JP2001513990A - 免疫増強作用を有する乳酸菌 - Google Patents

免疫増強作用を有する乳酸菌

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規な細菌株ラクトバチルス・ラムノサスHN001 及びHN067 、ラクトバチルス・アシドフィルスHN017 、及びビフィドバクテリウム・ラクチスHN019 に関する。各菌株は、摂取後、免疫増強作用を発揮する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、乳酸菌の新規な菌株、及び、免疫増強のための使用に関する。
【０００２】 背景技術 乳酸菌(LAB) を含有する製品を摂取することは、免疫増強を含む広範な健康に
役立つ。多数の乳酸菌株が存在するが、その内いくつかの株のみが、健康促進作
用を有する。これらの菌における酸及び胆汁酸塩に対する耐性、粘膜上皮細胞へ
の接着性、並びに胃腸管通過後の生存性が、健康促進菌株を選択する重要な判断
基準になる。これまで、少数の乳酸菌株が健康上の効果を有することが示された
。
【０００３】 ニュージーランド特許248057では、小腸の粘膜上皮細胞への接着性が良い、す
なわち治療に使用される乳酸菌株が知られている。この特許に記載された当該微
生物は、自然免疫（貪食作用）及び獲得免疫（抗体応答及びリンパ球増殖応答）
の両方を増強する。
【０００４】 食作用を含む広範な免疫応答を増強する他の乳酸菌株が求められている。 本発明の対象は、この様な要望を達成する方法であり、少なくとも、免疫増強
作用を有する乳酸菌の有用な選択方法を提供することである。
【０００５】 発明の説明 従って、本発明の１つの点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・ラムノサス
(Lactobacillus rhamnosus)HN001(AGAL 寄託番号NM97/09514,1997 年８月18日付
け) の生物学的に純粋な培養菌から成る。
【０００６】 本発明の別の点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobaci
llus rhamnosus)HN067(AGAL 寄託番号NM97/01925,1998 年２月17日付け) の生物
学的に純粋な培養菌から成る。
【０００７】 本発明の別の点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lacto
bacillus acidophilus)HN017(AGAL 寄託番号NM97/09515,1997 年８月18日付け)
、ラクトバチルス・ラムノサスHN001 、ラクトバチルス・ラムノサスHN067 、又
はビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)HN019(AGAL寄託番
号NM97/09513,1997 年８月18日付け) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌を、
免疫刺激する濃度で、生理学的に適する賦形剤又は希釈剤と共に含んでいる組成
物から成る。
【０００８】 １つの態様では、その組成物は、２つ以上の前記菌株を含有する。 好ましくは、その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤は、食物である。 好ましくは、その食物は、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳のい
ずれかである。 あるいは、その組成物は医薬用であり、その賦形剤又は希釈剤は、医薬に適す
るものである。
【０００９】 本発明には、下記のいずれかの菌株の相同菌又は変異菌の、免疫増強作用を有
する、生理学的に許容される、生物学的に純粋な菌株も含まれる： L.アシドフィルスHN017 、 L.ラムノサスHN001 、 B.ラクチスHN019 、又は L.アシドフィルスHN067 。
【００１０】 別の態様では、本発明は、大まかに言うと、自然免疫及び獲得免疫を増強する
方法であって、前記の生物学的に純粋な培養菌のいずれかを、免疫刺激する用量
で、哺乳動物に投与することを含んで成る方法から成る。
【００１１】 別の態様では、２又は３つの前記菌株の実質的に生物学的に純粋な培養菌を用
いる。 好ましくは、その培養菌を、生理学的に適する賦形剤又は希釈剤と混合した形
で投与する。 好ましくは、その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤は、食物である。 好ましくは、その食物は、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳であ
る。
【００１２】 更に、本発明は、大まかに言うと、本明細書中で指摘した部材、要素及び特徴
に、個別又は集合的に、並びに、その部材、要素又は特徴の２つ以上を組み合せ
たものに関する。本発明の分野における既知の等価物を有する本発明の特定な対
象が本明細書に記載され、この様な既知の等価物も、独立なものとして本明細書
に組み込む。
【００１３】 発明の実施態様 下記の４種類の細菌株の凍結乾燥培養菌は、Australian Government Analytic
al Laboratories(AGAL), The New South Wales Regional Laboratory, 1 Suakin
Street,Pymble,NSW2073,Australiaに寄託されている。寄託の詳細は、以下の通
りである： 菌株 寄託番号 寄託日 ─────────────────────────────────── L.アシドフィルス(L.acidophilus)HN017 NM97/09515 1997年８月18日 L.ラムノサス(L.rhamnosus)HN001 NM97/09514 1997年８月18日 B.ラクチス(B.lactis)HN019 NM97/09513 1997年８月18日 L.ラムノサス(L.rhamnosus)HN067 NM97/01925 1998年２月11日 前記の４菌株は、自然免疫及び獲得免疫の両応答を含む広範囲な免疫応答を増
強することが判明した。
【００１４】 実施例１：形態及び一般特性 菌株の分類学的特性を確認するために、RAPD分析、16S rRNAの配列決定及びSD
S-PAGE分析を行った。L.アシドフィルスHN017 は、ニュージーランド特許248057
のL.アシドフィルス(LC1) と遺伝子的に異なることも判明した。
【００１５】 L.ラムノサスHN067 の分類学的特性を確認するために、RAPD分析、16S rRNAの
配列決定及びSDS-PAGE分析を行った。L.ラムノサスHN067 の分子レベルの特性を
調べるために、種特異的プライマーPr I（順方向）5'-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3'
及びPha II（逆方向）5'-GCGATGCGAATTTCTATTATT-3' を用いた。
【００１６】 表１及び２に、この菌株の形態及び糖発酵特性を詳細に示す。 表１：形態及び他の特性 ────────────────────────────────────L.アシドフィルスHN017 MRS ブロスで培養した場合、短から中間長の桿菌であり、丸まった末端を有し
、通常単独又は対又は短鎖状で存在する。 グラム陽性、非胞子形成、カタラーゼ陰性、通性嫌気性桿菌、増殖至適温度37
±１℃、増殖至適pH 6.0-6.5、偏性ホモ発酵型細菌であり、ブトウ糖から気体生
成しない。L.ラムノサスHN001 MRS ブロスで培養した場合、短から中間長の桿菌であり、角張った末端を有し
、鎖状で存在し、通常0.7x1.1x2.0-4.0 μm である。 グラム陽性、非可動、非胞子形成、カタラーゼ陰性、通性嫌気性桿菌、増殖至
適温度37±１℃、増殖至適pH 6.0-6.5、通性ヘテロ発酵型菌であり、ブトウ糖か
ら気体生成しない。B.ラクチスHN019 微好気性から嫌気性までの桿菌、特徴的形態を有する、例えば、TPY 寒天穿刺
培養した場合、細胞は中位に拡大した形状、Ｖ型状又は柵状を示し、0.05% シス
テイン塩酸塩を含むMR5 ブロスで培養した場合、細胞は中位に拡大した形状と棍
棒状（へら状の先端）を示す。 グラム陽性、非可動、非胞子形成、カタラーゼ陰性桿菌、増殖至適温度37±１
℃、増殖至適pH 6.0-7.0、フルクトース-6- リン酸ホスホケトラーゼ陽性。L.ラムノサスHN067 MRS ブロスで培養した場合、短から中間長の桿菌であり、角張った末端を有し
、鎖状で存在し、通常0.7x1.1x2.0-4.0 μm である。 グラム陽性、カタラーゼ陰性、非可動、非胞子形成、通性嫌気性桿菌、増殖至
適温度37±１℃、増殖至適pH 6.0-6.5、通性ヘテロ発酵型菌であり、ブトウ糖か
ら気体生成しない。 ────────────────────────────────────
【００１７】 表２：選択されたラクトバチルス菌及びビフィドバクテリウム菌の炭水化物の発
酵様式 試料番号 細菌名 評価点＊ ──────────────────────────── １ L.アシドフィルスHN017 5755546 ２ L.ラムノサスHN001 5757177 ３ B.ラクチスHN019 1051622 ４ L.ラムノサスHN067 5757175 この糖発酵様式を決定するために、API 50 CH 糖発酵キットを用いた。 ＊この評価点は、22の著名な糖の評価点に基づく(Bergey's manual) 。
【００１８】 実施例２：腸細胞への接着 前記菌株が人間の小腸上皮細胞に接着する性質を、分化した株化細胞(HT-29及
びCaCo-2) を用いて、インビトロで検査した。カバーグラス上でHT-29 及びCaCo
-2細胞を単層に増殖させ、これをマルチウエルディッシュ内に置いた。この単層
培養細胞に108cfu/ml の乳酸菌培養液１mlとDMEM培地１mlとを加え、そして10%C
O2/90%大気中、37℃で１時間インキュベーションした。この単層培養をPBS で４
回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色し、そして上皮細胞に接着している
細菌の数を顕微鏡で計数した。平均して20視野を観察し、その結果を表３に示す
。
【００１９】 表３：株化細胞HT-29 及びCaCo-2との接着＊ 菌株 HT-29 CaCo-2 ──────────────────────────── L.アシドフィルスHN017 98±17 171±16 L.ラムノサスHN001 161±18 218±35 B.ラクチスHN019 188±27 194±25 ＊細菌数（平均±SEM)/100上皮細胞
【００２０】 実施例３：自然免疫及び獲得免疫の増強 マウスにおける３菌株L.ラムノサスHN001 、L.アシドフィルスHN017 及びB.ラ
クチスHN019 の免疫増強効果を、血液リンパ球及び腹膜マクロファージの食作用
の測定、及び、ワクチン反応を擬態するために用いたタンパク質抗原に対する特
異的抗原の濃度の測定から、調べた。
【００２１】 下記の実験方法を用いた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。 2. マウスを無作為に異なる処置群に分けた（表４）。 3. 10日間、マウスに１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルス
HN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を与えた。コントロールマウ
スには、50μl の脱脂乳のみを与えた。 4. 実験中全てのマウスに、脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。
【００２２】 L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を摂取し
たマウスから得た血液リンパ球及びマクロファージでは、それらの食作用は、コ
ントロールマウスの細胞と比べて有意に大きかった（表４）。前記菌投与マウス
のリンパ球における酸素ラジカルの生産（酸化力急増）も、コントロールマウス
に比べて大きかった（データ省略）。
【００２３】 表４：食作用に対するL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 及びB.ラク
チスHN019 食事の効果 食作用を示す 食作用を示す 処置 血液リンパ球(%) 腹膜マクロファージ(%) ─────────────────────────────────── コントロール 14.33±0.87 66.1±3.5 L.アシドフィルスHN017 22.7 ±1.21** 79.0±1.0** L.ラムノサスHN001 24.84±0.93** 80.5±1.8** B.ラクチスHN019 23.19±0.95** 77.4±2.6*
【００２４】 BALB/cマウスに、10日間1 日あたり109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラム
ノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を経口投与した。フローサイトメトリーとフ
ルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜マ
クロファージの食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差
（Studentsのt 検査）：*P<0.05, **P<0.01 。
【００２５】 L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を摂取し
たマウスでは、その血清中及び腸洗浄液中の特異的IgG 抗体濃度も、コントロー
ルマウスに比べて高かった（表５）。
【００２６】 表５：血清及び粘膜の抗体応答に対するL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサス
HN001 及びB.ラクチスHN019 食事の効果 血清抗体応答 粘膜抗体応答 処置 （単位/ml) （単位/ml) ───────────────────────────────── コントロール 80.2±6.0 1350±96.0 L.アシドフィルスHN017 134.6±25.2* 1548±270.0 L.ラムノサスHN001 118.5±12.5** 1512±198.0 B.ラクチスHN019 158.1±51.6*** 1548±234.0
【００２７】 BALB/cマウスに、10日間1 日あたり109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラム
ノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を経口投与した。０日及び７日目に、コレラ
毒素（腸感染を擬態するために用いた抗原）をマウスに免疫接種した。10日目に
ELISA を用いて、血清中及び腸分泌液中の特異抗体の濃度を測定した。値は平均
±標準誤差である。対照との有意差（Studentsのt 検査）：P*=0.08, **P<0.05,
***P<0.01。
【００２８】 実施例４：４週間の乳酸菌の補充投与後の免疫刺激効果 下記の実験方法に従って、マウスにおけるL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノ
サスHN001 又はB.ラクチスHN019 の免疫刺激効果を調べた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。 2. マウスを無作為に異なる処置群に分けた（18匹／群）。 3. 環境に順化させた後（７日間）、28日間（０日〜28日目）マウスに１日あ
たり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又
はB.ラクチスHN019 を与えた。コントロールマウスには、50μl の脱脂乳（微生
物無し）のみを与えた。 4. 実験中マウスに、脱脂乳粉末ベースの食事と無制限の水を与えた。 5. 血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用、脾臓リンパ球のNK細胞活性
、T-細胞マイトジェンであるConAに対するリンパ球（脾臓細胞）の増殖応答（細
胞性免疫の指標）、及び、破傷風ワクチンに対する抗体反応を測定して、免疫刺
激効果を調べた。
【００２９】 表６から判るように、L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラ
クチスHN019 を摂取したマウスから得たリンパ球（好中球、単球及びマクロファ
ージ）では、それらの食作用（自然免疫の指標）は、コントロールマウスのリン
パ球と比べて有意に大きかった。
【００３０】 表６：L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 及びB.ラクチスHN019 食事
の効果 食作用を示す 食作用を示す 処置 血液リンパ球(%) 腹膜マクロファージ(%) ─────────────────────────────────── コントロール 15.5 72.67 L.アシドフィルスHN017 29.4** 82.2* L.ラムノサスHN001 24.2** 82.8** B.ラクチスHN019 31.1** 83.0**
【００３１】 マウス（18匹／群）に、1 日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィル
スHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を28日間与えた。28日目に
フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用い
て、血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平
均値である。対照との有意差(SAS分析）：*P<0.002, **P<0.0005。
【００３２】 28日間のL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019
の摂取は、NK細胞活性、ConAに対するリンパ球増殖応答、及び破傷風ワクチンに
対する抗体応答の増加も誘導した。これら全ての免疫能指標において、L.アシド
フィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を投与したマウスは
、コントロールマウスに比べてより高い応答を示した（表７）。
【００３３】 これらの結果を総合すると、より長い期間L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノ
サスHN001 又はB.ラクチスHN019 を補充投与することによって、自然免疫及び獲
得免疫のいくつかの現象の増強維持を誘導することができた。
【００３４】 表７：NK細胞活性、ConAに対するリンパ球増殖応答、及び破傷風ワクチンに対す
る抗体応答に対する、L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 及びB.ラク
チスHN019 食事の効果 ConAに対する 破傷風ワクチンに NK細胞活性 リンパ球増殖 対する抗体応答 処置 (%) （吸光度） （単位/ml) ─────────────────────────────────── コントロール 8.8 1.4±0.125 402.5±41.4 L.アシドフィルスHN017 9.9 1.6±0.44 923.9±116.0* L.ラムノサスHN001 11.5 1.8±0.1* 711.5±127.2* B.ラクチスHN019 10.5 1.7±0.15* 844.6±134.7*
【００３５】 マウス（18匹／群）に、1 日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィル
スHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を28日間与えた。28日目に
フローサイトメトリーとD275標識Yac-1 細胞とを用いて、脾臓リンパ球のNK細胞
活性を測定した。28日目に市販の細胞増殖キット(Boehringer Mannheim,Germany
) を用いて、ConAに対する脾臓リンパ球の増殖応答を調べた。抗体応答を調べる
ために、７日目及び21日目に破傷風ワクチン（50μl/投与,CSL,Australia) をマ
ウスに免疫接種した。ELISA によって、特異抗体濃度を決定した。このワクチン
製造業者(CSL,Australia) 製の抗原を用いて、プレートをコーティングした。値
は、18匹のマウスに基づく最小二乗の平均値である。対照との有意差(SAS分析）
：*P<0.05 。
【００３６】 実施例５：発酵品又は非発酵品による自然免疫及び獲得免疫の増強 前記菌株L.ラムノサスHN001 を利用して作られた（発酵した）ヨーグルトの免
疫増強効果を、L.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品と比較して検査した。そ
の免疫増強効果を調べるために、（末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージの）
食作用、及びB-細胞マイトジェン(LPS) に対するリンパ球増殖応答を測定した。
【００３７】 下記の実験方法を用いた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。 2. マウスを無作為に異なる処置群に分けた。 3. 実験中コントロールマウスには、全乳粉末ベースの食事を与えた。 4. 試験マウスには、１日あたり、L.ラムノサスHN001 を用いて作ったヨーグ
ルト2.5g(109cfu/日) 又はL.ラムノサスHN001 を含有する全乳2.5g(109cfu/日)
を、全乳粉末ベースの食事と共に10日間与えた。 結果： L.ラムノサスHN001 を用いて作ったヨーグルト又はL.ラムノサスHN001 を含有
する全乳を摂取したマウスでは、その末梢血リンパ球の食作用レベルは、コント
ロールマウスに比べて有意に高かった（図１）。ヨーグルト（L.ラムノサスHN00
1 による発酵品）又はL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品のいずれであるか
に関係なく、L.ラムノサスHN001 を投与した場合に、この増加が観察された。L.
ラムノサスHN001 を用いた発酵品ヨーグルトを摂取したマウスとL.ラムノサスHN
001 を含有する全乳品を摂取したマウスとの間で、食作用レベルに差は無かった
。
【００３８】 前記の発酵品及び非発酵品の両方の場合で、マウスにおけるLPS に対するリン
パ球増殖応答は、コントロールの場合に比べて高かった（表８）。この応答にお
いても、L.ラムノサスHN001 による発酵品を摂取したマウスとL.ラムノサスHN00
1 を含有する非発酵品を摂取したマウスとの間で差は無かった。
【００３９】 表８：リンパ球増殖応答に対するL.ラムノサスHN001 の発酵品及び非発酵品の効
果 LPS に対するリンパ球増殖 処置 （吸光度） ────────────────────────────────── コントロール（全乳品） 0.4699±0.028 L.ラムノサスHN001 による発酵全乳 0.5361±0.028 L.ラムノサスHN001 を含有する非発酵全乳 0.5518±0.028*
【００４０】 L.ラムノサスHN001 によるヨーグルト（発酵品）又はL.ラムノサスHN001 を含
有する非発酵品のいずれかの形で109cfu(1日あたり）のL.ラムノサスHN001 を含
有する乳ベースの食事で、14日間BALB/cマウスを飼育した。コントロールマウス
には、乳酸菌無しの乳ベースの食事を与えた。リンパ球の増殖応答を、96時間イ
ンキュベーションにおいて、最後の16時間5-ブロモ-2'-デオキシウリジンを取り
込ませ、比色定量的に測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差（
Students t検査）：P=0.05。
【００４１】 これらの結果から、L.ラムノサスHN001 の補充投与によって、食作用及びリン
パ球増殖を含む広範な免疫機能が増強されることが示唆される。発酵品又は非発
酵品のいずれの形においても、L.ラムノサスHN001 は、免疫機能の増強に有効で
あり、いくつかの機能では、発酵品の方が効率が良く、他の機能では、非発酵品
の方が効率が良い。
【００４２】 実施例６：L.ラムノサスHN067 による自然免疫及び獲得免疫の増強 実験１： L.ラムノサスHN067 の免疫刺激効果を、マウスにおいて、末梢血リンパ球及び
腹膜マクロファージの食作用（非特異的免疫の指標）、及び免疫抗原コレラ毒素
（腸ワクチン反応を擬態するために用いる）に対する特異的抗体の濃度を測定し
て調べた。
【００４３】 下記の実験方法を用いた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。実験中これらのマウス
を脱脂乳粉末ベースの食事で飼育した。 2. 試験群のマウス(n=6) に、10日間１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.
ラムノサスHN067 を経口投与した。コントロールマウス(n=6) には、50μl の脱
脂乳（乳酸菌無し）のみを与えた。
【００４４】 結果： L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの血液リンパ球及び腹膜マクロファージ
では、その食作用は、コントロールマウスに比べて有意に高かった（増強された
）。この結果を表９に示す。
【００４５】 表９：食作用に対するL.ラムノサスHN067 食事の効果 食作用を示す 食作用を示す 処置 血液リンパ球(%) 腹膜マクロファージ(%) ─────────────────────────────────── コントロール 13.1±1.5 76.4±1.9 L.ラムノサスHN067 23.7±1.5** 87.2±1.9*
【００４６】 マウス（６匹／群）を、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与し
て又は投与せずに、乳ベースの食事で10日間飼育した。フローサイトメトリーと
フルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜
マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差で
ある。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.0005, **P=0.0001 。
【００４７】 経口的に接種したコレラ毒素抗原に対する特異的抗体の血清中及び腸洗浄液中
の濃度も、L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの方が、コントロールマウスと
比べて有意に高かった（表10）。
【００４８】 表10：血清中及び粘膜中の抗コレラ毒素抗体の応答に対する、L.ラムノサスHN06
7 食事の効果 血清抗体応答 粘膜抗体応答 処置 （単位/ml) （単位/ml) ──────────────────────────────── コントロール 63.1±43.2 1969.7±279.5 L.ラムノサスHN067 246.5±43.2** 2995.5±465.2*
【００４９】 BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は
投与せずに、乳ベースの食事で10日間飼育した。０日目と７日目にマウスに、腸
感染を擬態する抗原であるコレラ毒素（10μg/投与）を経口で接種した。10日目
に血清中及び腸分泌液中の抗体レベルを、ELISA で測定した。値は最小二乗の平
均値(LSM) ±標準誤差である。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.02, **P=0.003
9 。
【００５０】 実験２： マウスにおけるL.ラムノサスHN067 の免疫刺激効果を、下記の方法で調べた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。実験中これらのマウス
に脱脂乳粉末ベースの食事及び無制限の水を与えた。 2. ７日間環境に順化させた後、14日間、群１のマウス(n=20)に１日あたり50
μl の脱脂乳中109cfuのL.ラムノサスHN067 を与えた。コントロールマウス（群
２n=20）には、微生物無しの脱脂乳を与えた。 3. 血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用、並びに、フィトヘマグルチ
ニン(PHA) 及びリポ多糖(LPS)(各々T-及びB-細胞のマイトジェンである）に対す
る脾臓リンパ球の増殖応答を測定して、免疫刺激効果を調べた。
【００５１】 結果： L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの血液リンパ球及び腹膜マクロファージ
では、その食作用（自然免疫の指標）は、コントロールマウスに比べて有意に高
かった（表11）。
【００５２】 表11：食作用に対するL.ラムノサスHN067 食事の効果 食作用を示す 食作用を示す 処置 血液リンパ球(%) 腹膜マクロファージ(%) ─────────────────────────────────── コントロール 13.7±0.07 64.6±2.1 L.ラムノサスHN067 22.5±0.07** 75.8±1.7*
【００５３】 BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は
投与せずに、乳ベースの食事で14日間飼育した。14日目にフローサイトメトリー
とフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹
膜マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差
である。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.002, **P=0.0001。
【００５４】 L.ラムノサスHN067 を14日間摂取したマウスでは、PHA 及びLPS に対するリン
パ球の増殖応答も、コントロールマウスと比べてより高かった（表12）。
【００５５】 表12：PHA 及びLPS に対するリンパ球の増殖応答に対するL.ラムノサスHN067 補
充投与の効果 PHA に対する LPSに対する 処置 リンパ球増殖 リンパ球増殖 ──────────────────────────────── コントロール 1.18±0.08 0.99±0.07 L.ラムノサスHN067 1.37±0.07* 1.24±0.06**
【００５６】 BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は
投与せずに、乳ベースの食事で14日間飼育した。14日目に市販の細胞増殖キット
(Boehringer Mannheim,Germany) を用いて、PHA 及びLPS に対する脾臓リンパ球
の増殖応答を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差である。対照と
の有意差(SAS分析）：*P<0.08, **P<0.01 。
【００５７】 要するに、L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスでは、リンパ球の食作用、経
口免疫接種に対する抗体応答、並びに、T-及びB-細胞のマイトジェンに対するリ
ンパ球増殖応答を含む広範な宿主免疫応答が、有意に増強した。血液リンパ球（
好中球と単球）及びマクロファージは、自然免疫の主要な効果器であり、そして
微生物感染に対する防御の主役である。また、インビトロのマイトジェン（T-及
びB-細胞のマイトジェン）に対するリンパ球増殖応答と、個体の免疫能力との相
関が良く知られている。従って、これらの結果は、L.ラムノサスHN067 の補充投
与によって、自然免疫及び獲得免疫のいくつかの機能を増強することができる。
【００５８】 実施例７：L.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌による自然免疫及び獲得免疫
の増強 この実験では、生菌又は加熱死菌の形での前記菌株L.ラムノサスHN001 の免疫
刺激効果を調べた。免疫機能に対する効果を、末梢血リンパ球の食作用の測定に
よって調べた。体液性免疫に対するL.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌の効
果を、コレラ毒素を免疫接種したマウスにおいて生産された特異的抗体の濃度を
測定することによって調べた。
【００５９】 下記の実験方法を用いた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。 2. マウスを無作為に異なる処置群に分けた。 3. 実験中コントロールマウスに、脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。 4. 試験マウスに、14日間、脱脂乳粉末ベースの食事と共に１日あたり109cfu
のL.ラムノサスHN001 の生菌又は加熱死菌を与えた。 5. 飼育０日目と７日目に、コレラ毒素によってマウスを経口で免疫接種した
。
【００６０】 結果： L.ラムノサスHN001 の投与によって、マウスの末梢血リンパ球の食作用レベル
は、コントロールマウスに比べて有意に増強された（図２）。L.ラムノサスHN00
1 が生菌であるか又は加熱死菌であるかに関係なく、この増強が観察された。L.
ラムノサスHN001 の生菌を摂取したマウスと、その加熱死菌を摂取したマウスと
の間で、食作用レベルに差は無かった。
【００６１】 L.ラムノサスHN001 の生菌及び死菌の両投与によって、血清及び粘膜中の抗体
は、コントロールマウスに比べてより多く誘導された。しかし、その応答レベル
は、L.ラムノサスHN001 の生菌を投与した場合の方が有意により大きかった（表
13）。
【００６２】 表13：コレラ毒素による血清及び粘膜の抗体応答に対するL.ラムノサスHN001 の
生菌及び加熱死菌の効果 血清抗体応答 粘膜抗体応答 処置 （単位/ml) （単位/ml) ─────────────────────────────────── コントロール 88.69±18.52 708.6±146.9 L.ラムノサスHN001 生菌 214.89±62.33* 2054.5±285.8*** L.ラムノサスHN001 加熱死菌 174.89±44.78 1533.6±319.3
【００６３】 14日間乳ベースの食事で飼育しながら、BALB/cマウスに1 日あたり109cfuのL.
ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌を経口投与した。コントロールマウスには
乳酸菌を与えなかった。０日及び７日目に、コレラ毒素をマウスに免疫接種した
。14日目にELISA を用いて、血清及び腸分泌液中の抗体応答を測定した。値は平
均±標準誤差である。対照との有意差（Studentsのt 検査）：P*=0.05,***P=0.0
005 。
【００６４】 これらの結果から、L.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌は両方共、マウス
の自然免疫及び獲得免疫の機能を増強することが示唆される。
【００６５】 実施例８：B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 の抗感染活性 下記の目的のために実験を行った： 1. 胃腸の病原体であるサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimur
ium)に対する、B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 による防御効果を調べ
ること、 2. マウスにおけるS.ティフィムリウム感染の防御において、B.ラクチスHN01
9 及びL.ラムノサスHN001 による免疫刺激の働きを決定すること。
【００６６】 抗感染活性を、肝臓及び脾臓への細菌の転移測定によって調べた。免疫増強効
果を、食作用（末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージ）並びにT-細胞のマイト
ジェン(PHA) に対するリンパ球の増殖応答の測定によって調べた。
【００６７】 下記の実験方法を用いた： 1. 重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。 2. マウスを無作為に４つの異なる処置群に分け、個室に入れた。 3. 実験中全てのマウスに脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。 4. 攻撃の７日前から毎日、試験マウスに１日あたり109cfuのB.ラクチスHN01
9 又はL.ラムノサスHN001 を与え始めて、試験期間中継続した。 5. ７日目から５日間、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を投与した
マウス、及び乳酸菌を投与していないコントロールマウスに、１日あたり8x105c
fuのサルモネラ・ティフィムリウム(ATCC1772)を経口投与（攻撃）した。 6. 非感染コントロール群には、S.ティフィムリウムを与えなかった。 7. 攻撃後６日目に、これらのマウスを用いて、肝臓及び脾臓への細菌の転移
並びに免疫機能の測定を行った。
【００６８】 結果： B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスでは共に、S.
ティフィムリウムだけを与えたマウスに比べて、肝臓及び脾臓への細菌の転移レ
ベルは有意に低かった（図３）。
【００６９】 攻撃感染によって、食作用は有意に抑制された（図４）。S.ティフィムリウム
だけを与えたコントロールマウスの食作用は、非感染コントロールマウスに比べ
て有意に低かった。しかし、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を補充投
与したマウスの末梢血リンパ球の食作用は、S.ティフィムリウムの感染によって
影響されなかった。このことは、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 が補
充投与され、且つS.ティフィムリウムによって攻撃されたマウスと、正常な非感
染コントロールマウスとの食作用レベルが同様であったことから判る。
【００７０】 B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスでは共に、S.
ティフィムリウムだけを与えたコントロールマウスに比べて、PHA に対するリン
パ球増殖応答は有意に高かった（図５）。B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN
001 を摂取したマウスと、非感染コントロールマウスとの間で、応答の有意な差
は無かった。
【００７１】 これらの結果を総合すると、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 の補充
投与によって、腸の病原体、例えばサルモネラ・ティフィムリウムに対する防御
を誘導できることが示唆される。感染抵抗性の増強は、免疫機能の増強に依る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例５に記した通り、末梢血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノ
サスHN001 による発酵品、又はL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品のマウス
への補充投与の効果を示す。発酵品又は非発酵品中に109cfu(1日あたり）のL.ラ
ムノサスHN001 を含有する乳ベースの食事で、14日間BALB/cマウスを飼育した。
フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用い
て、末梢血リンパ球の食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との
有意差(ANOVA, SAS プログラム）：**P<0.0001。
【図２】 図２は、実施例７に記した通り、末梢血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノ
サスHN001 の生菌又は加熱死菌のマウスへの補充投与の効果を示す。乳ベースの
食事を与え、且つ109cfu(1日あたり）のL.ラムノサスHN001 の生菌又は加熱死菌
を経口投与して、14日間BALB/cマウスを飼育した。フローサイトメトリーとフル
オレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、末梢血リンパ球及び腹膜
マクロファージの食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意
差(ANOVA, SAS プログラム）：**P<0.0001。
【図３】 図３は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウム(S.typhimurium) で攻撃
したマウス内の細菌転位に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 の
マウスへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチ
スHN019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリ
ウムによって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、マウスを
無痛死させ、細菌転位を観察するために、その肝臓と脾臓を回収した。その臓器
から得た組織縣濁液をMacConkey アガープレート上で24〜48時間培養してから、
計数を行った。値は平均±標準誤差である。対照との有意差(ANOVA, SAS プログ
ラム）：*P<0.05 。
【図４】 図４は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウムで攻撃したマウスの末梢
血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 のマウ
スへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチスHN
019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリウム
によって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、フローサイト
メトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、末梢血リ
ンパ球の食作用を測定した。異なる上付き文字を記した値（平均±標準誤差）は
、有意差を示す(ANOVA, SAS プログラム）：P<0.01。
【図５】 図５は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウムで攻撃したマウスの脾臓
リンパ球の増殖応答に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 のマウ
スへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチスHN
019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリウム
によって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、脾臓リンパ球
の増殖応答を、96時間インキュベーションにおいて、最後の16時間5-ブロモ-2'-
デオキシウリジンを取り込ませ、比色定量的に測定した。異なる上付き文字を記
した値（平均±標準誤差）は、有意差を示す(ANOVA, SAS プログラム）：P<0.01
。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月１５日（２０００．８．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】 本発明には、下記のいずれかの菌株の相同菌又は変異菌の、免疫増強作用を有
する、生理学的に許容される、生物学的に純粋な菌株も含まれる： L.アシドフィルスHN017 、 L.ラムノサスHN001 、 B.ラクチスHN019 、又は L.ラムノサスHN067 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/24 Ａ２３Ｌ 1/24 Ｚ 1/28 1/28 Ｚ Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225 Ｃ１２Ｒ 1:225 1:23 1:23 1:00） 1:00） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スマート，ジョン ビー. ニュージーランド国，パーマーストン ノ ース，マッセー ユニバーシティ，デアリ ー ニュートリション アンド ヘルス プログラム (72)発明者 ゴパル，プラモッド ケー. ニュージーランド国，パーマーストン ノ ース，フィッツハーバート ウエスト，ニ ュー ジーランド デアリー リサーチ インスティテュート Ｆターム(参考） 4B001 AC31 EC99 4B018 MD71 MD86 ME14 4B047 LG56 4B065 AA21X AA30X CA41 CA44 4C087 BC56 BC58 MA17 MA27 MA52 NA14 ZB09 ZC61

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 L.ラムノサス(L.rhamnosus)HN001(AGAL 寄託番号NM97/09514
    ;1997 年８月18日) 又はL.ラムノサス(L.rhamnosus)HN067(AGAL 寄託番号NM97/0
    1925;1998 年２月11日) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌。
  2. 【請求項２】 L.ラムノサスHN001(AGAL寄託番号NM97/09514;1997 年８月18
    日) の生物学的に純粋な培養菌。
  3. 【請求項３】 L.ラムノサスHN067(AGAL寄託番号NM97/01925) の生物学的に
    純粋な培養菌。
  4. 【請求項４】 請求項２のL.ラムノサスHN001 、請求項３のL.ラムノサスHN
    067 、B.ラクチス(B.lactis)HN019(AGAL寄託番号NM97/09513;1997 年８月18日)
    、又はL.アシドフィルス(L.acidophilus)HN017(AGAL 寄託番号NM97/09515;1997
    年８月18日) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する濃度で、生
    理学的に適する賦形剤又は希釈剤と共に含んでいる組成物。
  5. 【請求項５】 ２つ以上の前記菌株を含んでいる、請求項４の組成物。
  6. 【請求項６】 その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤が食物である、請求
    項４又は５の組成物。
  7. 【請求項７】 その食物が、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳
    のいずれかである、請求項６の組成物。
  8. 【請求項８】 医薬用であり、そしてその賦形剤又は希釈剤が医薬に適する
    ものである、請求項４又は５の組成物。
  9. 【請求項９】 下記のいずれかの菌株の相同菌又は変異菌の、免疫増強作用
    のある、生理学的に許容される、生物学的に純粋な菌株： L.アシドフィルスHN017 、 L.ラムノサスHN001 、 B.ラクチスHN019 、又は L.アシドフィルスHN067 。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜３及び９のいずれかの生物学的に純粋な培養菌
    を、免疫刺激する用量で哺乳動物に投与することを含んで成る、自然免疫及び獲
    得免疫を増強する方法。
  11. 【請求項１１】 ２又は３つの前記菌株の生物学的に純粋な培養菌を用いる
    、請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 請求項４〜８のいずれかの組成物を哺乳動物に投与するこ
    とを含んで成る、自然免疫及び獲得免疫を増強する方法。
  13. 【請求項１３】 その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤が食物である、請
    求項１０の方法。
  14. 【請求項１４】 その食物が、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉
    乳である、請求項１０の方法。
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