CN108498549A

CN108498549A - 用于改善免疫功能的组合物及其应用

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Publication number: CN108498549A
Application number: CN201810495767.4A
Authority: CN
Inventors: 党福军; 林海鸣; 周军; 王欣; 郑晓鹤; 徐晴雨; 李娜; 黄隽
Original assignee: Taizhou Maikang Biotechnology Co ltd; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-05-22
Also published as: CN108498549B

Abstract

本发明属于医药领域，提供一种改善免疫功能的组合物及其制备方法和应用。所述组合物的有效成分为透明质酸或其盐和乳酸菌。该组合物能够改善机体的免疫功能，特别适用于缓解和治疗由抗肿瘤化疗诱发的并发症，降低化疗药物的副作用。

Description

用于改善免疫功能的组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种改善免疫功能的组合物。

背景技术

目前为止，大多数用于化疗的抗癌药或者放疗都对患者有不同程度的细胞毒性等副作用，导致患者免疫力降低，进而增加肠源性感染和多器官衰竭的风险，同时也严重影响癌症病人的生活质量。人们逐渐意识到在癌症治疗过程中不仅仅要追求疗效，寻求一切办法降低药物引起的副作用也是非常必要的。

环磷酰胺(Cyclophosphamide，CY)作为临床上一种广谱的抗癌药，主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞，并可抑制淋巴细胞转化，其疗效显著，但是也常常伴随着很严重的副作用如白细胞减少(leukopenia)、骨髓抑制(myelosuppression)、免疫抑制(immunosuppression)、细胞毒作用等(cytotoxiceffects)。CY有较强的免疫抑制功能(Pass,J.,D.Carrie,N.Boylan,S.et al.Role ofhepatic cytochrome P450s in the pharmacokinetics and toxicity ofcyclophosphamide:Studies with the hepatic cytochrome P450reductase nullmouse.Cancer Res.2005,65:4211-4217)。免疫系统中，胸腺为中枢免疫器官，脾脏为外周免疫器官，这些免疫器官指数高低一定程度反映机体免疫机能强弱；白细胞也是一种免疫细胞，具有吞噬异物并产生抗体的作用，能抵抗病原体的入侵。而CY能使动物胸腺萎缩、脾脏变小，使白细胞和淋巴细胞降低，因此常被作为免疫抑制动物模型的理想药物(PeláezB,Campillo J A,Lópezasenjo J A,et al.Cyclophosphamide induces the developmentof early myeloid cells suppressing tumor cell growth by a nitric oxide-dependent mechanism.[J].Journal of Immunology,2001,166(11):6608-15.)。

现在已有一些免疫增强剂(immunopotentiating agents)如levamisole被用于缓减化疗患者白细胞减少症，但是这类药物也存在显著的安全性副作用。近年来研究者在不断尝试寻找更加安全的免疫增强剂，其中利用益生菌食物提高免疫力的研究越来越受到人们的关注。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)作为益生菌中重要的一大类，其中乳杆菌(Lactobacillus sp.,)、乳球菌(Lactococcus sp.,)、明串珠菌(Leuconostoc sp.,)、片球菌(Pediococcus sp.,)肠球菌(Enterococcus sp.,)、链球菌(Streptococcus sp.,)、双歧杆菌(Bifidobacterium sp.,)等的安全性已得到国内外一致认可，这些菌广泛分布于发酵食品及人体和动物体中；其作为一类安全的活体微生物能起到多种生理功能，如促进动物生长、提高食物消化率、拮抗病原微生物入侵和生长、调节胃肠道菌群、维持肠道微生态平衡，从而减少代谢综合征发病风险，提高机体免疫力等(Paul W.O’Toole1,JulianR.Marchesi，and Colin Hill1.Next-generation probiotics:the spectrum fromprobiotics to live biotherapeutics.Nature Microbiology 2017 25(5),2:17057)。多项研究表明特定肠道微生物也可能成为肿瘤治疗的有效候选药物，可抑制肿瘤生长，增强放疗、化疗和免疫疗法药物的疗效，减少抗肿瘤治疗中的毒副作用(Soumen Roy andGiorgio Trinchieri.Microbiota:a key orchestrator of cancer therapy.Naturereviews.2017,17:271-285)。

发明内容

本申请发明人在研究乳酸菌抗肿瘤治疗中的作用时，发现由透明质酸和乳酸菌作为有效成分的组合物在提高免疫力方面有显著作用。基于此，本发明提供一种对改善免疫功能有作用的组合物，可以用于缓解和治疗由抗肿瘤化疗诱发的并发症，降低化疗药物副作用。

在第一个方面，本发明提供一种组合物，其有效成分为透明质酸或其盐和乳酸菌，其中，透明质酸或其盐的质量含量为组合物总质量的1-70％，优选为3-50％，更优选为4-30％，更优选为6-25％，乳酸菌含量为10⁴-10¹²CFU/g组合物，优选为10⁶-10¹⁰CFU/g组合物，更优选为10⁸CFU/g组合物。

优选地，所述组合物用于改善免疫功能。

优选地，所述透明质酸为低分子量透明质酸或高分子量透明质酸或二者的混合物；所述低分子量透明质酸的分子量为15万-150万道尔顿，优选为18万-22万道尔顿；所述高分子量透明质酸的分子量为150万-350万道尔顿，优选为180万-220万道尔顿；所述高分子量透明质酸与低分子量透明质酸以任意比例混合。

优选地，所述透明质酸的盐为钠盐或钾盐。

优选地，所述乳酸菌可以是乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、链球菌、肠球菌中的一种或者几种的混合物，优选的为乳杆菌中的一种或者多种菌；更进一步优选为乳杆菌中的鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或者两种或者三种菌，优选地，所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌三种菌以任意比例配制的混合物，更优选为三种菌以1︰1︰1比例配制的混合物。

在优选的实施方式中，所述组合物是一种制剂。

优选地，所述制剂的剂型为：片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、液体制剂等。

优选地，所述组合物中还含有制药学上可接受的辅料，所述辅料包括赋形剂如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素，填料如异麦芽酮糖醇、木糖醇、甘露醇等，调味剂如水果蔬菜粉、薄荷、各种香料、各种甜味剂等，粘合剂如淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素等，润滑剂如二氧化硅、硬脂酸镁等，氢化植物油、聚乙二醇等。

优选地，所述制剂为食品、药品或保健品。

第二个方面，提供本发明的组合物的制备方法，其中所述组合物为制剂，包括步骤：

1)利用冷冻干燥的方法，将乳酸菌制备成冻干菌粉；

2)用包埋剂包埋冻干菌粉制得包埋菌粉；优选地，所述包埋剂为氢化棕榈油；

3)将透明质酸、冻干菌粉或包埋菌粉以及辅料按照预设比例混合，并制备成预设的剂型。

第三个方面，提供本发明的组合物在制备用于改善免疫功能、优选地调节免疫力低下的药物、食品或保健品中的应用。

优选地，所述免疫力低下是由抗肿瘤化疗或放疗引起的；进一步优选地，所述免疫力低下的表征为：白细胞减少、骨髓抑制、消化道炎症、胃肠粘膜损伤、呕吐、腹泻、便秘。

优选地，所述免疫力低下是由环磷酰胺药物引起的。

透明质酸(hyaluronan or Hyaluronic Acid，HA)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，3和β-1，4糖苷键重复交替连接而成的具有直链结构的生物聚合物，存在于哺乳动物的多种组织中，特别是皮肤、眼睛的玻璃状体、关节液、脐带以及软骨组织中含量更加丰富(Toole BP.Hyaluronan:from extracellular glue to pericellular cue.NatRev Cancer.2004,4:528–539)。天然HA的相对分子质量分布广泛，由1000到1000万不等，研究表明不同分子量的HA作用不同，高分子量HA具有抗血管增生、抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡的作用且无免疫原性，低分子量的HA具有诱导肿瘤细胞粘附、血管生成和转移的作用(Jiurong Liang,Dianhua Jiang,and Paul W.Noble.Hyaluronan as a therapeutictarget in human diseases.Adv Drug Deliv Rev.2016,97:186–203)。

申请人在研究中意外发现用含有透明质酸的菌粉样品喂食经环磷酰胺致免疫功能低下的造模小鼠后，小鼠免疫力相关指标和对照相比有显著性差异，而不含透明质酸的菌粉样品则无显著变化。据此推测，透明质酸和菌株的组合物可能对免疫力低下小鼠有免疫增强剂的功效。利用环磷酰胺致BALB-c小鼠免疫功能低下的动物模型实验显示，本发明的透明质酸和益生菌的组合物可显著改善化疗药物引起的不良反应，如白细胞减少、淋巴细胞减少、多器官损伤等。以透明质酸和益生菌作为有效成分的组合物显著提升白细胞的功效，可能通过降低小肠粘膜通透性、促进肠绒毛修复和增强黏膜屏障等方式，提高肠道免疫功能。本发明的组合物可作为抗肿瘤化疗药物导致的免疫力低下哺乳动物的免疫增强剂，可与抗肿瘤化药联合使用，用于防治因化疗药物引发的并发症或降低因化疗诱发的毒副作用。

附图说明

图1示出了不同给药对环磷酰胺致免疫低下小鼠白细胞的影响。

图2为高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测尿液标本中乳果糖和甘露醇含量图谱。A：甘露醇和乳果糖标准品图谱；B：空白尿液；C：对照组小鼠尿液；D：模型组小鼠尿液；E：SHA301组小鼠尿液；F：SHA404组小鼠尿液。

图3示出了微生态制剂对小肠绒毛长度和隐窝深度的影响(HE染色观察)。A：对照组；B：模型组；C：SHA301组；D：SHA404组。

具体实施方式

如没有特别说明，本申请中使用的试剂及仪器皆为普通市售品，可以通过商购途径购得；本申请中使用的方法均为常规方法，本领域技术人员根据说明书所记载的内容，可以毫无疑问地实施该方法并获得相应的结果。其中，

厌氧工作站：英国ELECTROTEK厌氧/微需氧工作站AW300SG；

PBS(货号：B640435-0050)购自生工上海有限公司；

Rogosa Agar(固体培养基)，Oxoid；

MRS Broth(液体培养基)，Oxoid；

透明质酸(HA)，海正药业股份有限公司提供；

注射用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；

APC Hemster Anti-Mouse CD3e(APC-CD3e)、FITC Rat Anti-Mouse-CD4(FITC-CD4)、PE Rat Anti-Mouse-CD8a(PE-CD8a)，均购自美国BD Biosciences公司；

甘露醇、乳果糖标准品均购自中国食品药品检定研究院；

BALB/c小鼠，雄性，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001；

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HPL03，保藏号：CGMCC NO.15143，是从生产醋的发酵液中经过特殊培养基分离、纯化、菌株鉴定后获得；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HCL01(保藏号：CGMCC NO.15144)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)HCL04(保藏号：CGMCC NO.15145)，均是从健康的儿童粪便中经过特殊培养基分离、纯化、菌株鉴定后获得。这三株菌均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期均为2018年1月2日。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：样品制备

(1)菌粉样品制备：将植物乳杆菌HPL03、鼠李糖乳杆菌HCL01、罗伊氏乳杆菌HCL04的-80℃冻存甘油管菌株活化到Rogosa固体培养基上，37℃厌氧培养40h；挑取单菌落转接到含有5ml液体培养基(MRS Broth)的试管中，37℃厌氧培养24h；按1％(体积比)接种量转接到含有200ml液体培养基(MRS Broth)的三角摇瓶中，37℃厌氧静止培养约18h；收集发酵液，4℃4000rpm离心10min，弃上清，用PBS(货号：B640435-0050，配制方法及成分详见其说明书)缓冲液洗涤两遍，最后用20ml的PBS缓冲液悬浮菌体，三种菌的菌浓度分别控制在10⁹～10¹²CFU/ml，混合，加入等体积的冻干保护剂液体溶液(8％脱脂奶粉、3％乳糖、1％麦芽糊精、0.5％谷氨酸钠、0.5％抗坏血酸，其余为水，其中各物质含量为质量体积比，即，100ml液体中含有8g脱脂奶粉，其它物质相同表示)悬浮菌体，充分混匀，室温静置30min，放入-80℃冷冻4h，迅速转移至真空冷冻干燥机内，进行抽真空冷冻干燥，冷冻干燥40h，获得冻干菌粉(活菌数达10¹⁰～10¹⁴CFU/g菌粉)。按照冻干菌粉质量含量10％、其他辅料如异麦芽酮糖醇质量含量90％配制样品，并充分混匀，获得小鼠受试组一的样品SA，分装到西林瓶中抽真空压盖密封，4℃保存备用。

(2)透明质酸样品配制：按照透明质酸质量含量20％、其他辅料如异麦芽酮糖醇质量含量80％配制样品，并充分混匀，获得小鼠受试组二的样品HA，分装到西林瓶中抽真空压盖密封，4℃保存备用。

(3)混合物的配制：按照透明质酸质量含量20％、上述制备的冻干菌粉质量含量10％、其他辅料如异麦芽酮糖醇质量含量70％配制样品，并充分混匀，获得小鼠受试组三的样品SHA，分装到西林瓶中抽真空压盖密封，4℃保存备用。

实施例2：动物实验

(1)动物分组：BALB/c小鼠，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001；BALB/c小鼠40只，7周龄，20-22g，雄性，随机分成5组，每组8只，分别为对照组、模型组、受试组一、受试组二、受试组三。

(2)给药：小鼠以灌胃的方式给药，具体的对照组和模型组给小鼠灌胃PBS溶液，受试组给小鼠灌胃如下样品：受试组一：4mg SA/小鼠/天，受试组二：4mg HA/小鼠/天，受试组三：4mg SHA/小鼠/天。具体的，每天从4℃取出并分别称取40mg样品，用PBS缓冲液定容到5ml，充分混匀，每只小鼠灌胃0.5ml，每天1次，连续灌胃21天。

(3)造模：本试验用动物模型为利用腹腔注射环磷酰胺致小鼠免疫低下模型；具体方法为：对步骤(2)的给药21天的模型组和受试组腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续给药2天，造模1次。对照组腹腔注射生理盐水，量同上。造模的2天中，依然按照步骤(2)的方式给药；2天造模后，再按照步骤(2)的方式给药5天。

实施例3：常规免疫指标的检测

(1)检测方法：

造模后的第5天，用血细胞分析仪检测小鼠尾静脉血的红细胞、血小板计数、白细胞和淋巴细胞数目；并取胸腺、脾，称重，计算其免疫器官指数。

免疫器官指数＝免疫器官重量/体重

(2)统计学方法

实验所得的数据均以(MEAN±SD)表示，用t检验比较组间差异。

(3)结果分析：

A.各实验组的小鼠器官分析结果如表1所示。

表1：不同给药对免疫低下小鼠免疫器官的影响

注：a:HA平均分子量约18-22万道尔顿；b:SHA样品中的透明质酸为HA,平均分子量约18-22万道尔顿；^#P<0.05,^##P<0.01，与对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组比较。

经T检验，结果(表1)显示，模型组小鼠的体重和胸腺指数与正常组比较，有显著性差异##P<0.05；各受试组的胸腺指数与模型组比较没有差异；对小鼠给药SA/HA/SHA后，小鼠体重和脾脏变化，特别是SHA连续给药28天能显著恢复小鼠体重、促进脾脏指数提升，说明SHA组能促进小鼠免疫功能。

B.小鼠血常规检测结果如表2所示：

经T检验，结果显示(见表2、图1)，模型组与对照组比较，白细胞、淋巴细胞有显著性差异###P<0.001；给药SA或HA的受试组与模型组比，白细胞和淋巴细胞没有显著变化；但给药SHA组(受试组三)，白细胞和淋巴细胞的数量明显回升**P<0.01，说明SHA有显著促进小鼠免疫功能提升的作用。

表2：不同给药对免疫低下小鼠血常规的影响

注：^###P<0.001，与对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组比较。

实施例4：不同分子量透明质酸对免疫低下小鼠血常规的影响

小鼠的对照组和模型组的给药内容同实施例2；受试组的给药情况如下：SHA301样品同实施例2的SHA，而SHA404与SHA301不同的是透明质酸平均分子量为180-220万道尔顿。小鼠的给药、造模过程同实施例2。

通过不同分子量透明质酸比较试验可见，如表3所示，本发明的组合物，含有低分子量透明质酸和高分子量透明质酸的组合物均有显著的升高白细胞疗效，含有高分子量透明质酸的组合物效果更显著。

表3.不同剂量及成分的组合物对免疫低下小鼠血常规的影响(n＝8)

注：^#P<0.05,^##P<0.01，与对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较；

实施例5：本发明组合物对免疫功能低下小鼠免疫细胞亚群的影响

将实施例4实验小鼠进一步进行免疫细胞亚群测定，具体步骤如下：

脾淋巴细胞提取：断颈处死小鼠，浸入75％的乙醇中浸泡1-2分钟；在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏，注意无菌操作；在40mm培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上；然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基；2500rpm离心30分钟。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集；吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，1000rpm离心5分钟。倾倒上清液，加入3-5mL无血清培养基重悬，细胞计数。

细胞表面流式染色：将制好的单细胞重悬于PBS中制备成1×10⁶细胞的悬液，分装于EP管中，每管100ul，样本管、空白管、单阳管(3管)；

空白管：不加；

单阳管：FITC管：每管加入5μl的FITC-CD4；

PE管：每管加入2μl的PE-CD8a；

APC管：每管加入2μl的APC-CD3e；

样本管：加5μl的FITC-CD4，2μl的PE-CD8a，2μl的APC-CD3e；

避光孵育20min，温度4-20℃；每管加1ml的PBS清洗2次，2000rpm离心2min。仔细吸去或倒掉上清；用0.5ml的PBS重悬，上机；上空白管调FSC、SSC、FITC、PE、PE-CY7电压，上单染管调补偿，上样本管记录数据。

T淋巴细胞按功能和表面标志主要分为辅助T细胞、细胞毒T细胞、抑制T细胞、记忆T细胞，辅助T细胞和细胞毒T细胞直接参与机体免疫应答。CD3是成熟T淋巴细胞表面标志。CD4是辅助T淋巴细胞表面标志，其主要功能是增强吞噬细胞介导抗感染，增强B细胞介导的免疫应答；CD8是细胞毒T细胞表面标志，能直接杀伤病原体感染的细胞或肿瘤细胞，CD8+细胞数量上升可能与机体遭受病毒侵袭有关。CD4+/CD8+的比值降低是机体免疫功能下降的重要标志。结果显示(见表4)，模型组的CD4+/CD8+的比值与正常组比较有明显下降，说明小鼠免疫功能下降。给予SHA301和SHA404后，小鼠CD4+比例与模型组比较有明显上升趋势，CD4+/CD8+的比值也有显著升高，说明微生态制剂SHA301和SH404可通过提高CD4+标记的T辅助淋巴细胞来提高机体免疫。

表4.微生态制剂对免疫低下小鼠免疫细胞影响(n＝8)

注：#P<0.05与空白组比较；*P<0.05，**P<0.01与模型组比较

实施例6：本发明组合物对肠粘膜通透性的影响

利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析(HPLC-ELSD)检测尿液标本中乳果糖和甘露醇的排除率比值(L/M)，具体方法如下：

(1)给药方法及尿样采集：实施例4的小鼠在给药28天后，受试前所有小鼠禁食16h，对照组小鼠不喂食乳果糖/甘露醇混合物，直接取尿样；模型组和受试组：取0.5ml乳果糖/甘露醇混合物(含乳果糖60mg/ml，甘露醇40mg/ml)，用灌胃器插小鼠食管上端缓慢灌注。收集6h尿液，将尿液置于-80℃保存，待尿样收齐后检测。

(2)尿液预处理：取冰冻贮存的尿液样品解冻、摇匀，将尿液离心(12000r/min)30min，以去除尿中的沉淀物。再经0.22μm滤膜去蛋白颗粒。用超声波脱气20min后上机分析待检。

(3)甘露醇标准溶液的配制：精密称取甘露醇标准品100mg，用超纯水配制成10mg/mL的标准储备液。精密量取甘露醇储备液，分别配制成浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg/mL的溶液。

(4)乳果糖标准溶液的配制：精密称取乳果糖标准品50mg，用超纯水配制成5mg/mL标准储备液。精密量取乳果糖储备液，分别配制成浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液。注：乳果糖与甘露醇标准品同时溶解于10ml超纯水中，分别制成5mg/mL、10mg/mL标准品储备液。

(5)色谱条件方法：色谱柱：XBridge Amide(4.6mm﹡250mm*3.5um),柱温为30℃，流动相为乙腈：水，梯度：0～10min 20％水，80％乙腈；10～25min40％，60％乙腈；25～35min20％水，80％乙腈。流速为1.0ml/min，进样量为20μl，样品盘温度为8℃，检测波长为225nm。

小肠黏膜透性降低，可阻止肠内细菌、内毒素以及炎症因子等有害物质通过肠黏膜进入腹腔器官和血液循环，降低肠道损伤和炎症产生。有文献报道，益生菌可定植于肠黏膜上，增强黏膜屏障，降低黏膜通透性，保护肠黏膜免受其他病原菌的黏附与入侵。甘露醇(N)是单糖(分子量182kb)，分子较小，主要从肠黏膜细胞膜上的水溶性微孔透过肠道。乳果糖(L)是双糖(分子量342kb)，分子较大，主要通过肠黏膜细胞间的紧密连接透过肠黏膜，这也是细菌及其毒素通过肠黏膜的途径，因此乳果糖/甘露醇的比值(L/N)可反应黏膜通透性，比值变大，通透性增加。实验结果(见表5、图2)表明，SHA301和SHA404均能降低小肠黏膜通透性，提示SHA301和SHA404提高小鼠免疫功能可能与其降低小肠黏膜通透性有关。

表5.微生态制剂对免疫低下小鼠小肠通透性影响(n＝8)

注：^*P<0.05，与模型组比较

实施例7：本发明组合物对小肠绒毛高度、隐窝深度以及二者比值的影响

形态学观察取实施例4中连续给药28天后的小鼠小肠空肠段约1～2cm置于10％中性甲醛中固定，常规石蜡包埋后制作石蜡切片，并进行HE染色，光镜下观察并拍照记录。每组取5只小鼠的切片，每个片子取2个不同视野，每个视野随机选择5个完整的绒毛、隐窝单位测量小肠绒毛高度(以肠腺绒毛连接处到绒毛顶端为准)和隐窝深度(以肠腺绒毛连接处到肠腺基部为准)，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C比值)。

肠道免疫系统在抗原物质通过黏膜的机械屏障、生物屏障、化学屏障进入淋巴组织后发挥作用。环磷酰胺在杀伤肿瘤细胞的同时，对细胞增殖活跃的消化道黏膜也会造成严重损伤，吸收能力下降，黏膜屏障功能失调，从而导致免疫功能损伤。当肠道受到侵袭或应激反应时，肠绒毛就会受损变短，隐窝细胞便不断产生大量具有分泌功能的未成熟上皮细胞以补充绒毛细胞，表现为隐窝深度变深。绒毛高度/隐窝深度的比值(V/C值)则综合反映小肠的功能状态。比值下降，表示消化吸收功能下降，黏膜损伤加剧；比值上升，表明吸收功能上升，屏障功能恢复。实验结果(见表6和图3)显示，模型组小鼠小肠绒毛明显缩短变粗，隐窝加深，提示小肠黏膜受到损伤，而给予SHA301和SHA404两种组合物后，小肠绒毛变长，隐窝变短，绒毛高度/隐窝深度的比值(V/C值)变大，说明SHA301和SHA404能够促进肠绒毛的修复功能和增强黏膜屏障，从而提高肠道免疫功能。

表6：本发明组合物对免疫低下小鼠小肠通透性影响(n＝8)

注：^###P<0.001，与对照组比较；^**P<0.01,^***P<0.001，与模型组比较

实施例8：制剂产品的制备

基于实施例1-SHA样品显著降低化疗药物毒副作用结果，将SHA即透明质酸和乳酸菌作为必须的有效成分开发成一类复合微生态制剂。乳酸菌在体内体外的存活率直接影响着该制剂的功效，故该微生态制剂优选的通过以下步骤制备成易保存易携带易服用的片剂，具体制备过程如下：

(1)冻干菌粉制备：按照实施例1的方法获得冻干菌粉(活菌数为10¹⁰～10¹⁴CFU/g)。

(2)菌粉包埋：将氢化棕榈油加热融化，置于自动搅拌机内，待温度降到55℃左右时，按氢化棕榈油:冻干菌粉重量比例1:1缓慢加入菌粉，同时快速搅拌粉碎，包埋后的菌粉过40目筛，获得颗粒均一的可压片的包埋菌粉，迅速转移至铝箔袋中抽真空密封，4℃保存备用。经检测，每克包埋菌粉中，活菌数为10⁹-10¹³CFU/g。

(3)原料混合：将不同原料按以下质量比例混合，透明质酸(15万-150万道尔顿，优选18万-22万道尔顿，或者150万-350万道尔顿，优选180万-220万道尔顿)1％-70％，优选3-50％，更优选为4-30％，更优选为6-25％，包埋菌粉1％-20％，润滑剂(二氧化硅、硬脂酸镁等，氢化植物油或聚乙二醇)0.1％-1％，其他辅料(如赋形剂(淀粉、糊精、乳糖或微晶纤维素)、调味剂(水果蔬菜粉、薄荷、各种香料或各种甜味剂)、粘合剂(淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基纤维素)等、包囊剂等)0.1％-5％，填料(异麦芽酮糖醇、木糖醇或甘露醇)10％-90％，使总量为100％，充分搅拌混匀待用。应当理解的是赋形剂、填料、调味剂、包囊剂、润滑剂、粘合剂以及片剂产品的其它组分是本领域公知的，可以使用且不影响该产品功效。混合的原料中，活菌数的含量为10⁷-10¹²CFU/g。

(4)压片：将混合好的原料转移至压片机的料斗中，按500-1000mg/片的重量压片。

(5)包装：将片剂与干燥剂一起包装在铝箔袋中，4℃保存待重新包装。

在该实施例中，接着如上将所选择的乳酸菌和透明质酸以需要量的水平添加到片剂中作为有效成分(如上述的SHA)，该片剂供人使用以作为一种降低化疗引起毒副作用的方法，也可用于免疫力低下的人群。

如上所述，本发明的产品可以是不同于片剂的形式，例如锭剂、粉剂及其它制剂，包括选择SHA在内的本领域公知的制备基础产品标准方法对于制备本发明产品是有用的。

尽管某些代表性实施方案已列于此，本领域技术人员可容易地意识到能进行不背离本发明精神或范围的修改，均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种组合物，其有效成分为透明质酸或其盐和乳酸菌，其中，透明质酸或其盐的质量含量为组合物总质量的1-70％，优选为3-50％，更优选为4-30％，更优选为6-25％，乳酸菌含量为10⁴-10¹²CFU/g组合物，优选为10⁶-10¹⁰CFU/g组合物，更优选为10⁸CFU/g组合物；优选地，所述组合物用于改善免疫功能。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述透明质酸为低分子量透明质酸或高分子量透明质酸或二者的混合物；所述低分子量透明质酸的分子量为15万-150万道尔顿，优选为18万-22万道尔顿；所述高分子量透明质酸的分子量为150万-350万道尔顿，优选为180万-220万道尔顿；优选地，所述高分子量透明质酸与低分子量透明质酸以任意比例混合。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述透明质酸的盐为钠盐或钾盐。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述乳酸菌为乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、链球菌、肠球菌中的一种或者几种的混合物，优选的为乳杆菌中的一种或者多种菌；更优选为乳杆菌中的鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或者两种或者三种菌；优选地，所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌以任意比配制的混合物；更优选为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌三种菌等比例配制成混合物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中，所述组合物是一种制剂；优选地，所述制剂的剂型为片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂或液体制剂。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物还含有制药学上可接受的辅料；优选地，所述辅料包括赋形剂、填料、调味剂、粘合剂、润滑剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述制剂为食品、药品或保健品。

8.制备权利要求5-7任一项所述组合物的方法，包括步骤：

1)利用冷冻干燥的方法，将乳酸菌制备成冻干菌粉；

2)任选地，用包埋剂包埋冻干菌粉制得包埋菌粉；优选地，所述包埋剂为氢化棕榈油；

9.权利要求1-7的组合物在制备用于改善免疫功能、优选地调节免疫力低下的药物、食品或保健品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述免疫力低下是由抗肿瘤化疗或放疗引起的；优选地，所述免疫力低下是由环磷酰胺药物引起的。