JP4489315B2 - 抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を用いた発酵乳の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を用いて発酵乳製品を製造する際に、抗体の力価を維持するとともに一般の微生物及び酵母の汚染を防止することができる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、胃潰瘍の原因菌として知られているヘリコバクターピロリに対する抗原を産卵鶏に注射し、この抗原から卵黄に移行した抗体を有効成分として使用する研究が活発に行われている。日本国特開平４−２７５２３２号は、ヘリコバクターピロリ菌体破砕液を抗原として生成された抗体を有効成分とする胃潰瘍、十二指潰瘍の予防食品を開示する。韓国特許公告９８−８１３２３号は、ヘリコバクターピロリウレアーゼとフラジェラ（鞭毛）に対して免疫化された卵黄抗体を０．０１〜０．１重量％含有し、乳酸バクテリア、エンテロコッカス（腸球菌）、イースト及びバシラス属のなかから選択された有機体を含有する胃炎、胃潰瘍及び十二指潰瘍の予防、治療用の薬学的組成物について開示する。しかし、前記特許などから作られた卵黄抗体を発酵乳、飲料などの製品に用いる場合、工程上実施される熱処理により特定抗体の力価が著しく減少するため、卵黄抗体による胃潰瘍、胃炎、十二指潰瘍の予防と治療効果を期待することは難しい。このような卵黄抗体の貯蔵中の力価維持のための研究としては、シミズなどが、貯蔵又は工程上抗体の力価維持のため、３０〜５０重量％の蔗糖又は砂糖を添加し７５〜８５℃で１５分間熱処理したと報告している（Ｊ．ｏｆ ｆｏｏｄ ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，５９（４），７６３〜７７２）。
【０００３】
一方、鶏卵の発酵乳に対する適用は、１９８４年リンとカニンガムが４７．４％の卵白にクエン酸と２８．４％のアルカリ処理大豆油、１９．０％の脱脂乳を殺菌して混合し、これにブドウ糖、蔗糖、キサンタンガム、バニラ抽出物などを添加した後、ラクトバシルスブルガリカスとストレプトコッカスサーモフィルスを接種してヨーグルトを開発した。１９８４年カニンガムなどは、低脂肪均質乳を殺菌、冷却し、これに、５４．４℃で２回殺菌した卵白アルブミンを均質化して混合した後、ラクトバシルスブルガリカスとストレプトコッカスサーモフィルスを混合、接種し、４０℃で６時間培養してヨーグルトを製造した。また、１９８３年キムなどは、５８℃、３０分の熱処理条件で均質全卵液にブドウ糖、蔗糖、乳糖を添加し、乳酸菌を添加してｐＨを４．８までも低めて発酵乳を製造した。日本国の場合、特許公告（公告番号：昭５７−５４１１３）には、卵白のリゾチームを除去した乾燥滅菌卵白を牛乳に溶解し、ブドウ糖を添加した後、乳酸菌を接種して発酵乳を製造するという技術が開示されている。韓国の特許としては、ユなど（公告番号：９７−５７４）が全卵液、卵黄液、卵白液に乳糖、砂糖、水を混合し殺菌した後、ラクトバシルスアシドフィルス、ビフィドバクテリウムロンガム、ストレプトコッカスサーモフィルスを混合、接種して発酵させる乳酸菌発酵飲料の製造方法を開示した。以上のように、鶏卵を用いる発酵乳の開発は、全卵液、卵白、卵黄の希釈液に、発酵を促進させるための糖、アルカリ処理大豆乳、脱脂乳などを混合して発酵乳を製造し、発酵乳の層分離現象など、物理的安定性を解決するため、キサンタンガムのような安定剤を使用した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は鶏卵の希釈液に乳酸菌成長促進物質を添加した後、乳酸菌を接種して培養する従来の技術とは異なり、既存の発酵乳工程に、抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を添加する方法に関し、より詳細には発酵乳の製造工程において、抗ヘリコバクターピロリ抗体力価を維持するのみなく、一般の微生物及び酵母の汚染も防止するための殺菌方法を提供しようとするものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、ヘリコバクターピロリ抗原により免疫化された卵黄抗体を含む卵黄液を発酵乳の製造に適用するに際し、これらが持っている抗体力価を維持するとともに一般の微生物及び酵母の汚染を防止することができる殺菌方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはヘリコバクターピロリを抗原として、産卵鶏から抗体の入っている免疫卵を生産した。こうして生産された免疫卵から抗体を含有している卵黄部分のみを分離して発酵乳の製造に使用しようとした。そして、卵黄液を発酵乳製品に添加するに際し、一般の微生物と酵母の汚染を防止し、熱処理過程で抗体力価の減少を防止するための殺菌条件を研究して本発明を完成することになった。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の望ましい一実施例によると、抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液に糖を添加して抗体力価を維持し、殺菌熱処理して一般の微生物及び酵母の汚染を防止した後、この殺菌処理された卵黄液を乳酸菌培養液に混合し撹拌することで発酵乳を製造する。抗体力価を維持するために使用する望ましい糖は砂糖、高果糖、ガラクトオリゴ糖からなる群から選択されるが、より望ましくは砂糖である。
【０００８】
前記卵黄液に添加される糖の含量は重量比１０〜３０％が望ましい。また、前記殺菌熱処理は、６０〜６５℃で２〜１０分間１〜３回にわたり行われることが望ましい。
【０００９】
本発明の望ましい実施例によると、前記乳酸菌培養液に添加される熱処理された卵黄液の含量は重量比で０．１〜１０％である。
【００１０】
抗原の準備
胃潰瘍の原因菌として知られたヘリコバクターピロリを超音波で破砕した後、遠心分離して上澄み液を得た。この上澄み液を超遠心分離して細胞膜を沈殿させた後、蒸留水に懸濁させて抗原として使用した（実施例１参照）。
【００１１】
抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液の製造
外膜蛋白質抗原を用いて４０週齢の白色レグホンに免疫を実施した。アジュバント、乳化剤、抗原を９：１：８の割合で混合して乳化した後、十分な抗体が得られるまで２週間隔で４回にわたって筋肉注射を行った。鶏卵に移行した特異的抗体力価が十分に上昇した段階の鶏卵を収集した。収集した免疫卵を割卵基を経て卵白と卵黄に分離し、分離した卵黄をフィルタで濾過した後、７０〜８０ｋｇ／ｃｍ２に均質化させて卵黄液を製造した。こうして製造された卵黄液の抗ヘリコバクターピロリ抗体力価はおよそ５，７００程度であった（実施例２、３参照）。
【００１２】
糖濃度と殺菌温度による抗体力価
卵黄液の貯蔵性を高め、抗体力価の減少を防止するため、砂糖の濃度と殺菌濃度による抗体力価の変化を確認した。その結果、１０重量％の砂糖濃度を有する卵黄液を６３℃以下の殺菌温度で１０分間処理すると抗ヘリコバクターピロリ抗体力価を８０％以上に維持し得ることが示された（実施例４参照）。
【００１３】
殺菌時間による抗体力価及び汚染度
特に、砂糖を１０％添加した卵黄液を６３℃で３、５、７、１０分間それぞれ殺菌した後、抗ヘリコバクターピロリ抗体力価と一般の微生物及び酵母汚染度を測定した。その結果、６３℃で５分間まで熱処理した場合、抗体力価が９０％以上維持されることが示され、汚染度の測定結果、７分以上の熱処理だけで、一般の微生物と酵母が完全に死滅することを確認することができた（実施例５参照）。
【００１４】
殺菌回数による抗体力価及び汚染度
砂糖を１０％添加した卵黄液を６３℃、３分の熱処理条件で３回にわたって殺菌しながら抗体力価の変化と汚染度を確認した。その結果、抗ヘリコバクターピロリ抗体力価は２回殺菌するまで９５％以上維持され、一般の微生物と酵母の汚染度も２回の殺菌時、殆ど抑制されることが示された。したがって、卵黄液の抗体力価を維持するとともに微生物の汚染を防止するためには、６３℃で３分ずつ２回にわたって殺菌することがより効果的であることを確認した（実施例６参照）。
【００１５】
卵黄液を用いる発酵乳の製造
抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を用いて発酵乳を製造した。殺菌された原料乳にラクトバシルスアシドフィルスカセイ、ストレプトコッカスサーモフィルス、ビフィドバクテリウムロンガムを一定の濃度で接種し、ｐＨ４．５になるまで培養した後、冷却させた。そして、果汁濃縮液、食餌繊維、ブドウ糖、オリゴ糖などを溶かしてシロップを製造した。特に、卵黄液を６３℃で３分間２回殺菌処理し、０．１〜１０重量％を前記培養液に混合して撹拌した。これに、予め製造されたシロップを一定の割合で混合、撹拌して均質化した後、容器に包装した。こうして特定抗体を有効成分として含有している卵黄が添加された発酵乳を官能検査した結果、風味、物性、全体的な味において良好な結果を示した（実施例７参照）。
【００１６】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で当業者による通常の変形が可能である。
【００１７】
実施例１
抗原の準備
ヘリコバクターピロリを５％の馬血清を含有するブルセラ培地で３７℃、２日間培養した。この培養液を４，０００×ｇで遠心分離して菌体を回収した後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁させた。超音波で菌体を破砕した後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、破砕されていない菌体を除去した後、回収した上澄み液を１００，０００×ｇで３０分間超遠心分離して細胞膜を沈殿させた後、蒸留水に懸濁させて抗原として使用した。
【００１８】
実施例２
抗ヘリコバクターピロリ抗体の製造
実施例１で製造した外膜蛋白質抗原を用いて白色レグホンに免疫を実施した。アジュバントはミネラルオイルの一種であるドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ）と乳化剤を混合して使用し、乳化剤としてはスパン８５（Ｓｐａｎ ８５）及びトゥイーン８５（Ｔｗｅｅｎ ８５）を５４：４６の割合で混合して使用した。ドラケオール、乳化剤、抗原を９：１：８の割合で混合して乳化させた後、十分な抗体力価が得られるまで２週間隔で４回にわたって筋肉注射を行った。鶏卵に移行した特異的抗体力価の推移を追跡して、抗体力価が十分に上昇した段階の鶏卵を採取して卵黄液を製造した。
【００１９】
間隔を置き４回にわたって筋肉注射を行った。鶏卵に移行した特異的抗体力価が十分に上昇した段階の鶏卵を収集した。収集した免疫卵を割卵基を経て卵白と卵黄に分離し、分離した卵黄をフィルタで濾過した後、７０〜８０ｋｇ／ｃｍ２で均質化して卵黄液を製造した。
【００２０】
実施例３
抗体力価の測定
卵黄中の抗ヘリコバクターピロリ抗体力価はマイクロタイター法によりつぎのように測定した。卵黄液１ｇとラムダカラゲナン水溶液（０．１５％ｗ／ｖ）９ｍｌを混合し、室温で３０分間放置した後、１０，０００×ｇ、１０分間遠心分離を行うことで、特異的抗体を含有する卵黄水溶性蛋白分画を得て試料液とした。試料液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２ｎ倍希釈して検液とした。凝集抗体力価は、各検液５０μｌと菌破砕液５０μｌをμプレートに混合した後、３７℃で２４時間定置して凝集の有無を調査することにより得られた。抗体力価は凝集が現れるサンプルの最大希釈倍率の逆数で示された。実施例２により製造された卵黄液の抗体力価はおよそ５，７００程度と示された。
【００２１】
実施例４
糖濃度と殺菌温度による抗体力価
卵黄液の貯蔵性を高めるためには、殺菌工程が必須である。しかし、この殺菌工程の熱処理条件により抗体力価が減少する。従って、殺菌工程による抗体力価の減少を防止するため、砂糖をいろいろの濃度で添加した後、殺菌温度による抗体力価の変化を次のように確認した。まず卵黄液に砂糖を０、１０、２０、３０、４０重量％の濃度で添加し、それぞれの卵黄液を管形殺菌器を用いて６０、６３、６５、６７℃で１０分間殺菌処理を行った。殺菌処理後、実施例３の方法により抗体力価の変化を確認した。
【００２２】
図１に示すように、１０重量％以上の砂糖を卵黄液に添加し、６３℃以下の殺菌温度で処理する場合、抗体力価がおよそ８０％以上で維持されることが示された。
【００２３】
実施例５
殺菌時間による抗体力価及び汚染度
実施例５で設定された６３℃で、殺菌時間による抗体力価と一般の微生物及び酵母の汚染度を確認した。まず卵黄液を６３℃で３、５、７、１０分間それぞれ殺菌した後、実施例３の方法により抗体力価を測定した。同時に、殺菌時間別試料１ｍｌを取り、１０進連続希釈した。希釈液１ｍｌをペトリ皿に接種し、ＰＣＡ（ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔ ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ，＃０４７９−１７−６）培地を分株して固めた後、３７℃で２日間培養した結果、現れた集落数を一般の微生物で計数した。そして、希釈液１ｍｌをペトリ皿に接種してＰＤＡ（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ，＃００１３−１７−６）培地を分株し、２５℃で４日間培養した結果、現れた集落数を酵母数で計数した。
【００２４】
図２に示すように、６３℃で５分間まで熱処理した場合、抗ヘリコバクターピロリ抗体の力価は９０％以上で維持されることが示された。しかし、汚染度の測定結果、７分以上の熱処理のみによって一般の微生物と酵母が完全に死滅することが確認できた。
【００２５】
実施例６
殺菌回数による抗体力価及び汚染度
実施例５では抗体力価が維持される殺菌条件が６３℃、５分と示されたが、この殺菌条件では一般の微生物と酵母の汚染を防止することができないため、殺菌回数を増やす方案を検討した。１０重量％の砂糖が添加された卵黄液を６３℃、３分の熱処理条件で３回まで殺菌しながら抗体力価の変化と汚染度を確認した。図３に示すように、抗体力価の維持は２回殺菌時までそのまま維持され、一般の微生物と酵母の汚染度も２回殺菌時に殆ど抑制されることが示された。したがって、卵黄液の抗体力価を維持するとともに微生物の汚染を防止するためには、６３℃で続けて熱処理するよりは、３分ずつ２回にわたって殺菌することがより効果的であることを確認した。
【００２６】
実施例７
卵黄液を用いる発酵乳の製造
抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を用いて、図４のように、発酵乳を製造した。まず脱脂粉乳を用いて無脂乳固形分含量を８〜２０重量％に調整した原料乳を７２〜７５℃で１５秒間殺菌した。殺菌された原料乳を一定の温度まで冷却した後、ラクトバシルスアシドフィルスとラクトバシルスカセイ、ストレプトコッカスサーモフィルス、ビフィドバクテリウムロンガムを１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種してｐＨが４．５となるまで培養してから冷却した。次いで、果汁濃縮液０．１〜５０重量％、食餌繊維０．１〜２０重量％、ブドウ糖０．５〜３０重量％、オリゴ糖０．１〜１５重量％などを溶かしてシロップを製造した。こうして製造したシロップを殺菌した後、冷却した。一方、１０重量％の砂糖を添加し６３℃で３分間２回殺菌処理した卵黄液０．１〜１０重量％を前記乳酸菌培養液に混合し撹拌した。これに、予め製造されたシロップを一定の割合で混合、撹拌して均質化させた後、容器に包装した。このように、特定抗体を有効成分として含有している卵黄が添加された発酵乳を官能検査した結果、風味、物性、全体的な味において良好な結果が示された。
【００２７】
【発明の効果】
以上の実施例から確認したように、本発明による卵黄液の熱処理工程は、抗ヘリコバクターピロリ抗体力価がそのまま維持されるとともに、一般の微生物と酵母の汚染を抑制することができた。したがって、本発明によると、抗ヘリコバクターピロリ抗体力価を維持している卵黄液を用いて発酵乳を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 糖濃度と殺菌温度による抗体力価の変化を示すグラフ
【図２】 殺菌時間による抗体力価と微生物汚染度の変化を示すグラフ
【図３】 殺菌回数による抗体力価と微生物汚染度の変化を示すグラフ
【図４】 抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液を用いる発酵乳の製造工程図

Claims (4)

1. 発酵乳の製造において、抗ヘリコバクターピロリ抗体を含有する卵黄液に糖を添加し、
   加熱温度６３℃で加熱時間３分間の加熱を２回行うことにより殺菌熱処理して一般の微生物及び酵母の汚染を防止した後、この殺菌処理された卵黄液を乳酸菌培養液に混合して撹拌することを特徴とする発酵乳の製造方法。
2. 前記糖が、砂糖、高果糖、ガラクトオリゴ糖からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の発酵乳の製造方法。
3. 前記卵黄液に添加される糖の含量が重量比で１０〜３０％であることを特徴とする請求項１又は２記載の発酵乳の製造方法。
4. 前記乳酸菌培養液に添加される熱処理された卵黄液の含量が重量比で０．１〜１０％であることを特徴とする請求項１記載の発酵乳の製造方法。

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