PT96167B

PT96167B - Processo para a preparacao de um agente imunoestimulante compreendendo derivados de n-acetil-muramil-peptidos

Info

Publication number: PT96167B
Application number: PT96167A
Authority: PT
Inventors: Harriet Link; Jean-Jacques Pahud
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-12-13
Filing date: 1990-12-12
Publication date: 2001-05-31
Also published as: US5185321A; DE69022005T2; DK0432490T4; CA2030951C; NO310498B1; NO905228D0; ZA909658B; JPH03255034A; DE69022005T3; EP0432490A3; AU643728B2; AU6702190A; ES2076280T3; DE69022005D1; GR3017428T3; CA2030951A1; EP0432490B1; PT96167A; MX172984B; IE904323A1

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção tem por objecto a preparação de um agente imunoestimulante bem como a utilização deste agente ou deste processo no domínio dos leites fermentados.

Ê conhecido um processo para a preparação de um agente anti-carcinogénico, no qual se cultiva um lactobacilo nomeadamente o lactobacillus bulgaricus, se hidrolisa este bacilo com uma enzima proteolitica e se extrai do hidrolisado um produto rico em proteína e em ácido ribonucleico que apresenta uma actividade anticarcinogénia.

Ê também conhecido um processo para a preparação de um produto dietético à base de leite para crianças, no qual se suplementa um leite, acidificado pelo Lactobacillus acidophilus, com oligoelementos, vitaminas e uma solução de lisozima. Esta última parece substituir a lisozima presente no leite maternal e melhorar a conservação, o gosto e a textura deste produto dietético.

A presente invenção tem por objectivo propor um agente imunostimulante eficaz, que ee pode obter a partir de uma bactéria láctea, e é particularmente indicado

para uma utilização no domínio dos leites fermentados.

Para este efeito, o agente lmunostlmulante de acordo com a presente invenção compreende os diferentes derivados de N-acetil-muramil-péptidos por hidrólise com a lisozima de péptidoglicanos da parede celular de bactérias lácteas sensíveis á lisozima, nomeadamente Lactobacillus bulgaricus.

Além disso, no processo para a preparação de um agente imunoestimulante de acordo com a presente invenção, é feita a hidrólise com a lisozima dos petidoglicanos da parede celular das bactérias lácteas sensíveis ã lisozima, nomeadamente o Lactibacillus bulgaricus, para se obterem os N-acetil-muramil-péptidos. Constatou-se com efeito que esse agente apresenta um efeito estimulante notável da resposta imunitária, nomeadamente da resposta imunitária ás bactérias enteropatogénicas gram-negativas, tais como por exemplo,

E.coli.

Esse agente presta-se particularmente bem a uma utilização num leite fermentado, nomeadamente num iogurte ou num produto lactossêrico.

Além disso, esse processo prestase bem a uma utilização, ou seja pode ser directamente realizado no quadro da preparação de um leite fermentado, nomeadamente de nm iogurte, ou na preparação de ura produto lactossêrico.

A presente invenção engloba assim igualmente estas utilizações.

Na presente descrição, á estimado o efeito imunoetimulante do presente produto de forma qualitativa do modelo do ratinho. Sabe-se que os resultados desses ensaios não se podem transpor directamente pera o homem, eles fornecem contudo indicações úteis.

Na presente descrição, a expressão bactérias lácteas sensíveis ã lisozima é utilizada no sentido de bactérias lácteas era que a parede celular compreende os péptidoglicanos hidrolisáveis pela lisozima, ou degradáveis em N-acetil-muramil-péptidos sob a acçao da lisozima.

Para realizar o presente processo, pode ser utilizada uma cultura ou suspensão pura de bactéria láctea sensível á lisozima, ou uma cultura ou uma suspensão mista compreendendo bactérias sensíveis e não sensíveis á lisozima. Pode-se nomeadamente utilizar uma cultura pura de Lactobacillus bulgaricus ou uma cultura mista de Lactobacillus bulgaricus e de Streptococcus thermophilus, ou uma cultura de iogurte, como aquela que se encontra no comércio, por exemplo.

Pode ser utilizada em particular uma cultura ou uma suspensão contendo 10& a ΙΟ^θ células de bactérias lácteas sensíveis ao lisozima por cada mililitro. Para produzir uma quantidade pretendida de células numa concentração suficiente, pode-se inocular um meio de cultura adequado com uma cultura de inseminação da referida bactéria e incubar a uma temperatura e a um valor de Ph favoráveis ao crescimento da bactéria, durante um tempo suficiente para restabelecer no meio de cultura uma concentração de células comparável á da cultura de início. 0 referido meio de cultura adequado pode ser um meio lácteo, como por exemplo leite de vaca desnatado ou não, ura soro lácteo, fluido obtido da permeação de ultraflltração, ou um meio sintético, por exemplo.

Utiliza-se de preferência uma cultura de L.bulgaricus. Para preparar esta cultura, pode-se inocular um leite de vaca, ou um melo sintético como por exemplo um melo MRS (Difco), por exemplo, com uma cultura de inseminação deste microoganismo e incubar durante 3-6 horas a 37-45°C. Se se incubar durante menos de 3 horas ou a menos de 37^QC, corre-se o risco de permanecer na fase dita de latente, também dita fase de arranque da multiplicação do microorganismo, ou de não se ficar um tempo suficiente na fase dita exponencial também referida como fase de multiplicação exponencial do microorganismo.

Pelo contrário, se se incubar durante mais de 6 horas, corre-se o risco de entrar na fase estaciona-

ria, também referida fase em que a multiplicação do microorgdoiamo pára e no decurso da qual a composição da parede celular se pede modificar de forma desfavorável. Finalmente acima de 45°C a temperatura jã não é favorável ao crescimento do

L. bulgaricus.

Sealiza-se assim a referida hidrólise com a lisozima. Esta pode ser obtida de qualquer fonte adequada, nomeadamente coalho, em particular coalho de ruminante (sobretudo de bovino), ou gema de ovo sob a forma pura ou impura. Numa forma de execução particular do presente processo utiliza-se o proprio coelho sem o ter separado da lisozima.

A hidrólise dos referidos péptidoglicanos pode ser realizada na parede celular das referidas bactérias lácteas a 15-37°C, durante 1-48 horas, de preferência 12-24 horas, com o auxilio de 1-500 g de lisozima por ml de uma cultura contendo ΙΟ^-ΙΟ^θ células destas bactérias por ml, por exemplo, a um valor de Ph favorável á acção da lisozima utilizada. Este valor de Ph é assim de cerca de

4-6 para uma lisozima de coalho de cerca de 6-8 para uma lisozima de gema de ovo, por exemplo.

Para realizar as utilizações de acordo com a presente invenção, pode-se por um lado adicionar este tel agente, tal e qual ou sob a forma de um extracto aquoso, a um leite fermentado como por exemplo, iogurte liquido ou agitado, ou a um produto lactossérico como por exemplo uma bebida ã base de soro lácteo. A quantidade de agente adicionado pode corresponder á quantidade de N-acetll-muramll-páptldoa derivados das paredes de 10& a 10¹⁰ células de bactérias lácteas sensíveis á lisozima, por ml do referido leite fermentado com o referido produto lactossérico, por exemplo.

Pode—ae também realizar a referida hidrólise num leite fermentedo, nomeadamente pelo L.bulgaricus isolado ou em combinação com S.therraophilus ou num soro lácteo por exemplo. No caso do leite fermentado, pode-se adicionar a lisozima ao leite antes, durante ou depois da sua fermenta-

ção, a uma taxa de cerca de 1-500 g de lisozima por ml de leite por exemplo. No caso do soro lácteo, pode—se adicionar as referidas bactérias sensíveis á lisozima, a qual se pode também, se desejado, cultivar, e pode-se adicionar, se necesãrlo, lisozima.

Os exemplos a seguir apresentados são a titulo de ilustração da presente invenção. As percentagens são dadas em peso, a menos que se diga o contrário.

efeito imunoestimulante, também referido como efeito estimulante da resposta imunitária, é calculando por intermédio de uma determinaçãodé concentrações em anticorpos específicos, no ratinho, por meio do ensaio de ELISA.

Este último ensaio, bem conhecido dos especialistas, consiste em dosear uma enzima que marca um anticorpo que se liga a um anticorpo especifico de uma imunoglobulina, como por exemplo IgG, IgM ou IgA, que se liga a um antigénio, tal como um antigénio bacteriano, por exemplo, ele próprio fixado sobre um suporte insolúvel em meio aquoso.

EXEMPLO I

Prepara-se um meio de cultura sintético, consistindo num meio MRS (Difco Lab., Estados Unidos da América) modificando, apresentando a composição . seguinte (expressa em grama de matéria seca por litro do melo):

hidrolisado de protélnas 10 extracto de carne 10 extracto de levedura 5 glicose 20 lactose 10 émulsimante 1 citrato de amónio 2 acêtato de sódio 5

MgSO₄ 0,1

MnS0₄ 0,05

K₂HP0₄ 2

Este meio de cultura sintético apresenta um valor de Ph de

6,5. Esteriliaa-se durante 15 minutos a 121°C. Inocula—se com uma cultura de inseminação de Lactobaclllus bulgaricus, neste caso uma cultura de L.bulgaricus (National Culture of Food Bactéria, AFRC Instltnite of Food Research, Reading Laboratory, Shinfield, Reading, RG2 UR).

Incuba-se a 40^eC durante 6 horas. Separa-se a biomaesa, lava-se e separa-se em duaa partes A e B. Coloca-se a parte A em suspensão num tampão de fosfato 0,02 M a Ph 7 e a parte B em suspensão num tampão de acetato 0,01 M a Ph 5, a uma taxa de 2x10^ células do microorganismo por ml.

Hidrolisam-se as células de L.bulgaricus da suspensão A com uma lisozima de gema de ovo comercial (Calbiochem, Républica Federal da Alemanha). Hidrolisam-se as células de L.bulgaricus da suspensão B com uma lisozima de coalho extraída e purificada por J.J Pahud e col. em Biochem. J. 201,661-664(1982).

Para realizar esta operação, adicionam—se 16 g de lisozima por ml de suspensão e incuba-se a 25^QC durante 18 horas. Centrifuga-se e filtra-se o sobrenadante de uma membrana com poros de 0,45 m de diâmetro.

São assim obtidos dois agentes imunoestlmulantes A e B sob a forma de soluções estéreis ou extractos que contêm os derivados de N-acetll-muramil-péptidos, por hidrólise com a lisozima de gema de ovo (A) oa de coalho

Q (B) coo paredes celulares de 2x10 de L.bulgaricus por ml.

Verifica-se o efeito imunoestlmulante destes agentes A e B no ratinho da raça Swiss white (Tuttlingen, Républica Federal da alemanha), de acordo com o protocolo exprlmental seguinte:

Seis grupos numerados de 1 a 6 compreendendo cada um 6 ratinhos de 18—29 g recebem uma dieta normal e água á vontade. A partir do Início da experiência no dia designado por 0, procede—se a entubaçoes orais nos

dias 1, 3, 5, 15, 19 e 30. A dieta e a água são retiradas dos ratinhos 3 horas antes de cada uma das entubações e restabelecidas imediatamente a seguir. Sao recolhidos soros dos ratinhos nos dias 0, 29 e 40. Ê efectuada uma lavagem intestinal no dia 40.

Cada entubação oral é realizada cora uma dose de 0,5 ml por ratinho. A composição destas doses é a mesma para oe ratinhos do mesmo grupo, mas ela varia de grupo para grupo conforme o Quadro I a seguir apresentado.

Neste Quadro, a rubrica vacina” Índica que se colocaram - 9 » em suspensão, por dose, 5x10 células de Eschericia coli 0111sK58 em que uma metade foi desactlvada durante 1 hora de glutaraldeldo a 0,05% (Hllpert e coli., Food and Immunology 1977, Ed.L.Hambraeux, L.A.Hanson, H.Mc Farlane, Svedish nutrition Foundation Symposium XIII, 182-196). As letras CT designam a toxina da cólera, que é um agente imunoestimulante bem conhecido do especialista.

A expressão água fisiológica designa água destilada contendo 0,9% de NaCl.

QUADRO I

Grupo Liquido de base Substâncias adicionadas

NaHCo^ outros %

1	água fisiológica	3	-	-
2	«	3	1	g CT
3	n	3	vacina	-
4	n	3	vacina	g CT
5	agente A	3	vacina	-
6	agente B	3	vacina	-

		Determina-se	por	meio	do	ensaio	de
ELISA a	concentração	em anticorpos	IgG e	IgM	dos	soros, bem
como a	concentração	em anticorpos	IgG e	IgA	dos	fluídos	de
lavagem	intestinal	retirados dos	ratinhos.	0 Quadro II	a

seguir apresentado mostra os valores determinados para cada um dos 6 ratinhos do mesmo grnpo. Os asteriscos indicam que para oa números assim marcados, a proballdade de cometer um erro ao pretender que eles são diferentes do número correspondente (mesma coluna) do grupo 3 (testemunho, ratinhos que não receberam senão a vacina) é inferior a 5Z. Por outras palavras, para os números marcados com um asteriscos, o valor p, determinado por análise de variância unilateral, é inferior a 0,05,

QUADRO II

Grupo ex soro: ex fluido intestinal:

	IgG	IgM	IgG J40	IgA J40
J29	j40	j29	J40
1	69	57	36	39	8	8
2	96	94	25	80	10	11
3	189	489	31	83	11	18
4	572*	759	113	123*	13	24
5	525*	828	104	141*	18	53*
6	397	1362*	39	45	24*	72*

Constata-se assim que os soros retirados nos dias 29 e 40 apresentam um aumento do factor de cerca de 2-3 da concentração em anticorpos IgG para os ratinhos que receberam a vacina e os agentes A ou B (invenção, grupos 5 e 6) ou CT (comparação, grupo 4) em relação aos ratinhos que nao receberam senão a vacina (testemunho, grupo 3). 0 aumento da concentração em anticorpos IgM pelo contrário não é constatada senão para o agente A (invenção, grupo 5) e CT (comparação, grupo 3).

A concentração em anticorpos IgG e IgA nos fluidos intestinais dos ratinhos que receberam a vacina e os agentes A ou 6 (invençã, grupos 5 e 6) apresenta igualmente um aumento muito forte em relação aos fluidos intestinais dos ratinhos que receberam apenas a vacina (testemunho, grupo 3).

EXEMPLO 2

Prepara-se uma biomassa de L. bulgaricus da maneira descrita no exemplo 1. Coloca-se era suspensão num tampão de acetato 0,01 M a Ph 5, á taxa de 1,6x10^ células do microorganismo por ml.

Adiclona-se a esta suspensão IX de coalho líquido contendo 4X de lisozima (Laboratoire Présure Granday, Beaune, França). Incuba-se com ligeira agitação durante 18 horas a 25°C. Centrifuga-se e filtra-se o sobrenadante numa membrana de poros com 0,45 m de diâmetro.

Obtem-se assim um agente imunoestlmulante C sob a forma de solução estéril ou extracto contendo os derivados de N-acetil-murarall-péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, sob a forma do próprio coalho, das paredes celulares de l,6xl0⁹ células de L. bulgaricus por mililitro.

Verifica-se o efeito imunoestimulante deste agente C sobre o ratinho de raça Sviss vhite de maneira semelhante a descrita no exemplo 1, com a exepção do agente imunoestimulante não ser administrado aos ratinhos por entubaçao, raas de ter sido adicionado á égua que bebem á vontade, á razão de 1 parte de agente para 50 partes de ãgua. Durante toda a experiência, colocam-se 10 ml de lipido por 24 horas a disposição dos ratinhos eo que a necessidade diária á de cerca de 4-7 ml.

Quatro grupos de 6 ratinhos cada ura, numerados de 1-4, recebem uma dieta normal. Dois destes grupos recebem água fisiológica vontade. Os outros dois recebem água fisiológica á qual se adicionou o agente imunoestimulante C. Por outro lado, os ratinhos de dois destes grupos recebem igualmente uma vacina de E. coli por entubaçao oral, de maneira semelhante á descrita no protocolo exprimental do exemplo 1. 0 Quadro III a seguir apresentado resume este programa de alimentação e/ou de vacinaçao dos ratinhos dos diferentes grupos.

Grupo

QUADRO III

Liquido

Intubaçao ãgua fisiológica água fisiológica+agenteC ãgua fisiológica+agente C v_aci_naágua fisiológica+agente C vacina

Determina-se por meio do ensaio ELISA a concentração em anticorpos IgG e IgM dos soros, bem como a concentração em anticorpos IgA dos fluídos de lavagem intestinal retirados dos ratinhos. 0 Quadro IV a seguir apresentado mostra os valores relativos obtidos.

QUADRO IV

Grupo ex soro ex fluido intestinal

IgG IgM IgA

j29	j40	J29	J40	J40
1	77	68	54	101	2
2	96	78	37	66	3
3	1427	1213	71	94	25
4	2365	3180*	219*	360**	31

*-valorp»0,065 ♦♦-valorp=0,014

Constata-se assim que os soros retirados nos dias 29 e 40 apresentam um aumento de um factor de cerca de 2-3, ou ainda mais, da concentração em anticorpos IgG IgM para os ratinhos que receberam a vacina e que beberam água adicionada com o agente C (invenção, grupo 4), em relação

aos ratinhos que não receberam senão a vacina apenas (testemunho, grupo 3). Pelo contrário, não se observa diferença entre as concentrações em anticorpos IgA para os ratinhos deste grupo 3 e 4.

EXEMPLO 3

Ê Inoculado um leite de vaca com 3Z em volume de uma cultura de inseminação pura do comércio, contendo cerca de 10 células de Lactobacillus bulgaricus por ml. Incuba-se durante 5 horas a 40°C. Obtem-se uma cultura pura de L. bulgaricus contendo 10° células deste microorganismo por ml e apresentando um valor de Ph de 4,6.

Adicionam-se á cultura 20 g/ml de lisozima de coalho. Incuba-se durante 12 horas a 25°C.

Obtem-se assim um agente lmunoestimulante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramil-péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, péptidoglicanos das paredes de 10 células de L. bulgaricus.

EXEMPLO 4

Procede-se da maneira descrita no exmplo 3, até á obtenção da cultura pura de L. bulgaricus.

Adicionam-se ã cultura 1Z de coalho líquido contendo ela própria cerca de 4Z de lisozima. Incubase durante 8 horas a 20^cC.

Ê assim obtido um agente ímunoestimu— lante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramÍÍ-péptÍdos, por hidrólise com a lisozima de coalho, os péptldoglica— 8 * nos das paredes de 10 células de L. bulgaricus.

EXEMPLO 5

E inoculado um leite de vaca com 5Z em volume de uma cultura de inseminação mista contendo, por ml, cerca de 5x10? de Lactobacillus bulgaricus, e cerca de 2x10 células de Streptococcus thermophilus obtidos a partir de culturas comerciais. Incuba-se a 43°C durante 3

horas. Obtem-se um iogurte contendo cerca de 2x10 células de L. bulgaricus e cerca de 10° células de S. thermophilus por ml.

Adicionam-se a este iogurte 50 g de lisozima de coalho por ml. Incuba-se durante 12 horas a 25^BC e arrefece-se a 4^aC.

Obtem-se assim um produto do tipo iogurte que apresenta as propriedades de um agente imunoestimulante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramilpéptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, dos péptidoglicanos das paredes de 2x10? células de L. bulgaricus.

EXEMPLO 6

Procede-se da forma descrita no exemplo 5 até é obtenção do iogurte. Adicionam-se a este iogurte IX de coalho liquido contendo 4X de lisozima. Deixa-se incubar durante 24 horas a 25°C.

Obtem-se assim um produto do tipo iogurte que apresenta as propriedades de um agente imunoestimulante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramilpéptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, dos péptidoglicanos das paredes de 2x10? de L. bulgaricus.

EXEMPLO 7
	Centrifuga-se o	produto obtido	no
exemplo	6 e recolhe-se o soro lácteo.	Este representa	ele
próprio	um agente imunoestimulante rico	em derivados de	N-

acetil-muramil-péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, de péptidoglicanos de paredes celulares de L. bulgaricus.

EXEMPLO 8

Inocula-se um soro lácteo doce de queijo com uma cultura de inseminação de Lactobacillus bulgaricus. Incuba-se durante 6 horas a 42^QC.

Arrefece-se a 25°C. Adiciona-se IX . de coalho contendo 42 de lisozima. Incuba-se durante 18 horas * a 25^fiC.

fi obtido um rico em derivados de N—acetil—mnramil com lisozima de coelho, de péptidogli res de L. bulgaricus.

Claims

R Ε I V I N D I C A Cl agente imunoestiaulante -péptidos. por hidrólise canos de paredes célula- I

- I^a Processo am agente iraanoestimulante, caracteri cora lisozima os pêptido-glicanos da pe as lácticas sensíveis ao lisozima, acetil-muramil-péptidos.

- 2^a Processo d cação 1, caracterizado por a referida vel ao lisozima ser a Lactobacillus bu

- 3^a para a preparaçao de zado por se hidrolisarem rede celular de bactérioara se derivarem os Waccrcio ccji a •ívmai- ¹ bactéria Irctíca 3snsi· Igaricjs.

Processo d cação 1, caracterizado por a lisoz coalho, sob a forma purificada ou coalho.

- 4^a Processo d cação 1, caracterizado por o lisoz clara de ovo.

- 5^a Processo de caçao 2, caracterizado por, para se i· bulgaricus a hidrolisar, se ino um meio de cultura sintético com uma deste microorganiamo, e se incubar <

κ acordo com a reivindi- i i.ma ser um lisozima de ί sob a forma do próprio !

a acordo com ε reivindima ser um lisozima de acordo com a reivindiobterem as células de ular leite de vaca ou | cultura de inseminação j lurante 3-6 horas a 37- í

- 13 45®C _ 6^a Processo de acordo com a reivindição 1, caracterizado por se efectuar a hidrólise á 15-37°C, durante 1—24 horas, com a ajuda de 1—500 ug lisozima por ml de uma cultura contendo ΙΟ^-ΙΟ^θ células de bactérias lácticas sensíveis ao lisozima por ml.

- 7» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um agente imunoestimulante da resposta imunitária às bactérias entero-patogánicas gramnegatlvas.

- 8^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um agente imunoestimulante da resposta imunitária à 15. coli.

A requerente reivindica a prioridade do pedido suíço apresentado em 13 de Dezembro de 1989, sob o n°. 4484/89-4.