JP2595133B2 - 免疫刺激剤およびその製造法 - Google Patents
免疫刺激剤およびその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫刺激剤、その製造方
法および醗酵乳の分野で免疫刺激剤および／又は方法の
使用に関する。
法および醗酵乳の分野で免疫刺激剤および／又は方法の
使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】制癌剤はラクトバチルス、特にＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを培養し、
たん白分解酵素によりラクトバチルスを加水分解し、た
ん白および制癌活性を示すリボ核酸の豊富な生成物を加
水分解物から抽出する工程を含む方法により製造できる
ことが知られている。
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを培養し、
たん白分解酵素によりラクトバチルスを加水分解し、た
ん白および制癌活性を示すリボ核酸の豊富な生成物を加
水分解物から抽出する工程を含む方法により製造できる
ことが知られている。
【０００３】さらに、幼児に対する乳に基づく食品はＬ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに
より酸性化した乳にオリゴ要素、ビタミンおよびリゾチ
ーム溶液を補う方法により製造できることが知られてい
る。
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに
より酸性化した乳にオリゴ要素、ビタミンおよびリゾチ
ーム溶液を補う方法により製造できることが知られてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は乳酸菌
から得ることができ、醗酵乳分野で使用するのに特に適
する有効な免疫刺激剤を供することである。
から得ることができ、醗酵乳分野で使用するのに特に適
する有効な免疫刺激剤を供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このために、本発明によ
る免疫刺激剤はリゾチームに感受性の乳酸菌、特にＬａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞
壁からのペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解
して誘導したＮ−アセチルムラミルペプチドを含む。
る免疫刺激剤はリゾチームに感受性の乳酸菌、特にＬａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞
壁からのペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解
して誘導したＮ−アセチルムラミルペプチドを含む。
【０００６】同様に、本発明による免疫刺激剤の製造方
法では、リゾチーム感受性の乳酸菌、特にＬａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞壁からの
ペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解してそこ
からＮ−アセチルムラミルペプチドを誘導する。このタ
イプの剤は免疫応答、特にグラム陰性の腸病原性細菌、
例えばＥ．ｃｏｌｉに対する免疫応答に著しい刺激効果
を有するこが分かった。
法では、リゾチーム感受性の乳酸菌、特にＬａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞壁からの
ペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解してそこ
からＮ−アセチルムラミルペプチドを誘導する。このタ
イプの剤は免疫応答、特にグラム陰性の腸病原性細菌、
例えばＥ．ｃｏｌｉに対する免疫応答に著しい刺激効果
を有するこが分かった。
【０００７】本発明による免疫刺激剤は醗酵乳、特にヨ
ーグルト又はホエイ製品に使用するのに特に適する。
ーグルト又はホエイ製品に使用するのに特に適する。
【０００８】同様に、本発明方法は醗酵乳、特にヨーグ
ルトの製造に、又はホエイ製品の製造に使用するのに適
する、すなわち直接行なうことができる。
ルトの製造に、又はホエイ製品の製造に使用するのに適
する、すなわち直接行なうことができる。
【０００９】従って、本発明はこれらの使用にも関す
る。
る。
【００１０】本発明に関連して、本発明生成物の免疫刺
激剤効果はマウスに対する試験で定性的に評価される。
これらの試験結果は直接ヒトに適用することはできない
が、それでも尚有用な情報を提供することが知られる。
激剤効果はマウスに対する試験で定性的に評価される。
これらの試験結果は直接ヒトに適用することはできない
が、それでも尚有用な情報を提供することが知られる。
【００１１】本発明に関連して、「リゾチームに感受性
の乳酸菌」とは細胞壁がリゾチームにより加水分解しう
る、すなわちリゾチームの作用下でＮ−アセチルムラミ
ルペプチドに分解しうるペプチドグリカンを含む乳酸菌
の意味に使用する。
の乳酸菌」とは細胞壁がリゾチームにより加水分解しう
る、すなわちリゾチームの作用下でＮ−アセチルムラミ
ルペプチドに分解しうるペプチドグリカンを含む乳酸菌
の意味に使用する。
【００１２】本発明方法はリゾチームに感受性の乳酸菌
の純粋培養体または懸濁液又はリゾチームに感受性およ
び非感受性の細菌を含む混合培養体又は懸濁液を使用し
て行なうことができる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの純粋培養体又はＬａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの混合培
養体、すなわち、例えば市販されているタイプのヨーグ
ルト培養体は特に使用することができる。
の純粋培養体または懸濁液又はリゾチームに感受性およ
び非感受性の細菌を含む混合培養体又は懸濁液を使用し
て行なうことができる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの純粋培養体又はＬａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの混合培
養体、すなわち、例えば市販されているタイプのヨーグ
ルト培養体は特に使用することができる。
【００１３】特に、リゾチームに感受性の乳酸菌の１０
6 〜１０10細胞／mlを含有する培養体又は懸濁液を使用
することができる。十分な濃度の所望量の細胞を生産す
るために、適当な培地に当該細菌の種子培養体を接種
し、出発培養体のものに匹敵しうる細胞濃度を培地に再
定着するのに十分な時間細菌の生育に有利な温度および
pHでインキュベートできる。培地は例えば脱脂又は未脱
脂牛乳、ホエイ、限外濾過透過物のような乳に基づく培
地、又は合成培地でよい。
6 〜１０10細胞／mlを含有する培養体又は懸濁液を使用
することができる。十分な濃度の所望量の細胞を生産す
るために、適当な培地に当該細菌の種子培養体を接種
し、出発培養体のものに匹敵しうる細胞濃度を培地に再
定着するのに十分な時間細菌の生育に有利な温度および
pHでインキュベートできる。培地は例えば脱脂又は未脱
脂牛乳、ホエイ、限外濾過透過物のような乳に基づく培
地、又は合成培地でよい。
【００１４】Ｌ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの培養体を使
用することが好ましい。この培養体を製造するために、
牛乳、又は例えばＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）のような合
成培地にこの微生物の種子培養体を接種し、３〜６時
間、３７〜４５℃でインキュベートできる。培養体を３
時間未満又は３７℃以下の温度でインキュベートする場
合、いわゆる潜伏相、すなわち微生物増殖が出発相に留
まり、又はいわゆる指数相、すなわち微生物の指数増殖
相に十分な永さで含まれない危険がある。
用することが好ましい。この培養体を製造するために、
牛乳、又は例えばＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）のような合
成培地にこの微生物の種子培養体を接種し、３〜６時
間、３７〜４５℃でインキュベートできる。培養体を３
時間未満又は３７℃以下の温度でインキュベートする場
合、いわゆる潜伏相、すなわち微生物増殖が出発相に留
まり、又はいわゆる指数相、すなわち微生物の指数増殖
相に十分な永さで含まれない危険がある。
【００１５】他方、培養体を６時間以上インキュベート
する場合、定常相、すなわち微生物の増殖が停止し、そ
の間細胞壁の組成が不利に変化する相に入る危険があ
る。最後に４５℃を超えると、温度はもはやＬ． ｂｕ
ｌｇａｒｉｃｕｓの生育に有利ではなくなる。
する場合、定常相、すなわち微生物の増殖が停止し、そ
の間細胞壁の組成が不利に変化する相に入る危険があ
る。最後に４５℃を超えると、温度はもはやＬ． ｂｕ
ｌｇａｒｉｃｕｓの生育に有利ではなくなる。
【００１６】次に加水分解工程はリゾチームにより行な
う。リゾチームは任意の起源由来でよく、特にレンネッ
ト、特に反芻動物（特に牛）レンネット、又は卵白、任
意には純粋形がよい。本発明方法の１態様では、レンネ
ットはそのまま、すなわちリゾチームをそこから分離せ
ずに使用する。
う。リゾチームは任意の起源由来でよく、特にレンネッ
ト、特に反芻動物（特に牛）レンネット、又は卵白、任
意には純粋形がよい。本発明方法の１態様では、レンネ
ットはそのまま、すなわちリゾチームをそこから分離せ
ずに使用する。
【００１７】上記乳酸菌の細胞壁からのペプチドグリカ
ンは１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間、１５〜
３７℃で、１〜５００μｇリゾチーム／mlのこれらの細
菌細胞１０6 〜１０10を含有する培養体を使用して例え
ば使用リゾチームの作用に有利なpH値で加水分解でき
る。このpHは例えばレンネットのリゾチームに対し４〜
６のオーダ、卵白のリゾチームに対しては６〜８のオー
ダのものである。
ンは１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間、１５〜
３７℃で、１〜５００μｇリゾチーム／mlのこれらの細
菌細胞１０6 〜１０10を含有する培養体を使用して例え
ば使用リゾチームの作用に有利なpH値で加水分解でき
る。このpHは例えばレンネットのリゾチームに対し４〜
６のオーダ、卵白のリゾチームに対しては６〜８のオー
ダのものである。
【００１８】本発明による使用に対し、一方ではそのま
ま、又は水性抽出物形で液体又は撹拌ヨーグルトのよう
な醗酵乳に、又はホエイに基づく飲料のようなホエイ製
品に免疫刺激剤を添加することができる。剤添加量は例
えば醗酵乳又はホエイ製品１mlにつきリゾチームに感受
性の１０6 〜１０10の乳酸菌細胞の壁由来のＮ−アセチ
ルムラミルペプチド量に相当する。
ま、又は水性抽出物形で液体又は撹拌ヨーグルトのよう
な醗酵乳に、又はホエイに基づく飲料のようなホエイ製
品に免疫刺激剤を添加することができる。剤添加量は例
えば醗酵乳又はホエイ製品１mlにつきリゾチームに感受
性の１０6 〜１０10の乳酸菌細胞の壁由来のＮ−アセチ
ルムラミルペプチド量に相当する。
【００１９】他方、加水分解工程は例えば、醗酵乳、特
に独自で、又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと組み合
せたＬ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓにより醗酵乳に、又は
乳清に実施できる。醗酵乳の場合、リゾチームは醗酵
前、中又は後に、例えば約１〜５００μｇリゾチーム／
ml乳の量で乳に添加できる。ホエイの場合、リゾチーム
に感受性の上記細菌はホエイに添加でき、又は適当な場
合、そこで培養することもでき、必要な場合、リゾチー
ムを添加できる。
に独自で、又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと組み合
せたＬ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓにより醗酵乳に、又は
乳清に実施できる。醗酵乳の場合、リゾチームは醗酵
前、中又は後に、例えば約１〜５００μｇリゾチーム／
ml乳の量で乳に添加できる。ホエイの場合、リゾチーム
に感受性の上記細菌はホエイに添加でき、又は適当な場
合、そこで培養することもでき、必要な場合、リゾチー
ムを添加できる。
【００２０】本発明は次例により例示する。例中特記し
ない限り％は重量による。
ない限り％は重量による。
【００２１】免疫刺激効果、すなわち免疫応答に対する
刺激効果はＥＬＩＳＡ試験によりマウスの特異抗体濃度
を測定することにより評価する。
刺激効果はＥＬＩＳＡ試験によりマウスの特異抗体濃度
を測定することにより評価する。
【００２２】専門家には周知のＥＬＩＳＡ試験は、例え
ば細菌抗原のような抗原に順次結合し、水性媒体に不溶
性の支持体に結合する免疫グロブリン、例えばＩｇＧ，
ＩｇＭ又はＩｇＡの特異抗体に結合する抗−抗体をマー
クする酵素を検出することを含む。
ば細菌抗原のような抗原に順次結合し、水性媒体に不溶
性の支持体に結合する免疫グロブリン、例えばＩｇＧ，
ＩｇＭ又はＩｇＡの特異抗体に結合する抗−抗体をマー
クする酵素を検出することを含む。
【００２３】例１ 次の組成（ｇ乾物／ｌ培地で表わす）： たん白加水分解物 １０ 肉抽出物 １０ 酵母抽出物 ５ グルコース ２０ ラクトース １０ 乳化剤 １ クエン酸アンモニウム ２ 酢酸ナトリウム ５ ＭｇＳＯ4 ０．１ ＭｎＳＯ4 ０．０５ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ を有する改質ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．，米
国）から成る合成培地を調製する。
国）から成る合成培地を調製する。
【００２４】この合成培地は６．５のpHを有する。１２
１℃で１５分滅菌し、次にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの種子培養体、この場合Ｌ．
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＮＣＤＯ１４８９（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂａ
ｃｔｅｒｉａ，ＡＦＲＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ ｏｆ
Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｅａｄｉｎｇ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈｉｎｆｉｅｌｄ，Ｒｅａｄｉｎ
ｇ，ＲＧ２ ９ＡＴ，英国）の培養体を接種する。
１℃で１５分滅菌し、次にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの種子培養体、この場合Ｌ．
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＮＣＤＯ１４８９（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂａ
ｃｔｅｒｉａ，ＡＦＲＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ ｏｆ
Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｅａｄｉｎｇ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈｉｎｆｉｅｌｄ，Ｒｅａｄｉｎ
ｇ，ＲＧ２ ９ＡＴ，英国）の培養体を接種する。
【００２５】培養体は６時間４０℃でインキュベートす
る。バイオマスを分離し、洗滌し、ＡおよびＢの２部に
分割する。部ＡはpH７の０．０２Ｍリン酸塩緩衝液に懸
濁し、一方部ＢはpH５の０．０１Ｍ酢酸塩緩衝液に、微
生物の２・１０9 細胞／mlの量で懸濁する。
る。バイオマスを分離し、洗滌し、ＡおよびＢの２部に
分割する。部ＡはpH７の０．０２Ｍリン酸塩緩衝液に懸
濁し、一方部ＢはpH５の０．０１Ｍ酢酸塩緩衝液に、微
生物の２・１０9 細胞／mlの量で懸濁する。
【００２６】懸濁液ＡのＬ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細
胞は市販品として入手しうる卵白からのリゾチーム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ．ドイツ連邦共和国）により加水分
解する。懸濁液ＢのＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞は抽
出レンネットリゾチームにより加水分解し、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｊ． ２０１，６６１〜６６４（１９８２）に
Ｊ．Ｊ． Ｐａｈｎｄらが記載したように精製した。
胞は市販品として入手しうる卵白からのリゾチーム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ．ドイツ連邦共和国）により加水分
解する。懸濁液ＢのＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞は抽
出レンネットリゾチームにより加水分解し、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｊ． ２０１，６６１〜６６４（１９８２）に
Ｊ．Ｊ． Ｐａｈｎｄらが記載したように精製した。
【００２７】このために、１６μｇのリゾチームを懸濁
液１mlについて添加し、１８時間２５℃でインキュベー
トする。次に懸濁液は遠心分離し、上澄相は０．４５μ
ｍ直径孔を有する膜を通して濾過する。
液１mlについて添加し、１８時間２５℃でインキュベー
トする。次に懸濁液は遠心分離し、上澄相は０．４５μ
ｍ直径孔を有する膜を通して濾過する。
【００２８】２種の免疫刺激剤ＡおよびＢは卵白（Ａ）
又はレンネット（Ｂ）由来のリゾチームによる加水分解
により１mlにつき２・１０9 のＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕ
ｓ細胞の細胞壁由来のＮ−アセチルムラミルペプチドを
含有する滅菌溶液または抽出物形で得る。
又はレンネット（Ｂ）由来のリゾチームによる加水分解
により１mlにつき２・１０9 のＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕ
ｓ細胞の細胞壁由来のＮ−アセチルムラミルペプチドを
含有する滅菌溶液または抽出物形で得る。
【００２９】剤ＡおよびＢの免疫刺激効果は次の試験手
順を使用して「スイス白色」種のマウス（Ｔｕｔｔｌｉ
ｎｇｅｎ，ドイツ連邦共和国）で測定する。
順を使用して「スイス白色」種のマウス（Ｔｕｔｔｌｉ
ｎｇｅｎ，ドイツ連邦共和国）で測定する。
【００３０】体重１８〜２０ｇの６匹のマウスを含む番
号１〜６の６群に通常飼料および水を自由に与える。試
験開始の０日から出発して経口挿管法を１，３，５，１
５，１７，１９および３０日に行なう。飼料および水は
これらの挿管法を行なう３時間前に除去し、その後直ち
に戻す。血清は０，２９および４０日にマウスから採取
する。腸の洗滌は４０日に行なう。
号１〜６の６群に通常飼料および水を自由に与える。試
験開始の０日から出発して経口挿管法を１，３，５，１
５，１７，１９および３０日に行なう。飼料および水は
これらの挿管法を行なう３時間前に除去し、その後直ち
に戻す。血清は０，２９および４０日にマウスから採取
する。腸の洗滌は４０日に行なう。
【００３１】各経口挿管法は０．５ml／マウスの用量で
行なう。これらの投与物の組成は同じ群のマウスに対し
ては同一であるが、表Ｉに示すように群毎に異なる。表
Ｉでは、「ワクチン」とは１用量につき５・１０9 のＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ０１１１；Ｋ５８の細
胞が懸濁し、細胞の半数は１００℃で１時間不活性化
し、他の半数は０．０５％グルタルアルデヒドにより不
活性化したことを示す（Ｈｉｌｐｅｒら、Ｆｏｏｄ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７７，編集Ｌ． Ｈ
ａｍｂｒａｅｎｘ，Ｌ．Ａ．Ｈａｎｓｏｎ，Ｈ． Ｍｃ
Ｆａｒｌａｎｅ，Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＸＩＩ
Ｉ，１８２〜１９６）。ＣＴとは専門家に周知の免疫刺
激剤、コレラ毒素を表わす。「生理的溶液」とは０．９
％ＮａＣｌを含有する蒸留水を表わす。
行なう。これらの投与物の組成は同じ群のマウスに対し
ては同一であるが、表Ｉに示すように群毎に異なる。表
Ｉでは、「ワクチン」とは１用量につき５・１０9 のＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ０１１１；Ｋ５８の細
胞が懸濁し、細胞の半数は１００℃で１時間不活性化
し、他の半数は０．０５％グルタルアルデヒドにより不
活性化したことを示す（Ｈｉｌｐｅｒら、Ｆｏｏｄ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７７，編集Ｌ． Ｈ
ａｍｂｒａｅｎｘ，Ｌ．Ａ．Ｈａｎｓｏｎ，Ｈ． Ｍｃ
Ｆａｒｌａｎｅ，Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＸＩＩ
Ｉ，１８２〜１９６）。ＣＴとは専門家に周知の免疫刺
激剤、コレラ毒素を表わす。「生理的溶液」とは０．９
％ＮａＣｌを含有する蒸留水を表わす。
【００３２】
【表１】 群 基本液 添加物質 ＮａＨＣＯ3 その他 ％ １ 生理的溶液 ３ − − ２ 生理的溶液 ３ − １μｇ ＣＴ ３ 生理的溶液 ３ ワクチン − ４ 生理的溶液 ３ ワクチン １μｇ ＣＴ ５ 免疫刺激剤 Ａ ３ ワクチン − ６ 免疫刺激剤 Ｂ ３ ワクチン −
【００３３】マウスから採取した血清中のＩｇＧおよび
ＩｇＭ抗体濃度および腸管洗滌液中のＩｇＧおよびＩｇ
Ａ抗体濃度をＥＬＩＳＡ試験により測定する。表２は得
た相対値を示す。数字は１つの同じ群の各６匹のマウス
に対し測定した幾何学的平均値である。星印はマークし
た数字に対し群３（対照、ワクチンのみを与えたマウ
ス）の相当する数字（同じカラム）と異ることに対し要
求される誤差の確率は５％より低いことを示す。換言す
れば、星印によりマークした数字に対し一方的分散分析
により測定した値「Ｐ」は０．０５より小さい。
ＩｇＭ抗体濃度および腸管洗滌液中のＩｇＧおよびＩｇ
Ａ抗体濃度をＥＬＩＳＡ試験により測定する。表２は得
た相対値を示す。数字は１つの同じ群の各６匹のマウス
に対し測定した幾何学的平均値である。星印はマークし
た数字に対し群３（対照、ワクチンのみを与えたマウ
ス）の相当する数字（同じカラム）と異ることに対し要
求される誤差の確率は５％より低いことを示す。換言す
れば、星印によりマークした数字に対し一方的分散分析
により測定した値「Ｐ」は０．０５より小さい。
【００３４】
【表２】 群 血清から： 腸液から： ＩｇＧ ＩｇＭ ＩｇＧ ＩｇＡ ｄ２９ ｄ４０ ｄ２９ ｄ４０ ｄ４０ ｄ４０ １ ６９ ５７ ３６ ３９ ８ ８ ２ ９６ ９４ ２５ ８０ １０ １１ ３ １８９ ４８９ ３１ ８３ １１ １８ ４ ５７２* ７５９ １１３ １２３* １３ ２４ ５ ５２５* ８２８ １０４ １４１* １８ ５３* ６ ３９７* １３６２* ３９ ４５ ２４* ７２*
【００３５】２９日および４０日に取り出した血清はワ
クチンおよび免疫刺激剤Ａ又はＢ（本発明、群５および
６）又はＣＴ（比較、群４）を与えたマウスに対しワク
チンのみを与えたマウス（対照、群３）に関してＩｇＧ
抗体の濃度に約２〜３の率で増加を示す。対照的に、Ｉ
ｇＭ抗体濃度の増加は単に免疫刺激剤Ａ（本発明、群
５）およびＣＴ（比較、群３）に対してのみ認められ
る。
クチンおよび免疫刺激剤Ａ又はＢ（本発明、群５および
６）又はＣＴ（比較、群４）を与えたマウスに対しワク
チンのみを与えたマウス（対照、群３）に関してＩｇＧ
抗体の濃度に約２〜３の率で増加を示す。対照的に、Ｉ
ｇＭ抗体濃度の増加は単に免疫刺激剤Ａ（本発明、群
５）およびＣＴ（比較、群３）に対してのみ認められ
る。
【００３６】ワクチンおよび免疫刺激剤Ａ又はＢ（本発
明、５および６）を与えたマウスの腸管液のＩｇＧおよ
びＩｇＡ抗体の濃度はワクチンのみ（対照、群３）を与
えたマウスの腸管液のものに関し非常に明白な増加を示
す。
明、５および６）を与えたマウスの腸管液のＩｇＧおよ
びＩｇＡ抗体の濃度はワクチンのみ（対照、群３）を与
えたマウスの腸管液のものに関し非常に明白な増加を示
す。
【００３７】例２ Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのバイオマスを例１記載と同
じ方法で調製する。バイオマスをpH５の０．０１Ｍ酢酸
塩緩衝液に１mlにつき１．６・１０9 微生物細胞量で懸
濁する。４％リゾチーム（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｐ
ｒｅｓｕｒｅ，Ｇｒａｎｄａｙ，Ｂｅａｕｍｅ，フラン
ス）を含有する１％液体レンネットを懸濁液に添加し、
次いで穏やかに撹拌しながら２５℃で１８時間インキュ
ベーションする。次に懸濁液は遠心分離し、上澄相は
０．４５μｍ直径孔を有する膜を通して濾過する。
じ方法で調製する。バイオマスをpH５の０．０１Ｍ酢酸
塩緩衝液に１mlにつき１．６・１０9 微生物細胞量で懸
濁する。４％リゾチーム（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｐ
ｒｅｓｕｒｅ，Ｇｒａｎｄａｙ，Ｂｅａｕｍｅ，フラン
ス）を含有する１％液体レンネットを懸濁液に添加し、
次いで穏やかに撹拌しながら２５℃で１８時間インキュ
ベーションする。次に懸濁液は遠心分離し、上澄相は
０．４５μｍ直径孔を有する膜を通して濾過する。
【００３８】免疫刺激剤Ｃは滅菌溶液形、又はレンネッ
ト自体の形のレンネットリゾチームにより加水分解する
ことにより１mlにつきＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１．
６・１０9 細胞の細胞壁由来のＮ−アセチルムラミルペ
プチドを含有する抽出物形で得る。
ト自体の形のレンネットリゾチームにより加水分解する
ことにより１mlにつきＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１．
６・１０9 細胞の細胞壁由来のＮ−アセチルムラミルペ
プチドを含有する抽出物形で得る。
【００３９】免疫刺激剤Ｃの免疫刺激効果は例１と同様
の方法で「スイス白色」種のマウスで立証される。但し
免疫刺激剤は挿管法によりマウスに投与せず、１部の免
疫刺激剤対５０部の水量で自由に飲用する水に添加す
る。試験を通して、毎日の要求が約４〜７mlであるマウ
スに対し１０mlリピド／２４時間を自由に使用させる。
の方法で「スイス白色」種のマウスで立証される。但し
免疫刺激剤は挿管法によりマウスに投与せず、１部の免
疫刺激剤対５０部の水量で自由に飲用する水に添加す
る。試験を通して、毎日の要求が約４〜７mlであるマウ
スに対し１０mlリピド／２４時間を自由に使用させる。
【００４０】１〜４番号の６匹のマウスの４群には通常
飼料を与える。これらの群のうちの２群は自由に生理的
溶液が受けられる。他の２群には免疫刺激剤Ｃを添加し
た生理的溶液を与える。さらに、これらの群のうちの２
群のマウスには例１の試験手順に記載のものと同じ方法
で経口挿管法によりＥ．ｃｏｌｉのワクチンも与える。
表ＩＩＩは各種群のマウスに対し給飼および／又はワク
チンプログラムを要約する。
飼料を与える。これらの群のうちの２群は自由に生理的
溶液が受けられる。他の２群には免疫刺激剤Ｃを添加し
た生理的溶液を与える。さらに、これらの群のうちの２
群のマウスには例１の試験手順に記載のものと同じ方法
で経口挿管法によりＥ．ｃｏｌｉのワクチンも与える。
表ＩＩＩは各種群のマウスに対し給飼および／又はワク
チンプログラムを要約する。
【００４１】
【表３】 群 液体 挿管法 １ 生理的溶液 − ２ 生理的溶液＋免疫刺激剤Ｃ − ３ 生理的溶液＋免役刺激剤Ｃ ワクチン ４ 生理的溶液＋免役刺激剤Ｃ ワクチン
【００４２】血清のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の濃度およ
びマウスから採取した腸管洗滌液のＩｇＡ抗体の濃度は
ＥＬＩＳＡ試験により測定する。表４は得た相対値を示
す。
びマウスから採取した腸管洗滌液のＩｇＡ抗体の濃度は
ＥＬＩＳＡ試験により測定する。表４は得た相対値を示
す。
【００４３】
【表４】 群 血清から 腸管液から ＩｇＧ ＩｇＭ ＩｇＡ ｄ２９ ｄ４０ ｄ２９ ｄ４０ ｄ４０ １ ７７ ６８ ５４ １０１ ２ ２ ９６ ７８ ３７ ６６ ３ ３ １４２７ １２１３ ７１ ９４ ２５ ４ ２３６５ ３１８０* ２１９* ３６０** ３１ * 値“ｐ”＝０．０６５ ** 値“ｐ”＝０．０１４
【００４４】２９日および４０日に取り出した血清はワ
クチンを与え、免役刺激剤Ｃ（本発明、群４）を含有す
る水を飲用したマウスに対しワクチンのみを与えたマウ
ス（対照、群３）に関しＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の濃度
に約２〜３又はそれ以上でさえの率の増加を示すことが
分る。対照的に、これらの群３および４のマウスではＩ
ｇＡ抗体の濃度間にほとんど差はない。
クチンを与え、免役刺激剤Ｃ（本発明、群４）を含有す
る水を飲用したマウスに対しワクチンのみを与えたマウ
ス（対照、群３）に関しＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の濃度
に約２〜３又はそれ以上でさえの率の増加を示すことが
分る。対照的に、これらの群３および４のマウスではＩ
ｇＡ抗体の濃度間にほとんど差はない。
【００４５】例３ 牛乳に１mlにつきＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌ
ｇａｒｉｃｕｓの約１０8 細胞を含有する市販品の純粋
種子培養体の３容量％を接種する。こうして接種した培
養体は４０℃で５時間インキュベートする。１mlにつき
この微生物の約１０8 細胞を含有し、４．６のpHを有す
るＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの純粋培養体を得る。
ｇａｒｉｃｕｓの約１０8 細胞を含有する市販品の純粋
種子培養体の３容量％を接種する。こうして接種した培
養体は４０℃で５時間インキュベートする。１mlにつき
この微生物の約１０8 細胞を含有し、４．６のpHを有す
るＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの純粋培養体を得る。
【００４６】２０μｇ／mlのレンネットリゾチームを培
養体に添加し、次に２５℃で１２時間インキュベートす
る。
養体に添加し、次に２５℃で１２時間インキュベートす
る。
【００４７】レンネットリゾチームで加水分解すること
によりＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１０8 細胞の壁から
ペプチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド
／mlを含有する免役刺激剤をこうして得る。
によりＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１０8 細胞の壁から
ペプチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド
／mlを含有する免役刺激剤をこうして得る。
【００４８】例４ Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの純粋培養体を例３記載と同
じ方法で製造する。
じ方法で製造する。
【００４９】約４％リゾチームを含有する１％液体レン
ネット自体を培養体に添加し、次に２０℃で８時間イン
キュベートする。
ネット自体を培養体に添加し、次に２０℃で８時間イン
キュベートする。
【００５０】レンネットリゾチームによる加水分解によ
りＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１０8 細胞の細胞壁のペ
プチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド／
mlを含有する免疫刺激剤をこうして得る。
りＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの１０8 細胞の細胞壁のペ
プチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド／
mlを含有する免疫刺激剤をこうして得る。
【００５１】例５ 牛乳に市販品の培養体から得たＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの約５・１０7 細胞／mlお
よびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓの約２・１０8 細胞／mlを含有する５容量％の混
合種子培養体を接種する。約２・１０7 ／mlのｂｕｌｇ
ａｒｉｃｕｓ細胞および約１０8 ／mlのＳ． ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｌｕｓ細胞を含有するヨーグルトを４３℃
で３時間のインキュベーション後得る。
ｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの約５・１０7 細胞／mlお
よびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓの約２・１０8 細胞／mlを含有する５容量％の混
合種子培養体を接種する。約２・１０7 ／mlのｂｕｌｇ
ａｒｉｃｕｓ細胞および約１０8 ／mlのＳ． ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｌｕｓ細胞を含有するヨーグルトを４３℃
で３時間のインキュベーション後得る。
【００５２】５０μｇのレンネットリゾチームをこのヨ
ーグルト／mlについて添加する。次にヨーグルトは２５
℃で１２時間インキュベートし、４℃に冷却する。
ーグルト／mlについて添加する。次にヨーグルトは２５
℃で１２時間インキュベートし、４℃に冷却する。
【００５３】レンネットリゾチームによる加水分解によ
り２・１０7 Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞の壁からペ
プチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチドを
含有し、免役刺激剤の性質を有するヨーグルトタイプの
生成物をこうして得る。
り２・１０7 Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞の壁からペ
プチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチドを
含有し、免役刺激剤の性質を有するヨーグルトタイプの
生成物をこうして得る。
【００５４】例６ ヨーグルトを例５記載と同じ方法で得る。４％リゾチー
ムを含有する１％液体レンネットをこのヨーグルトに添
加し、次いで２５℃で２４時間インキュベートする。
ムを含有する１％液体レンネットをこのヨーグルトに添
加し、次いで２５℃で２４時間インキュベートする。
【００５５】レンネットリゾチームによる加水分解によ
り２・１０7 ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞の細胞壁からの
ペプチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド
を含有し、免役刺激剤の性質を有するヨーグルトタイプ
の生成物をこうして得る。
り２・１０7 ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ細胞の細胞壁からの
ペプチドグリカン由来のＮ−アセチルムラミルペプチド
を含有し、免役刺激剤の性質を有するヨーグルトタイプ
の生成物をこうして得る。
【００５６】例７ 例６で得た生成物を遠心分離し、ホエイを集める。ホエ
イ自体がレンネットリゾチームによる加水分解により
Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞壁からのペプチドグリ
カン由来のＮ−アセチルムラミルペプチドの豊富な免役
刺激剤を表わす。
イ自体がレンネットリゾチームによる加水分解により
Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの細胞壁からのペプチドグリ
カン由来のＮ−アセチルムラミルペプチドの豊富な免役
刺激剤を表わす。
【００５７】例８ チーズ製造からのスイートホエイにＬａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの種子培養体を接種
し、次いで４２℃で６時間インキュベートする。
ｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの種子培養体を接種
し、次いで４２℃で６時間インキュベートする。
【００５８】２５℃に冷却後、４％リゾチームを含有す
る１％レンネット自体を添加し、２５℃で１８時間イン
キュベートする。
る１％レンネット自体を添加し、２５℃で１８時間イン
キュベートする。
【００５９】こうして得た免役刺激剤はレンネットリゾ
チームによる加水分解によりＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
の細胞壁からのペプチドグリカン由来のＮ−アセチルム
ラミルペプチドが豊富である。
チームによる加水分解によりＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
の細胞壁からのペプチドグリカン由来のＮ−アセチルム
ラミルペプチドが豊富である。
Claims (10)
- 【請求項１】リゾチームに感受性を有する乳酸菌の細胞
壁からのペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解
することにより誘導したＮ−アセチルムラミルペプチド
を含有する免疫刺激剤。 - 【請求項２】リゾチームに感受性を有する細菌はラクト
バチルス・ブルガリカスである、請求項１記載の免疫刺
激剤。 - 【請求項３】グラム陰性の腸病原性細菌に対し免疫応答
を刺激する、請求項１記載の免疫刺激剤。 - 【請求項４】大腸菌に対し免疫応答を刺激する、請求項
１記載の免疫刺激剤。 - 【請求項５】リゾチームに感受性を有する乳酸菌の細胞
壁からのペプチドグリカンをリゾチームにより加水分解
してそこからＮ−アセチルムラミルペプチドを誘導する
ことを特徴とする、免疫刺激剤の製造法。 - 【請求項６】リゾチームに感受性を有する乳酸菌はラク
トバチルス・ブルガリカスである、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】リゾチームは純粋形又はレンネット自体の
形のレンネットリゾチームである、請求項５記載の方
法。 - 【請求項８】リゾチームは卵白のリゾチームである、請
求項５記載の方法。 - 【請求項９】加水分解するラクトバチルス・ブルガリカ
ス細胞は牛乳又は合成培地にこの微生物の種子培養体を
接種することにより製造し、こうして接種も培地は３７
〜４５℃で３〜６時間インキュベートする、請求項６記
載の方法。 - 【請求項１０】加水分解工程はリゾチームに感受性を有
する乳酸菌の１０６〜１０１０細胞／ｍｌを含有する１
〜５００μｇリゾチーム／ｍｌ培養体を使用して１５〜
３７℃で１〜２４時間行なう、請求項５記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH4484/89A CH680192A5 (ja) | 1989-12-13 | 1989-12-13 | |
| CH04484/89-4 | 1989-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03255034A JPH03255034A (ja) | 1991-11-13 |
| JP2595133B2 true JP2595133B2 (ja) | 1997-03-26 |
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ID=4276966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2402041A Expired - Lifetime JP2595133B2 (ja) | 1989-12-13 | 1990-12-13 | 免疫刺激剤およびその製造法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0432490B2 (ja) |
| JP (1) | JP2595133B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127023T1 (ja) |
| AU (1) | AU643728B2 (ja) |
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| CH (1) | CH680192A5 (ja) |
| DE (1) | DE69022005T3 (ja) |
| DK (1) | DK0432490T4 (ja) |
| ES (1) | ES2076280T5 (ja) |
| GR (1) | GR3017428T3 (ja) |
| IE (1) | IE68244B1 (ja) |
| MX (1) | MX172984B (ja) |
| NO (1) | NO310498B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ236295A (ja) |
| PT (1) | PT96167B (ja) |
| ZA (1) | ZA909658B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO1994018997A1 (en) * | 1993-02-24 | 1994-09-01 | Valio Ltd. | Method of enhancing immune response to oral vaccines |
| WO1994022459A1 (en) * | 1993-04-07 | 1994-10-13 | Eisai Co., Ltd. | Immunopotentiative and infection-protective agent, containing two or more bacillus, egg white and garlic |
| US6348346B1 (en) | 1994-05-27 | 2002-02-19 | University Of Kentucky Research Foundation | Method of inhibiting binding activity of immunoglobulins |
| DE19619505C2 (de) * | 1996-05-14 | 1998-03-26 | Zyma Gmbh | Milch/Bakterienlysat zur Herstellung von Kosmetika und Arzneimitteln |
| GB9822619D0 (en) * | 1998-10-19 | 1998-12-09 | Porter William L | Immune response stimulation |
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| US6696057B1 (en) | 1999-09-22 | 2004-02-24 | Lacpro Industries, Inc. | Composition and method for treatment of gastrointestinal disorders and hyperlipidemia |
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| US6827940B1 (en) | 2000-05-25 | 2004-12-07 | Aidan Products, Llc | Immune-stimulating bacterial cell wall extracts |
| US7655248B2 (en) * | 2000-06-19 | 2010-02-02 | Hunter Immunology Limited | Compositions and methods for treatment of candidiasis |
| GB0027761D0 (en) * | 2000-11-14 | 2000-12-27 | Nestle Sa | Nutritional composition for an immune condition |
| US20040258779A1 (en) * | 2003-06-06 | 2004-12-23 | Pinegrin Boris V. | Dietary and pharmaceutical compositions for treatment of anemia, thrombocytopenia, and leukopenia |
| JP4716769B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2011-07-06 | キユーピー株式会社 | 血圧降下剤の製造方法 |
| JP4716770B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2011-07-06 | キユーピー株式会社 | 免疫賦活・アレルギー改善剤の製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
| NO134752C (ja) * | 1965-06-01 | 1976-12-08 | Texim Entreprise Economique D | |
| SU618088A1 (ru) * | 1975-06-03 | 1978-08-05 | Киргизский Научно-Исследовательский Институт Акушерства И Педиатрии | Способ получени детского лечебного кисломолочного продукта |
| FR2343484A1 (fr) * | 1976-03-10 | 1977-10-07 | Anvar | Le 2- (2-acetamido-2-deoxy-3-o-d-glucopyranosyl) -d-propionyl-l-alanyl-d- (a-methylamide)-glutamique et medicaments le contenant |
| SU789096A1 (ru) * | 1978-03-23 | 1980-12-23 | Киргизский Научно-Исследовательский Институт Акушерства И Педиатрии | Способ получени кисломолочного продукта дл детского питани |
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| FR2523154A1 (fr) * | 1982-03-09 | 1983-09-16 | Fabre Sa Pierre | Procede de preparation de proteoglycanes immunostimulants inducteurs d'interferon, proteoglycanes obtenus et medicaments les contenant |
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1989
- 1989-12-13 CH CH4484/89A patent/CH680192A5/fr not_active IP Right Cessation
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