CN115927482A - 一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用 - Google Patents
一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927482A CN115927482A CN202211210792.6A CN202211210792A CN115927482A CN 115927482 A CN115927482 A CN 115927482A CN 202211210792 A CN202211210792 A CN 202211210792A CN 115927482 A CN115927482 A CN 115927482A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- lactobacillus paracasei
- powder
- days
- parts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 65
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 239000002775 capsule Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 40
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 claims abstract description 95
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 claims abstract description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 85
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 82
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 56
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 28
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 27
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 27
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 26
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 25
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 claims description 15
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 14
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 11
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 11
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 11
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 11
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 10
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 10
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 10
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 10
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 10
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 9
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000001393 triammonium citrate Substances 0.000 claims description 7
- 235000011046 triammonium citrate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 claims description 4
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 claims description 4
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 claims 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 19
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 abstract description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 86
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 35
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 34
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 29
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 27
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 23
- 239000003626 gastrointestinal polypeptide Substances 0.000 description 21
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 18
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 16
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 15
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 15
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 12
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 12
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 11
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 229960001596 famotidine Drugs 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000003305 oral gavage Methods 0.000 description 10
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 9
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 8
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 8
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 8
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 7
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- -1 picrylhydrazyl Chemical group 0.000 description 7
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 7
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 239000002662 enteric coated tablet Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 3
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 2
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- NWCHELUCVWSRRS-SECBINFHSA-N (2r)-2-hydroxy-2-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@](O)(C)C1=CC=CC=C1 NWCHELUCVWSRRS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N (S)-3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WCBPJVKVIMMEQC-UHFFFAOYSA-N 1,1-diphenyl-2-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1NN(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WCBPJVKVIMMEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFAYBQDGCKZKMH-UHFFFAOYSA-N BNCC Chemical compound BNCC SFAYBQDGCKZKMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 101001035752 Homo sapiens Hydroxycarboxylic acid receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 238000009837 dry grinding Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000020068 maotai Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 210000002417 xiphoid bone Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
- A23L2/39—Dry compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/52—Adding ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
- Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用,其中,该肽素是副干酪乳杆菌LBP‑YE01的各种次级代谢产物,所述副干酪乳杆菌LBP‑YE01的保藏编号CGMCC NO.15360。本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能,能灭杀人体皮肤、胃肠道内有害菌群,为有益菌群的繁殖提供空间,从而维持人体皮肤、胃肠道微生态平衡,另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞,且有很好的抗氧化活性,加快人体新陈代谢,修复受伤组织细胞。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵培养技术领域,具体涉及一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用。
背景技术
副干酪乳杆菌是我国卫生部允许添加在食品中的有益菌,广泛分部在胃肠道、皮肤、生殖道、口腔等人体微生态中。
它是胃肠道与皮肤中有益菌群的核心菌种,它能够定植于胃肠道、皮肤上皮细胞上大量繁殖,它在胃肠道与皮肤内通过次级代谢产生抗菌肽、苯乳酸等抑菌物质可以抑制有害菌,调整和维持胃肠道与皮肤内各种菌群的生长繁殖和相互关系,副干酪乳杆菌产生的D-苯乳酸可以与人类HCA3受体结合从而触发免疫细胞活动。
它产生的次级代谢物胞外多糖(EPS)能刺激机体内某些细胞的分裂,活化包括巨噬细胞在内的一系列与免疫相关的淋巴细胞,促进抗体、干扰素的大量分泌,从而能够激活和促进人体内的非特异性和特异性免疫反应,提高人体抵御入侵病原菌的能力。同时这些EPS也能将自由基氧化为过氧化氢等无毒物质,从而解除其对机体的损伤,减缓了机体的衰老过程,加快人体新陈代谢。
副干酪乳杆菌株LBP-YE01(保藏编号CGMCCNO.15360)在不同的营养环境中培养具有不同的生理功能,如何得到大量的次级代谢产物(也称为肽素)是需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种肽素,该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
本发明的第二个目的是提供一种肽素混合固体饮品,该肽素混合固体饮品是肽素的一种应用。
本发明的第三个目的是提供一种肽素精华物,该肽素精华物是肽素的另一种应用。
本发明的第四个目的是提供一种肽素精华物在治疗胃溃疡药物方面的应用。
本发明的一种肽素,该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
进一步的,所述肽素是通过如下方法制备得到的:
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天,再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月,再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天,得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,即肽素。
进一步的,所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的:
将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后,再加入0.09L-0.11L无机盐液,再在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天,得到初级代谢产物;所述初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株;
每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水;
所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的;
所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。
进一步的,所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的:
将585份-715份大豆,315份-385份糯米混合清洗后,烘干灭菌,粉碎后得到植物性培养基;
将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀,得到副干酪乳杆菌菌种调配液;
将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀,在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天,得到植物性培养物。
进一步的,所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的:
将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份;葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后,加水定容至0.4L,并煮沸灭菌,得到0.4L的动物性培养基;
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1%(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中,在温度为36.5℃-37.5℃,搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天,得到动物性培养物。
进一步的,在制备所述植物性培养基时,采用的是650份大豆和350份糯米;烘烤温度为125℃-135℃,烘烤时间是为1.5h-2.5h。
进一步的,在制备动物性培养基的过程中,具体是:将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份;葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后,加水定容至0.4L,并煮沸灭菌,得到动物性培养基。
进一步的,在所述初级代谢产物的制备过程中,向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液,并在15-40℃厌氧再培养4-6天后,转入0-4℃培养至少三个月以上;且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。
本发明还提供了一种肽素混合固体饮品,该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到:
将上述的肽素与水、麦芽糖混合,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天,随后再加入脱脂奶粉、果糖、搅拌均匀经冷冻干燥,磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
进一步的,将每9.8kg-2.2kg的肽素加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天,随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥,磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
本发明还提供了一种肽素精华物,所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的:
将上述的肽素与水、麦芽糖混合,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后,再加入水搅拌,离心取上层清液待用;
向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖,经冷冻干燥磨成粉后即得到所述肽素精华物。
进一步的,将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖,在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后,加入3.6kg-4.4kg水,70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h,并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min,取上层清液,待用;
向上层清液中加入0.1%(m/v)的脱脂奶粉,以及果糖,经冷冻干燥干磨成粉后即得到所述的肽素精华物。
本发明还提供一种肽素精华物在治疗胃溃疡药物方面的应用。
进一步的,所述肽素精华物在治疗胃溃疡药物方面的应用体现在:对所述肽素精华物进行粉碎,将粉碎后的肽素精华物封装在胶囊中得到活菌型胃肠粉胶囊。
与现有技术相比,采用上述方案本发明的有益效果为:
本发明的肽素中的抗菌肽具有对有益菌群免疫的功能,能灭杀人体胃肠道内有害菌群,为有益菌群的繁殖提供空间,从而维持人体胃肠道微生态平衡。另一方面肽素中的胞外多糖(EPS)可以刺激免疫细胞,且有很好的抗氧化活性,加快人体新陈代谢,修复受伤组织细胞。
附图说明
图1中图A为副干酪乳杆菌LBP-YE01 10×100倍镜检图;
图1中图B为副干酪乳杆菌BNCC337289 10×100倍镜检图;
图1中图C为副干酪乳杆菌LPc-G110 10×100倍镜检图;
图1中图D为副干酪乳杆菌JLPF-131 10×100倍镜检图;
图2是检测平板MY1的抑菌和免疫结果;
图3是检测平板MY2的抑菌和免疫结果;
图4是谷胱甘肽DPPH清除率拟合图;
图5Bid连续经口灌胃给药2天对水浸拘束法致胃溃疡模型大鼠的胃液pH值的影响(n=10,x±s);
图7LBP-02A对水浸拘束法致胃溃疡模型大鼠胃病变的影响;
图9为受试物经口连续给药7天对阿司匹林致胃溃疡大鼠胃溃疡指数和胃酸pH的影响(n=10,)A.受试物对阿司匹林致胃溃疡大鼠胃溃疡指数的影响;B.受试物对阿司匹林致胃溃疡大鼠液pH的影响;##P<0.01vs.正常对照组,*P<0.05vs.模型组;
图10受试物对阿司匹林致胃溃疡模型大鼠胃病变的影响。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点等,下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种肽素,该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
该肽素是通过如下方法制备得到的:
S1、植物性培养物的制备
将650g大豆,350g糯米混合清洗后,烘干灭菌,粉碎后得到植物性培养基;其中各物质成分质量配比允许误差为10%;
将0.1g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到10g麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀,得到副干酪乳杆菌菌种调配液;
将副干酪乳杆菌菌种调配液与植物性培养基搅拌均匀,在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天,得到1510g植物性培养物。
S2、动物性培养物的制备
将酪蛋白水解物10g、牛肉粉10g、酵母粉10g;葡萄糖20g、吐温-80 1g混合后,加水定容至0.4L,并100℃下煮沸灭菌30min,得到动物性培养基;
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1%(V/m)的接种量接种在0.4L的动物性培养基中,在温度为37℃,搅拌速度为75rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天,得到动物性培养物。
S3、初级代谢产物的制备
将上述制备得到的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后,再加入0.1L无机盐液,再在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-6天,得到初级代谢产物;初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株;
其中,每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和余量水。
S4、肽素的制备
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在(15-40℃)厌氧条件下培养14天-16天,再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月,再在(25℃-40℃)厌氧条件下培养6天-8天,得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,即肽素。
将初级代谢产物转入(0℃-4℃)厌氧条件下培养至少三个月的过程中,副干酪乳杆菌LBP-YE01在冷胁迫下进入次级代谢状态,它们从周围吸收自身初级代谢后的营养物合成次级代谢产物来保护自身菌群,此时菌数量由1×109CFU/g以上迅速减少至1×107CFU/g以下,通过菌数量变化作为副干酪乳杆菌LBP-YE01进入次级代谢状态的判断依据。
在(25℃-40℃)厌氧培养6-8天中,副干酪乳杆菌LBP-YE01会消耗培养物中剩余的营养物质进行初级代谢发酵,菌数量会迅速上升至1×109CFU/g以上。
在低温(0-4℃)厌氧长期培养(至少三个月)中。副干酪乳杆菌LBP-YE01长时间发酵积累大量的次级代谢产物,该次级代谢产物可以在0℃-4℃厌氧环境中长期保藏。
实施例2
本实施例提供了一种肽素混合固体饮品,该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到:
将实施例1得到的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合,并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天,此过程为副干酪乳杆菌LBP-YE01的复壮扩培;随后再加入脱72g脂奶粉、10g果糖、搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干,磨成粉后即得到肽素混合固体饮品。
其中,加麦芽糖是为了给菌提供ATP能量,让菌迅速激活。加入脱脂奶粉、果糖作为副干酪乳杆菌保护剂。
通过实验可知,肽素混合固体饮品可以让酪乳杆菌LBP-YE01菌株在人体胃肠道内有很好的耐受性。该固体饮品中所含有的肽素对有益菌群免疫且能灭杀人体胃肠道内有害菌群,为有益菌群的繁殖提供空间,从而维持人体胃肠道微生态平衡。
实施例3
本实施例提供了一种肽素精华物,该肽素精华物是通过如下方法制备得到的:
将实施例1的肽素与1kg矿泉水、50g麦芽糖混合,并在15℃-40℃厌氧条件下培养7天后,再加入4kg矿泉水,75rpm/min下搅拌24h,并在7500rpm/min下离心8min,取上层清液,待用;
向上层清液中加入0.1%(m/v)的脱脂奶粉、以及果糖,经冷冻干燥或者烘干磨成粉后即得到肽素精华物。
通过实验发现,本实施例的肽素精华物具有很好的抑菌能力和抗氧化能力。
实施例4
本实施例提供一种活菌型肽素皮肤保护液,具体为:将每50g的肽素精华物,用水定容至1L,得到活菌型肽素皮肤保护液。
通过实验可知,该活菌型肽素皮肤保护液能够保护创面不受有害菌定植感染,同时使胞外多糖(EPS)刺激受伤细胞加速分裂繁殖,促进结痂脱落,快速修复伤口面,逐渐缩小创面。
实施例5
本实施例提供一种活菌型胃肠粉胶囊,具体为:将实施例3的肽素精华物粉碎后填充在胶囊中,就得到活菌型胃肠粉胶囊。
通过实验可知,活菌型胃肠粉胶囊对胃溃疡的改善作用,可降低模型动物的死亡率,且作用强度与受试物剂量有一定量效关系。
一、副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究:
(一)、材料
1.1菌株
表1菌株名称和来源
1.2培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础):
成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉、4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
MRS肉汤:
成分:酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2。
1.3主要仪器和设备
表2主要仪器和设备
1.4试剂
表3试剂
(二)、实验方法
2.1菌种活化、鉴定
在超净工作台里分别称取1g四种菌株(表1中的四种菌种),加9mL无菌生理盐水(10倍稀释),混悬均匀后进行梯度稀释,稀释倍数至105;分别吸取各菌株1mL 102、103、104、105倍稀释液加入无菌培养皿中,倾注MRS培养基19mL,冷却干燥后倒置于37℃培养箱中培养72H。挑选四种菌的典型副干酪乳杆菌菌落,镜检,观察形态。
2.2供试菌液制备
挑选四种菌株中典型副干酪乳杆菌单菌落,分别接种在100mLMRS肉汤中,37℃摇床培养48H,稳定传代培养三代,选择对数增长后期的菌液作为供试菌液。
2.3胃蛋白酶液的制备
用盐酸溶液、氢氧化钠溶液调节蒸馏水的pH至1.8,加入胃蛋白酶,使其质量浓度分别为1g/100mL,用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到胃蛋白酶液。
2.4胰蛋白酶液的制备
用0.4%氢氧化钠溶液调节0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8,加入胰蛋白酶,加等体积水适量混合,使其质量浓度为1g/100mL,用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,制得胰蛋白酶液备用。
2.5含牛胆盐MRS肉汤培养基制备
配制500mL MRS肉汤培养基,加入牛胆盐,使牛胆盐质量浓度为0.3g/100mL,蒸汽高压灭菌(121℃,20min)后备用。
2.6四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验
供试菌液以2%(v/v)的接种量接种于胃蛋白酶液中,在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解,分别在0、0.5h、1h、2h取样,采用平板计数法测定活菌数,将活菌数取对数值,计算存活率。
2.7四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验
取1mL供试菌液加入29mL胰蛋白酶液中混悬,在温度37℃振荡转速为120rpm下孵育酶解,在0h、2h、4h、6h处分别取样,采用平板计数法测定活菌数,将活菌数取对数值,计算存活率。
2.8四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验
供试菌液以2%(v/v)的接种量接种到10mL的MRS中,37℃培养18h,离心(4000r/min,30min),用无菌生理盐水洗涤,收集菌体,将收集到的菌体悬浮于牛胆盐MRS肉汤培养基中(0.3g/100mL),于37℃,120rpm培养4h,分别在0h、2h和4h取样,采用平板计数法测定活菌数,将活菌数取对数值,计算存活率。
2.9存活率计算
每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下:
式中:
Nt—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL);
N0—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。
(三)、结果分析
3.1四种菌株镜检结果
如图1所示,四种菌株的光学显微镜10×100倍放大倍数的镜检可以观察出,四种菌株都主要呈现出杆状,细长有弯曲的杆菌,部分呈球杆状,排列成栅状或链状,无芽孢,呈布朗无规则运动无动力运动。四种菌株在MRS培养基中的菌落形态为白色,圆形,表面光滑湿润,边缘整齐、凸起的菌落,具有典型干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的形态。
3.2四种副干酪乳杆菌的胃蛋白酶耐受实验结果
表4耐受人工胃液试验结果(CFU·mL-1)
注:“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110,
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表4可以看出,四款菌株在人工胃液中均具有一定的耐受性,最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01,2H后菌落数存活率大于2.95%(10-1.53),其余3株菌副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110、副干酪乳杆菌JLPF-131存活率分别为0.87%(10-2.06)、2.04%(10-1.69)、1.86%(10-1.73)。以上结果说明,副干酪乳杆菌LBP-YE01在胃酸中更稳定。
3.3四种副干酪乳杆菌的胰蛋白酶耐受实验结果
表5胰蛋白酶耐受试验结果(CFU·mL-1)
注:“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110,
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表5可以看出,胰蛋白酶处理6H后,副干酪乳杆菌LBP-YE01、副干酪乳杆菌BNCC337289、副干酪乳杆菌LPc-G110的存活率均大于100%,说明胰蛋白酶对这三种菌没有明显的抑制作用,副干酪乳杆菌JLPF-131 6H后的存活率为89.12%,也没有很明显的降低。综上所述,四种菌株对胰蛋白酶均具有很好的耐受性。
3.4四种副干酪乳杆菌的牛胆盐耐受实验结果
表6耐受胆盐试验结果(CFU·mL-1)
注:“A”为副干酪乳杆菌LBP-YE01
“B”为副干酪乳杆菌BNCC337289
“C”为副干酪乳杆菌LPc-G110,
“D”为副干酪乳杆菌JLPF-131
由表6可以知道,四款菌株在含0.3%牛胆盐实验组中4H存活率都不是很高,但最能耐受的是副干酪乳杆菌LBP-YE01,4H后存活率为0.14%(10-2.84),副干酪乳杆菌JLPF-131存活率最低,4H后存活率为0.0048‰(10-5.32)。
通过上述实验可知,副干酪乳杆菌LBP-YE01在人体胃肠道内具有远超其它副干酪乳杆菌的生物活性。
二、肽素混合固体饮品在人工胃肠道内的活性检测研究
(一)、材料
1.1供试产品
实施例2的肽素混合固体饮品(规格:3g/包),深圳市肽素生物技术有限公司
1.2培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础)
成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
1.3主要仪器与设备
主要仪器与设备同副干酪乳杆菌LBP-YE01生物活性研究中用到的仪器和设备相同。
(二)、实验方法
2.1人工胃液的配制:
用盐酸、氢氧化钠调整蒸馏水的pH至2.5、3.5、4.5,加入胃蛋白酶,使其质量浓度分别为1g/100mL,用孔径0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后得到人工胃液。
2.2人工肠液的配制:
用0.4%氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8,加入胰蛋白酶,加等体积水适量混合,使其质量浓度为1g/100mL,用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,制得人工肠液备用。
2.3人工胆液的配制:
用0.4%氢氧化钠溶液调整0.1mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值至6.8,分别称取不同质量的牛胆盐溶解,用蒸馏水定容分装,使牛胆盐最终含量分别为0g/100mL、0.03g/100mL、0.3g/100mL、0.5g/100mL,制得人工胆液备用。
2.4人工胃肠液耐受性试验:
本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋,分别取1袋加入pH 2.5人工胃液、pH 3.5人工胃液、pH 4.5人工胃液人工肠液、无菌生理盐水至30mL,37℃恒温(60rpm)培养。在0、1.5、3h处分别对人工胃液样品取样,在0、1.5、3、4.5、6h处分别对人工肠液和生理盐水样品取样,采用菌落平板计数法测定样品中的菌落数,计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。
2.5耐胆盐试验:
取本公司同一批次生产的肽素混合物固体饮料成品4袋,分别取一袋加入人工胆液(0、0.03、0.3、0.5g/100mL),37℃恒温(60rpm)培养。分别在0、1.5、3、4.5、6h处取样,采用平板计数法测定样液中的菌落数,计算副干酪乳杆菌在不同时间的存活率。
2.6存活率计算:
每种副干酪乳杆菌在不同时间存活率的计算公式如下:
式中:
Nt—作用不同时间后的副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL);
N0—0h副干酪乳杆菌活菌数(CFU/mL)。
(三)、结果分析
在该固体饮品通过人体胃肠道的过程中,胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等因素会影响益生菌的存活性。所以益生菌要定植在人体肠道内发挥平衡菌群作用,就必须要有一定数量的菌能耐受胃和上部肠道的环境。固体饮料在人工胃肠道内的活性检测结果如表7。
表7肽素混合固体饮品在人工胃液、人工肠液、牛胆盐处理后的活菌数
人体胃液在正常状态下的pH值在2.5-3.5之间,流体食物通过人体胃部大约花费1h-2h,该固体饮料在pH2.5、3.5、4.5的人工胃液中培养6h的过程中,其副干酪乳杆菌活菌数较0h处稍有变换,变化不显著(P>0.05),说明该菌株在人工胃液中具有较好的耐受性。
如表7,本固体饮品在人工肠液作用6h的过程中,其活性较0h处无显著变化(P>0.05),说明该菌株在人工肠液中具有较好的耐受性。
小肠胆盐浓度的波动范围通常为0.03-0.3g/100mL,食物一般会在小肠中停留1-4h,由表7可知,胆盐对本固体饮品副干酪乳杆菌的生长有一定的抑制作用,且随胆盐浓度的增加,抑制作用增强。
在含有0.03g/100mL胆盐的固体饮品中,随作用时间的延长,活菌数成增长趋势。在含0.3、0.5g/100mL胆盐的固体饮品中作用1.5h后,活菌数均显著降低(P<0.05)。1.5h以后,随作用时间的延长,菌落总数缓缓增加,在作用4.5h后保持可较高的存活率(95%-85%)及活菌数(>106CFU/mL)能够满足益生菌发挥有效作用对菌浓度有要求(一般为106-109cFU/mL),说明该菌株对人体生理浓度范围内的胆盐有较好的耐受性。
肽素固体饮品中副干酪乳杆菌能耐受人体胃肠道的生存环境。
三、肽素固体饮品同诺氟沙星的抑菌与免疫实验
原理:在实验过程中,处于静置恒温(37℃)培养过程中的检测平板,一方面指示菌开始生长,另一方面牛津杯中的粗提取液在重力作用下在检测平板中呈球面扩散,其所含抑菌物质的浓度随着其在培养基扩散距离的增大而减小。在抑菌物质的有效抑菌浓度下,当指示菌为病原菌时,抑菌物质会抑制病原菌的生长,当指示菌为有益菌时,抑菌物质不会抑制有益菌的生长,即对有益菌免疫。而诺氟沙星对细菌具有广谱抗性,因此无论是有益菌还是病原菌,抗生素诺氟沙星对其都具有抑制作用。
(一)、材料
1.1样品
5g肽素固体饮品、1粒诺氟沙星,0.1g/粒。
1.2菌种
短双歧杆菌BNCC185972(有益菌)、金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)。
1.3培养基
MRS培养基(改良MRS培养基基础):
成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、酵母膏粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、琼脂15.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL、pH 6.2±0.2。
MRS肉汤:
成分:酪蛋白酶消化物10.0g、牛肉膏粉10.0g、酵母膏粉4.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.08g、蒸馏水1000mL、pH 5.7±0.2
营养琼脂NA:
成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。
营养肉汤NB:
成分:蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.2±0.2。
1.4主要仪器与设备
FA2204B电子分析天平上海佑科仪器仪表有限公司
DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SW-CJ-1FD垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司
SPX-250生化培养箱上海申贤恒温设备厂
723CRT可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司
ZD-85A数显气浴恒温振荡器常州普天仪器制造有限公司
H2-16台式高速离心机湖南可成仪器设备有限公司
(二)、实验方法
2.1预处理
2.1.1指示菌的制备
有益菌短双歧杆菌制备:在MRS肉汤中接种活化后短双歧杆菌BNCC185972,摇床37℃,200rpm,培养72h。其中短双歧杆菌活菌数为109cfu/mL。预先进行菌落计数,建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系;将短双歧杆菌培养液调整至合适的吸光度值,使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
病原菌金黄色葡萄球菌制备:将金黄色葡萄球菌ATCC 6538接种于5.0mL NB培养基的试管,36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养;取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管,36℃±1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养;取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶,36℃±1℃、200r/min±1min培养至金黄色葡萄球菌的稳定期,作为第三代培养液。预先按照GB4789.2进行菌落计数,建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系;将第三代培养液调整至合适的吸光度值,使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
2.1.2抑菌物质粗提取
称取肽素固体饮品5g,加入15mL无菌生理盐水。分别37℃,60rpm/min恒温振荡2H,振荡后的发酵液经离心(8000r/min)8min,得到上清液,即为含有肽素物质的上清粗提取液。
2.2抗生素制备
诺氟沙星,国药准字H14023224,规格0.1g。取一颗诺氟沙星胶囊去除胶囊壳倒入50mL水中,震荡摇匀1H。
2.2.1检测平板制备
指示菌为短双歧杆菌的检测平板制备:将配制的MRS培养基加热溶解,冷却至45℃-50℃,将制备的短双歧杆菌菌悬液按照1%的添加量加入MRS培养基中,充分混合均匀,量取20mL.倾倒入灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平,待其凝固后备用。记为检测平板MY1。
指示菌为金黄色葡萄球菌的检测平板制备:将配制的NA培养基加热溶解,冷却至45℃-50℃,将制备的金黄色葡萄球菌菌悬液按照1%的添加量加入NA培养基中,充分混合均匀,量取20mL.倾倒入灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平,待其凝固后备用。记为检测平板MY2。
2.2.2牛津杯放置
采用符合中国药典药品检验操作规范,适用于抗生素效价抑菌圈培养实验的牛津杯(内径6mm,外径7.8mm,高10mm)。在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在检测平板上,每皿均匀放置两盏牛津杯,轻轻按压。
2.2.3抑菌圈培养
在指示菌为短双歧杆菌的平皿MY1上的两盏牛津杯中,在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液,记为MY1a,在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液,记为MY1b。
在指示菌为金黄色葡萄球菌的平皿MY2上的两盏牛津杯中,在第一盏牛津杯中加入220μL肽素上清粗提取液,记为MY2a,在第二盏牛津杯中加入220μL诺氟沙星溶液,记为MY2b。
将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h,取出检测平板,将检测平板MY1恒温(37℃)静置培养48h,检测平板MY2恒温(37℃)静置培养16-20H,测量抑菌圈大小。
2.3抑菌性评价标准
抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用,15mm>抑菌圈≥10mm为中度抑菌,抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。
(三)、结果与分析
通过如图2和图3的展示结果可知,肽素固体饮品中所含的抑菌物质对有益菌的生长无抑制作用(如图2中的牛津杯MY1a),对病原菌具有高度抑菌作用(如图2中的牛津杯MY1b),抗生素诺氟沙星对有益菌和病原菌均具有高度抑菌作用(如图3中的牛津杯MY2a、MY2b)。
四、肽素精华物抑菌测试
(一)、材料
1.1检测样品
肽素精华物1g
1.2指示菌种
金黄色葡萄球菌ATCC 6538(有害菌)
1.3培养基
营养琼脂NA
成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH7.3±0.2。
营养肉汤NB
成分:蛋白胨10.0g、牛肉浸粉3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.2±0.2。
1.4主要仪器与设备
FA2204B电子分析天平上海佑科仪器仪表有限公司
DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SW-CJ-1FD垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司
SPX-250生化培养箱上海申贤恒温设备厂
723CRT可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司
ZD-85A数显气浴恒温振荡器常州普天仪器制造有限公司
H2-16台式高速离心机湖南可成仪器设备有限公司
(二)实验方法
2.1样品制备
称取肽素精华物1g,加入1mL无菌生理盐水,充分震荡溶解后作为待测样品。
2.2指示菌种活化
将指示菌接种于5.0mL NB培养基的试管,36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第一次传代培养;取第一代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管,36℃士1℃、200r/min±1min培养18h-24h进行第二次传代培养;取第二代培养液接种于5.0mL NB培养基的试管或50.0mL NB培养基的锥形瓶,36℃士1℃、200r/min±1min培养至指示菌的稳定期,作为第三代培养液。
2.3指示菌悬液制备
预先按照GB 4789.2进行指示菌的菌落计数,建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系;将第三代培养液调整至合适的吸光度值,使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL-5×108CFU/mL。
2.4检测平板制备
将配制的NA培养基加热溶解,冷却至45℃-50℃,将制备的指示菌菌悬液按照1%的添加量加入NA培养基中,充分混合均匀,量取20mL.倾倒入灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平,待其凝固后备用。
2.5牛津杯抑菌测试
在超净工作台内用无菌医用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放置在指示菌的检测平板上。在含有指示菌的检测平板中等距离安放4个牛津杯,轻轻按压,用移液器分别吸取待测样品4次,每次量取220uL,缓缓加入牛津杯中,将平板移入4℃冰箱中预扩散4-5h,取出检测平板,放入36℃±1℃恒温培养箱中正置培养15-16h,观察有无抑菌圈出现,如有则采用游标卡尺测定抑菌圈直径,每个抑菌圈沿不同方向测量3次,并记录平均值。
2.6抑菌性评价标准
抑菌圈直径的大小来反映出抑菌物质的抑菌效果。抑菌圈<10mm的为无抑菌作用,10mm≤抑菌圈<15mm为中度抑菌,抑菌圈≥15mm的为高度抑菌。
(三)、结果分析
3.1抑菌圈直径大小
表8抑菌圈直径大小
3.2抑菌性评价
肽素精华物平均抑菌圈直径为29.51mm,大于15mm,说明肽素精华物呈高度抑菌性。
五、肽素精华物DPPH法抗氧化测试
原理:
DPPH(11-Diphenyl-2picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2苦基肼基自由基。DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基,是一种暗紫色棱柱状结晶,分子式为C12H12NO6(M=394.32),其结构中含有3个苯环,1个N原子上有一个孤对电子。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色,并在515~520m范围有最大吸收峰。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂,孤对电子被配对,深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式,其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系,因而可以通过吸光度的变化进行定量分析,采用紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度,通过与谷胱甘肽分子的清除能力进行比较,采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化能力AO值,清除DPPH自由基是DPPH法的根据。
(一)试剂与设备
1.1试剂
还原型谷胱甘肽,天津市大茂化学试剂厂;
1,1-二苯基-2苦基肼基,上海阿拉丁试剂有限公司;
无水乙醇,天津市大茂化学试剂厂。
1.2设备
FA2204B电子分析天平,上海佑科仪器仪表有限公司;
723CRT可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司。
(二)、实验方法
2.1样品制备
2.1.1待测样品溶液制备
称取2g肽素精华物定容至20mL蒸馏水中得到100mg/mL的样品溶液,用蒸馏水将母液释至不同倍数,得到不同浓度的待测样品溶液。待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在35%~65%,且线性方程的R2≥0.9500。
2.1.2对照样品溶液制备
称取L-还原型谷胱甘肽10.0mg,蒸馏水定容至1.0mL,充分混合均匀,配制成10.0mg/mL的母液。以10倍的稀释倍数依次稀释得到不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液,根据DPPH溶液与不同数量级浓度的谷胱甘肽溶液的反应,计算DPPH清除率,寻找合适的谷胱甘肽溶液浓度,等差倍数稀释该浓度,谷胱甘肽溶液浓度的选择应使其清除率在35%~65%,且线性方程的R2≥0.9500。
2.1.3DPPH溶液的制备
称取5mg DPPH(精确至小数点后四位),加入少量无水乙醇,超声波充分溶解,无水乙醇定容至100mL(此过程全程避光)。
2.2测定
2.2.1对照组测定
取3组试管,分别编号为1、2、3号,每支试管中按照表9的组合添加试剂。
表9实际添加量
在1号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0mL谷胱甘肽溶液,作为试验组(As);
在2号试管中加入1.0mL谷胱甘肽溶液和3.0mL无水乙醇溶液,作为对照组(Ac);
在3号试管中加入3.0mL DPPH溶液和1.0ml待测样品溶液,作为空白组(Ab);
分别充分混合均匀后,室温避光反应30min,于波长517nm条件下,用紫外分光光度计测定其吸光度值(样品溶剂调零校准)。
2.2.2样品组测定
取3支试管,分别编号为1、2、3号,每支试管中按照表10的组合进行样品浓度稀释。稀释后的样品按表10添加,用待测样品肽素精华物溶液代替谷胱甘肽溶液,其它操作同2.2.1。待测样品浓度的选择应使其清除率在35%~65%,且线性方程的R2≥0.9500。根据线性方程求解当肽素精华物清除率P=50%时,对应的半数清除量EC50。
表10样品测定浓度梯度
2.2.3样品组测定
用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液,其它操作同2.2.1。
待测样品浓度的选择应使其清除率在35%~65%,且线性方程的R2≥0.9500。根据线性方程求解当肽素清除率P=50%时,对应的半数清除量EC50。
2.3试验数据处理
2.3.1清除率计算公式
式中:
P为清除率;
AS为待测溶液与DPPH溶液混合液的吸光度;
AC为待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度;
Ab为DPPH溶液与样品溶剂混合液的吸光度。
2.3.2抗氧化能力AO值计算
以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标,以清除率为纵坐标,建立待测溶液浓度自然对数值与清除率的线性方程(R2≥0.9500),计算半数清除量EC50,按式(2)计算多肽样品的抗氧化能力AO值。
式中:
AO为抗氧化能力;
EC50(S)为多肽样品的半数清除量,单位为毫克每毫升(mg/ml);
EC50(R)为谷胱甘肽的半数清除量,单位为毫克每毫升(mg/ml);
计算结果以平行测定值的算术平均值表示,保留三位有效数字。
(三)实验结果
3.1谷胱甘肽DPPH清除率试验结果,如图4,以及表11所示。
表11 L-还原型谷胱甘肽DPPH半数清除率测定
经过数据拟合,得到以EC为横坐标,以清除率为纵坐标的线性方程P(R)=0.216EC(R)-0.7588,且EC50(R)=5.8278,R2=0.9796≥0.95。
3.2肽素精华物DPPH清除率试验结果,如表12所示。
表12肽素精华物DPPH半数清除率测定
经过数据拟合,得到以EC为横坐标,以清除率为纵坐标的线性方程P(R)=0.2150EC(R)-1.2755,且EC50(R)=8.4561,R2=0.9663≥0.95。
3.3肽素精华素的抗氧化能力AO值
通过公式(2)计算得到肽素精华素的抗氧化能力AO值为1.45。
六、LBP02A活菌胃肠粉对水浸拘束法致大鼠胃溃疡影响的药效研究
本实验的目的是:采用水浸拘束法诱发大鼠实验性胃溃疡,经口灌胃给予受试药物(LBP02A活菌胃肠粉),通过测定胃液pH值、胃溃疡指数等指标,研究LBP02A活菌胃肠粉抗实验性胃溃疡的作用。
本实验的方法是:60只SD大鼠随机分组后,分别为:正常对照组、模型组、阳性药法莫替丁(4mg/kg/天)组、受试物700、350、175mg/kg/天。各组动物按应给予药液经口灌胃给药(Day 1),随后将大鼠固定水浸造模,12h后取出动物,并立即第二次给予相应药液,恢复正常饮食。次日(Day2)给药两次,于Day3(造模后36h)将大鼠解剖后摘取全胃,测定胃内pH值及溃疡指数,拍摄胃全景照片后用10%福尔马林固定胃组织,待做病理。
本实验的结果是:1)对胃液pH值的影响结果显示:与空白组比较,模型组的大鼠胃液pH值略有降低,但差异无统计学意义。法莫替丁4mg/kg/天及LBP02A高(700mg/kg/天)、中剂量(350mg/kg/天)组大鼠胃液pH值略高于模型组,但也无统计学的显著性差异;2)对胃溃疡指数的影响结果显示:模型组大鼠胃部粘膜可见多条条索状充血带,纵横交错、长短不一,且胃溃疡指数显著高于空白组(p<0.01),显示造模成功。与模型组比较,法莫替丁及LBP02A高、中剂量组大鼠胃溃疡指数显著降低(p<0.05或0.01),低剂量(175mg/kg/天)组大鼠胃溃疡指数虽明显低于模型组,但尚未出现统计学的显著性差异。
(一)药物信息
1.1受试物
名称:LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊是活菌型胃肠胶囊中的一种类型,其是将肽素精华物封装在胶囊中得到的。来源:深圳市肽素生物技术有限公司;性状:浅黄色粉剂,透明胶囊罐装;型号:LBP-02A;规格:350mg/粒;生产日期:2020.09.28。
受试物及其制剂准备将根据客户的要求。受试物由客户提供,客户应保证受试物的特性、纯度和稳定性。所有受试物根据客户提供的受试物储存条件进行储存。项目结束以后由上海美迪西生物医药股份有限公司保存或返还客户。实验人员应遵循实验设施要求的所有安全防护措施。
1.2阳性对照药
名称:法莫替丁片;来源:上海上药信谊药厂有限公司;性状:白色片剂;规格:20mg/片;批号:128200501;有效期至:2023.05.03;
1.3其他试剂。
A:异氟烷
来源:上海玉研科学仪器有限公司;性状:无色澄明液体规格:100mL;批号:S10010533;储存条件:RT;
B:生理盐水
来源:华裕(无锡)制药有限公司;性状:无色透明液体;规格:100mL;批号:19062801;储存条件:RT;
C:名称:甲醛,水溶液
来源:国药集团化学试剂有限公司;性状:无色透明液体;规格:500mL;批号:20190910;储存条件:RT。
(二)实验仪器及材料
2.1仪器
A.名称:旋涡混合器
型号:XW-80A 来源:上海青浦沪西仪器厂
B.名称:数码相机
型号:EOS 80D EF-S 18-200IS 来源:Canon
C.pH3.8-5.4精密试纸
型号:Q/HSSC 034-2016 来源:杭州试三科技有限公司
D.pH8.2-10.0精密试纸
型号:Q/HSSC 040-2016 来源:杭州试三科技有限公司
2.2材料及器械
器械:手术刀、持针器、剪刀、缝合针、弯镊、无齿镊等。
材料:医用纱布、酒精棉、3-0Prolene缝合线等。
(三)实验动物及饲养
3.1动物
品种和品系:SD大鼠;级别:SPF级;性别:雄性;来源:上海市计划生育科学研究所实验动物经营部;实验动物质量合格证号:20180006021147;实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006;实验动物使用许可证号:SYXK(沪)2015-0026;动物数量:60只;实验开始时动物年龄:6-8周;实验开始时动物体重:200-250;适应环境时间:3-5天;动物编号方式:每个鼠笼上均佩挂有项目编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种等信息的身份卡片,实验大鼠用尾根划线标号。
3.2环境
动物房的环境保持温度23±2℃,湿度40-70%,12h明暗交替。动物每笼5只饲养,每周更换两次垫料(玉米芯垫料,苏州埭川商贸有限公司)。
3.3食物和饮水
SPF大小鼠生长繁殖饲料Co60灭菌,购自北京科澳协力饲料有限公司。实验动物用水采用高压灭菌过滤水。
3.4动物选择和禁食
用于实验的动物将保持健康状况。实验过程中动物根据需要禁食不禁水。
(四)实验方法
4.1药物剂量的选择
LBP-02A活菌型胃肠肽粉的临床口服给药剂量为3500mg/60kg/日(58.3mg/kg/日),折合大鼠有效剂量约为350mg/kg/日;本实验设置3个剂量组,选择剂距为2倍,以临床折算剂量350mg/kg/日为中剂量,则受试物高、低剂量分别为700mg/kg/日和175mg/kg/日。每日给药2次,因此受试物高、中、低剂量组的单次给药剂量分别为350mg/kg、175mg/kg和87.5mg/kg。
4.2动物分组
将适应性饲养后的大鼠,根据Excel完全随机分组法分成6组,每组10只动物,具体分组情况如下:
表13动物分组与给药情况
4.3药物配制
A.受试物配制:
1)LBP-02A活菌型胃肠肽粉高剂量:单次剂量350mg/kg,5mL/kg,70mg/mL6粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至30mL,每日配置一次。
2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉中剂量:单次剂量175mg/kg,5mL/kg,35mg/mL
取3粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至30mL,每日配置一次。
3)LBP-02A活菌型胃肠肽粉低剂量:单次剂量87.5mg/kg,5mL/kg,17.5mg/mL
取2粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至40mL,每日配置一次。
B.法莫替丁配置:单次剂量2mg/kg,5mL/kg,0.4mg/mL
取1粒法莫替丁片,研碎,加水继续研磨,定容至50mL溶液即可。
4.4实验方法
动物称重并随机分组后禁食不禁水24h(Day 0)。24h后(Day 1),各动物按应给予药液经口灌胃给药(第一次),随后将大鼠固定在筛状金属板上,60°倾斜浸于水温18土1℃的水槽中,水面没过剑突处,空白对照组不做处理。水浸12h后取出动物,并立即第二次给予相应药液,恢复正常饮食。次日(Day 2)给药两次,实验共给药四次。于Day 3(造模后36h)将大鼠麻醉后剪开腹腔,结扎胃贲门和幽门,摘取全胃,测定胃内pH值。从腺胃部注入1%甲醛8mL于胃中,随后将胃浸泡于1%甲醛溶液中,20min后沿胃大弯剖开,生理盐水冲洗干净,观察并测定大鼠胃粘膜的损伤,并拍摄胃全景照片。
4.4.1胃液pH值测定
采用精密试纸,测定胃液的pH值。
4.4.2胃溃疡面积的测定
受损大鼠胃粘膜将呈现为条索状充血及出血带,纵横交错、长短不一。溃疡损伤情况以溃疡指数进行评估,评估方法为:若其宽度小于1mm者、条索状损伤长度大于1mm者,测量其长度,每mm计1分;若其宽度大于1mm者,将计分按宽度的mm数加倍,以长度x宽度评分作为溃疡指数进行统计。每只大鼠的溃疡指数为数个溃疡指数的总和。
(五)数据统计
实验数据以Mean士切表示,数据采用〖检验。p<0.05认为是有显著性差异,最终数据用Excel进行作图。
(六)结果
6.1给药后动物的一般临床症状观察
实验过程中,单次经口灌胃给予受试药后各大鼠均无明显肉眼可见异常。
6.2LBP02A对水浸拘束法致胃溃疡模型大鼠胃液pH值和胃溃疡形成的影响
对胃液pH值的影响结果显示:与空白组比较,模型组大鼠胃液pH值略有降低,但差异无统计学意义。4mg/kg的法莫替丁及LBP02A高、中剂量组大鼠胃液pH值略高于模型组,但也无统计学的显著性差异。
对胃溃疡指数的影响结果显示:模型组大鼠胃部粘膜可见多条条索状充血带,纵横交错、长短不一,且胃溃疡指数显著高于空白组(p<0.01),显示造模成功。与模型组比较,法莫替丁及LBP02A高、中剂量组大鼠胃溃疡指数显著降低(p<0.05或0.01),低剂量组大鼠胃溃疡指数虽明显低于模型组,但尚未出现统计学的显著性差异(表14,图5,图6)。
##P<0.01vs.空白对照组
*P<0.05,**P<0.01vs.模型对照组
6.3LBP-02A对水浸拘束法致胃溃疡模型大鼠胃整体观照片,如图7所示。
注:照片中显示的剂量为每日剂量。
(七)结论
在本次实验中,每天两次,连续2天给予受试物LBP02A后对水浸拘束法致胃溃疡模型大鼠的胃溃疡指数有明显的改善作用,并对胃液pH值也有一定的升高作用,但无统计学的显著性差异。
七、LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊对阿司匹林致大鼠胃溃疡影响的药效研宄
本实验的目的是:采用阿司匹林法诱导大鼠实验性胃溃疡,经口灌胃给予受试物(LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊),通过检测胃液pH值、胃溃疡指数和HE染色胃组织形态学变化,研究LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊抗阿司匹林实验性胃溃疡的作用。
本实验的方法是:选择体重240g左右的SD大鼠,经口灌胃给药,2次/日,连续7天。末次给药前(第7天)大鼠禁食24h,给药后2h除空白对照组外每只大鼠灌胃给予阿司匹林溶液(250mg/kg)。4h后大鼠麻醉后剪开腹腔,结扎胃贲门和夹闭幽门,摘取全胃,测定胃内pH值。从腺胃部注入1%甲醛8ml于胃中,随后将胃浸泡于1%甲醛溶液中,30min后沿胃大弯剖开,生理盐水冲洗干净,观察并测定大鼠胃黏膜的损伤,并拍摄胃全景照片;计算溃疡指数和溃疡抑制率。
本实验的结果是:1)LBP-02A活菌型胃肠肽粉给药7天对SD大鼠体重改变无影响;2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉低剂量(175mg/kg)有上调阿司匹林致胃溃疡大鼠胃液的pH值和改善其胃黏膜损伤的作用趋势。3)LBP-02A对胃内pH值的影响和溃疡的防治作用呈现出反向的量效关系,即:剂量越低,效果越好。
(一)药物信息
1.1受试物
名称:LBP-02A活菌型胃肠粉胶囊;来源:深圳市肽素生物技术有限公司;形状:浅黄色粉剂,透明胶囊罐装;型号:LBP-02A;规格:350mg/粒;生产日期:2020.09.28。
1.2阳性对照药
名称:法莫替丁片;来源:上海上药信谊药厂有限公司;性状:白色片剂;规格:20mg/片;批号:128200501;有效期至:2023.05.03。
1.3其他试剂
A.名称:阿司匹林肠溶片;来源:拜尔医药保健有限公司;性状:白色肠溶片剂;规格:100mg/片;批号:BJ51142;有效期至:2022.10.25。
B.名称:甲醛,水溶液;来源:国药集团化学试剂有限公司;性状:无色透明液体;规格:500mL/瓶;批号:20190910。
受试物及其制剂准备将根据客户的要求。受试物由客户提供,客户应保证受试物的特性、纯度和稳定性。所有受试物根据客户提供的受试物储存条件进行储存。项目结束以后由上海美迪西生物医药股份有限公司保存或返还客户。实验人员应遵循实验设施要求的所有安全防护措施。
(二)实验动物及饲养
2.1动物
品种和品系:SD大鼠;级别:SPF级;性别:雄性;来源:上海市计划生育科学研究所实验动物经营部;数量:60只;体重:约240g;实验动物质量合格证号:20180006019832;实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006;实验动物使用许可证号:SYXK(沪)2015-0026;适应环境时间:一周左右;动物编号方式:每个鼠笼均佩挂有项目编号、实验组别、实验人员姓名、动物品种和性别等信息的身份卡片,大鼠用尾根部画线标号。
2.2环境
动物房环境保持温度23±2℃,湿度40~70%,12h明暗交替。动物每笼5只饲养,每周更换至少两次垫料(玉米芯或木屑垫料垫料,苏州埭川商贸有限公司)。
2.3食物和饮水
饲喂SPF大小鼠生长繁殖饲料(Co60灭菌,购自北京科澳协力饲料有限公司)。实验动物用水采用高压灭菌过滤水。
2.4动物选择和禁食
用于实验的动物将保持健康状况,实验过程中动物自由饮水,根据实验需要禁食。
(三)其他实验材料
3.1数码相机
型号:EOS 80D EF-S 18-200IS;来源:Canon
3.2精密试纸
A.pH0.5-5.0精密试;型号:Q/HSSC 031-2016;来源:杭州试三科技有限公司。
B.pH5.5-9.0精密试纸;型号:Q/HSSC 037-2016;来源:杭州试三科技有限公司。
(四)实验方法
4.1药物剂量的选择
LBP-02A活菌型胃肠肽粉临床口服给药剂量为3500mg/60kg/日(58.3mg/kg/日),折合大鼠有效剂量约为350mg/kg/日;设置3个剂量组,选择剂距为2倍,以临床折算剂量350mg/kg/日为中剂量,则受试物高、低剂量分别为700mg/kg/日和175mg/kg/日。每日给药2次,因此受试物高、中、低剂量组的单次给药剂量分别为350mg/kg、175mg/kg和87.5mg/kg。
4.2动物分组
将适应性饲养后的大鼠,根据Excel完全随机分组法分成6组,每组10只动物。可见下表:
表15动物分组与给药情况
4.3药物配置
4.3.1受试物配置:
1)LBP-02A活菌型胃肠肽粉高剂量:单次剂量350mg/kg,5mL/kg,70mg/mL
取12粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至60mL;平均分装成两份,4℃保存备用,两日配置一次。
2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉中剂量:单次剂量175mg/kg,5mL/kg,35mg/mL
取6粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至60mL;平均分装成两份,4℃保存备用,两日配置一次。
3)LBP-02A活菌型胃肠肽粉低剂量:单次剂量87.5mg/kg,5mL/kg,17.5mg/mL
取3粒LBP-02A活菌型胃肠肽粉胶囊,去除胶囊壳收集所有内容物,加入少量水搅拌溶解,搅拌同时逐步多次少量加水,最后定容至60mL;平均分装成两份,4℃保存备用,两日配置一次。
4.3.2造模剂——阿司匹林配置
250mg/kg,5mL/kg,40mg/mL
取35粒阿司匹林肠溶片,研碎,加水继续研磨,定容至70mL混悬液即可。
4.4方法
4.4.1造模、给药及操作步骤
各组动物按应给予药液经口灌胃给药,2次/日,连续7天。末次给药前(第7天)大鼠禁食24h,给药后2h除空白对照组外每只大鼠灌胃给予阿司匹林溶液(250mg/kg)。4h后大鼠麻醉后剪开腹腔,结扎胃贲门和夹闭幽门,摘取全胃,测定胃内pH值。从腺胃部注入1%甲醛8ml于胃中,随后将胃浸泡于1%甲醛溶液中,30min后沿胃大弯剖开,生理盐水冲洗干净,观察并测定大鼠胃黏膜的损伤,并拍摄胃全景照片;计算溃疡指数和溃疡抑制率。
4.4.2胃液pH值测定
采用精密试纸,测定胃液的pH值。
4.4.3胃溃疡指数的测定
受损大鼠胃粘膜将呈现为条索状充血及出血带,纵横交错、长短不一。溃疡损伤情况以溃疡指数进行评估,评估方法为:若其宽度小于1mm者、条索状损伤长度大于1mm者,测量其长度,每mm计1分;若其宽度大于1mm者,将计分按宽度的mm数加倍,以长度x宽度评分作为溃疡指数进行统计。每只大鼠的溃疡指数为数个溃疡指数的总和。
(五)数据统计
实验数据以Mean±SD表示,用SPSS进行统计学分析,p<0.05认为是有显著性差异
(六)实验结果
6.1受试物对SD大鼠体重的影响
由体重数据可知,给药7天期间,各组大鼠体重均呈现逐渐增长趋势,且各组间未见明显差异;表明连续7天经口灌胃给予受试物LBP-02A活菌型胃肠肽粉(2次/日),对SD大鼠体重变化无明显影响(表16和图8)。
Day0:给药第一天,Day7为禁食后24h
6.2受试物对阿司匹林至胃溃疡大鼠胃液pH和胃溃疡指数的影响
对胃溃疡指数的影响结果显示:①模型组与空白组比,大鼠胃溃疡指数明显增加,表明过量阿司匹林诱导胃溃疡大鼠造模方法可靠,该胃溃疡大鼠模型稳定;②阳性药法莫替丁组与模型组比较,大鼠胃溃疡指数明显减少,表明抑制胃酸分泌能显著改善由过量阿司匹林导致的胃溃疡;③受试物组与模型组相比,350mg/kg和175mg/kg的剂量大鼠胃溃疡指数有减少的趋势,且低剂量效果更优,但高剂量700mg/kg溃疡指数未减少,甚至高于模型组。受试物对胃溃疡形成的影响呈现出反向的量效关系(表17,图9A)。
对胃液pH值的影响结果显示:①与空白组相比,模型组大鼠胃液pH略有下降;②阳性药法莫替丁组与模型组比较,大鼠胃液pH明显升高,接近空白组水平,符合法莫替丁抑制胃酸分泌的作用机制;③受试物组与模型组相比,低剂量175mg/kg有增加胃液pH作用的趋势,但中、高剂量700mg/kg、350mg/kg未见明显调节胃液酸碱度的作用。受试物对胃内pH值得影响也呈现出反向的量效关系(表17,图9B)。
结合对胃溃疡指数、胃内pH值的影响,受试物显示出剂量越低,溃疡面积越小、pH越高。这说明低剂量(175mg/kg)的受试物可有效地抑制胃内的酸度,保护胃粘膜。但随着用药剂量的升高,此种抑酸、保护胃粘膜的作用反而越差。
##P<0.01vs.正常对照组,*P<0.05vs.模型组
6.2受试物对阿司匹林致胃溃疡模型大鼠胃全景照片,如图10所示。
由大鼠胃全景照片可见,整体来看,空白组大鼠胃内壁黏膜光滑、红润,无异常损伤;模型组大鼠胃黏膜出现明显条索状及斑点状出血点,表明造模后有胃黏膜损伤产生;阳性药法莫替丁组大鼠胃损伤情况明显好转;LBP-02A活菌型胃肠肽粉高剂量700mg/kg组的大鼠胃黏膜损伤较严重,中、低剂量(350mg/kg和175mg/kg)组大鼠的胃黏膜损伤有好转的趋势。这与受试物反向的量效关系有关,见上述分析(表17)
(七)结论
1)LBP-02A活菌型胃肠肽粉给药7天对SD大鼠体重改变无影响;
2)LBP-02A活菌型胃肠肽粉低剂量(175mg/kg)有上调阿司匹林致胃溃疡大鼠胃液的pH值和改善其胃黏膜损伤的作用趋势。
3)LBP-02A对胃内pH值的影响和溃疡的防治作用呈现出反向的量效关系,即:剂量越低,效果越好。
LBP-02A活菌型胃肠肽粉可能通过调节胃液酸度来保护胃黏膜,从而发挥抗胃溃疡的作用,但疗效应该与其用药剂量关系密切,需进一步降低用药量研究受试物的量效关系,找出最佳的有效剂量。
在本说明书的描述中,术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表达不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的母体特征、结构、材料或特点可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (14)
1.一种肽素,其特征在于,该肽素是副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,所述副干酪乳杆菌LBP-YE01的保藏编号CGMCCNO.15360。
2.根据权利要求1所述的肽素,其特征在于,所述肽素是通过如下方法制备得到的:
将副干酪乳杆菌LBP-YE01的初级代谢产物先在15-40℃厌氧条件下培养14天-16天,再转入0-4℃厌氧条件下培养至少三个月,再在25-40℃厌氧条件下培养6天-8天,得到副干酪乳杆菌LBP-YE01的次级代谢产物,即肽素。
3.根据权利要求2所述的肽素,其特征在于,所述初级代谢产物是通过如下方法制备得到的:
将0.9kg-1.1kg的植物性培养物和动物性培养物混合均匀后,再加入0.09L-0.11L无机盐液,在15℃-40℃厌氧条件下培养14天-16天,得到初级代谢产物;所述初级代谢产物中含有至少1×109CFU/g副干酪乳杆菌LBP-YE01菌株;
每0.09L-0.11L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵1.8份-2.2份、乙酸钠4.5份-5.5份、硫酸镁1.18份-0.22份、硫酸锰0.045份-0.055份和余量水;
所述植物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于植物性培养基中进行培养得到的;
所述动物性培养物是将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种置于动物性培养基中进行培养得到的。
4.根据权利要求3所述的肽素,其特征在于,所述植物性培养物具体是通过如下方法制备得到的:
将585份-715份大豆,315份-385份糯米混合清洗后,烘干灭菌,粉碎后得到植物性培养基;
将0.09份-0.11份副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种加入到9份-11份麦芽糖和矿泉水中搅拌均匀,得到副干酪乳杆菌菌种调配液;
将所述副干酪乳杆菌菌种调配液与所述植物性培养基搅拌均匀,在15℃-40℃厌氧条件下培养4天-10天,得到植物性培养物。
5.根据权利要求3所述的肽素,其特征在于,所述动物性培养物具体是通过如下方法制备得到的:
将酪蛋白水解物9.5份-10.5份、牛肉粉9.5份-10.5份、酵母粉9.5份-10.5份;葡萄糖19.5份-20.5份、吐温-80 0.5份-1.5份混合后,加水定容至0.4L,并煮沸灭菌,得到0.4L的动物性培养基;
将副干酪乳杆菌LBP-YE01菌种以0.1%(V/m)的接种量接种在0.4L的所述动物性培养基中,在温度为36.5℃-37.5℃,搅拌速度为60rpm/min-90rpm/min的厌氧条件下发酵4天-10天,得到动物性培养物。
6.根据权利要求4所述的肽素,其特征在于,在制备所述植物性培养基时,采用的是650份大豆和350份糯米;烘烤温度为125℃-135℃,烘烤时间是为1.5h-2.5h。
7.根据权利要求5所述的肽素,其特征在于,在制备动物性培养基的过程中,具体是:将酪蛋白水解物10份、牛肉粉10份、酵母粉10份、葡萄糖20份、吐温-80 1份混合后,加水定容至0.4L,并煮沸灭菌,得到动物性培养基。
8.根据权利要求3所述的肽素,其特征在于,在所述初级代谢产物的制备过程中,向植物性培养物和动物性培养物的混合物中加入0.1L的无机盐液,并在15-40℃厌氧再培养4-6天后,转入0-4℃培养至少三个月以上;且每0.1L的所述无机盐液包括柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份和余量水。
9.一种肽素混合固体饮品,其特征在于,该肽素混合固体饮品通过如下方法制备得到:
将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天,随后再加入脱脂奶粉、果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干,磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
10.根据权利要求9所述的肽素混合固体饮品,其特征在于,将每9.8kg-2.2kg的肽素培养物加入到0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天,随后再加入64g-80g脱脂奶粉、9g-11g果糖搅拌均匀经冷冻干燥或者烘干,磨成粉后即得到所述的肽素混合固体饮品。
11.一种肽素精华物,其特征在于,所述肽素精华物是通过如下方法制备得到的:
将权利要求1-8任一项的肽素与水、麦芽糖混合,并在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后,再加入水搅拌,离心取上层清液待用;
向上层清液中加入脱脂奶粉、果糖,经冷冻干燥或者烘干磨成粉后即得到所述肽素精华物。
12.根据权利要求11所述的肽素精华物,其特征在于,将每9.8kg-2.2kg的肽素加入0.8kg-1.2kg水和45g-55g麦芽糖,在25℃-40℃厌氧条件下培养6天-8天后,加入3.6kg-4.4kg水,70rpm/min-80rpm/min下搅拌20h-28h,并在7000rpm/min-8000rpm/min下离心5min-10min,取上层清液,待用;
向上层清液中加入0.1%(m/v)的脱脂奶粉,以及果糖,经冷冻干燥磨成粉后即得到所述的肽素精华物。
13.一种权利要求11或12所述的肽素精华物在治疗胃溃疡药物方面的应用。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于,所述肽素精华物在治疗胃溃疡药物方面的应用体现在:对所述肽素精华物进行粉碎,得到活菌型胃肠粉,或将粉碎后的肽素精华物封装在胶囊中得到活菌型胃肠粉胶囊。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2021112374138 | 2021-10-22 | ||
CN202111237413.8A CN114015727A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种肽素、肽素混合固体饮品、肽素精华物及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115927482A true CN115927482A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=80057380
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111237413.8A Pending CN114015727A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种肽素、肽素混合固体饮品、肽素精华物及应用 |
CN202211210797.9A Pending CN115786404A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤切割伤药物方面的应用 |
CN202211220406.1A Pending CN116287008A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用 |
CN202211211806.6A Pending CN116479056A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤烧、烫伤药物方面的应用 |
CN202211210792.6A Pending CN115927482A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用 |
Family Applications Before (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111237413.8A Pending CN114015727A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种肽素、肽素混合固体饮品、肽素精华物及应用 |
CN202211210797.9A Pending CN115786404A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤切割伤药物方面的应用 |
CN202211220406.1A Pending CN116287008A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素胶囊及在治疗结肠炎药物方面的应用 |
CN202211211806.6A Pending CN116479056A (zh) | 2021-10-22 | 2022-09-30 | 一种肽素、肽素精华物及在治疗皮肤烧、烫伤药物方面的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (5) | CN114015727A (zh) |
-
2021
- 2021-10-22 CN CN202111237413.8A patent/CN114015727A/zh active Pending
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211210797.9A patent/CN115786404A/zh active Pending
- 2022-09-30 CN CN202211220406.1A patent/CN116287008A/zh active Pending
- 2022-09-30 CN CN202211211806.6A patent/CN116479056A/zh active Pending
- 2022-09-30 CN CN202211210792.6A patent/CN115927482A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116287008A (zh) | 2023-06-23 |
CN114015727A (zh) | 2022-02-08 |
CN116479056A (zh) | 2023-07-25 |
CN115786404A (zh) | 2023-03-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111254090B (zh) | 一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用 | |
CN106399154B (zh) | 乳酸杆菌益生菌cgmcc no.12422及在制备降脂药物中的应用 | |
WO2020063553A1 (zh) | 一种乳双歧杆菌bl-99及其应用 | |
CN110643524B (zh) | 一种具有胃肠道粘膜保护作用的复合益生菌制剂及其应用 | |
CN114574406B (zh) | 鼠李糖乳杆菌菌株wka55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品 | |
CN106434427A (zh) | 乳酸杆菌益生菌cgmcc no.12421及在制备降脂药物中的应用 | |
CN102824417B (zh) | 治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法 | |
CN116445360A (zh) | 一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 | |
CN116121154A (zh) | 一种乳明串珠菌及其应用 | |
JP6793380B2 (ja) | スクロース摂取による血糖値上昇を抑制する物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法 | |
Kolaylı et al. | Evaluation of anti-Helicobacter pylori activity and urease inhibition by some Turkish authentic honeys | |
CN111419829B (zh) | 和厚朴酚在抑制猪链球菌或其生物被膜中的用途 | |
CN105274032B (zh) | 一种拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌 | |
CN115927482A (zh) | 一种肽素、肽素胶囊及在治疗胃溃疡药物方面的应用 | |
CN110959792B (zh) | 一种含乳双歧杆菌的固体饮料及其应用 | |
CN116179413A (zh) | 一种缓解或改善念珠菌性阴道炎的益生菌组合物及其应用 | |
CN113967243B (zh) | 一种用于防治家禽腹泻的发酵中药制剂及其制备方法 | |
CN108653322A (zh) | 一种具有预防肿瘤转移的功能性保健品的组合物 | |
CN110025636A (zh) | 脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的组合物中的应用 | |
CN109757730B (zh) | 一种具有降血脂、血压以及血糖的组合物及其制备方法 | |
CN106754427A (zh) | 嗜蓝孢孔菌新菌株及其驯化方法 | |
CN113116938A (zh) | 四联活菌制剂及其应用 | |
CN116286537B (zh) | 具有辅助减肥作用的副干酪乳杆菌gf045及其应用 | |
CN118059188B (zh) | 一种长双歧杆菌sf-b-60后生元菌剂及其制备方法和应用 | |
TW201902498A (zh) | 醫藥組成物在製備用於抗幽門螺旋桿菌的藥物中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |