PT96167A

PT96167A - Processo para a preparacao de um agente imunoestimulante compreendendo derivados de n-acetil-muramil-peptidos

Info

Publication number: PT96167A
Application number: PT96167A
Authority: PT
Inventors: Harriet Link; Jean-Jacques Pahud
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-12-13
Filing date: 1990-12-12
Publication date: 1991-09-30
Also published as: US5185321A; DE69022005T2; DK0432490T4; CA2030951C; NO310498B1; NO905228D0; ZA909658B; JPH03255034A; DE69022005T3; EP0432490A3; AU643728B2; AU6702190A; PT96167B; ES2076280T3; DE69022005D1; GR3017428T3; CA2030951A1; EP0432490B1; MX172984B; IE904323A1

Description

de invenção de SOCIÊTfi DES PRODUITS NESTLÊ S.A., suiça, industrial e comercial, com sede em Vevey, Salça, (inventores: Harriet LinK Jean-Jacques Pahud, residente na Suiça), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE HM AGENTE IMONOES-TIMULANTE COMPREENDENDO DERIVADOS DE N-ACETIL-MDRAMIL-PÊPTIDOS"

DESCRIÇÃO A presente invenção tem por objecto a preparação de um agente imunoestimulante bem como a utilização deste agente ou deste processo no domínio dos leites fermentados. fi conhecido um processo para a prepa-raçao de um agente anti-carcinogénico, no qual se cultiva um lactobacilo nomeadamente o lactobacillus bulgaricus, se hidrolisa este bacilo com uma enzima proteolltica e se extrai do hidrolisado um produto rico em proteína e em ácido ribonu-clelco que apresenta uma actividade anticarcinogénia. fi também conhecido um processo para a preparação de um produto dietético à base de leite para crianças, no qual se suplementa um leite, acidificado pelo Lactobacillus acidophilus, com oligoelementos, vitaminas e uma solução de lisozima. Esta ultima parece substituir a liso-zima presente no leite maternal e melhorar a conservação, o gosto e a textura deste produto dietético. A presente invenção tem por objectivo . propor um agente imunostimulante eficaz, que ee pode obter | a partir de uma bactéria láctea, e é particularmente indicado

ΙΜΜΜίΐ para uma utilização no domínio dos leites fermentados.

Para sete efeito, o agente Innnosti-mulante de acordo com a presente invenção compreende os diferentes derivados de N-acetil-muramil-péptidos por hidrólise com a lisozima de péptidoglicanos da parede celular de bactérias lácteas sensíveis á lisozima, nomeadamente Lactobacillus bulgaricus.

Além disso, no processo para a preparação de um agente imunoestimulante de acordo com a presente invenção, é feita a hidrólise com a lisozima dos petidoglicanos da parede celular das bactérias lácteas sensíveis ã lisozima, aomeadaraente o Lactibacillus bulgaricus, para se obterem os N-acetll-muramil-péptidos. Constatou-se com efeito que esse agente apresenta um efeito estimulante notável da resposta imunitária, nomeadamente da resposta imunitária ás bactérias enteropatogénicas gram-negativas, tais como por exemplo, E.coli.

Esse agente presta-se particularmente bem a uma utilização num leite fermentado, nomeadamente num iogurte ou num produto lactossérico.

Além disso, esse processo presta-se bem a uma utilização, ou seja pode ser directamente realizado no quadro da preparação de um leite fermentado, nomeadamente de um iogurte, ou na preparação de um produto lactossérico. A presente invenção engloba assim igualmente estas utilizações.

Na presente descrição, é estimado o efeito imunoetimulante do presente produto de forma qualitativa do modelo do ratinho. Sabe-se que os resultados desses ensaios não se podem transpor directamente para o homem, eles fornecem contudo indicações úteis.

Na presente descrição, a expressão "bactérias lácteas sensíveis á lisozima" é utilizada no sentido de bactérias lácteas em que a parede celular compreende os pépfcidoglicanos hidrolisáveis pela lisozima, ou degradáveis 2

em N-acetil-muramil-péptidos sob a acção da lisozima.

Para realizar o presente processo, pode ser utilizada uma cultura ou suspensão pura de bactéria láctea sensível á lisozima, ou uma cultura ou uma suspensão mista compreendendo bactérias sensíveis e não sensíveis á lisozima. Pode-se nomeadamente utilizar uma cultura pura de Lactobacillus bulgaricus ou uma cultura mista de Lactobacillus bulgaricus e de Streptococcus thermophllus, ou uma cultura de iogurte, como aquela que se encontra no comércio, por exemplo.

Pode ser utilizada em particular uma cultura ou uma suspensão contendo 10^ a 10*® células de bactérias lácteas sensíveis ao lisozima por cada mililitro. Para produzir uma quantidade pretendida de células numa concentração suficiente, pode-se inocular um meio de cultura adequado com uma cultura de inseminação da referida bactéria e incubar a uma temperatura e a um valor de Ph favoráveis ao crescimento da bactéria, durante um tempo suficiente para restabelecer no meio de cultura uma concentração de células comparável á da cultura de início. 0 referido meio de cultura adequado pode ser um meio lácteo, como por exemplo leite de vaca desnatado ou não, um soro lácteo, fluido obtido da permeação de ultraflltração, ou um meio sintético, por exemplo.

Utiliza-se de preferência uma cultura de L.bulgaricus. Para preparar esta cultura, pode-se inocular um leite de vaca, ou um melo sintético como por exemplo um melo MRS (Difco), por exemplo, com uma cultura de inseminação deste microoganismo e incubar durante 3-6 horas a 37-45°C. Se se incubar durante menos de 3 horas ou a menos de 37°C, corre-se o risco de permanecer na fase dita de latente, também dita fase de arranque da multiplicação do mlcroorganismo, ou de não se ficar um tempo suficiente na fase dita exponencial também referida como fase de multiplicação exponencial do mlcroorganismo.

Pelo contrario, se se incubar durante maie de 6 horas, corre-se o risco de entrar na fase estacionã- 3 -

ria» também referida fase em que a multiplicação do microorge- aiemo pera e no decurao da qual a composição da parede celular se pede modificar de forma desfavorável. Finalmente acima de 45®C a temperatura já não é favorável ao crescimento do L. bulgaricus.

Realiza-se assim a referida hidrólise com a lisozima. Esta pode ser obtida de qualquer fonte adequada, nomeadamente coalho, em particular coalho de ruminante (sobretudo de bovino), ou gema de ovo sob a forma pura ou impura. Numa forma de execução particular do presente processo utlllza-se o próprio coalho sem o ter separado da lisozima. A hidrólise dos referidos péptidogli-canos pode ser realizada na parede celular das referidas bactérias lácteas a 15-37BC, durante 1-48 horas, de preferência 12-24 horas, com o auxilio de 1-500 g de lisozima por ml de uma cultura contendo 10®-10*® células destas bactérias por ml, por exemplo, a um valor de Ph favorável á acçáo da lisozima utilizada. Este valor de Ph é assim de cerca de 4-6 para uma lisozima de coalho de cerca de 6-8 para uma lisozima de gema de ovo, por exemplo.

Para realizar as utilizações de acordo com a presente invenção, pode-se por um lado adicionar este tal agente, tal e qual ou sob a forma de um extracto aquoso, a um leite fermentado como por exemplo, iogurte liquido ou agitado, ou a um produto lactossérico como por exemplo uma bebida á base de soro lácteo. A quantidade de agente adicionado pode corresponder á quantidade de N-acetil-muramll-péptidos derivados das paredes de 10^ a 10*® células de bactérias lácteas sensíveis á lisozima, por ml do referido leite fermentado com o referido produto lactossérico, por exemplo.

Pode-se tsmbém realizar a referida hidrólise num leite fermentedo, nomeadamente pelo L.bulgaricus isolado ou em combinação com S.thermophilus ou num soro lácteo por exemplo. No caso do leite fermentado, pode-se adicionar a lisozima ao leite antes, durante ou depois da sua fermenta- 4

ção, a uma taxa de cerca de 1-500 g de lisozima por ml de loite por exemplo. Ro caso do soro lácteo, pode-se adicionar as referidas bactérias sensíveis á lisozima, a qual se pode também, se desejado, cultivar, e pode-se adicionar, se nece-sãrio, lisozima.

Os exemplos a seguir apresentados são a título de ilustração da presente invenção. As percentagens são dadas em peso, a menos que se diga o contrário. 0 efeito imunoestlmulaate, também referido como efeito estimulante da resposta imunitária, é calculando por intermédio de uma determinaçãodé concentrações em anticorpos específicos, no ratinho, por melo do ensaio de ELISA.

Este último ensaio, bem conhecido dos especialistas, consiste em dosear uma enzima que marca um anticorpo que se liga a um anticorpo específico de uma imunoglobulina, como por exemplo IgG, IgM ou IgA, que se liga a um antigénio, tal como um antigénio bacteriano, por exemplo, ele próprio fixado sobre um suporte insolúvel em meio aquoso. EXEMPLO 1

Prepara-se um meio de cultura sintético, consistindo num melo MRS (Difco Lab., Estados Unidos da América) modificando, apresentando a composição . seguinte (expressa em grama de matéria seca por litro do melo): hidrolisado de protélnas 10 extracto de carne 10 extracto de levedura 5 glicose 20 lactose 10 émulsimante 1 citrato de amónio 2 acétato de sódio 5

MgS04 0,1

MnS°4 o,05 K2HP04 2

Este meio de cultora sintético apresenta um valor de Ph de 6,5. Esterilizo-ee durante 15 minutos a 121®C. Inocula—se com uma cultura de inseminação de Lactobacillus bulgaricus, neste caso uma cultura de L.bulgaricus (National Culture of Food Bactéria» AFRC Instituite of Food Research, Reading Laboratory, Shlnfield, Reading, R62 UR).

Incuba-se a 40°C durante 6 horas. Separa-se a biomassa, lava-se e separa-se em duas partes A e B. Coloca-se a parte A em suspensão num tampão de fosfato 0,02 M a Ph 7 e a parte B em suspensão num tampão de acetato 0,01 M a Ph 5, a uma taxa de 2x10^ células do mlcroorganlsmo por ml.

Hidrolisam-se as células de L.bulgaricus da suspensão A com uma lisozima de gema de ovo comercial (Calblochem, Républica Federal da Alemanha). Hidrolisam-se as células de L.bulgaricus da suspensão B com uma lisozima de coalho extraída e purificada por J.J Pahud e col. em Bio-chem.J.201,661-664(1982).

Para realizar esta operação, adicionam—se 16 g de lisozima por ml de suspensão e incuba-se a 25eC durante 18 horas. Centrifuga-se e filtra-se o sobrena-dante de uma membrana com poros de 0,45 m de diâmetro. São assim obtidos dois agentes imuno-estimulantes A e B sob a forma de soluções estéreis ou extrac-tos que contêm os derivados de N-acetll-ouramil-péptidos, por hidrólise com a lisozima de gema de ovo (A) ou de coalho

A (B) com paredes celulares de 2x10 de L.bulgaricus por ml.

Verifica-se o efeito imunoestlmulante destes agentes A e B no ratinho da raça "Svlss white" (Tu-ttlingen, Républica Federal da alemanha), de acordo com o protocolo exprlmental seguinte:

Seis grupos numerados de 1 a 6 compreendendo cada um 6 ratinhos de 18-29 g recebem uma dieta normal e água â vontade. A partir do início da experiência no dia designado por 0, procede—se a entubações orais nos 6-

dias 1, 3, 5, 15, 19 e 30. A dieta e a água são retiradas dos ratinhos 3 horas antes de cada uma das entubações e restabelecidas imediatamente a seguir. São recolhidos soros dos ratinhos nos dias 0, 29 e 40. Ê efectuada uma lavagem intestinal no dia 40.

Cada entubação oral é realizada cora uma dose de 0,5 ml por ratinho. A composição destas doses é a mesma para os ratinhos do mesmo grupo, mas ela varia de grupo para grupo conforme o Quadro I a seguir apresentado. Neste Quadro, a rubrica "vacina" Indica que se colocaram - Q » em suspensão, por dose, 5x10 células de Eschericia coli 0111sK58 em que uma metade foi desactivada durante 1 hora de glutaraldeldo a 0,05% (Hilpert e coll., Food and Immunology 1977, Ed.L.Hambraeux, L.A.Hanson, H.Hc Farlane, Svedish nutri-tion Foundation Symposium XIII, 182-196). As letras CT designam a toxina da cólera, que é um agente imunoestimolante bem conhecido do especialista. A expressão "água fisiológica" designa água destilada contendo 0,9% de NaCl.

QUADRO I

Grupo Liquido de base Substâncias adicionadas NaHCo, outros % 1 água fisiológica 3 - - 2 tv 3 1 g CT 3 ft 3 vacina - 4 91 3 vacina g CT 5 agente A 3 vacina - 6 agente B 3 vacina - 7

Determina-se por meio do ensaio de ELISA a concentração em anticorpos IgG e IgM dos soros, bem como a concentração em anticorpos IgG e IgA dos fluídos de lavagem intestinal retirados dos ratinhos. 0 Quadro II a seguir apresentado mostra os valores determinados para cada um dos 6 ratinhos do mesmo grupo. Os asteriscos indicam que para os números assim marcados, a probalidade de cometer um erro ao pretender que eles são diferentes do número corres- pondente (mesma coluna) do grupo 3 (testemunho, ratinhos que não receberam senão a vacina) é inferior a 5%. Por outras palavras , para os números marcados com um asteriscos , o valor "p", determinado por análise de variância unilateral , ê infe- rior a 0 ,05. QUADRO II Grupo ex soro: ex fluido intestinal: IgG IgM IgG IgA J29 J40 j29 J40 J40 j40 1 69 57 36 39 8 8 2 96 94 25 80 10 11 3 189 489 31 83 11 18 4 572* 759 113 123* 13 24 5 525* 828 104 141* 18 53* 6 397 1362* 39 45 24* 72*

Constata-se assim que os soros retirados nos dias 29 e 40 apresentam um aumento do factor de cerca de 2-3 da concentração em anticorpos IgG para os ratinhos que receberam a vacina e os agentes A ou B (invenção, grupos 5 e 6) ou CT (comparação, grupo 4) em relação aos ratinhos que não receberam senão a vacina (testemunho, grupo 3). 0 aumento da concentração em anticorpos IgH pelo contrário não é constatada senão para o agente A (invenção, grupo 5) e CT (comparação, grupo 3). 8

A concentração em anticorpos IgG e IgA nos fluidos intestinais dos ratinhos que receberam a vacina e os agentes A ou B (invençã, grupos 5 e 6) apresenta igualmente um aumento muito forte em relação aos fluidos intestinais dos ratinhos que receberam apenas a vacina (testemunho, grupo 3). EXEMPLO 2

Prepara-se uma biomassa de L. bulgari-cus da maneira descrita no exemplo 1. Coloca-se em suspensão num tampão de acetato 0,01 M a Ph 5, á taxa de 1,6x10^ células do microorganisrao por ml.

Adiclona-se a esta suspensão 1% de coalho liquido contendo 4% de lisozima (Laboratoire Présure Granday, Beaune, França). Incuba-se com ligeira agitação dorante 18 horas a 25°C. Centrifuga-se e filtra-se o sobrena-dante numa membrana de poros com 0,45 m de diâmetro.

Obtem-ee assim um agente imunoestlmu-lante C sob a forma de solução estéril ou extracto contendo os derivados de N-acetil-muramil-péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, sob a forma do próprio coalho, das paredes celulares de 1,6x10^ células de L. bulgaricus por mililitro.

Verifica-se o efeito imunoestimulante deste agente C sobre o ratinho de raça "Swiss white" de maneira semelhante a descrita no exemplo 1, com a exepção do agente imunoestimulante não ser administrado aos ratinhos por entuba-çao, mas de ter sido adicionado é égua que bebem é vontade, a razão de 1 parte de agente para 50 partes de égua. Durante toda a experiência, colocam—se 10 ml de lipido por 24 horas a disposição dos ratinhos em que a necessidade diária á de cerca de 4-7 ml.

Quatro grupos de 6 ratinhos cada um, numerados de 1-4, recebem uma dieta normal. Dois destes grupos recebem égua fisiológica vontade. Os outros dois rece- - 9 -

bem água fisiológica á qual se adicionou o agente imunoestimu-lante C. Por outro lado, os ratinhos de dois destes grupos recebem igualmente uma vacina de E. coli por entubação oral, de maneira semelhante á descrita no protocolo exprimental do exemplo 1. 0 Quadro III. a seguir apresentado resume este programa de alimentação e/ou de vacinação dos ratinhos dos diferentes grupos.

0DADR0 III Grupo N Liquido Intubação 1 água fisiológica - 2 água fisiológica+agenteC - 3 água fislológica+agente C vacina 4 água fisiológica+agente C vacina Determina-se por meio do ensaio ELISA a concentração em anticorpos IgG e IgM dos soros, bem como a concentração em anticorpos IgA dos fluidos de lavagem intestinal retirados dos ratinhos. 0 Quadro IV a seguir apresentado mostra os valores relativos obtidos.

QUADRO IV

Grupo ex soro ex fluido intestinal

IgG IgM IgA j29 j40 J29 J40 J40 1 77 68 54 101 2 2 96 78 37 66 3 3 1427 1213 71 94 25 4 2365 3180* 219* 360** 31 *-valorMpn»0,065 **-valor"pM=0,014

Constata-se assim que os soros retirados nos dias 29 e 40 apresentam um aumento de um factor de cerca de 2-3, ou ainda mais, da concentração em anticorpos IgG IgM para os ratinhos que receberam a vacina e que beberam água adicionada com o agente C (invenção, grupo 4), em relação 10

aos ratinhos que nao receberam senão a vacina apenas (testemunho, grupo 3). Pelo contrário, não se observa diferença entre as concentrações em anticorpos IgA para os ratinhos deste grupo 3 e A. EXEMPLO 3 Ê Inoculado um leite de vaca com 3% em volume de uma cultura de inseminação pura do comércio, 8 # contendo cerca de 10 células de Lactobacillus bulgaricus por ml. Incuba-se durante 5 horas a 40°C. Obtem-se uma cultura pura de L. bulgaricus contendo 10 células deste microorganis-mo por ml e apresentando um valor de Ph de 4,6.

Adiclonam-se á cultura 20 g/ml de lisozima de coalho. Incuba-se durante 12 horas a 25°C.

Obtem-se assim um agente imunoestimu-lante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramil-pépti-dos, por hidrólise com lisozima de coalho, péptidogllcanos das paredes de 10 células de L. bulgaricus. EXEMPLO 4

Procede-se da maneira descrita no ezmplo 3, até é obtenção da cultura pura de L. bulgaricus. Ádicionam-se é cultura 1% de coalho líquido contendo ela própria cerca de 4% de lisozima. Incuba-se durante 8 horas a 20fiC. E assim obtido um agente imunoestimu-lante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramil-pépti-dos, por hidrólise com a lisozima de coalho, os péptidoglica-nos das paredes de 10° células de L. bulgaricus. EXEMPLO 5 E inoculado um leite de vaca com 5% em volume de uma cultura de inseminação mista contendo, por ml, cerca de 5x10^ de Lactobacillus bulgaricus, e cerca de 2x10 células de Streptococcus thermophilus obtidos a partir de culturas comerciais. Incuba-se a 43*C durante 3 11

horas, de L. por ml

Obtem-se um Iogurte contendo cerca de 2xl07 células 8 # bulgaricus e cerca de 10° células de S. thermophllus

Adicionam-se a este iogurte 50 g de lisozima de coalho por ml. Incuba-se durante 12 horaa a 25°C e arrefece-se a 4°C.

Obtem-se assim um produto do tipo iogurte que apresenta as propriedades de um agente imunoesti-mulante contendo por ml os derivados de N-ecetil-muramil- péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, dos péptido-glicanos das paredes de 2xl07 células de L. bulgaricus. EXEMPLO 6

Procede-se da forma descrita no exemplo 5 até ã obtenção do iogurte. Adicionam-se a este iogurte 1% de coalho liquido contendo 4% de lisozima* Deixa-se incubar durante 24 horas a 25aC.

Obtem-se assim um produto do tipo iogurte que apresenta as propriedades de um agente imunoesti-mulante contendo por ml os derivados de N-acetil-muramil- péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, dos péptido-glicanos das paredes de 2xl07 de L. bulgaricus. EXEMPLO 7

Centrifuga-se o produto obtido no exemplo 6 e recolhe-se o soro lácteo. Este representa ele próprio um agente imunoestlmulante rico em derivados de N-acetll-muramil-péptidos, por hidrólise com lisozima de coalho, de péptidoglicanos de paredes celulares de L. bulgaricus. EXEMPLO 8

Inocula-se um soro lácteo doce de queijo com uma cultura de inseminação de Lactobacillus bulgaricus. Incuba-se durante 6 horas a 42°C.

Arrefece-se a 25°C. Adiciona-se 1Z de coalho contendo 4% de lisozima. Incuba-se durante 18 horas a 25®C. 12

Claims

i agente imunoestimuXante -péptidos,, por hidrólise canos de paredes célula- rata Ê obtido un rico em derivados de N-acetll-muramil com lisozima de coalho, de páptidogli ree de L. bulgaricus. REIVINDICACj - 1· - Processo um agente imunoestimulante, caracteri: com lisozima os pêptido-gllcanos da ps as lácticas sensíveis ao lisozima, acetil-muramil-péptidos.
- 2» - Processo df cação 1, caracterizado por a referidal vel ao lisozima ser a Lactobacillus bul - 3a -Processo d cação 1, caracterizado por a lisoz coalho, sob a forma purificada ou coalho. - 4a - Processo dç cação 1, caracterizado por o lisoz clara de ovo* I - 5a - Processo de cação 2, caracterizado por, para se L· bulgaricus a hidrolisar, se inoc um meio de cultura sintético com uma deste microorgauismo, e se incubar o 0 s s para a oreparaç ao de zado por se hidrolisarem rede celular de bactéri-d a r a se deriva r em os N - acera o c-j.ií a re: o ôct ãia 1? z t i z z l 1 V 1 il Cl 1 - 1 í acordo com a reivindi- ! Lroa ser um lisozima de j sob a forma do próprio j acordo com s reivindi- j '.ma ser um lisozima de i acordo com a reivindi-obterem as células de ! ular leite de vaca ou cultura de inseminação urante 3-6 horas a 37- 5 - 13 - 45°C. - 6a - Processo de acordo cora a reivindi-ção 1, caracterizado por se efectuar a hidrólise á 15-37BC, dorente 1—24 horas t cosi o ajuda de 1—500 ug lisozisia por ral de uma cultura contendo 10^-10*® células de bactérias lácticas sensíveis ao lisoziraa por ml. - 7» - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um agente imunoestimulante da resposta imunitária ás bactérias entero-patogénicas gram-negatlvas. - 8« - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um agente imunoestimulante de resposta Imunitária â E. coli. A requerente reivindica a prioridade do pedido suíço apresentado em 13 de Dezembro de 1989, sob o n°. 4484/89-4. Lisboa, 12 de Dezembro de 1990. 0 AGENTE OFICIAL DA PB0PBIEDADE IfTDtJSTBIAL

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