JPH03151853A

JPH03151853A - 抗体およびそれを有効成分とする整腸食品

Info

Publication number: JPH03151853A
Application number: JP1291918A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Onishi; 大西　重樹; Kazuyoshi Morita; 和良森田; Toru Tokoro; 所　透; Yoshikatsu Kodama; 義勝児玉
Original assignee: Ghen Corp; Kanebo Ltd
Current assignee: Ghen Corp; Kanebo Ltd
Priority date: 1989-11-09
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1991-06-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、経口摂取し、腸内有害凹のウェルシュ菌（Ｃ
ｌｏＳｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆＢｎｇｅｎｓ　）を抑
制して整腸する事ができる抗体およびそれを有効成分と
する整腸食品に関する。

（従来の技術）ヒトの腸内には１００種類余りの細菌が棲息している０
年令により腸内菌叢に変化を示すとされ、乳児が離乳食
を摂取するようになると、バタテロイデス、コウバクテ
リウム８偏性嫌気性菌、ビフィズス菌が優勢となる。こ
の菌叢は成年期まで保持し、老年期になると、腐敗菌の
一種ウエルシュ菌が増加しビフィズス菌が減少する。

腸内細凹には有効な働きをするものと、有害な働きをす
るものとがあり、健康な時は常に有用な働きをする菌が
優性を保持している。

しかし、この菌叢のバランスがくずれると有害な働きを
する菌が優勢になり、腐敗産物、Ｉ！素。

発癌物質等の産生が増加し、免疫力の低下や種々の病気
の原因になり、引いては老化を起すと考えられている。

有用な働きをする菌としては、ビフィズス菌。

乳酸桿菌等が知られており、有害な働きのみをする菌と
しては、ウェルシュ菌、ベーヨネラ菌、プドウ球菌等が
代表的である。有用菌の代表であるビフィズス菌、乳酸
桿菌を外部から摂取することにより有害菌の作用を抑制
することが期待されるので、乳酸発酵飲料が広く出まわ
っている。

また、腸内研究の発展により、人間の腸内有用菌は酪農
乳酸菌とは異なることが判ってきている。

人間の腸内にもっともよく検出される有用菌はビフィズ
ス菌ではビフィズス・ビフィダム、ビフィズス・ブレー
ベ等であり、乳酸桿菌ではラクトバチルス・アシドフィ
ルス、ラクトバチルス・サリバリウス等である。最近で
は発酵乳中で増殖した乳酸菌自体を利用して保健効果を
期待するといった研究もある。

一方、有用ビフィズス菌の増殖因子について研究されて
おり、４′　−ホスホパンテティン−Ｓ−スルホン酸や
デホスホＣ０Ａ−３−スルホン酸をニンジン中より単離
している。また、ラクチュロースもビフィズス菌の増殖
因子として上げられている。

最近、ショ糖を原料としてカビの酵素（Ｂ−ｆｒｕｃｔ
ｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）の作用により製造される
フラクトオリゴ糖がビフィズス菌により選択的に利用さ
れる糖として見つけられた。この糖は人の消化酵素で消
化されない難消化性槽である。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら乳酸発酵飲料に利用されている乳酸菌のほ
とんどは人間の腸内に生息する乳酸菌と異なり、腸内定
着性が必ずしも満足し得るものではない、大腸内に定着
性のあるビフィズス菌を利用しても、国自体が酸及び酵
素に弱いので製品保存中の生残性が悪いといった欠点が
ある。

また、ビフィズス菌の増殖因子であるパンテティンＭ縫
物質は、腸内の大腸菌から相当量供給されるにもかかわ
らず、効果が薄いので、経口摂取したとしても大きな効
果をもたらさず、重要なファクターではない。

ラクチュロースはビフィズス菌を増殖するが同時に有害
菌ウェルシュ菌等も増殖させるため、選択性が低く、好
ましくない。

フラクトオリゴ糖は従来のビフィズス菌増殖因子に比較
し優れた選択性をもつがクレプシラ閾やストレプトコッ
カス菌等にも利用されうる。

これら従来技術は有用菌に目を向けられたが本発明者等
は有害菌に目を向け、有害菌を制御することによって、
有用菌を増やすことを考察した。

その結果、有害菌でも主要なウェルシュ菌（Ｃｌ　ｏ　
ｓｉｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の細胞表
層抗原を鶏１；免疫し、その鶏が産生じた卵より抗体を
調製すればウェルシュ菌の抑制を可能にすることを見出
し、本発明を完成するに至ったのである。

本発明の目的はウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
　ｐｅ−ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に対する免疫活性を示し
、ウェルシュ菌に対し十分な抑制効果を有し、置屋性に
も優れ生産コストが低く整１！食品の有効成分として有
用な抗体及び該抗体を含む整腸食品を提供することにあ
る。

（！！題を解決するための手段）本発明は血清型がＡであるウェルシュ菌（ＣｌｏｓＬｒ
ｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の細胞表層抗原
を免疫した鶏が産生ずる卵より調製された免疫グロブリ
ンであって、その腸内有害国のウェルシュ菌に対して免
疫活性を有する抗体及びそれを有効成分とする整腸食品
に関する。

以下、本発明につき更に詳しく説明する。

本発明の抗体及びそれを有効成分とする整腸食品は、前
述のようにウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐｅ
ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の細胞表層抗原を鶏に免疫し、そ
の鶏が産生した卵より調製したものである。

ここで用いるウェルシュｖｌ（ＣＩｏｓｔｒｉｄｊｕ鋼
ｐｅｒｆ−ｒｉｎｇｅｎｓ）としては血清型がＡである
ヒト食中毒原因菌であり、例えばＣ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｓ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　Ｈｏｂｂｓ　５株、Ｈｏ
ｂｂｓ　９株、Ｈｏｂｂｓ　１０株、Ｈｏｂｂｓ　１株
、ＮＣＴＣ１０５７８株等が公知である。培地としては
無菌テストプロス（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
製）、トリプチケースソイブロス（同社製）等が使用で
きる。また、培養温度は菌体増殖が得られるのに適した
範囲内であれば良いが良好な菌体増殖という点からは通
常３７℃程度とするとよい。

また、培養時間は培養温度、培地の種類等の培養条件に
よって異なるが溶菌しない時期を選択して決定すれば良
＜１８〜２４時間程度とすれば良い。

また、培養は嫌気条件下で行われる。その他の培養条件
についても上記の観点から適宜選択すれば良い。

次にＲ，Ｃｈｅｒｎｉａｋらの方法（Ｉｎｆｅｃ口ｏｎ
＆ｌ５ｓｕｎｉｔｙ＋３１（２）　、６０８（１９８１
）によるウェルシュ１２ｉＩ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓ
　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）　１ｌｏｂｂｓ　ｌ　０株
の細胞表層抗原の調製方法を説明する。

培養液’ｌ　Ｑｍｌｌにウェルシュ菌を植菌し、３７’
Ｃｌ晩培養後、更に４５０ｍｌの無菌テストプロスに植
菌し、５〜６ｈｒ培養したウェルシュ菌を遠心（４１０
０Ｘｇ、１０分）で集菌し、菌体を０．８５％生理食塩
水で数回洗浄し、アセトンで洗浄し、真空乾燥する。乾
燥した菌体をわ）砕機で細粉する。この粉砕した菌体を
３００ｍｊの水に均一に懸濁し、沸とう浴上で５分間加
熱後、水冷下撹拌機で周期的に激しい撹拌処理をした。

その処理液から細胞残渣を遠心（２００００ｘｇ、１ｈ
ｒ）で除去した。その上清を１％酢酸濃度に調製し、９
５％エタノールを２倍量添加した。この懸濁液をｌ晩冷
蔵庫へ静置した後、遠心（２７０００Ｘｇ、３０分）に
より沈澱した。このエタノール沈′Ｒ画分（粗抗原）は
エタノール濃度をあげて洗浄し、アセトンで洗い、最後
にエーテルで洗った。

残留エーテルはエバポレーターで除去し、その沈澱は（
ａｃｌｇの入ったデシケータ−中に保存した。

この沈澱画分をＤＥＡＥ−セフアデツクスカラムに処理
し、水で溶出した両分を透析し、凍結乾燥し、（Ａ）を
調製した。また、前記細胞残渣（１００ｇ）は１％酢酸
１１で２ｈｒ還流し再抽出した。この懸濁液を水浴で冷
却し、その細胞残渣は遠心（２７０００ｘｇ、９０分）
で除去した。

この酢酸溶液は適当量エバポレーターで容量を減らし、
透析（３５０Ｇダルトン分子サイズをカントする透析チ
ェープ）し、凍結乾燥し、（Ｂ）を調製した。前記（＾
）および（Ｂ）を合一し、細胞表層抗原とした。

次に本発明の抗体の製造方法について説明する。

即ち、まず前記調製した細胞表層抗原を鶏に免疫する。

免疫される鶏としては特に制限はないが抗体の量産性と
いう点からは、白色レグホーン等の卵用種を用いると良
い。

また、菌体による免疫方法としては皮下注射筋肉注射、
腹腔内投与等による通常の方法や、点鼻１点眼等の方法
によって行うことができる。更に、菌体の投与聾は所望
の抗体価が得られ、且つ鶏に対して悪影響を与えない萱
を適宜選択すれば良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗体に対して特異的に
反応する抗体が鶏卵（卵黄）中に得られる。

尚、必要に応じて例えばＦＣＡ　（フロイント完全アジ
ュバント）等のアジュバントを菌体と共に併用しても良
い。

免疫から１ケ月以上経過した後から鶏が産生ずる卵を集
卵する。

尚、卵黄中の抗体価は、菌体凝集価、酵素免疫吸着法（
ＥＬＩＳＡ　）　、　　ラジオイムノアンセイ等を用い
て測定することができ、免疫後２週程度の間隔で抗体価
を測定することにより、抗体価の推移を追跡することが
できる。

後述の実施例においては、凝集抗体価での測定により抗
体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の卵
を採取して、本発明の抗体を調製した。また、通常３ケ
月間にわたって高抗体価を得ることができる。尚、免疫
後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔で適宜追
加免疫することにより抗体価を高くすることができる。

。得られた卵により目的とする免疫グロブリンを調製する
。この調製方法は、遠心分動、デキストラン硫酸による
抽出、ポリエチレングリコールによる抽出、プロパツー
ルによる抽出、各種クロマトグラフィーによる分離等が
挙げられる。特に卵黄を集めて、上記の精製を行うこと
で目的とする抗体有効率よ（精製・濃縮することができ
る。該抗体はウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）と特異的に反応し、ウェルシ
ュ菌に対して免疫活性を有する１本発明の抗体はウェル
シュ菌凝集を惹起することが示された。これら種々の抗
体含有画分は、通常の整腸食品に配合し、本発明に係る
整腸食品を調製することができる。

即ち本発明の整腸食品は飲料水、調味料、菓子類等に適
用されるものである。このような形態を調製する場合、
必要に応じて油の増量剤、甘味料。

増粘剤、Ｉｖ２Ｉ滑剤、賦形剤の添加をするのが望まし
い。

本発明抗体の整腸食品への配合足はその投与形態に応じ
た投与量に従って適宜選択すれば良く、例えば１０”以
上のａ集抗体価を有する抗体を０．０００１〜ｌＯ重川
％程度とすることができる。上記のように、本発明の整
腸食品は、前記免疫卵より調製した卵黄抗体を用いるこ
とにより、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕａ　ｐ
ｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の腸内増殖を抑制し、有害菌を
抑制し、整腸する事ができる。しかも、前記卵黄抗体は
安全性が高いため、本発明の整腸食品は使用上の安全性
が高いものである。

また更には、腸溶性フィルムまたはカプセルなどと賦形
剤にて剤型を整えることによって、積極的には整腸剤と
しての用途も可能である。

（実施例）以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。尚、
以下における％表示は特に指定されていない場合には、
重量／容量％を示す。

実施例１（ａ）抗原の調製前述Ｒ，Ｃｈｅｒｎｉａｋらの方法に基づき、ウェルシ
ュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ）の細胞表層抗原（Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−
アセチルマンノサミンを含む多糖体）を調製した。

（ｂ）抗原の鶏への免疫（ａ）で得た細胞表層抗原標品１ｍｇをリン酸緩衝液０
．５ｍｊに懸濁させたものとＦＣＡ　（フロイント完全
アジェバンド＞　ｏ、５ｍｌを１：ｌ混合してＷ２Ｏ型
のエマルジョンとした。

得られたエマルジョンを鶏の胸筋に０．５ｍｌずつ注射
し、初回免疫を行った後、下記の方法に従って、採取し
た卵から得たＷＳＦ（後述）の凝集抗体価を測定し、そ
の推移を観察した。その結果を第１図に示した０次に、
第１図に示すように初回免疫１６週後に卵黄中の抗体価
が下がり始めたのを確認して、前回と同様にして２次免
疫を行った。２次免疫終了後、約１ケ月経過した後から
鶏が産生ずる卵を集卵した。

（ｃ）抗体の調製卵黄を卵（１００個）より分離し、１１の卵黄を取り、
これと等■のＰＢＳ　（リン酸緩衝液、ｐＨ７，４）を
混合し、更に等量（２１）のクロロホルムを加え、よく
撹拌した後、３０分室温に放置した。その後、３０００
ｒｐｍにて２０分間遠心した。遠心後の最上層の透明な
画分１１を目的の抗体を含む画分（以下Ｗ　Ｓ　Ｆ　：
　ｗａｔｅｒ　５ｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　と
略記する）として得た。

尚、このＷＳＦ中の総蛋白量をピユーレ、ト法により測
定したところ約２２ｇ（約２２ｍｇｘ　１１）あった、
この両分を凍結乾燥機で乾燥することによって、乾燥粉
末として５０ｇ（純度４４％）を得た。

（ｄ）抗体価の測定方法（ｃ）で得られた抗体含有画分ＷＳＦについてウェルシ
ｓ　＠（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅ
ｎｓ）凝集テストを行った。

まず、（ａ）で得たホルマリン処理ウェルシュ菌１１ｏ
ｂｂｓ　　１０株をマクファーランド指数５（ＯＤｓｓ
ａ２．０）となるように調製し、試験管に１ｍｌとなる
ように分注した。ここで、（ｃ）で得られたＷＳＦのＰ
ＢＳによる２段階希釈液の１ｍｌを各試験管に加え、３
７℃で一晩反応させた６反応終了後、菌体の凝集の有無
を目視にて判断した。凝集抗体価はエンドポイントタイ
ター法により求め、凝集が確認される最終希釈倍率とし
た。

次に、本発明の整腸食品の実施例を記載する。

実施例２トマトピユーレ３ｋｇ、　　ショ糖７５ｇ１食塩３．７
５ｇ、グルタミン酸ソーダ３ｇ、香料の適量を水６７５
ｇと混合し、殺菌冷却し、更にこの混合液にＷＳＦ凍結
乾燥物３７．５ｇと殺菌（９０℃、３０分）した１０％
（Ｗ／Ｗ）還元脱脂乳培地で培養した乳酸菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｕｓ　Ｌｈｅｒ−ｍｏｐｈｉｌｕｓ及び／
またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ）カルチャー２２５ｇとを添加して均一に混合し乳
酸菌飲料を得た。

次にやや便秘気味の者、年齢２０才から５０才の男女５
名を選定し整腸効果を調べた。

調製した乳酸菌飲料（８０ｍｌ／本）を、パネラ−各自
が毎日１本、１週間飲用した結果、はとんどのパネラ−
は排便が正常になった。

（発明の効果）本発明により、ウェルシュ菌に対し凝集性が確認され量
産性にも優れ、生産コストが低く整腸食品の有効成分と
して有能な抗体および該抗体を含む整腸食品が提供され
る。

特に本発明のウェルシュ菌に対する免疫活性を有する抗
体は、従来の哺乳動物を免疫して得る抗体と比較して以
下のような利点を有する。

（１）　　本発明の抗体は、免疫した鶏の卵中に得られ
、採卵、卵の取り扱いおよび卵からの抗体の取得に特別
なあるいは熟練した技術を必要としない。

しかも、卵黄には免疫グロブリンのうちＩｇＧクラスし
か移行しないのでＩｇＧのみを容易に得ることができる
。

これに対して、免疫した哺乳動物から採血により抗体を
得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、しか
も血清から大量のＩｇＧを分離、精製することは未だ困
難である。

（２）　本発明の抗体の調製に用いられる鶏は、管理が
容易であり、例えばラット等と比較してもその管理費用
が安い。

しかも哺乳動物から継続的に多量の血液や乳を得ること
は困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量産には
適さないが、鶏は長期間にわたって安定して卵を生み続
けるので、本発明の抗体は置屋可能であり、かつ生産コ
ストが低い。

（３）　　免疫した哺乳動物の血液から調製した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは、精
製した状態でも一８０℃程度の温度条件下での保存が必
要とされる。

本発明の抗体は、良好な安定性を存し、また保存性も良
く、例えば卵の状態で４℃で１〜２力月間保存できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１における免疫した鶏の抗体価の推移
を示すグラフである。第１図符計出願人　体へ曾住　ケン・コーポレーション初回免
疫２次免疫

Claims

【特許請求の範囲】

（１）血清型がＡであるウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉ
−ｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の細胞表層抗原を
免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリン
であって、その腸内有害菌のウェルシュ菌に対して免疫
活性を有する抗体。
（２）血清型がＡであるウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉ
−ｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の細胞表層抗原を
免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリン
であって、その腸内有害菌のウェルシュ菌に対して免疫
活性を有する抗体を有効成分とする整腸食品。