CN115786404A - 一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤切割伤药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肽素、肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用，其中，该肽素是副干酪乳杆菌LBP‑YE01的各种次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP‑YE01的保藏编号CGMCC NO.15360。本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能，能灭杀人体皮肤、胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体皮肤、胃肠道微生态平衡，另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞，且有很好的抗氧化活性，加快人体新陈代谢，修复受伤组织细胞。

Description

一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤切割伤药物方面的应用
技术领域
本发明属于微生物发酵培养技术领域，具体涉及一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤切割伤药物方面的应用。
背景技术
副干酪乳杆菌是我国卫生部允许添加在食品中的有益菌，广泛分部在胃肠道、皮肤、生殖道、口腔等人体微生态中。
它是胃肠道与皮肤中有益菌群的核心菌种，它能够定植于胃肠道、皮肤上皮细胞上大量繁殖，它在胃肠道与皮肤内通过次级代谢产生抗菌肽、苯乳酸等抑菌物质可以抑制有害菌，调整和维持胃肠道与皮肤内各种菌群的生长繁殖和相互关系，副干酪乳杆菌产生的D-苯乳酸可以与人类HCA3受体结合从而触发免疫细胞活动。
它产生的次级代谢物胞外多糖(EPS)能刺激机体内某些细胞的分裂，活化包括巨噬细胞在内的一系列与免疫相关的淋巴细胞，促进抗体、干扰素的大量分泌，从而能够激活和促进人体内的非特异性和特异性免疫反应，提高人体抵御入侵病原菌的能力。同时这些EPS也能将自由基氧化为过氧化氢等无毒物质，从而解除其对机体的损伤，减缓了机体的衰老过程，加快人体新陈代谢。
副干酪乳杆菌株LBP-YE01(保藏编号CGMCCNO.15360)在不同的营养环境中培养具有不同的生理功能，如何得到大量的次级代谢产物(也称为肽素)是需要解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一个目的是提供一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
本发明的第二个目的是提供一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品是肽素的一种应用。
本发明的第三个目的是提供一种肽素精华物，该肽素精华物是肽素的另一种应用。
本发明的第四个目的是提供一种肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用。
本发明的一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
进一步的，所述肽素是通过如下方法制备得到的：
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。
进一步的，所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的：
将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.09L-0.11L无机盐液，再在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天，得到初级代谢产物；所述初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；
每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水；
所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的；
所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。
进一步的，所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：
将585份-715份大豆，315份-385份糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；
将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；
将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到植物性培养物。
进一步的，所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：
将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份；葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到0.4L的动物性培养基；
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。
进一步的，在制备所述植物性培养基时，采用的是650份大豆和350份糯米；烘烤温度为125℃-135℃，烘烤时间是为1.5h-2.5h。
进一步的，在制备动物性培养基的过程中，具体是：将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份；葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到动物性培养基。
进一步的，在所述初级代谢产物的制备过程中，向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液，并在15-40℃厌氧再培养4-6天后，转入0-4℃培养至少三个月以上；且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。
本发明还提供了一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：
将上述的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入脱脂奶粉、果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
进一步的，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
本发明还提供了一种肽素精华物，所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的：
将上述的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，再加入水搅拌，离心取上层清液待用；
向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖，经冷冻干燥磨成粉后即得到所述肽素精华物。
进一步的，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，加入3.6kg-4.4kg水，70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h，并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min，取上层清液，待用；
向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉，以及果糖，经冷冻干燥干磨成粉后即得到所述的肽素精华物。
本发明还提供一种肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用。
进一步的，所述肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用体现在：将每45g-55g的肽素精华物，用水定容至1L，得到活菌型肽素皮肤保护液。
与现有技术相比，采用上述方案本发明的有益效果为：
本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能，能灭杀人体皮肤、胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体皮肤、胃肠道微生态平衡。另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞，且有很好的抗氧化活性，加快人体新陈代谢，修复受伤组织细胞。
附图说明
图1中图A为副干酪乳杆菌LBP-YE01 10×100倍镜检图；
图1中图B为副干酪乳杆菌BNCC337289 10×100倍镜检图；
图1中图C为副干酪乳杆菌LPc-G110 10×100倍镜检图；
图1中图D为副干酪乳杆菌JLPF-131 10×100倍镜检图；
图2是检测平板MY1的抑菌和免疫结果；
图3是检测平板MY2的抑菌和免疫结果；
图4是谷胱甘肽DPPH清除率拟合图；
图5是连续14天伤口局部给予受试物对大鼠切割伤大鼠体重的影响(n＝10，
Figure SMS_1
)
图6是连续14天伤口局部给予受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响(n＝10，
Figure SMS_2
))
图7不同时间点下受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响；其中：
图7A为第4天受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响；
图7B为第8天受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响；
图7C为第11天受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响；
图7D为第14天受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响；
图8为造模给药后大鼠切割伤创面在不同天数的大体观照片；其中：
图8A-1至图8A-6是造模给药后大鼠切割伤创面在第1天的大体观照片；
图8B-1至图8B-6是造模给药后大鼠切割伤创面在第4天的大体观照片；
图8C-1至图8C-6是造模给药后大鼠切割伤创面在第8天的大体观照片；
图8D-1至图8D-6是造模给药后大鼠切割伤创面在第11天的大体观照片；
图8E-1至图8E-6是造模给药后大鼠切割伤创面在第14天的大体观照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种肽素，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
该肽素是通过如下方法制备得到的：
S1、植物性培养物的制备
将650g大豆，350g糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；其中各物质成分质量配比允许误差为10％；
将0.1g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到10g麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；
将副干酪乳杆菌菌种调配液与植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到1510g植物性培养物。
S2、动物性培养物的制备
将酪蛋白水解物10g、牛肉粉10g、酵母粉10g；葡萄糖20g、吐温-80 1g混合后，加水定容至0.4L，并100℃下煮沸灭菌30min，得到动物性培养基；
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的动物性培养基中，在温度为37℃，搅拌速度为75rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。
S3、初级代谢产物的制备
将上述制备得到的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.1L无机盐液，再在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-6天，得到初级代谢产物；初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；
其中，每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和余量水。
S4、肽素的制备
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在(15-40℃)厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在(25℃-40℃)厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。
将初级代谢产物转入(0℃-4℃)厌氧条件下培养至少三个月的过程中，副干酪乳杆菌LBP-YE01在冷胁迫下进入次级代谢状态，它们从周围吸收自身初级代谢后的营养物合成次级代谢产物来保护自身菌群，此时菌数量由1×109CFU/g以上迅速减少至1×107CFU/g以下，通过菌数量变化作为副干酪乳杆菌LBP-YE01进入次级代谢状态的判断依据。
在(25℃-40℃)厌氧培养6-8天中，副干酪乳杆菌LBP-YE01会消耗培养物中剩余的营养物质进行初级代谢发酵，菌数量会迅速上升至1×109CFU/g以上。
在低温(0-4℃)厌氧长期培养(至少三个月)中。副干酪乳杆菌LBP-YE01长时间发酵积累大量的次级代谢产物，该次级代谢产物可以在0℃-4℃厌氧环境中长期保藏。
实施例2
本实施例提供了一种肽素混合固体饮品，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：
将实施例1得到的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合，并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天，此过程为副干酪乳杆菌LBP-YE01的复壮扩培；随后再加入脱72g脂奶粉、10g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥，磨成粉后即得到肽素混合固体饮品。
其中，加麦芽糖是为了给菌提供ATP能量，让菌迅速激活。加入脱脂奶粉、果糖作为副干酪乳杆菌保护剂。
通过实验可知，肽素混合固体饮品可以让酪乳杆菌LBP-YE01菌株在人体胃肠道内有很好的耐受性。该固体饮品中所含有的肽素对有益菌群免疫且能灭杀人体胃肠道内有害菌群，为有益菌群的繁殖提供空间，从而维持人体胃肠道微生态平衡。
实施例3
本实施例提供了一种肽素精华物，该肽素精华物是通过如下方法制备得到的：
将实施例1的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合，并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天后，再加入4kg矿泉水，75rpm/min下搅拌24h，并在7500rpm/min下离心8min，取上层清液，待用；
向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉、以及果糖，经冷冻干燥，磨成粉后即得到肽素精华物。
通过实验发现，本实施例的肽素精华物具有很好的抑菌能力和抗氧化能力。
实施例4
本实施例提供一种活菌型肽素皮肤保护液，具体为：将每50g的肽素精华物，用水定容至1L，得到活菌型肽素皮肤保护液。
通过实验可知，该活菌型肽素皮肤保护液能够保护创面不受有害菌定植感染，同时使胞外多糖(EPS)刺激受伤细胞加速分裂繁殖，促进结痂脱落，快速修复伤口面，逐渐缩小创面。
一、副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究：
(一)、材料
1.1菌株
表1菌株名称和来源
Figure SMS_3
Figure SMS_4
1.2培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础)：
成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉、4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
MRS肉汤：
成分：酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2。
1.3主要仪器和设备
表2主要仪器和设备
Figure SMS_5
Figure SMS_6
1.4试剂
表3试剂
Figure SMS_7
(二)、实验方法
2.1菌种活化、鉴定
在超净工作台里分别称取1g四种菌株(表1中的四种菌种)，加9mL无菌生理盐水(10倍稀释)，混悬均匀后进行梯度稀释，稀释倍数至105；分别吸取各菌株1mL 102、103、104、105倍稀释液加入无菌培养皿中，倾注MRS培养基19mL，冷却干燥后倒置于37℃培养箱中培养72H。挑选四种菌的典型副干酪乳杆菌菌落，镜检，观察形态。
2.2供试菌液制备
挑选四种菌株中典型副干酪乳杆菌单菌落，分别接种在100mLMRS肉汤中，37℃摇床培养48H，稳定传代培养三代，选择对数增长后期的菌液作为供试菌液。
2.3胃蛋白酶液的制备
用盐酸溶液、氢氧化钠溶液调节蒸馏水的pH至1.8，加入胃蛋白酶，使其质量浓度分别为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到胃蛋白酶液。
2.4胰蛋白酶液的制备
用0.4％氢氧化钠溶液调节0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，加入胰蛋白酶，加等体积水适量混合，使其质量浓度为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得胰蛋白酶液备用。
2.5含牛胆盐MRS肉汤培养基制备
配制500mL MRS肉汤培养基，加入牛胆盐，使牛胆盐质量浓度为0.3g/100mL，蒸汽高压灭菌(121℃，20min)后备用。
2.6四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验
供试菌液以2％(v/v)的接种量接种于胃蛋白酶液中，在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解，分别在0、0.5h、1h、2h取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。
2.7四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验
取1mL供试菌液加入29mL胰蛋白酶液中混悬，在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解，在0h、2h、4h、6h处分别取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。
2.8四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验
供试菌液以2％(v/v)的接种量接种到10mL的MRS中，37℃培养18h，离心(4000r/min，30min)，用无菌生理盐水洗涤，收集菌体，将收集到的菌体悬浮于牛胆盐MRS肉汤培养基中(0.3g/100mL)，于37℃，120rpm培养4h，分别在0h、2h和4h取样，采用平板计数法测定活菌数，将活菌数取对数值，计算存活率。
2.9存活率计算
每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下：
Figure SMS_8
式中：
Nt—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)；
N0—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。
(三)、结果分析
3.1四种菌株镜检结果
如图1所示，四种菌株的光学显微镜10×100倍放大倍数的镜检可以观察出，四种菌株都主要呈现出杆状，细长有弯曲的杆菌，部分呈球杆状，排列成栅状或链状，无芽孢，呈布朗无规则运动无动力运动。四种菌株在MRS培养基中的菌落形态为白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，具有典型干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的形态。
3.2四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验结果
表4耐受人工胃液试验结果(CFU·mL-1)
Figure SMS_9
注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表4可以看出，四款菌株在人工胃液中均具有一定的耐受性，最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01，2H后菌落数存活率大于2.95％(10-1.53)，其余3株菌副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110、副干酪乳杆菌JLPF-131存活率分别为0.87％(10-2.06)、2.04％(10-1.69)、1.86％(10-1.73)。以上结果说明，副干酪乳杆菌LBP-YE01在胃酸中更稳定。
3.3四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验结果
表5胰蛋白酶耐受试验结果(CFU·mL-1)
Figure SMS_10
注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表5可以看出，胰蛋白酶处理6H后，副干酪乳杆菌LBP-YE01、副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110的存活率均大于100％，说明胰蛋白酶对这三种菌没有明显的抑制作用，副干酪乳杆菌JLPF-131 6H后的存活率为89.12％，也没有很明显的降低。综上所述，四种菌株对胰蛋白酶均具有很好的耐受性。
3.4四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验结果
表6耐受胆盐试验结果(CFU·mL-1)
Figure SMS_11
注：“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110，
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表6可以知道，四款菌株在含0.3％牛胆盐实验组中4H存活率都不是很高，但最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01，4H后存活率为0.14％(10-2.84)，副干酪乳杆菌JLPF-131存活率最低，4H后存活率为0.0048‰(10-5.32)。
通过上述实验可知，副干酪乳杆菌LBP-YE01在人体胃肠道内具有远超其它副干酪乳杆菌的生物活性。
二、肽素混合固体饮品在人工胃肠道内的活性检测研究
(一)、材料
1.1供试产品
实施例2的肽素混合固体饮品(规格：3g/包)，深圳市肽素生物技术有限公司
1.2培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础)
成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
1.3主要仪器与设备
主要仪器与设备同副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究中用到的仪器和设备相同。
(二)、实验方法
2.1人工胃液的配制：
用盐酸、氢氧化钠调整蒸馏水的pH至2.5、3.5、4.5，加入胃蛋白酶，使其质量浓度分别为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到人工胃液。
2.2人工肠液的配制：
用0.4％氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，加入胰蛋白酶，加等体积水适量混合，使其质量浓度为1g/100mL，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得人工肠液备用。
2.3人工胆液的配制：
用0.4％氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8，分别称取不同质量的牛胆盐溶解，用蒸馏水定容分装，使牛胆盐最终含量分别为0g/100mL、0.03g/100mL、0.3g/100mL、0.5g/100mL，制得人工胆液备用。
2.4人工胃肠液耐受性试验：
本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋，分别取1袋加入pH2.5人工胃液、pH 3.5人工胃液、pH 4.5人工胃液人工肠液、无菌生理盐水至30mL，37℃恒温(60rpm)培养。在0、1.5、3h处分别对人工胃液样品取样，在0、1.5、3、4.5、6h处分别对人工肠液和生理盐水样品取样，采用菌落平板计数法测定样品中的菌落数，计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。
2.5耐胆盐试验：
取本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋，分别取一袋加入人工胆液(0、0.03、0.3、0.5g/100mL)，37℃恒温(60rpm)培养。分别在0、1.5、3、4.5、6h处取样，采用平板计数法测定样液中的菌落数，计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。
2.6存活率计算：
每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下：
Figure SMS_12
式中：
Nt—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)；
N0—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。
(三)、结果分析
在该固体饮品通过人体胃肠道的过程中，胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等因素会影响益生菌的存活性。所以益生菌要定植在人体肠道内发挥平衡菌群作用，就必须要有一定数量的菌能耐受胃和上部肠道的环境。固体饮料在人工胃肠道内的活性检测结果如表7。
表7肽素混合固体饮品在人工胃液、人工肠液、牛胆盐处理后的活菌数
Figure SMS_13
Figure SMS_14
人体胃液在正常状态下的pH值在2.5-3.5之间，流体食物通过人体胃部大约花费1h-2h，该固体饮料在pH2.5、3.5、4.5的人工胃液中培养6h的过程中，其副干酪乳杆菌活菌数较0h处稍有变换，变化不显著(P＞0.05)，说明该菌株在人工胃液中具有较好的耐受性。
如表7，本固体饮品在人工肠液作用6h的过程中，其活性较0h处无显著变化(P>0.05)，说明该菌株在人工肠液中具有较好的耐受性。
小肠胆盐浓度的波动范围通常为0.03-0.3g/100mL，食物一般会在小肠中停留1-4h，由表7可知，胆盐对本固体饮品副干酪乳杆菌的生长有一定的抑制作用,且随胆盐浓度的增加，抑制作用增强。
在含有0.03g/100mL胆盐的固体饮品中，随作用时间的延长，活菌数成增长趋势。在含0.3、0.5g/100mL胆盐的固体饮品中作用1.5h后，活菌数均显著降低(P<0.05)。1.5h以后，随作用时间的延长，菌落总数缓缓增加，在作用4.5h后保持可较高的存活率(95％-85％)及活菌数(>106CFU/mL)能够满足益生菌发挥有效作用对菌浓度有要求(一般为106-109cFU/mL)，说明该菌株对人体生理浓度范围内的胆盐有较好的耐受性。
肽素固体饮品中副干酪乳杆菌能耐受人体胃肠道的生存环境。
三、肽素固体饮品同诺氟沙星的抑菌与免疫实验
原理：在实验过程中，处于静置恒温(37℃)培养过程中的检测平板，一方面指示菌开始生长，另一方面牛津杯中的粗提取液在重力作用下在检测平板中呈球面扩散，其所含抑菌物质的浓度随着其在培养基扩散距离的增大而减小。在抑菌物质的有效抑菌浓度下，当指示菌为病原菌时，抑菌物质会抑制病原菌的生长，当指示菌为有益菌时，抑菌物质不会抑制有益菌的生长，即对有益菌免疫。而诺氟沙星对细菌具有广谱抗性，因此无论是有益菌还是病原菌，抗生素诺氟沙星对其都具有抑制作用。
(一)、材料
1.1样品
5g肽素固体饮品、1粒诺氟沙星，0.1g/粒。
1.2菌种
短双歧杆菌BNCC185972(有益菌)、金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)。
1.3培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础)：
成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
MRS肉汤：
成分：酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2
营养琼脂NA：
成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。
营养肉汤NB：
成分：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH7.2±0.2。
1.4主要仪器与设备
FA2204B电子分析天平上海佑科仪器仪表有限公司
DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SW-CJ-1FD垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司
SPX-250生化培养箱上海申贤恒温设备厂
723CRT可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司
ZD-85A数显气浴恒温振荡器常州普天仪器制造有限公司
H2-16台式高速离心机湖南可成仪器设备有限公司
(二)、实验方法
2.1预处理
2.1.1指示菌的制备
有益菌短双歧杆菌制备：在MRS肉汤中接种活化后短双歧杆菌BNCC185972，摇床37℃，200rpm，培养72h。其中短双歧杆菌活菌数为109cfu/mL。预先进行菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将短双歧杆菌培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
病原菌金黄色葡萄球菌制备：将金黄色葡萄球菌ATCC 6538接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶，36℃±1℃、200r/min±1min培养至金黄色葡萄球菌的稳定期，作为第三代培养液。预先按照GB4789.2进行菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
2.1.2抑菌物质粗提取
称取肽素固体饮品5g，加入15mL无菌生理盐水。分别37℃，60rpm/min恒温振荡2H，振荡后的发酵液经离心(8000r/min)8min，得到上清液，即为含有肽素物质的上清粗提取液。
2.2抗生素制备
诺氟沙星，国药准字H14023224，规格0.1g。取一颗诺氟沙星胶囊去除胶囊壳倒入50mL水中，震荡摇匀1H。
2.2.1检测平板制备
指示菌为短双歧杆菌的检测平板制备：将配制的MRS培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的短双歧杆菌菌悬液按照1％的添加量加入MRS培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。记为检测平板MY1。
指示菌为金黄色葡萄球菌的检测平板制备：将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的金黄色葡萄球菌菌悬液按照1％的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。记为检测平板MY2。
2.2.2牛津杯放置
采用符合中国药典药品检验操作规范，适用于抗生素效价抑菌圈培养实验的牛津杯(内径6mm，外径7.8mm，高10mm)。在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在检测平板上，每皿均匀放置两盏牛津杯，轻轻按压。
2.2.3抑菌圈培养
在指示菌为短双歧杆菌的平皿MY1上的两盏牛津杯中，在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液，记为MY1a，在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液，记为MY1b。
在指示菌为金黄色葡萄球菌的平皿MY2上的两盏牛津杯中，在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液，记为MY2a，在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液，记为MY2b。
将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h，取出检测平板，将检测平板MY1恒温(37℃)静置培养48h，检测平板MY2恒温(37℃)静置培养16-20H，测量抑菌圈大小。
2.3抑菌性评价标准
抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用，15mm>抑菌圈≥10mm为中度抑菌，抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。
(三)、结果与分析
通过如图2和图3的展示结果可知，肽素固体饮品中所含的抑菌物质对有益菌的生长无抑制作用(如图2中的牛津杯MY1a)，对病原菌具有高度抑菌作用(如图2中的牛津杯MY1b)，抗生素诺氟沙星对有益菌和病原菌均具有高度抑菌作用(如图3中的牛津杯MY2a、MY2b)。
四、肽素精华物抑菌测试
(一)、材料
1.1检测样品
肽素精华物1g
1.2指示菌种
金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)
1.3培养基
营养琼脂NA
成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。
营养肉汤NB
成分：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.2±0.2。
1.4主要仪器与设备
FA2204B电子分析天平上海佑科仪器仪表有限公司
DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SW-CJ-1FD垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司
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723CRT可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司
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H2-16台式高速离心机湖南可成仪器设备有限公司
(二)实验方法
2.1样品制备
称取肽素精华物1g，加入1mL无菌生理盐水，充分震荡溶解后作为待测样品。
2.2指示菌种活化
将指示菌接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶，36℃士1℃、200r/min±1min培养至指示菌的稳定期,作为第三代培养液。
2.3指示菌悬液制备
预先按照GB 4789.2进行指示菌的菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
2.4检测平板制备
将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃-50℃，将制备的指示菌菌悬液按照1％的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL.倾倒入灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。
2.5牛津杯抑菌测试
在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在指示菌的检测平板上。在含有指示菌的检测平板中等距离安放4个牛津杯，轻轻按压，用移液器分别吸取待测样品4次，每次量取220uL，缓缓加入牛津杯中，将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h，取出检测平板，放入36℃±1℃恒温培养箱中正置培养15-16h，观察有无抑菌圈出现，如有则采用游标卡尺测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。
2.6抑菌性评价标准
抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用，10mm≤抑菌圈＜15mm为中度抑菌，抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。
(三)、结果分析
3.1抑菌圈直径大小
表8抑菌圈直径大小
Figure SMS_15
3.2抑菌性评价
肽素精华物平均抑菌圈直径为29.51mm，大于15mm，说明肽素精华物呈高度抑菌性。
五、肽素精华物DPPH法抗氧化测试
原理：
DPPH(11-Diphenyl-2picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2苦基肼基自由基。DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基,是一种暗紫色棱柱状结晶，分子式为C12H12NO6(M＝394.32)，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个孤对电子。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在515～520m范围有最大吸收峰。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系,因而可以通过吸光度的变化进行定量分析，采用紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度，通过与谷胱甘肽分子的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化能力AO值，清除DPPH自由基是DPPH法的根据。
Figure SMS_16
(一)试剂与设备
1.1试剂
还原型谷胱甘肽，天津市大茂化学试剂厂；
1,1-二苯基-2苦基肼基，上海阿拉丁试剂有限公司；
无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂。
1.2设备
FA2204B电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；
723CRT可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。
(二)、实验方法
2.1样品制备
2.1.1待测样品溶液制备
称取2g肽素精华物定容至20mL蒸馏水中得到100mg/mL的样品溶液，用蒸馏水将母液释至不同倍数，得到不同浓度的待测样品溶液。待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R2≥0.9500。
2.1.2对照样品溶液制备
称取L-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母液。以10倍的稀释倍数依次稀释得到不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液，根据DPPH溶液与不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液的反应，计算DPPH清除率，寻找合适的谷胱甘肽溶液浓度，等差倍数稀释该浓度，谷胱甘肽溶液浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R2≥0.9500。
2.1.3DPPH溶液的制备
称取5mg DPPH(精确至小数点后四位)，加入少量无水乙醇，超声波充分溶解，无水乙醇定容至100mL(此过程全程避光)。
2.2测定
2.2.1对照组测定
取3组试管，分别编号为1、2、3号，每支试管中按照表9的组合添加试剂。
表9实际添加量
Figure SMS_17
在1号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0mL谷胱甘肽溶液，作为试验组(As)；
在2号试管中加入1.0mL谷胱甘肽溶液和3.0mL无水乙醇溶液，作为对照组(Ac)；
在3号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0ml待测样品溶液，作为空白组(Ab)；
分别充分混合均匀后，室温避光反应30min，于波长517nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。
2.2.2样品组测定
取3支试管，分别编号为1、2、3号，每支试管中按照表10的组合进行样品浓度稀释。稀释后的样品按表10添加，用待测样品肽素精华物溶液代替谷胱甘肽溶液，其它操作同2.2.1。待测样品浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R2≥0.9500。根据线性方程求解当肽素精华物清除率P＝50％时，对应的半数清除量EC50。
表10样品测定浓度梯度
Figure SMS_18
2.2.3样品组测定
用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其它操作同2.2.1。
待测样品浓度的选择应使其清除率在35％～65％，且线性方程的R2≥0.9500。根据线性方程求解当肽素清除率P＝50％时，对应的半数清除量EC50。
2.3试验数据处理
2.3.1清除率计算公式
Figure SMS_19
式中：
P为清除率；
AS为待测溶液与DPPH溶液混合液的吸光度；
AC为待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度；
Ab为DPPH溶液与样品溶剂混合液的吸光度。
2.3.2抗氧化能力AO值计算
以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除率的线性方程(R2≥0.9500)，计算半数清除量EC50，按式(2)计算多肽样品的抗氧化能力AO值。
Figure SMS_20
式中：
AO为抗氧化能力；
EC50(S)为多肽样品的半数清除量，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
EC50(R)为谷胱甘肽的半数清除量，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。
(三)实验结果
3.1谷胱甘肽DPPH清除率试验结果，如图4，以及表11所示。
表11L-还原型谷胱甘肽DPPH半数清除率测定
Figure SMS_21
Figure SMS_22
经过数据拟合，得到以EC为横坐标，以清除率为纵坐标的线性方程P(R)＝0.216EC(R)-0.7588，且EC50(R)＝5.8278，R2＝0.9796≥0.95。
3.2肽素精华物DPPH清除率试验结果，如表12所示。
表12肽素精华物DPPH半数清除率测定
Figure SMS_23
经过数据拟合，得到以EC为横坐标，以清除率为纵坐标的线性方程P(R)＝0.2150EC(R)-1.2755，且EC50(R)＝8.4561，R2＝0.9663≥0.95。
3.3肽素精华素的抗氧化能力AO值
通过公式(2)计算得到肽素精华素的抗氧化能力AO值为1.45。
六、受试物对大鼠皮肤切割伤愈合作用的药效研究
本实验目的是：每天局部给予受试物(肽素皮肤保护液)，通过测定伤口面积、拍照以及病理HE染色等指标，研究受试物对大鼠皮肤切割伤愈合有否促进作用。
本实验的方法是：将60只SD大鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型组(灭菌水)、阳性药对照组(金因肽，40IU/cm2)以及受试物肽素皮肤保护液高剂量组(5mg/1mL/cm2)、中剂量组(3mg/1mL/cm2)、低剂量组(1mg/1mL/cm2)。除空白对照组动物外，其余各组大鼠于背部皮肤连续打2个孔，并切除打孔内部的全层皮肤，深达筋膜层，形成切割伤创面，随后创面局部给药(喷雾局部喷涂)，第一周6次/天、第二周4次/天；造模当日记为D1，2次/周对每只大鼠的创面进行拍照并描记伤口及计算伤口面积。实验结束时取伤口组织(边缘+创面)做病理组织学检查(HE)观察组织增生愈合的情况。
本实验的结果是：1)各组动物造模后，体重随时间增加而增长。模型组大鼠体重增加幅度明显降低，与空白对照组比较，表现出显著性差异；与模型组比较，阳性药金因肽组大鼠体重增加幅度较大，表现出统计学的显著性差异；受试物肽素各剂量组大鼠体重增幅与模型组相当；2)各组动物造模后开始逐步愈合。对整体结果重复测量方差分析结果表明，阳性药组受试物高剂量组大鼠伤口面积与模型组比较其伤口面积缩小，其结果显示出显著性差异。对同一给药时间点不同给药组分析，给予各组药物第4和8天，阳性药组大鼠与模型组大鼠比较大鼠伤口面积缩小不明显，受试物高剂量组大鼠与模型组大鼠比较大鼠其伤口面积开始缩小，并呈现出统计学的显著性差异；给予各组药物第11天，受试物高，中剂量组大鼠伤口面积缩小，与模型组比较呈现出统计学的显著性差异；给予各组药物至第14天，阳性药组、受试物中剂量组和受试物高剂量组大鼠伤口面积缩小，与模型组比较，受试物高剂量组呈现出统计学的显著性差异。
(一)药物信息
1.1受试物
名称：LBP02A肽素皮肤保护液
来源：深圳市肽素生物技术有限公司；性状：浅黄色浑浊液体规格：300mL；有效成分：副干酪乳杆菌细菌素(抗菌肽)和胞外多糖EPS多5mg/mL；PH：3.5-4.0(乳酸)；生产日期：2021.10.20储存条件：0-10℃
受试物及其制剂准备将根据客户的要求。受试物由客户提供，客户应保证受试物的特性、纯度和稳定性。所有受试物将根据客户提供的受试物储存条件进行储存。项目结束以后由上海美迪西生物医药股份有限公司保存或返还客户。实验人员应遵循实验设施要求的所有安全防护措施。
1.2阳性对照药
名称：金因肽(人表皮生长因子外用溶液)
来源：深圳市华生元基因工程发展有限公司；性状：无色透明液体；规格：15mL/支2000IU/mL；批号：20210604；有效期至：2022-11；储存条件：2-8C、避光；
用法用量：常规清创后，用本品局部均匀喷湿创面，每日一次；约4000IU/10*10cm2。
1.3其他试剂
A：异氟烷
来源：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；性状：无色澄明液体；规格：100mL；批号：21081501；储存条件：RT
B：灭菌水
来源：广西艾希德药业有限公司；性状：无色透明液体；规格：500mL；批号：201218206；有效期至：2022.11；储存条件：RT
(二)实验仪器及材料
2.1仪器
A名称：呼吸麻醉机；型号：VMR；来源：美国MIDMARK集团；
B名称：数码相机；型号：EOS 80D EF-S 18-200IS；来源：Canon；
C名称：Acu+Punch(Skin Biopsy Punches)；型号：P1225(12mm)；来源：Acuderm，Inc.
(三)实验动物及饲养
3.1动物
品种和品系：SD大鼠；级别：SPF级；性别：雄性；来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司；实验动物质量合格证号：20211202Aazz0619000432；实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2020-0038；动物数量：60只；实验开始时动物体重：250g左右；适应环境时间：3-5天；动物编号方式：每个鼠笼上均佩挂有项目编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种等信息的身份卡片，实验大鼠用尾根划线标号。
3.2环境
动物房的环境保持温度23±2℃，湿度40-70°％，12小时明暗交替。适应期动物每笼5只饲养，实验开始后单只单笼饲养，每周更换两次垫料(玉米芯垫料，苏州埭川商贸有限公司)。
3.3食物和饮水
SPF大小鼠生长繁殖饲料Co60灭菌，购自北京科澳协力饲料有限公司。
实验动物用水采用高压灭菌过滤水。
3.4动物选择和禁食
用于实验的动物将保持健康状况。实验过程中动物自由摄食和饮水。
(四)、实验方法
4.1动物分组
将适应性饲养后的大鼠，根据Excel完全随机分组法分成6组，每组10只动物。
表13动物分组及给药情况
Figure SMS_24
Figure SMS_25
注：金因肽推荐剂量为40IU/cm2，2000IU/mL，1次/天。阳性对照药及受试物给药时，依据伤口面积，以局部均匀喷湿创面为宜
4.2药物配制
A.3mg/mL肽素皮肤保护液配制：
Figure SMS_26
B.1mg/mL肽素皮肤保护液配制：
Figure SMS_27
4.3方法
动物适应期结束，除正常对照组外，其余大鼠异氟烷吸入麻醉后呈俯卧位放置，背部中央剃毛并消毒，用Acu+Punch(Skin Biopsy Punches.Acuderm，Inc.12mm)在大鼠背部皮肤连续打2个孔，并切除打孔内部的全层皮肤，深达筋膜层，形成切割伤创面，术后大鼠单只单笼饲养。随后创面局部给药(喷雾局部喷涂)，第一周6次/天，第二周4次/天；2次/周对每只大鼠的创面进行拍照并描记伤口，使用Image-Pro
Figure SMS_28
软件计算伤口面积。实验结束时取伤口组织(边缘+创面)做病理组织学检查(HE)观察组织增生愈合的情况。
(五)数据统计
实验数据以Mean±SD表示，采用t检验分析。p<0.05认为是有显著性差异，最终数据用GraphPad Prism 6软件进行作图，如图5所示。
(六)结果
6.1给药后大鼠的一般临床症状观察
连续14天给予受试物后各组大鼠均未发现肉眼可见异常。
6.2受试物对大鼠体重的影响
结果如图5和表14所示，各组动物造模后，体重随时间增加而增长。模型组大鼠体重增加幅度更小，与空白对照组比较，表现出显著性差异；与模型组比较，阳性药金因肽组大鼠体重增加幅度更大，表现出显著性差异；受试物肽素各剂量组大鼠体重增幅与模型组相当。
表14连续14天伤口局部给予受试物对切割伤大鼠体重的影响(n＝10，
Figure SMS_29
)
Figure SMS_30
#P<0.05，##P<0.01vs，空白对照组
*P<0.05，**P<0.01vs，模型组
6.3受试物对大鼠切割伤创面面积的影响
结果如图6和表15所示，各组动物造模后开始逐步愈合。对整体结果重复测量方差分析结果表明，阳性药组和受试物高剂量组大鼠伤口面积与模型组比较其伤口面积缩小。与模型组比较，阳性药和受试物各剂量组给药后，在a＝0.05检验水准下，时间因素的5个多元检验统计量，受试物高剂量组尸值均低于0.05，而阳性药组多元检测统计量P值大于0.05。对趋势进行的对比检验结果表明，给予受试物高剂量后与模型组比较，在不同时间点上大鼠切割伤伤口面积差异均有统计学意义；而阳性药和受试物中，低剂量组与模型组比较，在不同时间点上大鼠切割伤伤口面积差异无统计学意义。
对同一给药时间下不同组别进行分析(图7)，给予各组药物第4和8天，阳性药组大鼠与模型组大鼠比较大鼠伤口面积缩小不明显，受试物高剂量组大鼠与模型组大鼠比较其伤口面积开始缩小，并表现出显著性差异(p<0.05)；给予各组药物第11天，受试物高，中剂量组大鼠伤口面积缩小，与模型组比较表现出显著性差异(p<0.05，p<0.01)；给予各组药物第14天，阳性药组，受试物中剂量组和受试物高剂量组大鼠伤口面积缩小，与模型组比较，受试物高剂量组表现出显著性差异(p<0.05，p<0.01)。
表15连续14天伤口局部给予受试物对大鼠切割伤伤口面积(cm2)的影响(n＝10，
Figure SMS_31
)
Figure SMS_32
#P<0.05，##P<0.01vs，空白对照组
*P<0.05，**P<0.01vs，模型组
造模给药后大鼠切割伤创面的大体观照片，如图8所示。
(七)结论
受试物肽素皮肤保护液高剂量(5mg/1mL/cm2)伤口局部给药可于切割伤伤口愈合期加快大鼠的伤口愈合，在药效起效时间和促伤口愈合效果均优于阳性药物金因肽(40IU/cm2)。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表达不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的母体特征、结构、材料或特点可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (14)

1.一种肽素，其特征在于，该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
2.根据权利要求1所述的肽素，其特征在于，所述肽素是通过如下方法制备得到的：
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天，再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月，再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天，得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物，即肽素。
3.根据权利要求2所述的肽素，其特征在于，所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的：
将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后，再加入0.09L-0.11L无机盐液，在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天，得到初级代谢产物；所述初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株；
每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水；
所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的；
所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。
4.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：
将585份-715份大豆，315份-385份糯米混合清洗后，烘干灭菌，粉碎后得到植物性培养基；
将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀，得到副干酪乳杆菌菌种调配液；
将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀，在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天，得到植物性培养物。
5.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的：
将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份；葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到0.4L的动物性培养基；
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1％(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中，在温度为36.5℃-37.5℃，搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天，得到动物性培养物。
6.根据权利要求4所述的肽素，其特征在于，在制备所述植物性培养基时，采用的是650份大豆和350份糯米；烘烤温度为125℃-135℃，烘烤时间是为1.5h-2.5h。
7.根据权利要求5所述的肽素，其特征在于，在制备动物性培养基的过程中，具体是：将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份、葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后，加水定容至0.4L，并煮沸灭菌，得到动物性培养基。
8.根据权利要求3所述的肽素，其特征在于，在所述初级代谢产物的制备过程中，向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液，并在15-40℃厌氧再培养4-6天后，转入0-4℃培养至少三个月以上；且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。
9.一种肽素混合固体饮品，其特征在于，该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到：
将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入脱脂奶粉、果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
10.根据权利要求9所述的肽素混合固体饮品，其特征在于，将每9.8kg-2.2kg的肽素培养物加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天，随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干，磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
11.一种肽素精华物，其特征在于，所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的：
将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合，并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，再加入水搅拌，离心取上层清液待用；
向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖，经冷冻干燥或者烘干磨成粉后即得到所述肽素精华物。
12.根据权利要求11所述的肽素精华物，其特征在于，将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖，在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后，加入3.6kg-4.4kg水，70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h，并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min，取上层清液，待用；
向上层清液中加入0.1％(m/v)的脱脂奶粉，以及果糖，经冷冻干燥磨成粉后即得到所述的肽素精华物。
13.一种权利要求11或12所述的肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肽素精华物在治疗皮肤切割伤药物方面的应用体现在：将每45g-55g的肽素精华物，用水定容至1L，得到活菌型肽素皮肤保护液。
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