CN110025636A - 脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的组合物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的药物或食品中的应用，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。本发明的发明人发现含有荚膜多糖A的脆弱拟杆菌提取物具有增强免疫力的功能，为临床提供了一种适合人体服食的增强免疫力的良品。

Description

脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的组合物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的组合物中的应用。
背景技术
免疫力就是人体以免疫器官和免疫球蛋白为物质基础，抵抗疾病，维持机体生理平衡的能力。它能通过人体免疫系统来识别人体内正常与不正常的微生物，并通过免疫应答来排除内、外致病微生物和变性、衰老的细胞。免疫系统是机体健康的坚强保障，但是免疫系统又是很脆弱的。亚健康状态：免疫力低下是亚健康人群表现的重要特征，这几年亚健康人群成逐年上升趋势，特别是知识分子、领导干部、白领阶层等人群，亚健康人群人数超60％；人的不良生活方式和正常衰老都会导致免疫功能下降。所以免疫系统它需要不断的维护和加强，因此寻找具有良好免疫调节作用的药物已成为当代新药研制的发展方向之一。
多糖是一类天然高分子化合物，它是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究可以追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现。至50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。
荚膜多糖是细菌细胞壁外层的胶状物质,具有抗原性和特异性,可用于细菌鉴定,是细菌重要的毒力因子。荚膜多糖是一种分子量大、极性大的物质,对其进行分离纯化和结构解析要比单糖和寡糖更加复杂。目前，对脆弱拟杆菌荚膜多糖的结构解析和相关应用鲜有报道。
发明内容
基于此，本发明提供了一种脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)提取物的新应用。
具体技术方案如下：
脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的药物或食品中的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
所述的脆弱拟杆菌提取物可以进行预防性给药，或者作为治疗方法单独或与其它益生菌和/或益生材料一起给药。这种组合可以以单一制剂或分开的制剂，同时或不同时，使用相同或不同的给药途径进行给药。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为60～80KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65～75KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65～70KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为30-85wt％。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为65-75wt％。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65-72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65-72℃搅拌25-35min，离心，收集第一上清液；
(2)将步骤(1)中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；
(3)在步骤(2)中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75-85v/v％，醇沉，离心，收集第二沉淀物；
(4)取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
在其中一些实施例中，步骤(1)中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80％。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。
在其中一些实施例中，步骤(4)包括：取所述第二沉淀物，加水配制成质量浓度为8-12％的混悬液，再加入质量浓度为8-12％的冰乙酸水溶液，加热至沸，搅拌反应1.5-2.5小时，调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
本发明还提供了一种增强免疫力的脆弱拟杆菌提取物。
具体技术方案如下：
一种增强免疫力的脆弱拟杆菌提取物，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为60～80KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65～75KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65～70KD。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为30-85wt％。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为65-75wt％。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65-72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65-72℃搅拌25-35min，离心，收集第一上清液；
(2)将步骤(1)中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；
(3)在步骤(2)中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75-85v/v％，醇沉，离心，收集第二沉淀物；
(4)取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
在其中一些实施例中，步骤(1)中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80％。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。
在其中一些实施例中，步骤(4)包括：取所述第二沉淀物，加水配制成质量浓度为8-12％的混悬液，再加入质量浓度为8-12％的冰乙酸水溶液，加热至沸，搅拌反应1.5-2.5小时，调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
本发明还提供了一种增强免疫力的药物或者食品。
具体技术方案如下：
一种增强免疫力的药物或者食品，所述药物或食品中含有上述的脆弱拟杆菌提取物。
所述药物为药物组合物，包含治疗有效量的上述的脆弱拟杆菌提取物和药物中可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂是药物领域内公知的。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的给药途径和标准药学实践来做出选择。该药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除它们以外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂。
药用可接受载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
在适当的情况下，所述药物组合物可以通过以下任何一种或多种方式给药：吸入给药、以栓剂或阴道栓剂的形式给药；以洗剂、溶液剂、乳膏剂、软膏剂或喷粉的形式局部给药、通过使用皮肤贴剂给药、以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂的形式或者以单独或与赋形剂混合在胶囊或卵状小体中的形式口服给药、或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂形式给药，或者它们可以进行肠胃外注射，例如海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射给药。为了肠胃外给药，所述组合物最好可以以无菌水溶液形式使用，其可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖以使得该溶液与血液等渗。为了含服或舌下给药，所述组合物可以以常规方法配制的片剂或锭剂的形式给药。
可能存在取决于不同给药系统的不同的组合物/制剂要求。举例来说，本发明的药物组合物可以配制成使用微型泵或通过诸如鼻腔喷雾剂或吸入型气雾剂或可吸收溶液剂的粘膜途径进行给药，或者将所述组合物配制成可注射形式通过例如静脉内、肌内或皮下途径进行肠胃外给药。或者，所述制剂可以设计成通过两种途径给药。
所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、发酵谷类食品。所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。所述食品为婴儿食品或宠物食品。
本发明中所述的药物和食品均可用于人或动物。
本发明发掘了脆弱拟杆菌新的用途，开拓了一个新的应用领域。本发明通过实验证明，脆弱拟杆菌提取物(含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A)具有增强人体免疫力的功能。本发明提供的脆弱拟杆菌提取物，对机体没有任何副作用，可以进行预防性给药，或者作为治疗方法单独或与其它益生菌和/或益生材料一起给药，从而预示了本发明提供的脆弱拟杆菌提取物具有很好的食用和药用前景，为临床提供一种适合人体服食的保健和预防良品。
附图说明
图1为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；
图2为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图3为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的1H谱；
图4为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的13C谱；
图5为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的COSY谱；
图6为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HSQC谱；
图7为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HMBC谱图；
图8为实施例1制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的化学结构式；
图9为实施例2中脆弱拟杆菌提取物对小鼠碳廓清实验的影响结果；
图10为实施例4中不同浓度DNCB体外刺激T细胞结果；
图11为实施例5中T辅助细胞分化检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
以下实施例中所用的脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilisZY-312)，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1脆弱拟杆菌提取物的制备
1、脆弱拟杆菌的发酵培养
将菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
选取单个菌落接种于胰蛋白胨肉汤中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物。
2、脆弱拟杆菌提取物的制备
(1)取脆弱拟杆菌菌泥(上述步骤1获得的沉淀物)200g，加入68℃超纯水750mL，溶解后，再加入体积分数为75％苯酚溶液750mL，混合均匀，保持68℃搅拌萃取30min，15000g离心20min，取上层清液。
(2)上层清液用等体积乙醚(1.5L)萃取去除苯酚，收集上层清液，重复萃取至无苯酚残留。水浴加热去除乙醚，收集水相。
(3)水相15000g离心20min后测定体积，加入无水乙醇，至乙醇终浓度为80％(体积分数)，4℃醇沉过夜(12小时)，15000g离心20min，取沉淀。
(4)称量步骤3)中的沉淀的质量，加入一定体积的去离子水将沉淀配制成质量浓度为10％的混悬液，搅拌混合均匀，加入质量浓度为10％的冰乙酸水溶液，加热至沸，持续搅拌反应2h后，调节pH至7.0，15000g离心20min，收集上清液。将所得上清液透析除盐(10KD透析袋)，冷冻干燥，得到脆弱拟杆菌提取物。
(5)称量30mg步骤(4)所述的脆弱拟杆菌提取物，溶于0.5mL D2O，加入1μl丙酮(1H，2.22；13C，30.89)定标。采用500MHz Bruker核磁共振波谱仪分析1H、13C、COSY、HSQC、HMBC谱(图3-7)，确证步骤(4)收集的脆弱拟杆菌提取物为荚膜多糖A，纯度约为70％。通过GPC(凝胶渗透色谱)分析，结果显示上述荚膜多糖A的重复单元分子量为781，单元重复数目n值为89，分子量约为70KD，分子式为-[C31N3O20H47]91-，化学结构见图8。
实施例2脆弱拟杆菌提取物对小鼠碳廓清实验的影响
1、实验动物及分组
本实施例使用50只SPF级昆明种雌性小鼠，每只实验用小鼠均分配有一个唯一编号。在对动物进行分组之前，应在鼠笼的标签上标注项目编号、种属/品系、性别、笼号及动物号。使用BioBook软件根据小鼠的初始体重进行随机分组5组，即空白对照组，阳性对照组，脆弱拟杆菌提取物低、中、高剂量组，每组小鼠10只。
2、剂量选择与受试物给予方式
在本实施例中，据小鼠口服推荐量，设本发明脆弱拟杆菌提取物低、中、高剂量组的剂量分别为1.25mg/kg.Bw、2.5mg/kg.Bw、5mg/kg.Bw。脆弱拟杆菌提取物低、中、高剂量组分别取实施例1制备的脆弱拟杆菌提取物冻干粉12.5mg、25mg、50mg加蒸馏水定容至100ml，分别给予受试小鼠灌胃，每天灌胃一次，灌胃体积为0.1ml/10g.bw，连续给药30天。阴性对照组予以等体积的蒸馏水，连续给药30天。阳性对照组予以0.1ml/10g.bw的同仁堂乌鸡人参口服液，连续给药30天。
3、小鼠碳廓清实验步骤
于给药完成当天，给小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1ml，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，加入到2mlNa2CO3溶液中，摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照，用722型分光光度计在600nm波长处比色测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数。
4、结果与分析
具体检测结果如图9所示，从图9可以看出，脆弱拟杆菌提取物高、中、低剂量组较阴性对照组的吞噬指数明显升高，并呈剂量依赖趋势，说明本发明提供的脆弱拟杆菌提取物能提高单核-巨噬细胞的吞噬能力，改善非特异性免疫应答。
实施例3脆弱拟杆菌提取物对迟发型变态反应的影响
1、实验动物及分组
参照实施例2的实验动物及分组。
2、剂量选择与受试物给予方式
参照实施例2的剂量选择与受试物给予方式。
3、迟发型变态反应(DTH)
于给药完成当天，每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm*3cm，然后用新鲜配制的2％DNCB溶液50μL均匀涂抹致敏，5天后，用1％DNCB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳耳背进行攻击。攻击24h后，小鼠经30mg/kg的舒泰麻醉后，每只小鼠分别取直径为5mm的左右耳，测量厚度、称量，用耳肿胀涨度(左右耳厚度之差)和耳增重量(小鼠5mm的左右耳重之差)表示DTH的程度。
数据以表示,用SPSS 13.0软件进行统计分析。具体结果见表1。
表1脆弱拟杆菌提取物对迟发型变态反应(DTH)的影响
注:与阴性对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。
通过观察发现，小鼠经2％DNCB溶液涂抹致敏，5天后，用1％DNCB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳耳背进行攻击，攻击24h后，可以看出各实验组小鼠耳厚均有增加。从检测结果可以看出，脆弱拟杆菌提取物低、中、高剂量组的耳肿胀度和耳增重量均低于阴性对照组(P＜0.05)，其中，中、高剂量组耳肿胀度和耳增重量明显低于阴性对照组(P＜0.01)。低、中、高剂量组耳肿胀度和耳增重量较阴性对照组呈现降低趋势，说明本发明提供的脆弱拟杆菌提取物能够调节细胞免疫，改善迟发型超敏反应中T细胞的活化。
实施例4脆弱拟杆菌提取物对DNCB诱导小鼠淋巴细胞转化的影响
1、实验动物及分组
参照实施例2的实验动物及分组。
2、剂量选择与受试物给予方式
参照实施例2的剂量选择与受试物给予方式。
3、DNCB诱导小鼠淋巴细胞转化实验
于给药完成当天，分别将各组小鼠的脾脏无菌取出，研磨制成单个细胞悬液，调整细胞浓度至3×106个/mL并铺入96孔板中。以不同浓度DNCB(0.1μg/mL，0.5μg/mL)体外刺激T细胞，置5％CO2，37℃的CO2孵箱中培养72h后，CCK-8法检测细胞增殖。
4、结果与分析
具体检测结果如图10所示。从图10检测结果可以看出：脆弱拟杆菌提取物高剂量组的细胞增殖活性较阴性对照组减弱，说明本发明提供的脆弱拟杆菌提取物能够减小T细胞对特异性抗原的免疫应答，降低淋巴细胞的转化。
实施例5T辅助细胞分化检测
本实施例分别将实施例3中各组麻醉后小鼠的脾脏无菌取出，研磨制成单个细胞悬液，将脾细胞重悬至2×106个，加入PMA和离子霉素刺激5小时，收获细胞并加入CD4-FITC，IFN-γ-APC，IL-17-PE荧光抗体孵育30min，采用流式细胞仪分析。具体检测结果如图11所示。
从图11的检测结果可以看出脆弱拟杆菌提取物高、中、低剂量组较阴性对照组Th1，Th17细胞水平下降，说明本发明提供的脆弱拟杆菌提取物可通过下调Th1，Th17细胞的增殖分化调节细胞免疫。
实施例6 NK细胞活性的测定
为检测NK细胞的活性，实验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)进行传代培养，调整细胞浓度至4×105个/mL。将实施例5制备的各组小鼠脾脏细胞悬液调整细胞浓度至2×107个/mL并铺入96孔U型板中，取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1，100：1)，置37℃、5％CO2的培养箱中培养4h。用LDH释放法检测，每个试验组重复2次，每个效靶比检测3次。具体检测结果见表2。
表2 NK细胞活性的测定结果
从表2结果可以看出，各试验组OD值随着效靶比增高，低、中、高剂量组的OD值随脆弱拟杆菌提取物剂量的增加而增大，说明本发明提供的脆弱拟杆菌能有效提高NK细胞活性。
综上所述可以发现，本发明提供的脆弱拟杆菌提取物可以有效提高机体的免疫功能。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.脆弱拟杆菌提取物在制备增强免疫力的药物或食品中的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为60～80KD。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65～75KD。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为65-75wt％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65-72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65-72℃搅拌25-35min，离心，收集第一上清液；
(2)将步骤(1)中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；
(3)在步骤(2)中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75-85v/v％，醇沉，离心，收集第二沉淀物；
(4)取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80％；及/或，
步骤(3)所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(4)包括：取所述第二沉淀物，加水配制成质量浓度为8-12％的混悬液，再加入质量浓度为8-12％的冰乙酸水溶液，加热至沸，搅拌反应1.5-2.5小时，调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。
9.一种增强免疫力的脆弱拟杆菌提取物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
10.一种增强免疫力的药物或者食品，其特征在于，所述药物或食品中含有权利要求9所述的脆弱拟杆菌提取物。
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