KR101355440B1 - 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 에이취와이7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents
류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 에이취와이7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 류마티스 관절염을 비롯한 염증성 질환의 치료 및 예방과 더불어 항염증 효능을 위한 약학적 조성물, 발효유, 건강기능 식품 등으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Foxp3+ Tregs의 형성을 유도함으로써 면역관용을 유도하여 Th-1 매개 염증질환의 하나인 류마티스성 관절염을 예방하는 효능을 가지는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것이다.
최근 들어 유산균의 다양한 역할이 연구되어지고 있으며, 류마티스 관절염을 포함하여 대장성 염증질환, 아토피 피부염, 당뇨병과 같은 염증성 질환들의 치료 효능이 밝혀지고 있다. 2형 콜라겐으로 유도된 류마티스 관절염 마우스 동물모델에서 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 섭취가 관절염 억제에 효과가 있었으며(Life Science, 1998;63(8):635-644), Lewis rat을 이용한 관절염 동물모델에서 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG)의 섭취가 관절염 억제에 효과가 있다고 보고되었다(Journal of Nutrition, 2004;134(8):1964-1969). 또한, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 류마티스 관절염 억제 기작이 밝혀졌는데, CD4 T 세포에서 항 염증성 사이토카인(Cytokine)인 IL-10(Interleukin-10)의 발현은 증가시키는데 반하여, TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interleukin-1β)와 같은 염증성 사이토카인(Cytokine) 발현은 억제하는 것으로 보고되었다(Molecular Immunology, 2008;46(1):172-180).
본 발명자들은 염증반응에 의해 유발되는 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 프로바이오틱스(Probiotics)를 개발하고자 다양한 유산균을 대상으로 마우스 장간막 림프구 세포를 대상으로 면역조절/억제 T세포인 CD4+Foxp3+ Tregs의 형성을 유도하며, 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시킴과 동시에 대표적 염증성 사이토카인인 IL-12의 발현을 낮출 수 있는 유산균을 선발하는 과정에서 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801이 우수한 효능을 가짐을 생체외(in vitro) 실험을 통해 확인하고 류마티스성 관절염 동물 모델 실험을 통해서 류마티스 관절염 예방 효능을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 다양한 류마티스성 관절염을 예방할 수 있는 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD4+Foxp3+ Tregs의 형성을 유도하며, 대표적인 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시킴과 동시에 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-12 발현을 감소시킴으로써, 류마티스 관절염을 비롯한 Th1 매개 다양한 염증성 질환을 예방 및 치료 할 수 있는 항염증 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 건강한 성인 분변을 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후, 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 형성된 단일 콜로니를 각각 분리하여 사용하였다. 이렇게 분리한 균주의 관찰은 MRS 한천평판배지에서 37℃로 48시간 배양한 후, 그람염색(Cowan, 1974)을 통하여 분리 균주의 크기와 형태를 광학현미경으로 관찰하였으며, 분리한 균주의 생화학적 특성은 Cowan과 Steel(1984) 그리고 Macfaddin(1984)의 방법에 따라 균주의 특성을 조사한 후 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology와 Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology 및 16S rDNA 유전자 분석을 통하여 분류 및 동정하였다.
이와 같은 방법으로 분리된 본 발명에 따른 신규 유산균의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
① 세포의 형태: 간균
② 운동성: 없음
③ 포자형성능: 없음
④ 그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
① 형상: 원형
② 융기: 볼록
③ 표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
① 최적 생육온도: 36~38℃
② 최적 생육 pH: 6.0~6.5
③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10) 16S rDNA 분석
16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법을 실시하여 본 발명의 신균주를 동정하였다. 즉, MRS 배지에 배양된 본 발명의 신규주로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3') 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 반응[(95℃, 3분), 30cycles(95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 90초), 72℃, 10분]을 수행하여 1.45kbp의 증폭산물을 얻은 후 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석한 결과를 토대로 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 하기 표 1에서와 같이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주임을 동정할 수 있었다.
위와 같은 유산균의 유전적, 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 유산균을 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801로 명명하고, 한국생명공학연구원에 2011년 6월 10일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 11959BP).
한편, 본 발명의 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제재화하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 제조한다.
또한, 본 발명의 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다.
또한, 본 발명의 류마티스 관절염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801은 면역조절 T세포(Regulatory T cell)에서 면역관용(Immune tolerance)을 유도할 수 있는 Foxp3(Forkhead box p3) 전사조절인자(Transcriptional regulator)의 발현을 유도하며, 대표적인 항염증 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시킴과 동시에 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-12의 발현을 감소시키는 효능이 매우 뛰어남은 물론 류마티스 관절염 동물 모델에서 관절염 예방 효능을 확인하여 류마티스성 관절염을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료 기능을 갖는 약학 조성물, 기능성 식품 등에 이용될 수 있다.
도 1은 마우스의 장간막 림프구 유래 면역세포와 유산균을 1:10의 비율로 공동배양한 후 유세포분석기를 통하여 Foxp3+ population의 비율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 마우스의 장간막 림프구 유래 면역세포와 유산균을 1:10의 비율로 공동 배양하면서 배지에 존재하는 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마우스의 장간막 림프구 유래 면역세포와 유산균을 1:10의 비율로 공동 배양하면서 배지에 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-12의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 관절염 유도 동물 효능 평가에서 유산균 투여에 의한 관절염 예방 효능을 관찰한 사진이다.
도 5는 관절염 유도 동물 효능 평가에서 유산균 투여에 의한 관절염증 지표를 측정한 결과이다.
도 2는 마우스의 장간막 림프구 유래 면역세포와 유산균을 1:10의 비율로 공동 배양하면서 배지에 존재하는 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마우스의 장간막 림프구 유래 면역세포와 유산균을 1:10의 비율로 공동 배양하면서 배지에 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-12의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 관절염 유도 동물 효능 평가에서 유산균 투여에 의한 관절염 예방 효능을 관찰한 사진이다.
도 5는 관절염 유도 동물 효능 평가에서 유산균 투여에 의한 관절염증 지표를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801을 포함한 동결건조 분말 제조
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801은 식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract, 그리고 포도당을 첨가한 액체배지를 제조하여 37℃에서 약 16시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산하였다. 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 1011cfu 균수를 얻었다. 이 동결건조 분말을 면역조절 및 강화 효능 소재로 사용하였다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801은 상기와 같이 동결 건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 2>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
정제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
유산균 배양액과 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 × 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유한 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801을 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물 100중량부에 대하여 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactibacillus helveticus
) HY7801의 Foxp3+ population 증가능 측정
다양한 면역질환의 치료 및 예방에 있어서 면역관용(Immune tolerance)이 중요한 역할을 수행한다. 면역관용에 중요한 기능을 담당하고 있는 세포는 T 세포(T cell)라 알려져 있으며, CD4+Foxp3+ 형질을 가지는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)가 대표적이다. 면역조절 T 세포는 특이적으로 세포내에 Foxp3(Forkhead box p3) 전사조절인자(Transcriptional regulator)를 특이적으로 발현하고 있음에 착안하여 Foxp3 전사조절인자에 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광표지 단백질이 표지된 형질전환 마우스(Foxp3-GFP KI 마우스)를 이용하여 생후 6~8주령 Foxp3-GFP KI 마우스로부터 장간막 림프절을 분리한 후 장간막 림프구와 다양한 유산균주를 1:10의 비율로 공동배양 하였다. 공동배양 후 유세포 분석기를 사용하여 GFP+(Foxp3+) 신호를 측정함으로써 Foxp3 전사조절인자의 발현량을 측정하였다. 상기 유산균주로는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801, B. longum, L. acidophilus를 사용하였다.
또한 형질전환 마우스에 대한 음성대조군(Negative Control)으로서 정상 마우스의 장간막 림프구를 사용하였다.
본 시험에서 PBS(Phosphate buffered saline)는 무처리 대조군으로, LPS(Lipopolysaccharide)는 양성대조군으로 사용하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, B.longum 균주는 약 5%, L.acidophilus 균주는 약 11% 정도 Foxp3 population을 증가시킴에 비하여 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 유산균은 약 14% 정도 Foxp3 population을 증가시킴으로써 다른 균주에 비하여 Foxp3 전사조절인자의 발현을 가장 많이 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2>
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801의 IL-10 발현 증가능 측정
IL-10(Interleukin-10)은 TGF-β(Tumor growth factor-β)와 더불어 대표적인 항염증성 사이토카인(Cytokine)으로 Th2 세포(Helper T Cell 2)에서 분비되어 Th1 세포(Helper T Cell 1)의 IFN-γ(Interferone-γ)의 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다. IL-10이 발현되는 세포로는 대식세포(Macrophage), 수지상세포(Dendritic cell), CD8+ T cell, B cell, 비만세포(Mast cell)등이 존재한다.
본 시험에서는 유산균주가 IL-10의 발현에 미치는 영향을 조사하고자 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 Foxp3-GFP KI 마우스로부터 장간막 림프절을 분리한 후 장간막 림프구와 다양한 유산균을 공동배양 한 후 배지로 분비되는 IL-10 발현량을 ELISA 방법을 통해서 정량하였다.
상기 유산균주로는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801, B. longum, L. acidophilus를 사용하였다.
본 시험에서 PBS는 무처리 대조군으로 사용하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, B. longum, L. acidophilus, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801은 모두 약 1,000pg/ml 이상의 IL-10을 발현을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편 데이터를 보이지는 않았지만 시험에 사용된 다른 유산균은 대략 500pg/ml 이하의 IL-10의 발현을 유도하였다.
<시험예 3>
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactibacillus helveticus) HY7801의 염증성 사이토카인 IL-12 발현능 측정
대표적인 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-12(Interleukin-12)는 바이러스 감염에 의한 세포내의 외부 병원성 물질이 침입시 항원제시세포(Antigen presenting cell)에서 주로 생성되며, Th1 면역반응을 일으키고 발달시키는데 중요한 역할을 한다. IL-12는 Th1 세포의 IFN-γ와 TNF-α의 생성을 유도하고 Th2 세포의 발달은 억제한다. 따라서 IL-12의 생성을 감소 또는 억제 시키는 유산균은 강력한 항염증 효능을 가진다고 할 수 있다.
따라서, 본 시험에서는 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 Foxp3-GFP KI 마우스로부터 장간막 림프절을 분리한 후 장간막 림프구와 다양한 유산균을 공동배양 한 후 배지로 분비되는 IL-12의 양을 ELISA를 통해서 정량하였다.
상기 유산균주로는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801, B. longum, L. acidophilus를 사용하였다.
본 시험에서 PBS는 무처리 대조군으로 사용하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, B. longum, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801, L. acidophilus은 모두 약 100pg/ml 이하의 IL-12의 발현량을 보임을 확인할 수 있었다.
한편, 데이터를 보이지는 않았지만, 시험에 사용된 다른 유산균은 200pg/ml 이상의 IL-12를 발현을 유도하였다.
<시험예 4>
락토바실러스 헬베티쿠스(
Lactobacillus helveticus
) HY7801의 류마티스 관절염 예방 효능 평가
상기 시험예 2와 시험예 3에서와 같이 IL-10의 발현능은 높고, IL-12의 발현능은 낮은 3가지 유산균인 B. longum, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801, L. acidophilus를 선정하여 동물효능 평가를 수행하여 관절염 예방 효능을 확인하였다.
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801, B. longum, L. acidophilus 유산균주를 류마티스 관절염 동물모델 유도 전 3주 동안 주 5회 이상 구강을 통해 DBA1/J 마우스에 5x108cfu의 유산균을 직접 주입 하였다.
유산균을 먹이지 않고 PBS만을 먹이는 그룹을 음성대조군으로 하였다.
제2형 닭(chicken) 콜라겐을 완전 프로인트 아쥬번트[complete Freund's Adjuvant(CFA)]와 1:1로 에멀젼(emulsion) 해 준 후 base tail에 면역(immunization)하고 3주 후 첫 번째 면역(immunization) 한 부위(site)의 옆에 제2형 닭(chicken) 콜라겐을 불완전 프로인트 아쥬번트[incomplete Freund's Adjuvant(IFA)]와 1:1로 에멀젼(emulsion) 하여 두 번째 면역(second immunization)을 하여, 류마티스 관절염을 유도한 후 증상 및 염증이 심한 정도를 관절염 스코어(arthritis score) 기준에 따라 측정하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 PBS를 먹인 그룹에서 가장 심한 류마티스 관절염(arthritis) 증상을 나타내고 있으며, 상대적으로 락토바실러스 헬베티쿠스( Lactobacillus helveticus) HY7801 유산균 투여 그룹에서 류마티스 관절염 증상 완화가 가장 우수함을 관찰 할 수 있었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801 유산균 투여군에서 가장 낮은 관절염 스코어링 결과를 확인할 수 있었다.
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- 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방용 약학조성물.
- 면역조절 T 세포(Regulatory T cells: Tregs)의 Foxp3(Forkhead box p3) 전사조절인자(Transcriptional regulator)의 발현을 증가시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방용 약학조성물.
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- 면역조절 T 세포(Regulatory T cells: Tregs)의 Foxp3(Forkhead box p3) 전사조절인자(Transcriptional regulator)의 발현을 증가시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
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- 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 면역조절 T 세포(Regulatory T cells: Tregs)의 Foxp3(Forkhead box p3) 전사조절인자(Transcriptional regulator)의 발현을 증가시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 항 염증성 사이토카인(Cytokine) IL-10(Interleukin-10)의 발현을 증가시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방용 약학조성물.
- 염증성 사이토카인(Cytokine) IL-12(Interleukin-12)의 발현을 감소시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방용 약학조성물.
- 항 염증성 사이토카인(Cytokine) IL-10(Interleukin-10)의 발현을 증가시킴으로써 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 효능을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) HY7801(기탁번호:KCTC 11959BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
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