CN116287008A - 一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用，其中，该肽素是副干酪乳杆菌LBP‑YE01的各种次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP‑YE01的保藏编号CGMCC NO.15360。本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能，能灭杀人体皮肤、胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体皮肤、胃肠道微生态平衡，另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞，且有很好的抗氧化活性，加快人体新陈代谢，修复受伤组织细胞。

Description

一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵培养技术领域，具体涉及一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用。

背景技术

副干酪乳杆菌是我国卫生部允许添加在食品中的有益菌，广泛分部在胃肠道、皮肤、生殖道、口腔等人体微生态中。

它是胃肠道与皮肤中有益菌群的核心菌种，它能够定植于胃肠道、皮肤上皮细胞上大量繁殖，它在胃肠道与皮肤内通过次级代谢产生抗菌肽、苯乳酸等抑菌物质可以抑制有害菌，调整和维持胃肠道与皮肤内各种菌群的生长繁殖和相互关系，副干酪乳杆菌产生的D-苯乳酸可以与人类HCA3受体结合从而触发免疫细胞活动。

它产生的次级代谢物胞外多糖(EPS)能刺激机体内某些细胞的分裂，活化包括巨噬细胞在内的一系列与免疫相关的淋巴细胞，促进抗体、干扰素的大量分泌，从而能够激活和促进人体内的非特异性和特异性免疫反应，提高人体抵御入侵病原菌的能力。同时这些EPS也能将自由基氧化为过氧化氢等无毒物质，从而解除其对机体的损伤，减缓了机体的衰老过程，加快人体新陈代谢。

副干酪乳杆菌株LBP-YE01(保藏编号CGMCCNO.15360)在不同的营养环境中培养具有不同的生理功能，如何得到大量的次级代谢产物(也称为肽素)是需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。

本发明的第二个目的是提供一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品是肽素的一种应用。

本发明的第三个目的是提供一种肽素精华物，该肽素精华物是肽素的另一种应用。

本发明的第四个目的是提供一种肽素精华物在治疗结肠炎药物方面的应用。

本发明的一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。

进一步的，所述肽素是通过如下方法制备得到的：

将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。

进一步的，所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的：

将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.09L-0.11L无机盐液，再在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天，得到初级代谢产物；所述初级代谢产物中含有至少1×10⁹CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；

每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水；

所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的；

所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。

进一步的，所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：

将585份-715份大豆，315份-385份糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；

将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；

将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到植物性培养物。

进一步的，所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：

将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份；葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到0.4L的动物性培养基；

将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。

进一步的，在制备所述植物性培养基时，采用的是650份大豆和350份糯米；烘烤温度为125℃-135℃，烘烤时间是为1.5h-2.5h。

进一步的，在制备动物性培养基的过程中，具体是：将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份；葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到动物性培养基。

进一步的，在所述初级代谢产物的制备过程中，向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液，并在15-40℃厌氧再培养4-6天后，转入0-4℃培养至少三个月以上；且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。

本发明还提供了一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：

将上述的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入脱脂奶粉、果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。

进一步的，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。

本发明还提供了一种肽素精华物，所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的：

将上述的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，再加入水搅拌，离心取上层清液待用；

向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖，经冷冻干燥磨成粉后即得到所述肽素精华物。

进一步的，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，加入3.6kg-4.4kg水，70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h，并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min，取上层清液，待用；

向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉，以及果糖，经冷冻干燥干磨成粉后即得到所述的肽素精华物。

本发明还提供一种肽素精华物在治疗结肠炎药物方面的应用。

进一步的，所述肽素精华物在结肠炎药物方面的应用体现在：对所述肽素精华物进行粉碎，得到活菌型胃肠粉，或将粉碎后的肽素精华物封装在胶囊中得到活菌型胃肠粉胶囊。

与现有技术相比，采用上述方案本发明的有益效果为：

本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能，能灭杀人体胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体胃肠道微生态平衡。另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞，且有很好的抗氧化活性，加快人体新陈代谢，修复受伤组织细胞。

附图说明

图1中图A为副干酪乳杆菌LBP-YE01 10×100倍镜检图；

图1中图B为副干酪乳杆菌BNCC337289 10×100倍镜检图；

图1中图C为副干酪乳杆菌LPc-G110 10×100倍镜检图；

图1中图D为副干酪乳杆菌JLPF-131 10×100倍镜检图；

图2是检测平板MY1的抑菌和免疫结果；

图3是检测平板MY2的抑菌和免疫结果；

图4是谷胱甘肽DPPH清除率拟合图；

图5受试物经口连续给药7天对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠体重的影响(Mean±SE，n＝10)；

图6受试物经口连续给药7天对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠粪便评分指数的影响(Mean±SE，n＝10)；

图7受试物经口灌胃连续给药7天对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠病变的影响；

图8连续7天经口灌胃给予受试物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠重量、结肠长度及溃疡面积的影响(Mean±SE,n＝10)A.受试物对TNBS诱导结肠炎大鼠结肠重量的影响；B.受试物对TNBS诱导结肠炎大鼠结肠长度的影响；C.受试物对TNBS诱导结肠炎大鼠结肠溃疡面积的影响。

图9经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重的影响(n＝10，x±s)

图10经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠粪便评分的影响(n＝10，x±s)

图11经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠重量和长度的影响；A.不同药物处理对DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠重量的影响；B.不同药物处理对DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响；C.不同药物处理对DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠重量/长度的影响(n＝10，x±s，^##p<0.01vs.空白对照，*p<0.05,**p<0.01vs.模型组)；

图12受试物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠作用的结肠病变的影响。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点等，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。

该肽素是通过如下方法制备得到的：

S1、植物性培养物的制备

将650g大豆，350g糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；其中各物质成分质量配比允许误差为10％；

将0.1g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到10g麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；

将副干酪乳杆菌菌种调配液与植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到1510g植物性培养物。

S2、动物性培养物的制备

将酪蛋白水解物10g、牛肉粉10g、酵母粉10g；葡萄糖20g、吐温-80 1g混合后，加水定容至0.4L，并100℃下煮沸灭菌30min，得到动物性培养基；

将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的动物性培养基中，在温度为37℃，搅拌速度为75rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。

S3、初级代谢产物的制备

将上述制备得到的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.1L无机盐液，再在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-6天，得到初级代谢产物；初级代谢产物中含有至少1×10⁹CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；

其中，每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和余量水。

S4、肽素的制备

将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在(15-40℃)厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在(25℃-40℃)厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。

将初级代谢产物转入(0℃-4℃)厌氧条件下培养至少三个月的过程中，副干酪乳杆菌LBP-YE01在冷胁迫下进入次级代谢状态，它们从周围吸收自身初级代谢后的营养物合成次级代谢产物来保护自身菌群，此时菌数量由1×10⁹CFU/g以上迅速减少至1×10⁷CFU/g以下，通过菌数量变化作为副干酪乳杆菌LBP-YE01进入次级代谢状态的判断依据。

在(25℃-40℃)厌氧培养6-8天中，副干酪乳杆菌LBP-YE01会消耗培养物中剩余的营养物质进行初级代谢发酵，菌数量会迅速上升至1×10⁹CFU/g以上。

在低温(0-4℃)厌氧长期培养(至少三个月)中。副干酪乳杆菌LBP-YE01长时间发酵积累大量的次级代谢产物，该次级代谢产物可以在0℃-4℃厌氧环境中长期保藏。

实施例2

本实施例提供了一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：

将实施例1得到的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合，并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天，此过程为副干酪乳杆菌LBP-YE01的复壮扩培；随后再加入脱72g脂奶粉、10g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到肽素混合固体饮品。

其中，加麦芽糖是为了给菌提供ATP能量，让菌迅速激活。加入脱脂奶粉、果糖作为副干酪乳杆菌保护剂。

通过实验可知，肽素混合固体饮品可以让酪乳杆菌LBP-YE01菌株在人体胃肠道内有很好的耐受性。该固体饮品中所含有的肽素对有益菌群免疫且能灭杀人体胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体胃肠道微生态平衡。

实施例3

本实施例提供了一种肽素精华物，该肽素精华物是通过如下方法制备得到的：

将实施例1的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合，并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天后，再加入4kg矿泉水，75rpm/min下搅拌24h，并在7500rpm/min下离心8min，取上层清液，待用；

向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉、以及果糖，经冷冻干燥、磨成粉后即得到肽素精华物。

通过实验发现，本实施例的肽素精华物具有很好的抑菌能力和抗氧化能力。

实施例4

本实施例提供一种活菌型肽素皮肤保护液，具体为：将每50g的肽素精华物，用水定容至1L，得到活菌型肽素皮肤保护液。

通过实验可知，该活菌型肽素皮肤保护液能够保护创面不受有害菌定植感染，同时使胞外多糖(EPS)刺激受伤细胞加速分裂繁殖，促进结痂脱落，快速修复伤口面，逐渐缩小创面。

实施例5

本实施例提供一种活菌型胃肠粉胶囊，具体为：将实施例3的肽素精华物粉碎后填充在胶囊中，就得到活菌型胃肠粉胶囊。

通过实验可知，活菌型胃肠粉胶囊对胃溃疡的改善作用，具有治疗溃疡性结肠炎的药效作用，对3.5％DSS诱导的结肠炎小鼠有一定疗效，具有一定抑制3.5％DSS诱导的小鼠结肠萎缩的作用，可降低模型动物的死亡率，且作用强度与受试物剂量有一定量效关系。

一、副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究：

(一)、材料

1.1菌株

表1菌株名称和来源

1.2培养基

MRS培养基(改良MRS培养基基础)：

成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉、4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H₂O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。

MRS肉汤：

成分：酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO₄.4H₂O)0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2。

1.3主要仪器和设备

表2主要仪器和设备

1.4试剂

表3试剂

(二)、实验方法

2.1菌种活化、鉴定

在超净工作台里分别称取1g四种菌株(表1中的四种菌种)，加9mL无菌生理盐水(10倍稀释)，混悬均匀后进行梯度稀释，稀释倍数至10⁵；分别吸取各菌株1mL 10²、10³、10⁴、10⁵倍稀释液加入无菌培养皿中，倾注MRS培养基19mL，冷却干燥后倒置于37℃培养箱中培养72H。挑选四种菌的典型副干酪乳杆菌菌落，镜检，观察形态。

2.2供试菌液制备

挑选四种菌株中典型副干酪乳杆菌单菌落，分别接种在100mLMRS肉汤中，37℃摇床培养48H，稳定传代培养三代，选择对数增长后期的菌液作为供试菌液。

2.3胃蛋白酶液的制备

用盐酸溶液、氢氧化钠溶液调节蒸馏水的pH至1.8，加入胃蛋白酶，使其质量浓度分别为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到胃蛋白酶液。

2.4胰蛋白酶液的制备

用0.4％氢氧化钠溶液调节0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，加入胰蛋白酶，加等体积水适量混合，使其质量浓度为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得胰蛋白酶液备用。

2.5含牛胆盐MRS肉汤培养基制备

配制500mL MRS肉汤培养基，加入牛胆盐，使牛胆盐质量浓度为0.3g/100mL，蒸汽高压灭菌(121℃，20min)后备用。

2.6四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验

供试菌液以2％(v/v)的接种量接种于胃蛋白酶液中，在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解，分别在0、0.5h、1h、2h取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。

2.7四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验

取1mL供试菌液加入29mL胰蛋白酶液中混悬，在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解，在0h、2h、4h、6h处分别取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。

2.8四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验

供试菌液以2％(v/v)的接种量接种到10mL的MRS中，37℃培养18h，离心(4000r/min，30min)，用无菌生理盐水洗涤，收集菌体，将收集到的菌体悬浮于牛胆盐MRS肉汤培养基中(0.3g/100mL)，于37℃，120rpm培养4h，分别在0h、2h和4h取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。

2.9存活率计算

每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下：

式中：

N_t—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)；

N₀—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。

(三)、结果分析

3.1四种菌株镜检结果

如图1所示，四种菌株的光学显微镜10×100倍放大倍数的镜检可以观察出，四种菌株都主要呈现出杆状，细长有弯曲的杆菌，部分呈球杆状，排列成栅状或链状，无芽孢，呈布朗无规则运动无动力运动。四种菌株在MRS培养基中的菌落形态为白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，具有典型干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的形态。

3.2四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验结果

表4耐受人工胃液试验结果(CFU·mL^-1)

注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01

“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289

“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，

“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131

由表4可以看出，四款菌株在人工胃液中均具有一定的耐受性，最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01，2H后菌落数存活率大于2.95％(10^-1.53)，其余3株菌副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110、副干酪乳杆菌JLPF-131存活率分别为0.87％(10^-2.06)、2.04％(10^-1.69)、1.86％(10^-1.73)。以上结果说明，副干酪乳杆菌LBP-YE01在胃酸中更稳定。

3.3四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验结果

表5胰蛋白酶耐受试验结果(CFU·mL^-1)

注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01

“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289

“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，

“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131

由表5可以看出，胰蛋白酶处理6H后，副干酪乳杆菌LBP-YE01、副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110的存活率均大于100％，说明胰蛋白酶对这三种菌没有明显的抑制作用，副干酪乳杆菌JLPF-131 6H后的存活率为89.12％，也没有很明显的降低。综上所述，四种菌株对胰蛋白酶均具有很好的耐受性。

3.4四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验结果

表6耐受胆盐试验结果(CFU·mL^-1)

注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01

“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289

“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，

“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131

由表6可以知道，四款菌株在含0.3％牛胆盐实验组中4H存活率都不是很高，但最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01，4H后存活率为0.14％(10^-2.84)，副干酪乳杆菌JLPF-131存活率最低，4H后存活率为0.0048‰(10^-5.32)。

通过上述实验可知，副干酪乳杆菌LBP-YE01在人体胃肠道内具有远超其它副干酪乳杆菌的生物活性。

二、肽素混合固体饮品在人工胃肠道内的活性检测研究

(一)、材料

1.1供试产品

实施例2的肽素混合固体饮品(规格：3g/包)，深圳市肽素生物技术有限公司

1.2培养基

MRS培养基(改良MRS培养基基础)

成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H₂O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。

1.3主要仪器与设备

主要仪器与设备同副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究中用到的仪器和设备相同。

(二)、实验方法

2.1人工胃液的配制：

用盐酸、氢氧化钠调整蒸馏水的pH至2.5、3.5、4.5，加入胃蛋白酶，使其质量浓度分别为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到人工胃液。

2.2人工肠液的配制：

用0.4％氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，加入胰蛋白酶，加等体积水适量混合，使其质量浓度为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得人工肠液备用。

2.3人工胆液的配制：

用0.4％氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，分别称取不同质量的牛胆盐溶解，用蒸馏水定容分装，使牛胆盐最终含量分别为0g/100mL、0.03g/100mL、0.3g/100mL、0.5g/100mL，制得人工胆液备用。

2.4人工胃肠液耐受性试验：

本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋，分别取1袋加入pH 2.5人工胃液、pH 3.5人工胃液、pH 4.5人工胃液人工肠液、无菌生理盐水至30mL，37℃恒温(60rpm)培养。在0、1.5、3h处分别对人工胃液样品取样，在0、1.5、3、4.5、6h处分别对人工肠液和生理盐水样品取样，采用菌落平板计数法测定样品中的菌落数，计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。

2.5耐胆盐试验：

取本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋，分别取一袋加入人工胆液(0、0.03、0.3、0.5g/100mL)，37℃恒温(60rpm)培养。分别在0、1.5、3、4.5、6h处取样，采用平板计数法测定样液中的菌落数，计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。

2.6存活率计算：

每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下：

式中：

N_t—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)；

N₀—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。

(三)、结果分析

在该固体饮品通过人体胃肠道的过程中，胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等因素会影响益生菌的存活性。所以益生菌要定植在人体肠道内发挥平衡菌群作用，就必须要有一定数量的菌能耐受胃和上部肠道的环境。固体饮料在人工胃肠道内的活性检测结果如表7。

表7肽素混合固体饮品在人工胃液、人工肠液、牛胆盐处理后的活菌数

人体胃液在正常状态下的pH值在2.5-3.5之间，流体食物通过人体胃部大约花费1h-2h，该固体饮料在pH2.5、3.5、4.5的人工胃液中培养6h的过程中，其副干酪乳杆菌活菌数较0h处稍有变换，变化不显著(P＞0.05)，说明该菌株在人工胃液中具有较好的耐受性。

如表7，本固体饮品在人工肠液作用6h的过程中，其活性较0h处无显著变化(P>0.05)，说明该菌株在人工肠液中具有较好的耐受性。

小肠胆盐浓度的波动范围通常为0.03-0.3g/100mL，食物一般会在小肠中停留1-4h，由表7可知,胆盐对本固体饮品副干酪乳杆菌的生长有一定的抑制作用,且随胆盐浓度的增加，抑制作用增强。

在含有0.03g/100mL胆盐的固体饮品中，随作用时间的延长，活菌数成增长趋势。在含0.3、0.5g/100mL胆盐的固体饮品中作用1.5h后，活菌数均显著降低(P<0.05)。1.5h以后，随作用时间的延长，菌落总数缓缓增加，在作用4.5h后保持可较高的存活率(95％-85％)及活菌数(>10⁶CFU/mL)能够满足益生菌发挥有效作用对菌浓度有要求(一般为10⁶-10⁹cFU/mL)，说明该菌株对人体生理浓度范围内的胆盐有较好的耐受性。

肽素固体饮品中副干酪乳杆菌能耐受人体胃肠道的生存环境。

三、肽素固体饮品同诺氟沙星的抑菌与免疫实验

原理：在实验过程中，处于静置恒温(37℃)培养过程中的检测平板，一方面指示菌开始生长，另一方面牛津杯中的粗提取液在重力作用下在检测平板中呈球面扩散，其所含抑菌物质的浓度随着其在培养基扩散距离的增大而减小。在抑菌物质的有效抑菌浓度下，当指示菌为病原菌时，抑菌物质会抑制病原菌的生长，当指示菌为有益菌时，抑菌物质不会抑制有益菌的生长，即对有益菌免疫。而诺氟沙星对细菌具有广谱抗性，因此无论是有益菌还是病原菌，抗生素诺氟沙星对其都具有抑制作用。

(一)、材料

1.1样品

5g肽素固体饮品、1粒诺氟沙星，0.1g/粒。

1.2菌种

短双歧杆菌BNCC185972(有益菌)、金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)。

1.3培养基

MRS培养基(改良MRS培养基基础)：

成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。

MRS肉汤：

成分：酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2

营养琼脂NA：

成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。

营养肉汤NB：

成分：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.2±0.2。

1.4主要仪器与设备

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(二)、实验方法

2.1预处理

2.1.1指示菌的制备

有益菌短双歧杆菌制备：在MRS肉汤中接种活化后短双歧杆菌BNCC185972，摇床37℃，200rpm，培养72h。其中短双歧杆菌活菌数为109cfu/mL。预先进行菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将短双歧杆菌培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×10⁸CFU/mL-5×10⁸CFU/mL。

病原菌金黄色葡萄球菌制备：将金黄色葡萄球菌ATCC 6538接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶，36℃±1℃、200r/min±1min培养至金黄色葡萄球菌的稳定期，作为第三代培养液。预先按照GB4789.2进行菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×10⁸CFU/mL-5×10⁸CFU/mL。

2.1.2抑菌物质粗提取

称取肽素固体饮品5g，加入15mL无菌生理盐水。分别37℃，60rpm/min恒温振荡2H，振荡后的发酵液经离心(8000r/min)8min，得到上清液，即为含有肽素物质的上清粗提取液。

2.2抗生素制备

诺氟沙星，国药准字H14023224，规格0.1g。取一颗诺氟沙星胶囊去除胶囊壳倒入50mL水中，震荡摇匀1H。

2.2.1检测平板制备

指示菌为短双歧杆菌的检测平板制备：将配制的MRS培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的短双歧杆菌菌悬液按照1％的添加量加入MRS培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。记为检测平板MY1。

指示菌为金黄色葡萄球菌的检测平板制备：将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的金黄色葡萄球菌菌悬液按照1％的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。记为检测平板MY2。

2.2.2牛津杯放置

采用符合中国药典药品检验操作规范，适用于抗生素效价抑菌圈培养实验的牛津杯(内径6mm，外径7.8mm，高10mm)。在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在检测平板上，每皿均匀放置两盏牛津杯，轻轻按压。

2.2.3抑菌圈培养

在指示菌为短双歧杆菌的平皿MY1上的两盏牛津杯中，在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液，记为MY1a，在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液，记为MY1b。

在指示菌为金黄色葡萄球菌的平皿MY2上的两盏牛津杯中，在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液，记为MY2a，在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液，记为MY2b。

将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h，取出检测平板，将检测平板MY1恒温(37℃)静置培养48h，检测平板MY2恒温(37℃)静置培养16-20H，测量抑菌圈大小。

2.3抑菌性评价标准

抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用，15mm>抑菌圈≥10mm为中度抑菌，抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。

(三)、结果与分析

通过如图2和图3的展示结果可知，肽素固体饮品中所含的抑菌物质对有益菌的生长无抑制作用(如图2中的牛津杯MY1a)，对病原菌具有高度抑菌作用(如图2中的牛津杯MY1b)，抗生素诺氟沙星对有益菌和病原菌均具有高度抑菌作用(如图3中的牛津杯MY2a、MY2b)。

四、肽素精华物抑菌测试

(一)、材料

1.1检测样品

肽素精华物1g

1.2指示菌种

金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)

1.3培养基

营养琼脂NA

成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。

营养肉汤NB

成分：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.2±0.2。

1.4主要仪器与设备

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(二)实验方法

2.1样品制备

称取肽素精华物1g，加入1mL无菌生理盐水，充分震荡溶解后作为待测样品。

2.2指示菌种活化

将指示菌接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶，36℃士1℃、200r/min±1min培养至指示菌的稳定期,作为第三代培养液。

2.3指示菌悬液制备

预先按照GB 4789.2进行指示菌的菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×10⁸CFU/mL-5×10⁸CFU/mL。

2.4检测平板制备

将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的指示菌菌悬液按照1％的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。

2.5牛津杯抑菌测试

在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在指示菌的检测平板上。在含有指示菌的检测平板中等距离安放4个牛津杯，轻轻按压，用移液器分别吸取待测样品4次，每次量取220uL，缓缓加入牛津杯中，将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h，取出检测平板，放入36℃±1℃恒温培养箱中正置培养15-16h，观察有无抑菌圈出现，如有则采用游标卡尺测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。

2.6抑菌性评价标准

抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用，10mm≤抑菌圈＜15mm为中度抑菌，抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。

(三)、结果分析

3.1抑菌圈直径大小

表8抑菌圈直径大小

3.2抑菌性评价

肽素精华物平均抑菌圈直径为29.51mm，大于15mm，说明肽素精华物呈高度抑菌性。

五、肽素精华物DPPH法抗氧化测试

原理：

DPPH(11-Diphenyl-2 picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2苦基肼基自由基。DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基,是一种暗紫色棱柱状结晶，分子式为C12H12NO6(M＝394.32)，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个孤对电子。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在515～520m范围有最大吸收峰。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系,因而可以通过吸光度的变化进行定量分析，采用紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度，通过与谷胱甘肽分子的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化能力AO值，清除DPPH自由基是DPPH法的根据。

DPPH化学结构式

(一)试剂与设备

1.1试剂

还原型谷胱甘肽，天津市大茂化学试剂厂；

1,1-二苯基-2苦基肼基，上海阿拉丁试剂有限公司；

无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂。

1.2设备

FA2204B电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；

723CRT可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。

(二)、实验方法

2.1样品制备

2.1.1待测样品溶液制备

称取2g肽素精华物定容至20mL蒸馏水中得到100mg/mL的样品溶液，用蒸馏水将母液释至不同倍数，得到不同浓度的待测样品溶液。待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R²≥0.9500。

2.1.2对照样品溶液制备

称取L-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母液。以10倍的稀释倍数依次稀释得到不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液，根据DPPH溶液与不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液的反应，计算DPPH清除率，寻找合适的谷胱甘肽溶液浓度，等差倍数稀释该浓度，谷胱甘肽溶液浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R²≥0.9500。

2.1.3 DPPH溶液的制备

称取5mg DPPH(精确至小数点后四位)，加入少量无水乙醇，超声波充分溶解，无水乙醇定容至100mL(此过程全程避光)。

2.2测定

2.2.1对照组测定

取3组试管，分别编号为1、2、3号，每支试管中按照表9的组合添加试剂。

表9实际添加量

在1号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0mL谷胱甘肽溶液，作为试验组(As)；

在2号试管中加入1.0mL谷胱甘肽溶液和3.0mL无水乙醇溶液，作为对照组(Ac)；

在3号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0ml待测样品溶液，作为空白组(Ab)；

分别充分混合均匀后，室温避光反应30min，于波长517nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。

2.2.2样品组测定

取3支试管，分别编号为1、2、3号，每支试管中按照表10的组合进行样品浓度稀释。稀释后的样品按表10添加，用待测样品肽素精华物溶液代替谷胱甘肽溶液，其它操作同2.2.1。待测样品浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R2≥0.9500。根据线性方程求解当肽素精华物清除率P＝50％时，对应的半数清除量EC50。

表10样品测定浓度梯度

2.2.3样品组测定

用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其它操作同2.2.1。

待测样品浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R²≥0.9500。根据线性方程求解当肽素清除率P＝50％时，对应的半数清除量EC50。

2.3试验数据处理

2.3.1清除率计算公式

式中：

P为清除率；

A_S为待测溶液与DPPH溶液混合液的吸光度；

A_C为待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度；

A_b为DPPH溶液与样品溶剂混合液的吸光度。

2.3.2抗氧化能力AO值计算

以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除率的线性方程(R²≥0.9500)，计算半数清除量EC50，按式(2)计算多肽样品的抗氧化能力AO值。

式中：

AO为抗氧化能力；

EC₅₀(S)为多肽样品的半数清除量，单位为毫克每毫升(mg/ml)；

EC₅₀(R)为谷胱甘肽的半数清除量，单位为毫克每毫升(mg/ml)；

计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。

(三)实验结果

3.1谷胱甘肽DPPH清除率试验结果，如图4，以及表11所示。

表11 L-还原型谷胱甘肽DPPH半数清除率测定

经过数据拟合，得到以EC为横坐标，以清除率为纵坐标的线性方程P(R)＝0.216EC(R)-0.7588，且EC50(R)＝5.8278，R²＝0.9796≥0.95。

3.2肽素精华物DPPH清除率试验结果，如表12所示。

表12肽素精华物DPPH半数清除率测定

经过数据拟合，得到以EC为横坐标，以清除率为纵坐标的线性方程P(R)＝0.2150EC(R)-1.2755，且EC50(R)＝8.4561，R²＝0.9663≥0.95。

3.3肽素精华素的抗氧化能力AO值

通过公式(2)计算得到肽素精华素的抗氧化能力AO值为1.45。

六、LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊对TNBS致大鼠溃疡性结肠炎影响的研究

本实验的目的是：采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导溃疡性结肠炎大鼠模型，连续7日经口灌胃给予受试物(LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊)，以大鼠结肠长度、重量、溃疡面积、以及结肠病理变化为检测指标，研究受试物(LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊)对溃疡性结肠炎的治疗作用。

本实验的方法是：将选择60只体重240g左右的SD大鼠，按体重随机分成6组。动物禁食(不禁水)24h后，以异氟烷麻醉。正常对照组除外，其余5组在麻醉情况下采用乳胶软管经直肠灌入0.5mL/只的TNBS乙醇溶液，软管进入直肠的长度约为8cm。抽出软管后继续保持异氟烷麻醉状态并使大鼠保持倾斜状态15min；动物造模后恢复正常饮食，造模当天给予药物治疗(记为D1)，2次/日，连续7天；阳性药柳氮磺吡啶肠溶片剂量为360mg/kg，受试物(LBP-02A活菌型胃肠粉)剂量设置为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg。每日观察大鼠的一般状况，大便情况(评判标准：1级正常；2级大便软但成型；3级大便不成型；4级大便不成型伴有粘液及肉眼可见血渍。)，并监测体重。末次给药后次日(D8)，大鼠CO₂过量吸入安乐死，摘取整个结肠，沿肠系膜侧剖开，生理盐水清洗粪便，整个结肠称重、测量长度、测量溃疡面积、整体结肠拍照，随后取一段结肠福尔马林固定后进行组织病理检测(HE染色)。

本实验的结果是：①100mg/kgLBP-02A活菌型胃肠粉有一定促进TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠体重恢复的作用趋势；②LBP-02A活菌型胃肠肽粉可改善TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠的粪便异常现象，其中100mg/kg的剂量作用最佳；③LBP-02A活菌型胃肠肽粉对TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠大体观、结肠重量、结肠长度及溃疡面积都有改善作用，其中，100mg/kg的剂量作用最明显。④200mg/kg、100mg/kg剂量的LBP-02A活菌型胃肠肽粉均有减轻TNBS溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病变深度和溃疡程度，并改善结肠炎性症状的作用趋势。

(一)药物

1.1受试物

名称：LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊；来源：深圳市肽素生物技术有限公司

形状：浅黄色粉剂，透明胶囊罐装；型号：LBP-02A；规格：350mg/生产日期：2020.09.28。

1.2阳性对照药

名称：柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)；来源：上海福达制药有限公司；性状：本品为肠溶薄膜衣片，除去包衣后，显黄色至棕黄色；规格：0.25g/片；批号：2220604。

1.3造模剂

名称：2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)；来源：大连美伦生物科技有限公司；性状：黄色液体浓度：1M(293mg/mL)；规格：1ml/支；批号：00826A；储存条件：-20℃。

1.4其他试剂

A.灭菌注射用水；来源：广东艾希德药业有限公司；批号：190512203；储存条件：RT；

B.无水乙醇；来源：柯灵斯；批号：20180716；规格：AR，500ml/瓶；储存条件：RT。

(二)实验动物及饲养

同LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊对水浸拘束法致大鼠胃溃疡影响的药效研究。

2.1动物

品种和品系：SD大鼠；级别：SPF级；性别：雄性；来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司；实验动物质量合格证号：20201105Aazzz0619000239；实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2018-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2015-0026；动物数量：订购65只大鼠；实验开始时动物体重：240左右；适应环境时间：5-7天；动物编号方式：每个鼠笼均佩挂有项目编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种和性别等信息的身份卡片，大鼠用尾根部画线标号。

2.2环境

动物房环境保持温度23±2℃，湿度40～70％，12h明暗交替。动物每笼5只饲养，每周更换至少两次垫料(玉米芯或木屑垫料垫料，苏州埭川商贸有限公司)。2.3食物和饮水

饲喂SPF大小鼠生长繁殖饲料(Co⁶⁰灭菌，购自北京科澳协力饲料有限公司)。实验动物用水采用高压灭菌过滤水。

2.4动物选择和禁食

用于实验的动物将保持健康状况，实验过程中动物自由饮水，根据实验需要禁食。

2.5其他实验材料

数码相机型号：EOS 80D EF-S 18-200IS；来源；Canon

(三)、实验方法

3.1动物分组

60只SD大鼠根据体重平均分为7组，每组10只，每组给药如表13所示。

表13动物分组及给药情况

3.2药物配置

3.2.1受试物配置：

1)LBP-02A活菌型胃肠肽粉高剂量：单次剂量100mg/kg，5mL/kg，20mg/mL

取2粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊，去除胶囊壳收集所有内容物，加入温水(35-45℃之间)搅拌均匀定容至35mL，恒温放置2h后用药，每日配置。

2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉中剂量：单次剂量50mg/kg，5mL/kg，10mg/mL

取1粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊，去除胶囊壳收集所有内H容物，加入温水(35-45℃之间)搅拌均匀定容至35mL，恒温放置2h后用药，每日配置。

3)LBP-02A活菌型胃肠肽粉低剂量：单次剂量25mg/kg，5mL/kg，5mg/mL

取1粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊，去除胶囊壳收集所有内容物，加入温水(35-45℃之间)搅拌均匀定容至70mL，恒温放置2h后用药，每日配置。

3.2.2阳性药配制：

柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)：单次剂量180mg/kg，5mL/kg，36mg/mL

取5片SASP肠溶片，研磨粉碎，加入少量0.5％CMC-Na溶液继续研磨，超声，定容至34.7mL，每日配置。

3.2.3造模剂的配制

4.55mL TNBS、8.15mL无水乙醇、24.33mL灭菌注射用水混合得到37.03mL造模剂。

(二)、实验方法

1)造模：动物禁食(不禁水)24h后，以异氟烷麻醉。正常对照组除外，其余5组在麻醉情况下采用乳胶软管经直肠灌入0.5mL/只的TNBS乙醇溶液，软管进入直肠的长度约为8cm。抽出软管后继续保持异氟烷麻醉状态并使大鼠保持倾斜状态15min；

2)药物处理：动物造模后恢复正常饮食，造模当天给予药物治疗(记为D1)，2次/日，连续7天；

3)观察及处理：每日观察大鼠的一般状况，大便情况(评判标准：1级正常；2级大便软但成型；3级大便不成型；4级大便不成型伴有粘液及肉眼可见血渍)，并监测体重。末次给药后次日(D8)，大鼠CO₂过量吸入安乐死，摘取整个结肠，沿肠系膜侧剖开，生理盐水清洗粪便，整个结肠称重、测量长度、测量溃疡面积、整体结肠拍照，随后取一段结肠福尔马林固定后进行组织病理检测(HE染色)。

实验数据以Mean±SEM表示，采用SPSS进行统计学处理，p<0.05认为是有统计学的显著性差异。

(三)、实验结果

3.1受试物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠体重的影响

空白对照组大鼠随着饲养天数增加体重平稳增长，其他组动物在给予TNBS造模后，体重均有较大幅度降低，造模后至实验结束模型组大鼠体重均显著低于正常组大鼠体重，且具有统计学的显著性差异(P<0.001)。在造模后3天各组大鼠体重达到最低值后逐渐回升；其中360mg/kg的阳性药SASP和100mg/kgLBP-02A活菌型胃肠粉组大鼠体重较模型组增长更快，但无统计学差异(表14，图5)。

表14受试物经口连续给药7天对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠体重的影响(Mean±SE，n＝10)

注：Day1:给药第一天；##P<0.01vs.空白对照组，*P<0.05vs.模型组。

3.2受试物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠粪便评分指数的影响

TNBS造模次日大鼠粪便出现大便变软及不成型情况，少部分大鼠大便不成型伴有粘液及肉眼可见血渍，模型组大鼠的粪便造模后直至实验结束都未出现正常粪便，粪便评分与正常对照组相比具有统计学显著性差异(P<0.01)。此外模型组大鼠伴有饮食减少、疲倦、消瘦、竖毛、毛发无光泽的症状。

造模后第4天，模型组动物粪便评分仍保持较高水平。360mg/kg的阳性药SASP和200mg/kg、100mg/kg的LBP-02A活菌型胃肠粉均表现出明显改善TNBS肠炎大鼠粪便异常的作用(P<0.01vs.模型组)，其中阳性药和100mg/kg的LBP-02A活菌型胃肠粉的改善作用可维持至试验周期结束，200mg/kg和50mg/kg的LBP-02A活菌型胃肠粉也有一定降低模型大鼠粪便评分的作用趋势(表15，图6)。

表15受试物经口连续给药7天对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠粪便评分的影响(Mean±SE，n＝10)

注：Day1:给药第一天；^##P<0.01vs.空白对照组，**P<0.01,*P<0.05vs.模型组。

3.3结肠大体观情况

造模7天后，TNBS造模大鼠呈现程度不同的结肠坏死及愈合状态。个别大鼠结肠损伤症状严重，腹腔大量积液，结肠损伤部位与周围组织严重粘连。剖开结直肠后可见肠粘膜呈不同程度的坏死状，坏死粘膜呈现黑色，结肠壁增厚明显。正常大鼠整个结肠弹性好、肠壁薄、长度长。病变结肠组织无弹性、肠壁增生明显、且结肠缩短。给药处理组解剖大体观较优的是360mg/kg的阳性药SASP与受试物100mg/kg剂量(图7)。

3.4受试物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠重量、结肠长度及溃疡面积的影响大鼠TNBS造模后结肠组织出现肿胀、坏死、增厚等现象，因此造模大鼠的结肠重量均值会重于空白对照组。阳性药及受试物处理均有一定减轻TNBS大鼠结肠重量的作用，各给药组结肠重量的均值由低到高：360mg/kg的阳性药SASP<100mg/kg受试物<50mg/kg受试物<200mg/kg受试物<模型(表16，图8A)。

大鼠造模后结肠萎缩，导致结肠长度缩短，造模大鼠的结肠长度均值都比正常对照组更低。阳性药及受试物处理均有一定增加TNBS大鼠结肠长度的作用，各给药组结肠长度的均值由高到低：100mg/kg受试物>50mg/kg受试物>360mg/kg的阳性药SASP>200mg/kg受试物>模型(表16，图8B)。

TNBS诱导的大鼠结肠溃疡现象明显，阳性药及受试物处理均有一定缩小TNBS大鼠结肠溃疡面积的作用，溃疡面积从小到大依次为：360mg/kg的阳性药SASP<100mg/kg受试物<50mg/kg受试物<200mg/kg受试物<模型(表16，图8C)。

表16连续7天经口灌胃给予受试物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠重量、结肠长度及溃疡面积的影响(Mean±SE，n＝10)

^##P<0.01vs.空白对照组，*P<0.05vs.模型组.

通过上述实验可知，(1)100mg/kgLBP-02A活菌型胃肠粉有一定促进TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠体重恢复的作用趋势；(2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉可改善TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠的粪便异常现象，其中100mg/kg的剂量作用最佳；(3)LBP-02A活菌型胃肠肽粉对TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠大体观、结肠重量、结肠长度及溃疡面积都有改善作用，其中100mg/kg的剂量作用明显。

通过上述实验可得如下结果：

①100mg/kgLBP-02A活菌型胃肠粉有一定促进TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠体重恢复的作用趋势；

②LBP-02A活菌型胃肠肽粉可改善TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠的粪便异常现象，其中100mg/kg的剂量作用最佳；

③LBP-02A活菌型胃肠肽粉对TNBS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠大体观、结肠重量、结肠长度及溃疡面积都有改善作用，其中100mg/kg的剂量作用明显。

七、LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊对DSS致小鼠溃疡性结肠炎影响的试验研究

本实验的目的是：采用3.5％DSS溶液自由饮用7日诱导溃疡性结肠炎小鼠模型，以小鼠体重、粪便评分、结肠长度、结肠重量等为评价指标，研究受试物(LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊)经口灌胃连续给药9日，对3.5％DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎是否有治疗作用。

本实验的方法是：除空白对照组小鼠，其余小鼠给予3.5％DSS溶液自由饮水造模(造模当天记为D1)，同时开始给予药物治疗，1次/日，连续七天。随后(D8)将3.5％DSS换成饮用水继续饲养2天，并同时继续给药。末次给药后次日(D11)CO₂过量吸入安乐死小鼠，剖开腹腔，自阑尾处开始摘取整个结肠并拍照，测量长度，沿肠系膜侧剖开，生理盐水清洗粪便，观察结肠粘膜的完整性，整个结肠称重。

本实验的结果是：①对体重和粪便情况评分的影响：LBP-02A活菌型胃肠粉对3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠的体重和粪便评分无明显影响。②对结肠长度和重量的影响：LBP-02A活菌型胃肠粉有一定抑制3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠萎缩的作用，主要表现为可抑制造模小鼠的结肠缩短，但对结肠重量的影响并不明显；其中1120mg/kg和560mg/kg剂量的LBP-02A活菌型胃肠粉抑制模型小鼠结肠萎缩的作用较为显著。③对结肠整体外观的影响：560mg/kg和280mg/kg的LBP-02A活菌型胃肠粉对3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠整体外观(结肠外观颜色和直径)改善明显，但1120mg/kg的剂量效果较差。

(一)药物

1.1受试物

名称：活菌型胃肠粉胶囊；型号：LBP-02A；来源：深圳市肽素生物技术有限公司；PH值：3.5～4.5；规格：350mg/粒，60粒/瓶；CFU：≥1.5*10^8/g；抑菌圈：≥30mm；生产日期：2020.09.28；储存条件：常温。

受试物及其制剂准备将根据客户的要求。受试物由客户提供，客户应保证受试物的特性、纯度和稳定性。受试物根据客户提供的受试物储存条件进行储存。项目结束以后由上海美迪西生物医药股份有限公司保存或返还客户。实验人员应遵循实验设施要求的所有安全防护措施。

1.2阳性药

名称：柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)；来源：上海福达制药有限公司；性状：本品为肠溶薄膜衣片，除去包衣后，显黄色至棕黄色；规格：0.25g/片，60片(5×12片)；批号：22181202；储存条件：遮光，密封保存。

1.3造模剂

名称：葡聚糖硫酸钠(DSS)；分子量：36000-50000；来源：MP Biomedicals，LLC；性状：白色粉末；规格：100g/瓶；批号：S0948；储存条件：RT。

1.4其它试剂

名称：灭菌注射用水；来源：广东艾希德药业有限公司；性状：无色透明液体；规格：500ml/瓶；批号：190512203；储存条件：RT。

(二)实验动物饲养

2.1动物

品种和品系：C57BL/6N小鼠；级别：SPF级；性别：雄性；来源：北京维通利华实验动物技术有限公司；实验动物质量合格证号：20201019Abzz0619000592；实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2015-0026；动物数量：订购70只小鼠；实验开始时动物年龄：6-8周龄；实验开始时动物体重：22-25g；适应环境时间：3-5天；动物编号方式：每个鼠笼均佩挂有项目编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种和性别等信息的身份卡片，小鼠用尾根部画线标号。

2.2环境

动物房环境保持温度23±2℃，湿度40～70％，12h明暗交替。动物每笼5只饲养，每周更换两次垫料(玉米芯垫料，苏州埭川商贸有限公司)。

2.3食物和饮水

适应期饲喂SPF大小鼠生长繁殖饲料(Co⁶⁰灭菌，购自北京科澳协力饲料有限公司)。实验动物用水采用高压灭菌过滤水。

2.4动物选择和禁食

用于实验的动物将保持健康状况。实验过程中动物自由摄食和饮水。

(三)实验方法

3.1动物分组

小鼠适应性饲养后开始实验。选择健康状态良好的60只小鼠根据体重平均分为6组，每组10只：

表17动物分组及给药情况

3.2药物配制

3.2.1受试物配制

表18受试物计量配制情况

3.2.2阳性药配制

3.2.3 3.5％DSS的配制

注：每次配制1000ml，平均分装到每笼小鼠的饮水瓶中，每两天配制一次。

3.3实验方法

除空白对照组小鼠，其余小鼠给予3.5％DSS溶液自由饮水造模(造模当天记为D1)，同时开始经口灌胃给予药物治疗，1次/日，连续七天。随后(D8)将3.5％DSS换成饮用水继续饲养2天，并同时继续给药。末次给药后次日(D11)CO₂过量吸入安乐死小鼠，剖开腹腔，自阑尾处开始摘取整个结肠并拍照，测量长度，沿肠系膜侧剖开，生理盐水清洗粪便，观察结肠粘膜的完整性，整个结肠称重。

3.3.1检测指标

(1)一般状况及体重记录：1次/日

(2)疾病活动指数(DAI)：粪便情况：每日观察记录并分级评分：1级正常；2级大便软但成型；3级大便不成型；4级大便不成型伴有粘液及肉眼可见血渍；

(3)给药期结束后：

a)整体结肠拍照；b)测量整个结肠长度；c)解剖后观察结肠粘膜的完整性；d)结肠称重。

(四)数据统计

实验数据以Mean±SD表示，两组间数据采用非配对t检验，p<0.05认为是有显著性差异。

(五)实验结果

5.1受试物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重的影响

小鼠开始自由饮用3.5％DSS溶液后，体重几乎不再增长。从连续造模第六天开始，模型组及给药组小鼠出现较明显的体重下降情况，并随着造模天数的增加，体重下降越明显，而正常饮用高压灭菌水的空白组小鼠，体重变化不明显。该结果表明3.5％DSS诱导可明显降低造模期间小鼠的体重(P<0.05，vs.空白对照组)；连续9天经口灌胃给予阳性药SASP及不同剂量LBP-02A活菌型胃肠粉，对DSS致溃疡性结肠炎小鼠的体重变化影响较小，除阳性药和高剂量1120mg/kg受试物在day6时有一定减缓DSS小鼠体重下降的作用外(P<0.05，vs.模型组)，其余药物处理均无明显抑制体重下降的作用(表19，图9)。

表19经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重的影响(n＝10，

)

^##p<0.01vs.空白对照，^*p<0.05vs.模型组

5.2受试物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠粪便的影响

小鼠连续自由饮用3.5％DSS溶液的前3日，各组动物排便未见明显变化；至3日后多数造模小鼠出现粪便变软的现象，至4日后粪便变软、不成形的动物数量明显增多，到5日后多数造模小鼠出现血便情况，随着时间的增加，血便情况越发明显，在day7时粪便情况评分也达到顶峰；day8后把3.5％DSS换成高压灭菌水，造模小鼠粪便评分略有下降，但多数动物粪便仍有稀软不成形和带血的现象；该结果表明3.5％DSS诱导有明显增加造模小鼠粪便评分的作用(P<0.05，vs.空白对照组)。此外，连续9天经口灌胃给予阳性药及不同剂量LBP-02A活菌型胃肠粉，对DSS致溃疡性结肠炎小鼠造模期粪便变化的影响较小(表20、图10)。

表20经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠粪便评分的影响(n＝10，

)

^##p<0.01vs.空白对照，^*p<0.05vs.模型组

5.3受试物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠的重量及长度的影响

小鼠连续自由饮用3.5％DSS溶液7天，再继续给予2天高压灭菌水后，其结肠萎缩，表现为：模型组小鼠与自由饮用高压灭菌水的空白组相比，结肠重量减小，具有统计学显著性差异(P<0.01)；同时模型组小鼠结肠长度呈现缩短的趋势，与空白组比较具有统计学差异(P<0.001)(表21，图11)。

连续9天经口灌胃给予600mg/kg的阳性药SASP，可明显抑制3.5％DSS造模小鼠的结肠萎缩，表现为动物结肠重量和长度均明显增加(*p<0.05，**p<0.01vs.模型组)；不同剂量LBP-02A活菌型胃肠粉均有一定增加造模小鼠结肠长度的作用，其中1120mg/kg和560mg/kg剂量可明显增加动物的结肠长度(*p<0.05,vs.模型组)，但各剂量受试物均无明显增加造模动物结肠重量的作用。

表21经口灌胃连续给药9天对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠重量和长度的影响(n＝10，

)

^##p<0.01vs.空白对照，*p<0.05,**p<0.01vs.模型组

5.4受试物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠作用的结肠整体外观照片

由小鼠结肠照片可见，空白对照组小鼠结肠整体外观均匀、颜色呈现健康红润，无异常损伤；模型组小鼠结肠长度明显缩短(vs.空白对照组)，结肠直径大小不均匀，局部颜色呈现暗红至黑色，表明造模后有结肠损伤产生。阳性药SASP组小鼠结肠长度较模型组有所延长，但结肠整体外观颜色和直径等改变较小。受试物对小鼠结肠长度的改变程度小于阳性药SASP，但560mg/kg和280mg/kg对结肠整体外观(颜色及直径)的改善作用较明显。结肠长度的具体分析可见上述结果描述(5.3)。

(六)结果

6.1对体重和粪便情况评分的影响：

LBP-02A活菌型胃肠粉对3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠的体重和粪便评分无明显影响作用。

6.2.对结肠长度和重量的影响：

LBP-02A活菌型胃肠粉有一定抑制3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠萎缩的作用，主要表现为可抑制造模小鼠的结肠缩短，但对结肠重量的调控作用并不明显；其中1120mg/kg和560mg/kg剂量的LBP-02A活菌型胃肠粉抑制模型小鼠结肠萎缩的作用较为显著。

6.3.对结肠整体外观的影响：

560mg/kg和280mg/kg的LBP-02A活菌型胃肠粉对3.5％DSS致溃疡性结肠炎小鼠结肠整体外观(结肠外观颜色和直径)改善明显，但1120mg/kg剂量效果较差。

(七)结论

小鼠连续自由饮用3.5％DSS溶液7天，出现溃疡性结肠炎样反应：明显的稀便、血便，结肠萎缩，体重减轻。连续9天经口灌胃给予LBP-02A活菌型胃肠粉(1120mg/kg和560mg/kg)具有一定抑制3.5％DSS诱导的小鼠结肠萎缩的作用，且560mg/kg和280mg/kg受试物对模型小鼠结肠整体外观改善较明显，综上可见560mg/kg剂量LBP-02A活菌型胃肠粉对3.5％DSS诱导的结肠炎小鼠有一定疗效，但具体的量效关系还应做进一步研究。另外，各剂量受试物无明显抑制小鼠体重下降和改善小鼠脓血便的作用。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表达不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的母体特征、结构、材料或特点可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (14)

1.一种肽素，其特征在于，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。

2.根据权利要求1所述的肽素，其特征在于，所述肽素是通过如下方法制备得到的：

将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。

3.根据权利要求2所述的肽素，其特征在于，所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的：

将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.09L-0.11L无机盐液，在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天，得到初级代谢产物；所述初级代谢产物中含有至少1×10⁹CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；

每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水；

所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的；

所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。

4.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：

将585份-715份大豆，315份-385份糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；

将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；

将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到植物性培养物。

5.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：

将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份；葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到0.4L的动物性培养基；

将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。

6.根据权利要求4所述的肽素，其特征在于，在制备所述植物性培养基时，采用的是650份大豆和350份糯米；烘烤温度为125℃-135℃，烘烤时间是为1.5h-2.5h。

7.根据权利要求5所述的肽素，其特征在于，在制备动物性培养基的过程中，具体是：将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份、葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到动物性培养基。

8.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，在所述初级代谢产物的制备过程中，向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液，并在15-40℃厌氧再培养4-6天后，转入0-4℃培养至少三个月以上；且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。

9.一种肽素混合固体饮品，其特征在于，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：

将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入脱脂奶粉、果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。

10.根据权利要求9所述的肽素混合固体饮品，其特征在于，将每9.8kg-2.2kg的肽素培养物加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。

11.一种肽素精华物，其特征在于，所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的：

将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，再加入水搅拌，离心取上层清液待用；

向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖，经冷冻干燥或者烘干磨成粉后即得到所述肽素精华物。

12.根据权利要求11所述的肽素精华物，其特征在于，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，加入3.6kg-4.4kg水，70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h，并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min，取上层清液，待用；

向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉，以及果糖，经冷冻干燥磨成粉后即得到所述的肽素精华物。

13.一种权利要求11或12所述的肽素精华物在治疗结肠炎药物方面的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，对所述肽素精华物进行粉碎，得到活菌型胃肠粉，或将粉碎后的肽素精华物封装在胶囊中得到活菌型胃肠粉胶囊。

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