20 min；

B液：精氨酸盐酸盐2 g，谷氨酸钠2 g，纯化水16 g，115℃灭菌20 min；

C液：维生素C钠4 g，纯化水16 g。过滤除菌备用。

使用时按A:B:C=6:2:2混合。

菌粉制备：将保藏的乳明串珠菌Llact-1按10%接种量接种至菌粉制备发酵培养基中，37℃，90 rpm厌氧培养15~20 h，得到一级种子液（OD₆₀₀值≥1.0）。随后，按1.5%接种量转接至菌粉制备发酵培养基中，37℃，90 rpm厌氧培养16~24 h，得到二级种子液（OD₆₀₀值≥0.8）。二级种子按1.5%接种量用蠕动泵泵入配制有菌粉制备发酵培养基的发酵罐中，设置发酵参数（温度30℃、pH= 6.0、转速100 rpm，压力控制0.06 MPa）开始发酵培养。发酵菌液OD₆₀₀值≥1.0 或OD₆₀₀值增长≤0.1时停止发酵，对菌液进行菌体收集。菌液分装至离心桶中，离心弃上清。按菌泥和冻干保护剂重量比1:2添加冻干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液，放入降温至-40℃的冷冻干燥机的板层上冻干，冻干程序结束后取出菌饼，粉碎后即得菌粉。动物给药前使用0.2 mL生理盐水将1×10⁹ CFU菌粉配置成菌悬液。

试验动物：20只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。

试验设计：采用5-FU（购自天津金耀药业有限公司，规格10 mL/支，0.25 g/10 mL）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型，根据小鼠初始体重随机分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照洛哌丁胺组和乳明串珠菌Llact-1组，每组5只。除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组别均进行5-FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量为350 mg/kg。所有组别给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂；阳性对照组灌胃5 mg/kg洛派丁胺（购自西安杨森制药有限公司）；Llact-1组灌胃1×10⁹ CFU乳明串珠菌。总体实验周期为9 d，记为D1-D9。D1-D5连续灌胃给药5天，D3进行5-FU单次造模处理，在D5给药结束后，连续观察4天。具体实验分组和给药方案见表1。

腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。实验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分。腹泻总分为每天腹泻评分的总和。

表1 试验分组和给药方案

组别

数量

造模剂

造模剂量

受试物

给药体积

给药剂量

给药天数

正常对照组

5

生理盐水

/

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

模型对照组

5

5-FU

350mg/kg

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

洛哌丁胺

5

5-FU

350mg/kg

洛哌丁胺

10 mL/kg

5 mg/kg

5 d

Llact-1

5

5-FU

350mg/kg

Llact-1

0.2 mL/只

<![CDATA[1×10<sup>9</sup> CFU/只]]>

5 d

注：5-FU:5-氟尿嘧啶；CFU:菌落形成单位；d: 天

试验结果：如图5所示，与模型对照组相比，Llact-1给药组对5-FU导致的腹泻具有明显改善作用，且与阳性对照咯哌丁胺效果相当（图5A）；D8 时腹泻评分与模型对照组相比显著降低（P<0.05）（图5B）；洛哌丁胺和乳明串珠菌Llact-1均可显著降低腹泻总分（P<0.01）（图5C）。

实施例8 乳明串珠菌Llact-1对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠结肠病理损伤情况的影响

动物模型的构建方法同实施例7，D10解剖所有动物，采集中段结肠，于4%多聚甲醛中固定24 h。将固定好的结肠组织依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋。将包埋好的结肠组织蜡块进行切片，厚度为5 μm，随后进行展片和烤片，将干燥的切片进行常规HE染色（随机挑选一只，染色结果如图6A所示）。在光学显微镜下观察其病理变化，并按照表2对其进行病理评分，统计结果见图6B。

由图6A可知，正常对照组结肠结构完整，黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层清晰可见；模型对照组结肠固有层可见肠腺坏死溶解，杯状细胞减少，淋巴细胞浸润，黏膜下层结缔组织疏松，血管扩张；洛哌丁胺组结肠结构较为完整，黏膜上皮细胞未见明显坏死，杯状细胞数量明显增多，固有层仅见少量淋巴细胞浸润；Llact-1组大肠组织的黏膜上皮细胞未见明显的变性或坏死，固有层可见少量肠腺坏死溶解、肠腺萎缩，杯状细胞数量轻度减少，偶见淋巴细胞浸润；黏膜下层及肌层未见明显异常。

对每组动物（n=5）炎症浸润病理评分进行统计分析，由图6B可知，模型对照组炎症浸润病理评分1.4±0.55（Mean±SD）显著高于正常对照组0±0.00（Mean±SD）（ P<0.01），表明5-FU诱导后小鼠结肠出现明显损伤。乳明串珠菌Llact-1给药后结肠的炎症浸润病理评分0.6±0.55（Mean±SD）显著低于模型对照组（ P<0.05），改善了结肠损伤程度。

由此可见，乳明串珠菌Llact-1可显著改善由5-氟尿嘧啶造成的小鼠结肠病理损伤。

表2 结肠组织病理学评分指标及说明（炎症细胞浸润情况）

等级	说明
		0	未见炎症细胞浸润
1	轻度浸润，黏膜中出现少量炎症细胞或炎症灶，炎症灶面积较小，或浸润到固有层
		2	中度浸润，黏膜中出现少量炎症细胞或炎症灶，炎症灶面积中等，或浸润粘膜肌层及粘膜下层
3	重度浸润，黏膜中出现大量炎症细胞或炎症灶，炎症灶面积较大，或跨壁浸润累及肌层

结论：本发明的乳明串珠菌Llact-1对化疗药物导致的动物腹泻及肠道损伤具有显著的改善作用。

Claims

1.一种乳明串珠菌（Leuconostoc lactis），其全基因组与保藏号为CCTCC NO：M20222028的菌株具有99.0%以上的平均核苷酸相似性。

2.根据权利要求1所述的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis），其全基因组与保藏号为CCTCC NO：M 20222028的菌株具有99.9%以上的平均核苷酸相似性。

3.一种乳明串珠菌（Leuconostoc lactis），所述乳明串珠菌是保藏号为CCTCC NO：M20222028的乳明串珠菌Llact-1或其子代菌株。

4.一种如权利要求1-3任意一项所述的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）的生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物。

5.一种药物组合物，其含有权利要求1-3任意一项所述的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）或权利要求4所述的生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

6.权利要求1-3任意一项所述的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）或权利要求4所述的生物纯培养物、活菌、灭活菌体或裂解物在制备治疗或预防腹泻的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，所述药物用于治疗或预防化疗相关性腹泻或致病菌引起的腹泻。

8.根据权利要求7所述的用途，所述致病菌选自铜绿假单胞菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、具核梭杆菌具核亚种和艰难梭菌中的一种或多种。

9.根据权利要求6所述的用途，所述乳明串珠菌还具有如下至少一种特征：

1）能缓解或减轻炎症因子IFN-γ或TNF-α造成的屏障功能障碍；

2）能抑制促炎因子IL-6的表达；

3）能减轻结肠组织炎性浸润程度。

10.根据权利要求7所述的用途，其中化疗所用的药物选自阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇、顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂、环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、培美曲塞、阿糖胞苷中的一种或几种。