JPH07228536A - 乳酸菌を用いた免疫賦活剤 - Google Patents
乳酸菌を用いた免疫賦活剤Info
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Abstract
シズ ブルガリカス(Lactobacillus d
elbrueckii subsp.bulgaric
us)を主成分とする免疫賦活剤。 【効果】 抗原性物質、感染性微生物によって引き起こ
される疾病の予防、治療に有用な、しかも安全性がきわ
めて高い食品や医薬品を供給することができる。
Description
のであって、更に詳細には、免疫賦活作用の高い特定の
乳酸菌(Lactobacillus delbrue
ckii subsp.bulgaricus)の菌体
及び/又はその処理物を有効成分とする免疫賦活剤に関
するものである。
様々な研究が進められている。この生理効果の中には、
腸管のIgA産生能の上昇、抗ガン作用やアジュバント
活性等の免疫賦活作用がある。例えば、保井らは、Bi
fidobacteriumbreveの菌体はパイエ
ル板細胞のIgA産生能を増強すると報告している(保
井ら;特開平2−280059)。また、Perdig
onらは、Lactobacillus caseiを
経口投与すると、皮下投与した繊維肉腫の成長を阻害し
たと報告している(Perdigon G.,et a
l.,;Int. J.Immunotherapy
IX(1) 29−52 (1993))。
乳酸菌の免疫賦活能は、LeeらがT細胞増殖活性試験
やin vitro抗体産生試験で調べたように、全般
にBifidobacterium属で高く、Lact
obacillus属やStreptococcus属
などでは低いとされている(Lee,et al.,;
Biosci.Biotech. Biochem.,
57(12),2127−2132,1993)。しか
し、Lactobacillus属やStreptoc
occus属などに属する全ての乳酸菌の免疫賦活能が
低いわけではなく、乳酸菌の持つ免疫賦活能は、菌株に
よって大きく異なっている。
llus delbrueckiisubsp.bul
garicus91菌株の免疫賦活能のスクリーニング
を行うことによって、より活性の高いL.delbru
eckii subsp.bulgaricusの菌株
を見つけることを目的とした。その結果、Bifido
bacterium属の菌株と比較して、同等かそれ以
上の免疫賦活能を示す菌株を見出し、腸管感染やアレル
ギーの防御に同種の他菌株より効果が期待できることを
発見した。
解決すべく、本発明者らは、L.delbruecki
i subsp.bulgaricusの菌株間の免疫
賦活作用の程度を比較するため、菌体とは無関係のタン
パク質であるβ−ラクトグロブリン(β−LG)を免疫
したマウスを用いたT細胞増殖試験、および免疫してい
ないマウス脾臓細胞を用いたマイトジェン活性試験、マ
ウスパイエル板細胞に対する増殖試験を行った。ここで
用いたアッセイ系は、in vitroの系であるが、
これは、数多くの試料のリンパ球に対する分裂促進能力
を調べるためのもので、この活性を指標に免疫賦活剤の
開発が一般に行われている。
いては、その菌株のマウスへの経口投与が、腸管IgA
産生にどのような影響を与えるかについても調べた。
eckii subsp.bulgaricusの免疫
賦活作用を調べた結果、L.delbrueckii
subsp.bulgaricusの中にもBifid
obacterium属と同等以上にリンパ節細胞の免
疫応答を高める菌株OLL 1023,OLL 102
9,OLL 1030,OLL 1043,OLL 10
57,OLL 1083,OLL 1097,OLL 1
104を見出し、これらが、免疫賦活剤として同種の他
菌株より有用であることが明らかとなった。
を基礎とし、更に研究の結果完成されたものであって、
免疫賦活作用の高い特定のLactobacillus
delbrueckii subsp.bulgar
icus菌株を有効成分として含有することを特徴とす
る免疫賦活剤に関するものである。
tobacillus delbrueckii su
bsp. bulgaricusの菌体は、生菌および
死菌のいずれであってもよく、原料菌体の取得のための
培養法および菌体分離法にも制限はない。菌体として
は、純粋に分離した菌体(乾燥菌体、湿潤菌体を問わな
い)のほか、菌体含有物(培養物、懸濁物、ヨーグル
ト、チーズ等菌体含有飲食品その他菌体を含有するも
の)、菌体を超音波や酵素等を用いて処理してなる処理
物(菌体破砕物、細胞質/細胞壁画分等)、またこ(れ
ら)の濃縮物、乾燥物、ペースト化物、希釈物等を広く
包含するものである。
れる。その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル
剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与または
注射剤(静脈内、筋肉内、皮下)、点滴剤、座剤等によ
る非経口投与をあげることができる。これらの各種製剤
は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢
剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤
などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知
の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量
は症状、年令、体重、投与方法および剤形等によって異
なるが、通常は成人に対して1回約0.001mg乃至
2,000mgを投与することができる。また、本有効
成分は、ヨーグルト等発酵食品のスターターとしても利
用できるものであるゆえ、安全性については問題はな
く、現にマウスに対して1000mg/体重1kgを経
口投与しても急性毒性は認められなかった。
期の目的を達成しうるので、本発明に係る免疫賦活剤
は、飲食品タイプとして使用することができる。そのた
めには、本菌株、その含有物及び/又はその処理物を各
種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その
他各種の飲食品タイプにしたり、飲食品に直接添加した
り、あるいは、これをスターターにしてヨーグルトとす
る等これを利用して発酵食品にする等、各種の方法を利
用することができる。このように飲食品タイプとした本
発明組成物は、長期間に亘って摂取することが可能であ
るので、腫瘍の予防、再発防止等の目的で、通常の飲食
品のほか、特定保健用食品、栄養剤、健康食品等として
市販に供することができる。
バチルス デルブリッキ サブスピーシズ ブルガリカ
ス(Lactobacillus delbrueck
iisubsp.bulgaricus)の各菌株は、
工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ次のよう
に寄託されており、有効に使用される。
ueckii subsp. bulgaricus
OLL 1023株,OLL 1029株,OLL 10
30株,OLL 1043株,OLL 1057株,OL
L 1083株,OLL 1097株,OLL 1104
株の菌学的性質は、次のとおりである。 形態 BL寒天培地でよく生育し、ときに長桿状を呈す
る桿菌。メチレンブルー染色で顆粒を呈する。 グラム染色性 + 生理学的性質 嫌気性あるいは通性嫌気性 カタラーゼ − 糖の資化性:(ガスの発生はいずれもなし) アミグダリン − セロビオース − フラクトース + ガラクトース − グルコース + ラクトース + マルトース − マンノース − サリシン − サッカロース − トレハロース − エスクリン − 乳酸の異性体 D体
lbrueckii subsp.bulgaricu
sの菌学的性質にほかならず、また、OLL 1023
株(FERM P−14114)をはじめとして他の菌
株もその菌学的性質は同様であった。
界」、叢文社(1980))を用いて、37℃、16時
間嫌気条件下で乳酸菌 L.delbrueckii
subsp.bulgaricus 91菌株を静置培
養した。培養後、遠心分離(6500rpm,15分
間)で菌体を回収し、蒸留水で3回洗浄した。菌体を凍
結乾燥した後、菌体20mgを蒸留水25mlに分散さ
せた。これを20分間100W超音波破壊機で破砕し、
この菌体破砕液を2500rpmで30分間遠心し、沈
澱(未破砕菌体)を除去した。得られた上清を凍結乾燥
(超音波破砕物)し、この菌体破砕物を測定試料とし
た。
マウス(7−10w,メス)脾臓を用いた。培地には、
100U/mlのペニシリン、100μg/mlのスト
レプトマイシン、1%同系マウス血清、5×10-5Mの
2−メルカプトエタノールを含むRPMI1640を用
いた。細胞懸濁液を調製した後、96穴の細胞培養プレ
ートに各菌体試料(100μg/ml)とともに1穴当
たり5×105個になるように分注した。37℃、5%
CO2 Air条件下、培養72時間後に、各well
に1μCiのチミジン[メチル-3H]を添加し、20時
間後にセルハーベスターで細胞をフィルター上に濾過し
た。細胞中に取り込まれた3H量は、液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。
ex(SI), SI=(各菌体試料を加えたときのcpm)/(培養液
のみのときのcpm) を用いて表した。
株の数(度数)をとって91菌株の分布を調べると、図
1に示す分布が得られた。図1において、高い活性を示
した菌株(SI値が13以上)は、OLL 1023,
OLL 1029,OLL 1030,OLL 104
3,OLL 1083であり、そのマイトジェン活性の
SI値は図2に示した。図2に示すように、これらの菌
株の活性は、比較のために同一条件で培養した Bif
idobacterium longum 6001菌
体よりも高く、その中でも、OLL 1023とOLL
1083が特に高い活性を示した。なお、β−LGはネ
ガティブコントロールである。
ラクトグロブリン(β−LG)溶液(0.5mg/m
l)と完全アジュバントを1:1の比でエマルジョン化
し、β−LGが1匹当たり50μgになるように、BA
LB/cマウスの足の裏および尾基底部に皮下免疫し
た。免疫してから10日後に鼠蹊部および膝下部のリン
パ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製した。培地はマイ
トジェン活性試験に用いたものと同一組成の培地を用い
た。細胞は96穴の細胞培養プレートに各菌体試料とと
もに1穴当たり4×105個になるように分注した。以
下、マイトジェン活性試験と全く同様に L.delb
rueckii subsp.bulgaricus9
1菌株の活性の測定を行った。
値を示す菌株の数(度数)をとって91菌株の分布を調
べると、図3に示す分布が得られた。図3において、T
細胞増殖活性が高い菌株(SI値が9以上)は、OLL
1023,OLL 1057,OLL 1083,OL
L 1097,OLL 1104で、そのT細胞増殖活性
のSI値を図4に示した。図4に示すように、これらの
高い免疫賦活能を有する菌株の中でも、マイトジェン活
性の結果と同様にOLL 1023とOLL 1083が
特に高い活性を示し、その活性は B.longum
6001(SI値は約10.0)と比較して同等以上の
活性であった。
株については、パイエル板細胞に対する免疫賦活能を調
べた。
ら摘出し、洗浄した後、細胞懸濁液を調製した。これら
の細胞を96穴平底プレートを用いて、実施例1で調製
したL.delbrueckii subsp.bul
garicusの菌体破砕物の存在下(100μg/m
l)、37℃48時間培養した(5×105/wel
l)。以下、実施例1と全く同様に行い、各菌株のパイ
エル板細胞に対する免疫賦活能を調べた。
に、対照(実施例1、2において高い免疫賦活能が認め
られなかった菌株OLL 1022)と比べて、OLL
1023,OLL 1030,OLL 1043,OLL
1057,OLL 1083,OLL 1097および
OLL 1104で、パイエル板リンパ細胞に対して高
い細胞増殖活性が認められた。そして、その活性は
B.longum 6001と比較してそれ以上であっ
た。
与える影響をin vivoについて調べた。実施例
1、2で高い免疫賦活能が認められた菌株(L.del
brueckii subsp.bulgaricus
OLL 1023およびOLL 1083)をそれぞれ
3%含有する乳清タンパク質(WPI)固型飼料を作製
した。飼料の組成は、AIN−76に準拠した。また、
対照として、高い免疫賦活能が認められなかった菌株
(OLL 1022)を含むWPI固型飼料、および菌
体を含まないWPI固型飼料もそれぞれ作製した。マウ
ス(BALB/c,4w,メス)にそれぞれの飼料を経
口投与し、4週間後にマウスから小腸部分を取り出し、
露木らの方法(光岡知足編「腸内フローラの研究方法
論」P.157、学会出版センター(1989))に従
って小腸内容物および小腸壁抽出液を得た。これらの試
料中のIgA抗体価を抗マウスIgAモノクローナル抗
体を用いてELISA法で測定した。
L.delbrueckii subsp.bulga
ricus OLL 1023,OLL 1083を用い
ることで、腸管でのIgA抗体価が対照に比べて高まっ
ていることが分かった。
施例4で用いた L.delbrueckii sub
sp.bulgaricus菌体の入ったWPI固型飼
料および菌体を含まないWPI固型飼料をそれぞれ与え
て飼育した。2カ月後、各菌体飼料を与えたマウスから
小腸部分をそれぞれ取り出し、実施例4と同様の方法で
小腸壁抽出液を得た。これらの飼料中の抗β−ラクトグ
ロブリンIgA抗体価および抗LPS IgA抗体価を
ELISA法で測定した。
L.delbrueckii subsp.bulga
ricus OLL 1023およびOLL 1083に
よるパイエル板リンパ細胞活性化の結果、WPI中の食
物アレルゲンと言われるβ−ラクトグロブリン、および
グラム陰性菌のLPSに対する腸管でのIgA抗体価が
対照(高い免疫賦活が認められなかった菌株 OLL
1022および菌体を含まない飼料)に比べて高まって
いることが明らかになった。
ckii subsp.bulgaricus OLL
1023,OLL 1029,OLL 1030,OL
L 1043,OLL 1057,OLL 1083,O
LL 1097およびOLL 1104を2.0×108
個/ml以上に増殖させた培養液を4000Gで遠心濃
縮し、得られた沈澱画分に遠心前と同量の脱イオン水を
加え、均一に沈澱を分散させた後、HTST殺菌を行っ
た。その後、再び遠心分離を行い、沈澱画分を回収し、
凍結乾燥菌体粉末を得た。粉末中の L.delbru
eckii subsp.bulgaricusの菌体
数は約6.0×1011個/gに相当していた。この粉末
を市販の育児用調製粉乳(明治乳業(株)製)に0.1
%配合した。
製造するにあたり、乳酸菌菌体は、上記した使用量を1
例として使用することができるが、本発明においては、
粉乳1gあたり、1.0×103個以上、好ましくは
1.0×106〜1.0×1012個の乳酸酸菌体を使用
すればよい。しかしながら、一般に乳酸菌菌体は発酵乳
などに用いられているので、安全である。したがって、
上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、予
防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量
使用してもよい。また、育児用粉乳以外の飲食品を調製
する場合も、上記範囲を参考にして乳酸菌の使用量を定
めればよい。
レスあるいは超音波処理などで得られる菌体破砕物およ
び細胞質または細胞壁画分を使用してもよい。
ン酸の等量混合物20g、グラニュー糖50g、コーン
スターチと乳糖の等量混合物30gに、実施例1、2で
活性の高かった L.delbrueckii sub
sp.bulgaricusOLL 1083の凍結乾
燥物を50g加えて十分に混合した。混合物を100等
分して袋に詰め、1袋1.5gのスティック状免疫賦活
用栄養健康食品を100袋製造した。
(1)実施例1、2において活性の高かった菌株(L.
delbrueckii subsp.bulgari
cusOLL 1083)の超音波破砕物50g、
(2)ラクトース90g、(3)コーンスターチ29
g、(4)ステアリン酸マグネシウム1g。
g)を混合し、(3)(但し7g)から調製したペース
トとともに顆粒化した。得られた顆粒に(3)(但し5
g)と(4)を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠
剤機により圧縮し、1錠あたり菌体破砕物を10mg含
有する錠剤1000個を製造した。
なるが、0.1〜1500mg/kg/dayで1日1
〜4回投与する。本発明において用いる菌体は、本来食
品由来のものであり、既述のように安全性にはほとんど
問題はなく、したがって、上記容量を越えて、投与して
も差し支えはない。また、健康の維持増進、保健栄養剤
等としてこれを利用する場合は、上記容量より少ない量
を長期間にわたって服用すればよい。また、既述のよう
に本発明による錠剤は、経口投与以外の方法でも投与す
ることができるが、静脈投与および筋肉投与の場合は
0.01〜1200mg/kg/dayである。
で活性の高かった菌株(L.delbrueckii
subsp.bulgaricus OLL 108
3)の超音波破砕物10g、(2)塩化ナトリウム8
g、(3)クロロブタノール4g、(4)炭酸水素ナト
リウム1g。
れを500mlの点滴ビン2本に分注し、免疫賦活輸液
を製造した。
kii subsp.bulgaricusの菌株が他
の菌株と比較して、高い免疫賦活能を有することを利用
して、免疫賦活剤を提供するものである。L.delb
rueckii subsp.bulgaricus
は、ヨーグルトなどの食品にも用いられており、安全性
は確認されている。そのため、本発明によって、抗原性
物質あるいは感染性微生物により引き起こされる疾病の
予防や治療に役立つ食品や医薬品を供給することができ
る。
ulgaricusの各菌株によるマウス脾臓細胞の細
胞増殖促進を、横軸にSI値、縦軸にそのSI値を示す
菌株の数をとって示した図。
ckii subsp.bulgaricusのマイト
ジェン活性のSI値を示した図。
ulgaricusの各菌株によるβ−LG感作T細胞
の細胞増殖促進を、横軸にSI値、縦軸にそのSI値を
示す菌株の数をとって示した図。
kii subsp.bulgaricusのT細胞増
殖活性のSI値を示した図。
i subsp.bulgaricusのパイエル板細
胞に対する増殖活性を示した図。
ulgaricus菌体経口投与による腸管IgA産生
の誘導を示した図。
ulgaricus菌体経口投与による抗原性物質に対
する腸管IgA産生の誘導を示した図。
Claims (4)
- 【請求項1】 ラクトバチルス デルブリッキ サブス
ピーシズ ブルガリカス(Lactobacillus
delbrueckii subsp.bulgar
icus)を主成分とすることを特徴とする免疫賦活
剤。 - 【請求項2】 用いる菌株が、ラクトバチルス デルブ
リッキ サブスピーシズ ブルガリカス(Lactob
acillus delbrueckiisubsp.
bulgaricus)OLL 1023(FERM
P−14114)、OLL 1029(FERM P−
14113)、OLL 1030(FERM P−14
112)、OLL 1043(FERM P−1411
1)、OLL 1057(FERM P−1411
0)、OLL 1083(FERMP−14109)、
OLL 1097(FERM P−14108)、及び
/又は、OLL 1104(FERM P−1384
1)であることを特徴とする請求項1に記載の免疫賦活
剤。 - 【請求項3】 ラクトバチルス デルブリッキ サブス
ピーシズ ブルガリカス(Lactobacillus
delbrueckii subsp.bulgar
icus)の菌体及び/又は菌体処理物を含有してなる
ことを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の免疫賦
活剤。 - 【請求項4】 菌体処理物が菌体破砕物であることを特
徴とする請求項3に記載の免疫賦活剤。
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