CN117645955A - 具有促进肠上皮细胞恢复作用的直肠真杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有促进肠上皮细胞恢复作用的一株直肠真杆菌BPB22及其应用。具体地，本发明提供了直肠真杆菌BPB22(Eubacterium rectale BPB22)在促进肠上皮细胞恢复作用等方面中的用途，还提供了一种用于治疗或缓解炎症性肠病的组合物，包括药品等。

Description

具有促进肠上皮细胞恢复作用的直肠真杆菌及其应用

技术领域

产品所属领域为生物医药和食品/保健品领域。具体地，涉及具有促进肠上皮细胞恢复作用的直肠真杆菌及其应用。

背景技术

炎症性肠病(IBD)是一类急性或慢性的非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)两大类。其发病率在世界范围内迅速升高，严重威胁着人类的生命健康和生活质量。已有许多研究发现IBD患者肠道菌群结构的重要特征是一些机会性致病菌丰度的增多和丁酸盐产生菌类群的减少。丁酸盐产生菌的代谢产物丁酸对宿主的健康具有多方面的贡献，包括作为肠道上皮细胞的能量来源、调节免疫响应、增殖和凋亡等。丁酸盐产生菌可能成为以菌群为靶点的IBD治疗的新突破口。

由于IBD病因的复杂性，目前临床治疗的目的是控制病情发展，诱导并维持缓解，防治并发症，提高患者生存质量。虽然常规的药物治疗在临床上十分必要，也成功改善了大多数IBD症状，但同时也伴随着严重的副作用，不仅如此，药物治疗并不能对患者的所有症状起缓解作用，常常出现药物治疗无效的情况。为了提高IBD的治疗效果，许多研究者提出，未来的IBD治疗需要重视通过调节肠道菌群来恢复宿主-微生物之间的平衡。

丁酸盐产生菌是人体肠道菌群的高丰度功能类群，具有极高的种属多样性，目前已被分离鉴定的丁酸盐产生菌菌株并不多，人体肠道内仍可能存在大量功能未知的丁酸盐产生菌。

因此，本领域急需寻找到新的可产生丁酸的丁酸盐产生菌及新的、安全有效的用于缓解或治疗炎症性肠病的方法或药物。

发明内容

本发明提供了一种新的、安全有效的用于治疗炎症性肠病的方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种直肠真杆菌，所述直肠真肝菌为直肠真杆菌BPB22(Eubacterium rectale BPB22)，保藏号为：CCTCC M 20232177，并且所述直肠真杆菌具有促进肠上皮细胞恢复作用。

在另一优选例中，所述直肠真杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:7所示或具有与SEQ ID NO:7至少99.5％的相同性。

在另一优选例中，所述的直肠真杆菌分离自人粪便。

在另一优选例中，所述直肠真杆菌通过发酵膳食纤维产生丁酸。

在另一优选例中，所述膳食纤维为复杂膳食纤维。

在另一优选例中，所述膳食纤维来源包括选自下组的植物原料：白扁豆、枸杞、红枣、苦瓜、莲子、荞麦、山药、燕麦、玉米须、薏仁、或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种具有炎症性肠病/肠道炎症治疗作用的组合物，所述组合物包括：(a)安全有效量的本发明第一方面所述的直肠真杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述代谢产物包括丁酸。

在另一优选例中，所述炎症性肠病包括：溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)、克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物选自下组：食品组合物、保健品组合物、药物组合物、饮料组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物还含有额外的具有促进肠上皮细胞恢复作用的成分。

在另一优选例中，所述的组合物为口服制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为：(i)液体剂；(ii)固体制剂；(iii)半固体剂。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。

在另一优选例中，所述的食品组合物包括乳液制品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述的食品组合物包括乳品、乳粉、或乳液。

在另一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述组合物含有1×10-1×10²⁰cfu/mL或cfu/g LpA2，较佳地1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL或cfu/g LpA2，按所述组合物的总体积或总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物中，含有0.0001－99wt％，较佳地0.1-90wt％所述的植物乳植杆菌和/或其代谢产物，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中所述组合物的质量为0.05-5g，较佳地为0.1-1g。

在另一优选例中，所述的组合物还含有其它益生菌和/或益生元。

在另一优选例中，所述的益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的益生元选自下组：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为固体粉剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为冻干粉剂。

在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的直肠真杆菌或其同类直肠真肝菌、或本发明第二方面所述的组合物的用途，用于制备药物，所述药物用于促进肠上皮细胞恢复或治疗炎症性肠病/肠道炎症。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第二方面所述的组合物的制法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的直肠真杆菌或其同类直肠真杆菌和/或其代谢产物与食品上或药学上可接受的载体混合，从而形成本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述代谢产物包括丁酸。

在本发明的第五方面，提供了一种生产方法，包括步骤：

(a)在适合培养的条件下，对本发明第一方面所述的直肠真杆菌进行培养，从而获得培养物；

(b)任选地，从所述培养产物分离直肠真杆菌菌体和/或其代谢产物；和

(c)任选地，将上一步骤中分离获得的直肠真杆菌和/或其代谢产物与食品上或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。

在另一优选例中，所述代谢产物包括丁酸。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗炎症性肠病的方法，给有需要的患者施用本发明第一方面所述的直肠真肝菌或本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述的施用包括口服。

在另一优选例中，所述的施用剂量为0.01-5g/50kg体重/天，较佳地，0.1-2g/50kg体重/天。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Eubacterium rectale BPB22菌株的ERIC PCR图谱。

图2显示了Eubacterium rectale BPB22菌株16S rRNA基因全长序列的进化树。

图3显示了Eubacterium rectale BPB22菌株的生长曲线。

图4显示了Eubacterium rectale BPB22菌株的发酵复杂膳食纤维产酸结果。

图5显示了DSS诱导结肠炎小鼠动物实验设计

图6显示了Eubacterium rectale BPB22菌株能够促进小鼠肠炎的恢复。A图为各组小鼠的体重变化量，B图为各组小鼠的疾病活动指数(DAI)评分，C图为各组小鼠的生存率，D图为实验第10天各组小鼠的结肠长度，E图为实验第10天各组小鼠的远端结肠组织形态学评分，F图为实验第10天各组小鼠的远端结肠HE染色切片照片(比例尺：200μm)。组间差异采用One-way ANOVA方法进行检验，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

图7显示了直肠真杆菌(Eubacterium rectale)BPB22菌株的扫描电镜照片(比例尺：5.00μm)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和实验，通过大量筛选，意外获得了一种具有促进肠上皮细胞恢复作用且具有缓解/治疗炎症性肠病的直肠真杆菌BPB22，即Eubacteriumrectale BPB22，其能够发酵复杂膳食纤维产生丁酸。本发明的实验表明，本发明的菌株Eubacterium rectale BPB22具有促进肠上皮细胞恢复的功效。将含有菌株BPB22的活性组合物对实验对象进行施用，能够有效缓解/治疗炎症性肠病/肠炎，在此基础上完成了本发明。

炎症性肠病和DSS诱导的肠炎动物模型

炎症性肠病(IBD)是一系列发生在消化道的异质性慢性炎症疾病的总称，其发病机理目前尚不明确，但被认为与肠道菌群结构失调密切相关。与健康个体相比，IBD病人的肠道菌群结构显著失衡，伴随着特定机会致病菌的丰度增加和有益菌类群含量的减少。许多不依赖于培养的研究都发现，IBD患者肠道菌群结构的一个显著特征就是丁酸盐产生菌类群丰度的减少，包括Roseburia hominis、Faecalibacterium prausnitzii和Eubacterium rectale等等。

葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium，DSS)诱导的肠炎动物模型是IBD相关研究中使用最为广泛的动物模型，能够较好的模拟人类溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)的临床症状。DSS是一种白色粉末状的肝素样硫酸多醣体，分子量由5000至1400000不等，在水中溶解度极高，溶解后会形成透明的溶液。1985年日本学者Ohkusa首次报道可以采用DSS建立起仓鼠溃疡性结肠炎模型，其后该模型因为发病情况与人类溃疡性结肠炎极为相似、造模条件和操作方法简单、造价便宜等优点被广泛的用于炎症性肠病发病机制的研究以及对IBD潜在治疗方法的评价。

DSS诱导的急性肠炎常常会使得小鼠的体重显著下降，此外还会出现黏液样便、血便、进食量减少、活动力降低甚至死亡等症状。结肠是DSS诱导急性炎症的一般发病部位，可以肉眼观察到的病理状况有结肠充血、水肿、变短等。光学显微镜下可以看到侵及粘膜层、粘膜下层和肌层的全结肠多灶性小溃疡和粘膜及粘膜下层的炎性细胞浸润等症状。DSS诱导的慢性炎症反应主要有粘膜纤维化、上皮增生及淋巴结肿大等病理情况。

本发明的直肠真杆菌及其应用

如本文所用，术语“本发明的直肠真杆菌”，“本发明的直肠真杆菌BPB22”，“本发明的人源直肠真杆菌BPB22”，“本发明的Eubacterium rectale BPB22”，“本发明的菌株BPB22”和“本发明的BPB22”可互换使用，均指本发明的人源直肠真杆菌BPB22，其保藏号为CCTCC M 20232177。

本发明的人源直肠真杆菌BPB22分离自人粪便中。菌株BPB22的生理特性如下：扫描电镜观察菌株为两端呈梭状的棒状杆菌，菌体大小约为0.4×(2-6)μm，无可见菌毛，没有鞭毛或其他附属物。

本发明提供了菌株BPB22在促进肠上皮细胞恢复和治疗肠炎或炎症性肠病等方面的应用。根据本发明的一个优选例，采用菌株BPB22对DSS诱导的肠炎小鼠进行灌胃处理，发现灌胃BPB22的小鼠的肠上皮细胞恢复情况显著。因此，所述菌株能够用以缓解或治疗肠炎或炎症性肠病。

组合物及其应用

本发明还提供了一种组合物，优选地，为药物组合物。所述组合物包括有效量的直肠真杆菌BPB22，在一个优选例中，所述组合物还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合；和/或选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

在一优选例中，所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。

在一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

在一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。

本发明药物组合物可以以药物片剂，针剂或胶囊的任一种形式给药，所述药物制剂包括赋形剂、药物允许的媒介和载体，这些物质可根据给药途径进行选择。本发明中药物制剂可进一步包含辅助的活性组份。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等都可用作本发明中药物组合物的载体、赋形剂或稀释剂等。

此外，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药物组合物可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药物组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。

另外，本发明的微生物可以常规方法制备的胶囊形式使用。例如，标准赋形剂和本发明的冷干微生物混合制成小球药丸，然后将药丸装填入明胶胶囊中。此外，本发明的微生物和药物允许使用的赋形剂如液体胶、纤维素、硅酸盐或矿物油等混合制作悬浮液或分散液，这种悬浮液或分散液可装入软的明胶胶囊中。

本发明的药物组合物可制成肠衣片供口服使用。本申请中的术语—“肠衣”，包括所有常规药物允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。木发明的肠衣能在合成胃酸如pH＝1的HCl溶液中在36-38℃维持2小时以上，并优选在合成肠液如pH＝7.0的缓冲液中在1.0小时内分解。

本发明的肠衣为以每片约16-30mg进行包衣，较佳地16-25mg，更佳地16-20mg进行包衣。本发明中肠衣厚度为5-100μm，理想的厚度为20-80μm。肠衣成分选自己公开知晓的常规聚合物。

本发明优选的肠衣由纤维素乙酸邻苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及异丁烯酸的共聚物(例如，含有40％以上异丁烯酸和含有甲基纤维素邻苯二甲酸羟丙酯或其酯类衍生物的异丁烯酸的共聚物)制备。

本发明中肠衣所使用的纤维素乙酸邻苯二甲酸酯的粘度为约45-90cp，乙酰含量17-26％，邻苯二甲酸含量30-40％。用于肠衣中的纤维素乙酸偏苯二酸酯粘度为约5-21cs，乙酞含量17-26％。纤维素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科达公司生产，可用于本发明中的肠衣材料。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷，分子量一般为20,000-130,000道尔顿，理想分子量为80,000-100,000道尔顿，羟丙基含量为5-10％，甲氧基含量为18-24％，邻苯二甲酰基含量为21-35％。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷为HP50，由日本Shin-EtsuChemidnl Co.Ltd.生产。HP50含有6-10％羟丙基，20-24％甲氧基，21-27％的丙基，其分子量为84,000道尔顿。另一种肠衣物质为HP55，HP55含有5-9％的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，18-22％甲氧基，27-35％的邻苯二甲酸，其分子量为78,000道尔顿。

本发明肠衣如下制备：使用常规方法将肠衣溶液喷雾到核心上。该肠包衣方法中所有溶剂为醇类(如乙醇)、酮类(如丙酮)、卤代烃化合物(如二氯甲烷)、或其组合物。将软化剂如二-正丁基邻苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到肠衣溶液中，其比例为1份包衣物对约0.05份或约0.3份软化剂。喷雾方法优选连续执行，所喷雾的料量可根据包衣所采用的条件进行控制。喷雾压力可随意调节，一般而言，能在平均1-1.5巴压力下获得理想的结果。

说明书中“药物有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。比如，在本发明中，可制备含有1×10-1×10²⁰cfu/ml或cfu/g(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/ml或cfu/g；更特别地，可含有1×10⁶-1×10¹¹cfu/ml或cfu/g)的直肠真杆菌BPB22和/或其代谢产物的制剂。

当用于制备药物组合物时，所用的直肠真杆菌BPB22或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1×10-1×10²⁰cfu/ml或cfu/g(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/ml或cfu/g；更特别地，可含有1×10⁶-1×10¹¹cfu/ml或cfu/g)的活性直肠真杆菌BPB22或发酵产生的活性成分。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

所述的直肠真杆菌BPB22或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合直肠真杆菌BPB22或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。

将本发明组合物施用给所述个体，每天给药1次或多次。给药剂量单位表示其形式上能分开且适用于人类或其他所有哺乳动物个体的剂量。每一单位含有药物允许的载体和有效治疗量的木发明微生物。给药量随病人的体重和肥胖严重程度、所包括的补充活性组份和所使用的微生物而变化。此外如可能，可分开给药，并且如需要可连续给药。因此，所述给药量不会对本发明造成限制。此外，本发明中的“组合物”不仅意味着药品而且表示可作为功能性食品和健康补充食品。在一个优选例中，所述组合物包括：饮料、食品、药品、动物饲料等。

在本发明的一个优选例中，还提供了一种食品组合物，它含有有效量的直肠真杆菌BPB22和/或其代谢产物，以及余量的食品上可接受的载体，所述的食物组合物的剂型选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在一优选例中，所述组合物的配方如下：

1×10-1×10²⁰cfu/mL的直肠真杆菌BPB22和/或其代谢产物；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。

在另一优选例中，所述组合物的配方如下：

1×10⁶-1×10¹¹cfu/mL的直肠真杆菌BPB22和/或其代谢产物；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。

直肠真杆菌BPB22的生产方法

通常，直肠真杆菌BPB22可以用常规方法制得。

在本发明中，提供了一种能够大规模生产直肠真杆菌BPB22的方法，具体地，包括如下步骤：

(a)在适合培养的条件下，对所述的直肠真杆菌BPB22进行培养，从而获得培养产物；

(b)任选地，从所述培养产物分离直肠真杆菌BPB22菌体和/或其代谢产物；和

(c)任选地，将上一步骤分离获得的直肠真杆菌BPB22菌体和/或其代谢产物与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。

在另一优选例中，所述条件包括合适量的复杂膳食纤维。

在另一优选例中，所述代谢产物包括丁酸。

缓解/治疗肠道炎症或炎症性肠病的方法

在另一优选例中，所述方法包括：摄取本发明的药物组合物、食品组合物、饮料组合物、或其组合。所述实验对象为人。

在另一优选例中，所述方法包括：摄取本发明的药物组合物、食品组合物、或动物饲料，或其组合。所述实验对象为动物，较佳地为鼠类，兔类。

本发明的主要优点：

(a)本发明的直肠真杆菌BPB22能够发酵复杂膳食纤维产生丁酸，能够促进炎症性肠病的恢复。

(b)本发明的直肠真杆菌BPB22及其产物能够显著改善肠上皮细胞的恢复情况。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

人源直肠真杆菌Eubacterium rectale BPB22菌株的分离鉴定

1.1菌株来源、分离和纯化

采集一名健康男性志愿者的新鲜粪便样品，于厌氧培养箱中加入十倍体积的YCFAGSC液体培养基(0.1％L-Cysteine)，涡旋震荡至充分混匀。200g离心5min，取上清用YCFAGSC液体培养基进行梯度稀释。吸取10^-6-10^-10这5个稀释梯度的稀释液各100μL涂布于YCFAGSC平板上，每个梯度重复涂布2块，37℃厌氧条件下倒置培养18h。选择菌落数量适中且形态清晰的平板，随机挑取96个单菌落于YCFAGSC平板上进行两次划线纯化。

1.2菌株的筛选及16S rRNA基因鉴定

将纯化后的各单菌分离物分别接种于YCFAGSC液体培养基中，37℃厌养条件下培养24h，提取其中DNA。

具体步骤为：

(1)将菌液9000g离心5min；将沉淀的菌体悬浮于475μL 1×TE缓冲液中(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)；

(2)加入25μL 50mg/ml的溶菌酶，置于37℃摇床1.5h；溶菌酶消化后加入50μL20％SDS和5μL蛋白酶(10mg/mL)，震荡混匀，55℃金属浴放置45min；

(3)分别用等体积的Tris-饱和酚、酚-氯仿-异戊醇(v：v：v，25：24：1)、氯仿-异戊醇(v：v，24：1)各抽提一次；

(4)加入1/10体积的乙酸钠(3mol/L，pH 5.2)调节离子浓度，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃冰箱沉淀过夜；

(5)15000g离心15min，200μL 70％乙醇轻轻颠倒洗盐2次；

(6)析出的DNA进行真空冷冻抽干，并溶于50μL 1×TE缓冲液中；加入10μLRNA酶(10mg/mL)，于37℃金属浴消化30min。

以上述DNA为模板，用丁酸盐产生菌类群特异性引物，对分离菌株进行初步鉴定筛选。用引物P1/Rrec630mR对样品进行PCR扩增，引物信息如下：

上游引物P1：5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’(SEQ ID NO:1)

下游引物Rrec630mR：5’-CCTCCGACACTCTAGTMCG AC-3’(SEQ ID NO:2)(M＝A orC)

PCR反应体系(25μL)如下：1×PCR buffer(Mg²⁺free)，2mM MgCl₂，P2、P3引物各10pmol,四种脱氧核苷酸(dNTP)各200mM，0.5U Taq DNA聚合酶，10ng的细菌DNA作为模板。PCR扩增程序如下：94℃变性5min；94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30cycles；最后72℃终延伸7min。

用丁酸盐产生菌的重要功能基因丁酰辅酶，A-乙酰辅酶、A转移酶基因特异性引物验证筛选结果，引物信息如下：

上游引物BCoATscrF：5’-GCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGGCAYATG-3’(SEQ ID NO:3)(I＝inosine，Y＝C or T，W＝A or T，S＝C or G)

下游引物BCoATscrR：5’-CCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3’(SEQ ID NO:4)(R＝Aor G，I＝inosine，N＝A,C,G,or T)

PCR反应体系(25μL)如下：1×PCR buffer(Mg²⁺free)，2mM MgCl₂，P2、P3引物各10pmol,四种脱氧核苷酸(dNTP)各200mM，0.5U Taq DNA聚合酶，10ng的细菌DNA作为模板。PCR扩增程序如下：94℃变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35cycles；最后72℃终延伸7min。

将挑选出来的29个阳性单菌落通过ERIC PCR在菌株水平上进行分型，引物信息如下：

上游引物ERIC1：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGAATCCA-3'(SEQ ID NO:5)

下游引物ERIC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGATGCG-3'(SEQ ID NO:6)

PCR反应体系(25μL)如下：1×PCR buffer(Mg²⁺free)，2mM MgCl₂，E1、E2引物各0.4mM,四种脱氧核苷酸(dNTP)各200μM，2.5U Taq DNA聚合酶，60ng的细菌DNA作为模板。PCR反应程序如下：94℃预变性7min；94℃变性30sec，52℃退火60sec，65℃延伸8min，共30cycles；最后65℃终延伸16min。

取400ng PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶中100V条件下电泳1h，使用UVI凝胶成像系统照胶。

结果显示，29个单菌落可以被分为7种ERIC型，其中BPB22菌株代表的E2型拥有分离物数量最多，BPB22菌株ERIC PCR产物电泳成像如图1所示。

培养得到的BPB22菌株的16S rRNA基因全长进行Sanger测序，核酸序列如下：

TAACATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCACTTTATTTGATTTCCTTCGGGACTGATTATTTTGTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCTTGTACAGGGGGATAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACGGTATCGCATGATACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATAAGATGGACCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCCATAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGTATTTCGGTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGATAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGCAGGCGGTGCGGCAAGTCTGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACTGCATTGGAAACTGTCGTACTAGAGTGTCGGAGGGGTAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACGATAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTTGGGAAGCATTGCTTCTCGGTGCCGTCGCAAACGCAGTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGTCTTGACATCCTTCTGACCGGTACTTAACCGTACCTTCTCTTCGGAGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTAGCCAGCGGTCCGGCCGGGCACTCTAGAGAGACTGCCAGGGATAACCTGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTAAACAAAGGGAAGCAAAGCTGTGAAGCCGAGCAAATCTCAAAAATAACGTCTCAGTTCGGACTGTAGTCTGCAACCCGACTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGAATGCCCGAAGCCAGTGACCTAACCGAAAGGAAGGAGCTGTCGAAGGCAGGCTCGATAACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT(SEQ ID NO:7)

利用NCBI数据库对BPB22菌株的16S rRNA基因全长序列进行比对分析，结果显示该菌株与Eubacterium rectale ATCC 33656的16S rRNA基因相似度达到99.80％。使用MEGA 6软件基于neighbor-joining方法构建系统发育树如图2所示，结果显示BPB22菌株属于Eubacterium rectale。

对菌株进行扫描电镜观察，结果如图7所示。本发明菌株呈现0.4×(2-6)μm的杆状结构，无可见菌毛，没有鞭毛或其他附属物。

实施例2 Eubacterium rectale BPB22菌株的生长曲线

测定该Eubacterium rectale BPB22菌株在YCFAGSC培养基中的生长曲线。

具体方法为：将-80℃冻存的Eubacterium rectale BPB22菌株于YCFAGSC平板上进行划线活化，挑取单克隆于5mL YCFAGSC液体培养基中培养过夜，按1％接种量(v/v)转入200ml YCFAGSC液体培养基中，静置培养。

在接种后2、4、6、8、10、12、14、24、36、48小时分别取出2mL培养液(取样前混匀)，用于测定体系600nm下的吸光值(OD600)，绘制成菌株生长曲线。

培养过程均在厌氧环境下进行，每个生长曲线测量时间点设置3个重复，测定结果表示为平均值±标准误。

生长曲线测定结果如图3所示，Eubacterium rectale BPB22在YCFAGSC培养基中的生长于12h达到平台期。

实施例3 Eubacterium rectale BPB22菌株的发酵产丁酸结果

根据GB5009.88-2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》方法，提取了不同天然植物原料，包括白扁豆(BBD)，枸杞(GQ)，红枣(HZ)，苦瓜(KG)，莲子(LZ)，荞麦(QM)，山药(SY)，燕麦(YM)，玉米须(YMX)和薏仁(YR)的可溶性和不溶性膳食纤维成分，获得20种膳食纤维提取物。

Eubacterium rectale BPB22菌株活化后按2％的比例接种300uL于15mL YCFAG培养基中，37℃厌氧静置培养36h。4℃，5000rpm离心20分钟收集菌体，用含有5％半胱氨酸的PBS缓冲液洗涤菌体，并再次离心以去除残留的培养基。用Basal YCFA培养基重悬后稀释至OD600为1.0左右，并按2％的比例将菌株单独接种到10mL不添加其他碳源(N)，或分别添加葡萄糖(G)或不同纤维提取物(S1-S10，I1-I10)的Basal YCFA培养基(共22种培养基)中。

发酵48h后，各取5mL发酵液于15mL离心管中，5000rpm离心20分钟，吸取1mL上清发酵液收集于96孔深孔板中，取上清液采用酚红法测定pH。取上清液200μL，加入0.5倍体积的50％硫酸将发酵液酸化，释放出分子形式的短链脂肪酸。再加入2倍体积的乙醚，涡旋震荡10s充分混匀，利用乙醚萃取短链脂肪酸。静置2min，4℃条件下进行14,000g×5min离心，取上层乙醚相上机检测。

在确定六种短链脂肪酸(SCFA)(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)的保留时间之后，利用梯度稀释的方法配制0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04μL/mL的六种SCFA标准品的混合水溶液，再与样品按同样的方法进行酸化、萃取和上机测定。

实验中使用Agilent6890气相色谱仪(Agilent Technologies，USA)，配合极性HP-FFAP色谱柱(0.25mm×0.25mm×30m，Agilent Technologies，USA)进行检测。

使用氦气做为载气。色谱柱初始温度为140℃，持续10min；以5℃/min的速度升高至165℃；再以25℃/min的速度升高至270℃，持续2min。进样口温度为250℃，检测器温度为280℃。

最终根据标准品绘制的标准曲线计算发酵液中短链脂肪酸含量。全程手动操作都在冰上进行，乙醚事先在冰上预冷。

发酵产酸测定结果如图4所示，初始YCFAGSC培养基中添加有除丁酸外的其他5种SCFA，BPB22生长24小时后，消耗掉了19.16mM乙酸，丁酸产量达到28.43mM。

此外，根据培养液的pH下降和丁酸产量的结果，BPB22能够利用除玉米须可溶纤维和玉米须不溶纤维外的其他18种复杂膳食纤维，且利用薏仁可溶纤维(S10，YRS)和山药可溶纤维(S7，SYS)时，丁酸产量都可以达到10mM。

实施例4 Eubacterium rectale BPB22菌株能够促进葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导的小鼠肠炎的恢复

4.1实验方法

本实施例使用无特定病原菌(SPF)级的C57BL/6雄性小鼠，小鼠饲养过程在上海交通大学实验动物中心SPF屏障内完成。动物实验设计如图5所示。

36只6周龄SPF级的C57BL/6雄性小鼠，经过2周适应之后，随机分为3组，每组12只，每2只放一笼饲养。

第一组动物每天灌胃200μL(含2×10⁹个菌体细胞)的BPB22，后两组则每天灌胃200μL的厌氧PBS。

在实验0天到7天，前两组动物的饮水为含2.5％(w/v)DSS的水溶液，记为DSS+BPB22组和DSS模型对照组；另一组的饮水为纯水，记为PBS健康对照组。

实验第8天开始，所有动物的饮水均换成纯水，灌胃则按前一阶段的方法继续进行。灌胃操作保持一致，由一人进行。

每天观察小鼠腹泻情况，记录粪便和肛门出血情况，然后根据本领域已知的方法计算疾病活动指数(DAI)，数值为体重下降、腹泻、便血三项指标打分的平均值。在实验7天和10天分别对各组一半数量的动物进行解剖采样。

Eubacterium rectale BPB22灌胃液的制备流程如下，菌株培养过程均在厌氧环境中进行：将-80℃冻存的Eubacterium rectale BPB22菌株于YCFAGSC平板上进行划线活化，挑取单克隆于5mL YCFAGSC液体培养基中培养过夜，按1％接种量(v/v)转入400mlYCFAGSC液体培养基中培养至12h；菌液5000g离心10min，去除培养基上清；厌氧PBS缓冲液重悬菌体，5000g离心10min，去除上清，留下菌体；用厌氧PBS缓冲液重悬菌体，充分混匀后冻存于-80℃备用。

在整个实验过程中，DSS+BPB22组小鼠的体重变化量与DSS组始终无显著差异，疾病活动指数在实验第8天显著低于DSS组，最终全部14只动物无一死亡(图6A，B和C)。

DSS停药3天后，即实验第10天，持续灌胃BPB22的小鼠结肠长度虽然仍显著低于PBS组，但已经显著高于DSS组(图6D)。

结肠切片的HE染色后的肠上皮细胞形态观察发现，DSS停药3天后，DSS+BPB22组动物的肠上皮细胞恢复情况显著优于DSS组(图6E，F)。

综合以上实验结果，证实灌胃Eubacterium rectale BPB22菌株能够促进DSS诱导的小鼠肠炎的恢复。

保藏证明

本发明的直肠真杆菌BPB22(Eubacterium rectale BPB22)，于2023年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉市)，保藏号：CCTCC NO.M 20232177。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种直肠真杆菌，其特征在于，所述直肠真肝菌为直肠真杆菌BPB22(Eubacteriumrectale BPB22)，保藏号为：CCTCC M 20232177，并且所述直肠真杆菌具有促进肠上皮细胞恢复作用。

2.如权利要求1所述的直肠真杆菌，其特征在于，所述直肠真杆菌通过发酵膳食纤维产生丁酸。

3.如权利要求2所述的直肠真杆菌，其特征在于，所述膳食纤维来源包括选自下组的植物原料：白扁豆、枸杞、红枣、苦瓜、莲子、荞麦、山药、燕麦、玉米须、薏仁、或其组合。

4.一种具有炎症性肠病治疗作用的组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)安全有效量的权利要求1所述的直肠真杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上或药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物选自下组：食品组合物、保健品组合物、药物组合物、饮料组合物、或其组合。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有额外的具有促进肠上皮细胞恢复作用的成分。

7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为：(i)液体剂；(ii)固体制剂；(iii)半固体剂。

8.一种权利要求1所述的直肠真杆菌或其同类直肠真肝菌、或权利要求4所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于促进肠上皮细胞恢复或治疗炎症性肠病。

9.一种权利要求4所述的组合物的制法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求1所述的直肠真杆菌或其同类直肠真杆菌和/或其代谢产物与食品上或药学上可接受的载体混合，从而形成权利要求4所述的组合物。

10.一种生产方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合培养的条件下，对权利要求1所述的直肠真杆菌进行培养，从而获得培养物；

(b)任选地，从所述培养产物分离直肠真杆菌菌体和/或其代谢产物；和

(c)任选地，将上一步骤中分离获得的直肠真杆菌和/或其代谢产物与食品上或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。