TW587098B - Immunity enhancing lactic acid bacteria - Google Patents

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TW587098B TW087117136A TW87117136A TW587098B TW 587098 B TW587098 B TW 587098B TW 087117136 A TW087117136 A TW 087117136A TW 87117136 A TW87117136 A TW 87117136A TW 587098 B TW587098 B TW 587098B
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Harsharnjit S Gill
John B Smart
Pramod K Gopal
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Description

587098 五、發明說明（l) ' 技術領域 本發明係有關新穎之乳酸菌菌株及其於增進 之用途。 仅月匕力上 背景技藝 食用含乳酸菌（lab)之產品常伴隨包括增進免疫能 健康效果。有數以千計的乳酸菌菌株存在，但僅有+亏* 株具有促進健康的特質/這些細菌株所具有的耐酸^ t觥 鹽月b力，吸附黏膜表皮細胞之能力及在通過腸胃道膽 存活的能力等特性是篩選有促進健康效果的菌株時的f可 依據。時至今日，僅有少數幾株經證明具促進健康效=要 乳酸菌菌株被鏗定出來。 κ >严之 對小腸黏膜表皮細胞具有良好吸附能力之乳酸菌菌株， 已因為此種特性，在紐西蘭專利案第248 0 5 7號中提供醫療 用途上之員獻。此寻利案所描述的微生物可同時增強天= 免疫此力（吞嗟細胞功能）與後天免疫能力（抗體反應及妹 巴細胞增生反應）。 - 我們希望有其他可增強免疫反應廣泛之範圍（包括吞璧 細胞功能）的乳酸菌。 本發明的一個目標就是繼續朝向達成這些希求或至少提 供大眾在：¾擇增進免疫能力之乳酸_上有一個好的選擇。 發明說明 因此，本發明一方面廣義的包括生物性純培養物鼠李糖 乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ) HNO 0 1 ，1997 年8 月 18 曰AGAL寄存編號NM9 7 / 0 9 5 1 4。
587098 五 '發明說明（2) | 另一方面’本發明可廣義的包括生物性純培養物鼠李糖 | 乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus) HN0 67，1 9 98 年2 月 17 曰AGAL寄存編號NM9 7/ 0 1 92 5。 另一方面’本發明可廣義的包括由下列任一種生物性純 支。養物·嗔酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) HNO 17菌株，1 9 9 7年8月18日AGAL寄存編號NM9 7 / 0 9 5 1 5、鼠 李糖乳桿菌HN001、鼠李糖乳桿菌HN0 67或乳酸雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis) HN019 菌株，1997 年8 月 18 日 AGAL寄存編號NM9 7/ 0 95 1 3依免疫刺激性濃度，與生理上可 接受的賦形劑或稀釋劑組成之組合物。 在一項具體實施例中，該組合物含有二種或二種以上該| 等菌株。 | 該生理上可接受的賦形劑或稀釋劑為一種食品較佳。 | 該食品可以是醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品戒乳粉中i 任何一種較佳。 | ，或者，該混合物是醫藥組合物，且其賦形劑或稀釋劑應丨 為醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。 增進冗疫能力之生理上可接受之下列任一種菌株之同種； 或突變種之生物性純培養物： 嗜酸乳桿菌Η N 0 1 7， 鼠李糖乳桿議ΗΝ001 ， 乳酸雙歧桿菌ΗΝ019，或 鼠李糖乳桿菌ΗΝ 0 6 7。
587098 -—_ 五、發明說明（3) 疫能力與後天免疫能力的方 “ ^ ~ 到刺激免疫效果劑量之任一 〃如對哺乳動物投予可達 另一項具體實施例中，含述生物性純培養物。 生物性純培養物。 有别述所定義菌株中二至三種 該培養物與生理上可接Α 形式投予與較佳。 、、形劑或稀釋劑呈組合物的 該生理上可接受的賦形劑或 該食品是醱酵乳、優格、:2釋Μ為食品較佳。 種較佳。 乳製飲品或乳粉中任一 本發明亦可廣義的包括本申 明之部分、構成要件與特徵，及任：勺：中分開或總合說 要件與特徵中任何二者或更多者之等部分、構成 本文所述及之明確完整事物已於鱼全部組合，且若 中出現已知之同等物時， ρ ;、本發明有關之相關技藝 項併入本文中。 此寸已知之同等物將如同獨立事 圖示簡要說明 圖1頻示，當小白氣福古 :未::酵但含有鼠:===心 士=::=飼:實 ^Β在_酵或未醱酵產品中之109.ciu 1飼料中 乳桿菌HN0 〇 1。周邊血液白.，挂夕工 ）％李糖 細胞計數儀及標識螢光+/；'氛//細^活性則以流動 ^逆仃疋。貫驗值則以平均值士標準
C:\DATA\DATA30\54466.p td 第6頁 (Escherlchla 587098 五、發明說明（4) - 偏差表示。試驗組與對照組有顯著性差異（變方分 AN0VA，SAS 程式款體）：、〈〇· 0 0 0 1 〇 刀汗 圖2顯示，補充鼠李糖乳桿菌HN001活菌與經加熱殺死之| 鼠李糖乳桿菌HN 001時對周邊血液白血球之吞嗟細胞活性 丨 的影響，如實例7之說明。為BALB/c小白鼠餵飼以乳為主I 之飼料，連續14天，每天口服1〇9個以11鼠李糖乳桿^ — j HN0 01活菌或加熱殺死之死菌。周邊血液白血球與膜之 I 巨噬細，之吞噬細胞活性則以流動細胞計數儀及標識塋光j 素異硫氰酸鹽之大腸桿菌（Escheri chia col i )進行檢^。 i ^驗值則以平均值士標準偏差表示，試驗組與對照組$顯I 著性差異（變方分析AN0VA，SAS程式軟體）：**ρ<〇. 〇〇〇卜 | 圖3顯示，小白鼠補充鼠李糖乳桿菌ηΝου或 菌_9時，對感染鼠傷寒沙門氏菌之小白丨 移之影響，如實例8之說明。未補充與補充鼠李糖乳桿菌 HN001或乳酸雙歧桿菌HN〇19iBALB/c小白鼠在每天連續補 充k鉍口服感染鼠傷寒沙門氏菌。感染6天後，小白鼠經 人工殺死，取其肝臟與脾臟，監測細菌在小白鼠韹内之轉 f。將所收集器官之組織懸浮液於麥考基（MacC〇nkey)培 臀基上作細菌培養，2 4到4 8小時後計數。實驗值以平均值 丄平偏J：表示。試驗組與對照組有顯著性差異（變方分 析 ANOVA，SAS 程式軟體）：*p<〇.05。 圖4顯示’小白鼠補充鼠李糖乳桿菌腿〇 〇 1或乳酸雙歧 桿菌ΗΝ0 1 9時，對感染鼠傷寒沙門氏菌之小白鼠體内周邊 血液白血球吞噬細胞活性的影響，如實例8之說明。未補
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 丨五、發明說明（7) ί 嗜酸乳桿菌 HN017 鼠李糖乳桿菌 HN001 乳酸雙歧桿菌 HN019 鼠李糖乳桿菌 HN067 於MRS培養液培 於MRS培養液培 於TPY洋菜培養 於MRS培養液培 養時，菌體呈短 養時，呈短或稍 基平面培養時， 養時，呈短或稍 桿狀或稍長，二 長之桿狀，二 端 呈微好氣至厭氧 長之桿狀，二端 端呈圓形，通常 呈方形，成鏈狀 桿菌，並呈特殊 呈方形，成鏈狀， 單獨出現、成對 一般為 0.7 x 1.1 X 細胞形態，如中 一般約為0.7 X 1.1 或成短鏈狀。 2.0至4.0微米c ) 央肥大，”V”形或 X 2.0 至 4.0 微 柵狀排列形式。 米0 革蘭氏染色陽 革蘭氏染色 陽 在含有0.05%之 性，不生成孢子， 性，不活動性 半胱胺酸鹽之 革蘭氏染色暗 過氧化氫酶反應 不生成孢子， 過 MR5培養液培養 性，過氧化氫酶 陰性，兼厭氧性 氧化氫酶反應陰 時，則形成中央 反應陰性，不活 桿菌，最適宜的 性，兼厭氧性桿 肥大與棍棒狀(棒 動性，不生成绝 生長溫度為37土 1 菌最適宜的生長 端呈鏟狀)細胞。 子，兼厭氧性桿 °C，最適宜生長 溫度為37± 1°C 菌，最適宜的生 的酸驗値為6.0至 最適宜生長的酸 革蘭氏染色陽 長溫度為37± 1 6.5。屬於絕對同 驗値為6.0 至 性，不活動性， °C，最適宜生長 質發酵性菌株， 6.5。屬於兼性異 不生成孢子，過 的酸鹼値為6.0至 葡萄糖代謝時不 質醱酵性菌株 ， 氧化氫酶反應陰 6.5。屬於兼性異 產生氣體。 葡萄糖代謝時不 性，最適宜桿菌 質鏺酵性菌株， 產生氣體。 的生長溫度為J 7 葡萄糖代謝時益 ± 1°C，最適宜生 不產生氣體。 長的酸驗値為6.0 至7.0。6-劈酸果 糖-鱗酸酮i每陽 i | 性0 1 j 587098 表1——形態學及其它特徵
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 10 頁
rQ 587098 ! -~ --~~__________i 丨五、發明說明（8) j I表2 特定乳酸桿菌及雙岐桿菌菌株之碳水化合物醱酵i I模式 、
Sl.No. 菌株名 分數* 1 嗜酸乳桿菌ΗΝ017 5755546 2 鼠李糖乳桿菌ΗΝ001 5757177 3 乳酸雙歧桿菌ΗΝ019 1051622 4 鼠李糖乳桿菌ΗΝ067 5757175 *採用API 5 0 CH糖類潑酵套組來決定糖類醱酵模式。 分數是以對22種常見糖類（柏格（Bergey)氏手冊）之得分| 計算所得 ； 貝例2 對腸細胞的吸附 | 在活體外採用已分化的細胞株分析。原生性菌株吸附人| 類腸道f皮細胞（HT~29與CaCo —2)的能力。先由HT —29與| i CaCo-2單層細胞株於蓋玻片上生長至單層細胞後，置入 |孔=培養盤中。然後將含濃度1〇8 cfu/毫升㈣之丨毫升: 口〆後之L養扃上層液加至細胞表層，並添加丄毫升⑽⑽ 培養基，在3 7 C，氣體組成為百分之十的二氧化碳與百八 之九十的空氣下培養i小時。而後以pBS洗滌單層細胞4 丨人以曱酥固&後，進行革蘭氏染色，並以顯微鏡檢測 丨附在表皮細胞的細菌數目。平均來說，取二十個視野之1 : 丨算值，其結果整理於表3。
C:\DATA\DATA30\54466.ptd
587098 表3----對HT-29與CaCo-2細胞株之吸附能力" i五、發明說明（9) 菌株名 HT-29 CaCo-2 嗜酸乳桿菌HN017 98± 17 171± 16 1李糖乳桿菌HN001 161± 18 218± 35 乳酸雙歧桿菌HN019 188± 27 194± 25 細菌數（平均值±SEM)/1 〇〇個表皮細胞 實例3 對天然免疫與後天免疫能力的增進作用 檢視三株菌，鼠李糖乳桿菌ΗΝ00 1，嗜酸乳桿菌HN017及 乳酸雙歧桿菌HN0 1 9對免疫能力的增進效果，其係測定吞 噬細胞功能（白血球細胞及腹膜巨噬細胞）並對用於小白鼠 體内模擬疫苗反應之蛋白質抗原所能產生之特異性抗體濃 度加以定量。 使用如下之實驗步驟： 1·使用6至7週齡大，重20至30克之BAlb/C小白鼠。 2 ·小白鼠係隨機分佈至各處理條件不同之實驗組中（表4) 3. 分別以含嗜酸乳桿菌HN017，鼠李糖乳桿菌HN〇〇1或 乳酸雙歧桿菌H_19 (1〇9 ciu/天）之5〇微升脫脂乳镇飼 ^曰鼠，連續十天。對照組小白鼠則僅银飼50微升稅脂乳 4. 所有小白a在實驗中全程均接受以脫脂乳粉為主之 料。 a卞糖礼桿菌HN001或乳 自餵飼嗜酸乳桿菌ΗΝ0 1 7，鼠本撼巧4曰#
587098 I 二 -~ ----- I五、發明說明（10) δ^雙歧桿菌HN019的小白鼠鱧内抽出之白血球及巨嗟細胞 均較對照组小白鼠體内所抽出者具有明顯較高吞噬能力 (表4)。餵飼原生菌株的小白鼠體内白血球亦較對照組小 白氣產生更多氧自由基（突發氧化反應）（未顯示數據）。 表4----餵詞嗜酸乳桿菌ΗΝ017，鼠李糖乳桿菌ΗΝ001及 乳酸雙歧桿菌Η Ν 0 1 9對小白鼠之吞嗟細胞功能的影響 處理條件 · 具吞嗟細胞活性之白血 具吞噬細胞活性之腹膜 球所佔的百分比 巨噬細胞所佔的百分比 對照組 14·33± 0.87 66.1± 3.5 嗜酸乳桿菌ΗΝ017 22.7± 1.21** 79.0± 1.0 鼠李糖乳桿菌ΗΝ001 24.84± 0.93** 80.5± 1.8** 乳酸雙歧桿菌ΗΝ019 23.19± 0.95** 77.4± 2.6** ! BALB/c小白鼠每天0服1〇9 Cfu之嗜酸乳桿gHN017，鼠 I李糖乳桿菌ΗΝ001或乳酸雙歧桿菌腦〇19菌株，連續十 |天。曰血球細胞及腹膜巨噬細胞之吞噬細胞活性則以流動 |細胞計數儀及標識螢光素異硫氰酸鹽之大腸桿菌 丨（Escherichia coli)進行檢定。實驗值則以平均值土標準 i偏差表示。試驗組與對照組有顯著性差異（史登氏 i (Student’ s)試驗）：><〇. 〇5 ，” Ρ<〇·〇ι。 !接受嗜酸乳桿菌0017，鼠李糖乳桿菌ΗΝ001或乳酸雙
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 苐 13 頁 587098 五、發明說明（li) --一""_ 歧桿&HN019菌株餵飼的小白鼠，其血清及腸道洗液中特 異性IgG抗體濃度也較對照組小白鼠高（表5)。 表-餵飼嗜酸乳桿菌HN〇17，鼠李糖乳桿菌龍〇〇1及 乩酸雙歧私菌Η N 0 1 9對血清及黏液中抗體反應的影響 處理條件 青抗體瓦5¾(單位/毫升） 黏液抗體反應(單位/毫升） 對照組 80.2± 6.0 1350土 96.0 嗜酸乳桿菌HN017 134.6± 25,2* 1548± 270.0 鼠李糖乳桿菌HN001 118.5± 12.5** 1512± 198.0 乳酸雙歧桿菌HN019 158.1± 51.6*** 1548± 234.0 丨 BALB/c小白鼠連續十天，每天口服1〇9 cfu嗜酸乳桿議 I HN017，鼠李糖乳桿菌HN001或乳酸雙歧桿g〇019菌株， 丨在第0天及苐7天時分別對小白鼠接種霍亂毒素（一種用於 |模擬腸道感染之抗原）。第10天時，以ELISA法測定血清及 丨腸道分泌物中特異性抗體濃度。實驗值則以平均值土標準 丨偏差表示。試驗組與對照組有顯著性差異（史登氏試驗）： 卜：0· 08，P〈0. 05 ;，<0. 01。 丨實例4----連續4星期以乳酸g作為補充飼料所產生的免疫 |刺激效果 ! 嗜酸乳桿菌HN017，鼠李糖乳桿菌HN001及乳酸雙歧桿g | HN019在小白鼠體内的免疫刺激效果係藉由如下之實驗步
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 14 頁 587098 五、發明說明（12) 一 — ~~—~ - 驟進行評估： 1.使用6至7週齡大，重2〇至3〇克之BALB/c小白鼠。 2·小白鼠係隨機分佈（18隻/組）至各處理條件不同之實驗 組中。 3.待剔化觀察後（7天），以含1〇9❿（每天）嗜酸乳桿菌 HN017，氣李糖乳桿菌關〇〇1或乳酸雙歧桿菌〇〇19之5〇微 升脫脂乳中餵飼小白鼠’連續二十八天（第〇天至第28 天）。對照組小白鼠則僅接夸ς w立脱& > / 惶接又3 ϋ微升脫脂乳（不含有任何微 生物）。 4 ·小曰机在貝驗過程中，全藉技為 / 、，Α丄.此， 王％接又以脫脂乳粉為主之飼料 亚自由飲水。 5.免疫刺激效果係藉由觀察白血球及腹膜巨噬細胞之吞噬 細胞活性，脾臟祙巴細胞的白 T , ^ „ ν „ 钯的自然殺手細胞活性，針對一種 τ細胞有絲分裂原，原c A r 浐千硎彳π έ 4 + # 一種細胞調節性免疫能力之 Π ^ . 胞增生反應（脾藏細胞），及對玻 k風疫田所產生的抗體反應進行評估。 士表6所示來自接艾嗜酸乳桿g η N 0 1 7，Q查搪η θ — ΗΝ001或乳酸雙歧桿菌·〇19 \辟7咏李糖札㈣ l,,,-奸， 的】、曰既肢内之白血球（嗜中 f生白JHI球，早核細胞及巨嗟 ^ 天然免疫能力的指標）μ來vt，其吞^胞活性（一種 者顯著增加。…-來目對照組小白鼠體内賴
587098 五、發明說明（13) 表6 餵飼嗜酸乳桿菌ΗΝ0Π，鼠李糖乳桿菌HN001及乳 酸雙歧桿_ HN0 1 9對小白氧的影響 處理條件 具吞嗟細胞活性之白血 具吞噬細胞活性之腹膜 球所佔的百分比 巨嗟細胞所佔的百分比 對照組 15.5 72.67 嗜酸乳桿菌HN017 29.4** 82.2* 鼠李糖乳桿菌HN001 24.2** 82.8** 乳酸雙歧桿菌HN019 31.1** 83.0** 以含10 cfu (每天）之嗜酸乳桿gHN〇n，鼠李糖乳椁 菌HN001或乳酸雙歧桿菌〇〇19之5〇微升脫脂乳餵飼小: 鼠（18隻/組），連續二十八天。在第二十八天時，以流動 細胞計數儀及標識螢光素異硫氰酸鹽之大腸桿菌 (Escherichia coli)檢定白血球細胞/腹膜巨噬細胞之吞 噬細胞活性。實驗值則以最小平方平均值表示，有顯著性 差異（SAS 分析）：*ρ<〇.〇〇2，"ρ<〇·〇〇〇5。 适績餵飼嗜酸乳桿菌ΗΝ 0 1 7，氛李糖乳桿菌ΗΝ 〇 〇 1或乳酸 雙歧桿菌ΗΝ0 1 9二十八天亦可提高自然殺手細胞活性，針 對ConA所產生之梂巴細胞增生反應及對破傷風疫苗所產生 的抗體反應。所有這些和免疫能力有關之指標均顯示，益 受餵飼嗜酸乳桿菌HN017，氣李糖乳桿議關001或乳酸雙~ 歧桿菌HN0 1 9的小白鼠，較對照組小白氣擁有更高免疫^
587098 五、發明說明（14) 力。（表7) 綜合這些結果可以顯示，長時期補充嗜酸乳桿菌 HN017，鼠李糖乳桿菌HN〇〇1或乳酸雙歧椁菌.019菌株， 可以持續誘導多種天然及後天免疫能力。 表7 -餵飼嗜酸乳桿菌HN 0 1 7，鼠李糖乳桿菌HN 0 0 1及 乳酸雙歧桿菌HN01 9對小白鼠自然殺手細胞活性，對c〇nA 所產生之淋巴細胞增生反應及對破傷風疫苗所產生的抗體 反應的双果
ConA處理 自然殺手紳胞 活性(百分比） 對ConA所產生 之淋巴細胞增生 反應(吸光値） 對破傷風疫苗所 產生的抗體反應 (單位/毫升） 對照組 8.8 1.4±0.125 402.5±41.4 嗜酸乳桿菌HN017 9.9 1.6±0.44 923·9± 116.0* 鼠李糖乳桿菌HN001 11.5 1.8z:0.1* 711.5±127.2* 乳酸雙歧桿菌HN019 10.5 1·7±0.5* 844.6 ±134.7* 以含iO9 cfu (每天）之嗜酸乳桿菌HN017，鼠李糖乳桿 菌ΗΝτ 0 0 1或乳酸雙歧桿菌HN0 1 9之5 0微升脫脂乳餵飼小白 鼠（1 8隻/組），連續二十八天（亦即第〇天到第2 8天）。在第 二十八天時，以流動細胞計數儀及標定D 2 7 5之Y a c - 1細跑 檢定脾藏淋巴細胞之天然殺手細胞活性。在第二十八天
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 17 頁 587098 五、發明說明（15) 時，以市售測定細胞增生反應之商業套組（德國百靈公司
Boehringer Mannheim，Germany)測定脾臟淋巴細胞對ConA 所產生之淋巴細胞增生反應。為了測定抗體反應，鼠在第 7天及第2 1天時，以破傷風疫苗（5〇微升/劑，CSL，澳大利 亞）接種小白鼠。特異性抗體之濃度則以ELisA測定；採用 由疫苗製造商（CSL，澳大利亞）所提供之抗原塗覆在培養 盤。貝值為18隻小白鼠之最小平方平均值。有顯著性差 異（SAS 分析）··><〇· 〇5。 * 瓦 實例5 採用醱酵及未經醱酵產品對增進天然與後天； 疫反應之比較 ^ ^ 本實驗的目的在於評估使用原生菌株鼠李糖結 ΗΝ001醱酵製成之優袼製品相較於未經醱酵但含\ 礼桿囷删(H之產品於增進免疫能力上之效果 二隹 能力之評定則係測定吞噬細胞功能（周邊血液白血乂曰： 膜巨噬細胞）及對β細胞有絲分裂原（Lp 口次 增生反應。 玍之淋巴細跑 使用如下之實驗步驟： 1. 使用6至7週齡大，重2〇至3〇克之BALB/c小白窆。·· 2. 小白鼠係隨機分佈至各處理條件不同之實二二 ^對照組小白鼠在實驗全程中接受以全脂乳粉為… 4.試驗組小白鼠除以全脂乳粉為主之飼料餵 分別接受2. 5克以鼠李糖乳桿菌肋〇〇1 (1〇9 cfu/ 製成之優格製品或2. 5克含有鼠李糖乳桿菌HN〇 ⑽今 m
C: \DATA\DAT；\30\54466. p tel
第18頁 587098 I五、發明說明（16) 1〇9 ciu/天）之全脂乳，連續14天。 實驗結果 接受以鼠李糖乳桿囷HN001製成之優格或含有鼠李糖乳 桿菌HN0 0 1之全脂乳的小白鼠，在周邊血液白血球的吞噬 細胞活性上均較接受對照組飼料之小白鼠顯著的提高（圖 1)。此種在吞噬細胞活性上的增加顯然與究竟以何種方式 (以鼠李糖乳桿菌HN001醱酵所製成之優格或是含有鼠李糖 乳桿菌HN0 0 1但未經潑酵之產品）食入鼠李糖乳桿菌1 無關。若比？父以鼠李糖乳桿菌（Η N 0 〇 1)醋酵製成之優格饅 飼的小白鼠與食用含有鼠李糖乳桿菌（ΗΝ〇〇1)但未經醱酵 之全脂乳品的小曰鼠，則可以發現其吞噬細胞活性在程度 上並沒有顯者呈異。 餵倒不經醱晖汉乳竽椐孔桿菌ΗΝ〇〇1醱酵產品 · 均比對照組小白鼠對LP气產生較高之淋巴細Τ胞；生二應( 8)。接受含鼠李糖乳桿菌ΗΝΟΟί之未醱酵產口 ^ 鼠與接受鼠李糖乳桿菌_01之醱酵產品：的; LPS所產生的反應則沒有顯著差異。 小曰乳之间-
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第19頁 587098 白 I五、發明說明（17：) | !" 鼠李糖乳桿菌HN0 01之已醱酵及未醱酵產品對 !鼠琳巴細胞增生反應的影響 處理條件 對LPS產生的淋巴細胞增生反 應(吸光僅） 對照組(全脂乳粉，^yjp) 0.4699± 0.028 以鼠李糖乳桿菌HN001酸酵之WMP 〇.5361± 0.028 未經醱酵但含有鼠李糖乳桿菌之 0.5518± 0.028* 斤以乳為主之飼料餵飼BALB/c小白鼠，其中含有1〇9 cfu ^每辦天^ =子，礼桿囷0〇(H (呈含有鼠李糖乳桿菌HN001但 酵產或經鼠李糖乳桿菌HN001潑酵所製成之優格的 ，14天。對照組小白鼠則接受不含任何LAB之以 ^9之，。在細胞培養96小時過程中最後16小時添加 3值;Γ以平密咬核普進行比色法測定增生反應。實驗 差r。試驗組與對照組有顯著差 ’’I口〜二不頰不，補充鼠李糖乳桿菌HN001可增強免疫 上括上嗟人細胞活性與琳巴細胞增生反應。鼠李糖乳 杆囷HN001不确含在醱酵或未醱酵產品中， 冷 功能，其中以醱酵產品對部分免疫功能產生較大曰免^疫反人 應，而未經醱酵產品則在其他免疫功能上產生較佳效果。 實例6-…鼠李糖乳桿菌酬67對天然與後天免疫能力之增
I
第20頁 C:\DATA\DATA30\54466.ptd 587098 五、發明說明（18) '~~----一 進作用 | 實驗1 | i 觀祭小曰鼠周邊皿液曰血球及腹膜巨嗟細胞之吞# 4 月b力（為非特異性免疫反應的指標），及對一種免疫接 | 抗原（霍亂毒素，用來模擬對腸道疫苗所產生的免^反^· | 所月b產生之特異性抗體進行定量，來決定鼠李糖乳桿菌々I HN067對免疫功能之增強效果。 m |
使用如下實驗步驟： I 1·使用6至7週齡大，重20至30克之BALB/c小白鼠。小白鼠 在實驗全程中接受以脫脂乳為主之飼料。 丨 2·試驗組小白鼠（n=6) 〇服含跃李糖乳桿菌HN0 6 7 ( 1 09 c f u/天）之5 0微升脫脂乳，連讀1 〇天。對照組小白鼠 (n = 6)則僅接受50微升脫脂乳粉（不含任何LAB)。 貫驗結果 來自接受鼠李糖乳桿菌HN0 6 7的小白鼠體之白血球細皰 及腹膜巨噬細胞具有比對照組小白鼠顯著增加之吞噬細胞 I活性（增強吞噬細胞功能）。結果整理如下表9。
C:\DATA\DATA30\54466.ptd …第 21 頁 587098 I五、發明說明（19) j j ：. ;表9 含有鼠李糖乳桿菌HN067之飼料對吞嗟細胞功能的j
影響 I 處理條件 具呑噬細胞活性之白血 球所佔百分比 具吞嗜細胞活性之腹膜 巨噬細胞所佔百分比 對照組 13.1± 1.5 76.4± 1.9 鼠李糖乳桿菌HN067 23.7± 1.5** 87.2± 1.9* 為BALB/c小白鼠（6隻/組）餵飼以乳為主且含或不含鼠李i 糖乳桿菌Η N 067 (1 09 cfu/天）之飼料連續天。血液中白 丨 血球及腹膜巨噬細胞之吞噬細胞活性則以流動細胞計數儀 | 及標識螢光素異瑞氰酸鹽之大腸桿菌（Escherichia coli) j 進行檢定。實驗值則以最小平方平均值土標準偏差LSM表 j 示。試驗組與對照組有顯著性差異（S AS程式 *Ρ:0· 0 0 0 5，、：0. 〇〇〇1。 接受鼠李糖乳桿菌HN 0 6 7的小白鼠之血清及腸道洗液中 I針對霍亂毒素種用於經口接種免疫的抗原）所產生的特 丨異性抗體濃度亦較對照組小白鼠顯著增加（表10)。
C：\DATA\DATA30\54466.ptd 第 22 頁 587098 五、發明說明（20) 表10〜一補充鼠李糖乳桿菌HN067之飼料對血清及腸道洗 ,液中因霍亂毒素所產生之抗體反應的影響 處理條件 血清抗體反應(單位/毫升） 黏液抗體反應(單位/毫升） 對照組 63.1+43.2 1969.7 土279.5 鼠李糖乳桿菌ΗΝ067 246.5 士 43.2* 2995.5 ±465.2* 為BALB/c小白鼠镇飼以乳為主且含或不含鼠李糖乳桿菌 0067 (丨〇9 cfii/天）之飼料連續10天。小白鼠在第〇天與 第7天時分別口服接種霍亂毒素（丨〇微克/劑），一種用來模 擬腸道感染所使用之抗原。於第丨〇天時以ELISA測定血清 及腸道分泌物中抗體濃度。實驗值以最小平方平均值土標 準偏差LSM表示。試驗組與對照組有顯著差異（SAS程式）： *P = 0. 02，Ρ:〇· 0 0 3 9。 實驗2 以下列實驗步驟在小白鼠體内評估鼠李糖乳桿菌⑽〇 6 7 的免疫刺激效果： 1.使用6至7週齡大’重20至30克之B A LB/c小白鼠。小白气 在貫驗過程中全粒接受以脫脂乳粉為主之飼料且自由飲 水。 2 ·待馴化觀察後（了天），由苐一組小白鼠（η = 2 0 ) 口服含 109 cfu (每天）鼠李糖乳桿菌（ΗΝ 0 6 7 )之50微升脫脂乳（第 一組，η二2 0 )，連續丨4天。對照組小白鼠（第二組，η = 2 0 ) 則僅接受不含任何微生物之脫脂乳。
587098 五、發明說明（21) ' ~ ~ !
3·觀察血液中.白血球及腹膜巨噬細胞之吞噬細胞活性及脾i 臟淋巴細胞針對植物血凝素PHA與脂多醣體（LPS)(分別為T 細胞及B細胞的有絲分裂原）所產生之淋巴細胞增生反應評 估免疫刺激效果。 實驗結果 來自接受乳李糖乳桿菌}]N〇g7的小白鼠之白血球及腹膜 巨嗟細胞，較來自對照組小白鼠之白血球細胞及巨嗟細胞· 且有顯著增加之吞噬細胞活性（一種天然免疫能力之指標） (表⑴。 j 表Π----補充鼠李糖乳桿菌HN0 67之飼料對小白I之吞嗟 ! 細胞功能的影響 ； 處理條件 具吞嗟細胞活性之白金 球所佔百分比 具吞噬細胞活性之腹膜 巨噬細胞所佔百分比 對照組 13.7± 0.07 64.6± 2.1 鼠李糖乳桿菌HN067 22.5± 0.07** 75·8± 1.7* 為BALB/c小白氣餵飼以乳為主且含或不含鼠李糖乳桿菌 HN067 (1 〇9 cfu/天）之飼料連續14天。在第14天，以流 動細胞計數儀及標識螢光素異硫氰酸鹽之大腸桿菌 ^ (Escherichia coli)檢定血液中白血球/腹膜巨嗟細胞之 吞嗟細胞活性。實驗值則以最小平方平均值士標準偏差 LSM表示。顯著差異（SAS程式）：>判.0〇2
587098 五、發明說明（22) 遥續14天接受鼠李糖乳桿菌HN0 6 7的小白鼠對PHA與LPS亦 較對照組小白鼠產生更高的淋巴細胞增生反應（表1 2 )。 表12 — --補充鼠李糖乳桿菌hN0 67對因PHA與LPS所產生的 淋巴細胞增生反應的影響 以ConA處理 對PHA產生的淋 巴細胞增生反應 對LPS產生的淋巴 細胞增生反應 對照組 1.18± 0.08 0.99土 0.07 鼠李糖乳桿菌HN067 1.37± 0.07* 1.24± 0.06** 為BALB/c小白鼠餵飼以乳為主且含或不含鼠李糖乳桿菌| HN0 6 7 ( 1 〇9 Cfu/天）之飼料，連續14天。在第14天時，以 市售測定細胞增生反應之商業套組測定（德國百靈公司 (Boehringer Mannheim，Germany))測定脾臟細胞對 pha 與 丨 LPS產生的淋巴細胞增生反應。實驗值以最小平方平均值 | 土標準偏差LSM來表示。有顯著性差異（SAS程式）： ><0· 08，、〈0· 01。 總結來說，接受鼠李糖乳桿菌HN06 7的小白鼠對一定範 | 圍内的宿主免疫反應產生顯著的增進效果，包括白血球細 胞吞噬細胞功能，口服接種免疫所產生的抗體反應及對T 細胞與B細胞的有絲分裂原所產生的淋巴細胞增生反應。 丨 血液中白血球（嗜中性白血球與單核細胞）及巨嗟細胞是天 丨 然性免疫能力的主要執行者，並且在保護宿主免於受微生 |
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 25 頁 587098 丨五、發明說明（23) I 1 i物的感染方面扮演 與B細胞有絲分裂/ 免疫能力的相關性 此’這些結果均顯 天然與後天免疫能 實例7 使用鼠_ 對天然與後天免疫 本實驗的目的在 活菌或加熱殺死的 周邊血液白血球細 所產生的效果。鼠 菌對體液免疫能力. 並測定所產生特異, 使用如下實驗步騾 1 ·使用6至7週齡大 | 2.小白鼠係隨機分」 i 3 ·對照組小白鼠在」 料。 4 ·試驗組小白鼠除j I接受丨09 cfu/天之| |鼠李糖乳桿gHNOOl ! 3 ·小曰鼠在第〇天與 實驗結果 與僅接受對照組， 重要的角色。試管内有絲分裂原（τ細胞 衰）所W起之穌巴細胞增生反應與個體在 方面則已有非常詳細的文獻說明。因 示補充鼠李糖乳桿菌聽〇 6 7可增進多種 力。 &糖礼捍菌ΗΝ0 0 1活菌與加熱殺死的死菌 倉色力之增進作用 研，當原生菌株鼠李糖乳桿菌ΗΝ〇(Η以 死菌狀態存在時之免疫增進效果。測定 胞之吞噬細胞活性，以評估對免疫功能 李糖乳桿菌ΗΝ001活菌與加熱殺死之死 勺效果係藉由對小白鼠接種霍亂毒素， 至抗體之濃度進行評定。 ，重20至30克之BALB/c小白鼠。 ρ至各處理條件不同之實驗組中。 Γ驗全程中接受以脫脂乳粉為主之飼 〈脫脂乳粉為主之飼斜餵飼外，另分別 李糖乳桿菌ΗΝ0 0 1活g或i 〇9 c f u/天之 加熱殺死的死菌連續14天。 第7天時，分別口服接種霍亂毒素。 ]料的小白鼠比較，餵食鼠李糖乳桿菌
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.第26頁 587098 丨五、發明說明（24) 一 " —~~- | Η㈣〇1可明顯增進周邊灰液白血球每胞的吞嗜細胞活性（圖 2)。此，進=果與鼠李糖乳桿菌關〇〇1係以活菌或加熱殺 死的死a狀態存在無關。接受鼠李糖乳桿菌〇〇〇1活菌或 加熱殺死的鼠李糖乳桿菌ΗΝ001死菌的小白鼠，其吞噬細 胞活性之程度上沒有差異。 ” 與對照組小白鼠比較，餵食鼠李糖乳桿菌〇 〇 〇 1活菌與 死菌均可誘發血清性及黏膜抗體反應增強。然而抗體反慮 在程度上仍以接受鼠李糖乳桿菌ΗΝ〇〇1活菌的小白鼠增加 的較為明顯（表13)。 表13 鼠李糖乳桿菌ΗΝ001活菌與加熱殺死的死菌對小 白I因霍亂毒素所引起之血清及黏膜抗體反應的影響 處理條件 血清抗體反應(單位/毫升） 黏膜抗體反應(單位/毫升） 對照組 88.69± 18·52 708.6± 146.9 鼠李糖乳桿菌HN001活 菌 214.89± 62.33* 2054.5± 285.8*** 用熱殺死的鼠李糖乳桿菌 HN001死菌 174.89± 44.78 1 1533.6± 319.3 使用以乳為主之飼料餵飼BALB/c品系小白鼠，並口服 10 cfu (母天）之鼠李糖乳桿gJINQQl活菌或加熱殺死的 死菌，連續14天。對照組小白鼠則不接受lab。小白鼠在
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 27 頁 587098 五、發明說明（25) 弟〇天與第7天時分別口服接種霍亂毒素。於第14天時，以 ELKA法測定抗體反應（血清及腸道分泌物）。實驗值以平 均值土標準偏差表示。試驗組與對照組有顯著差異（史导 氏 t 試驗）：*P 二 0·05，_P = 〇〇〇〇5。 一 沒些貫驗結果顯示，鼠李糖乳桿菌關〇〇1活菌或加熱殺 =的死菌均能增進小白鼠天然與後天免疫能力。 κ例8 乳酸雙歧桿菌ΗΝ01Θ與鼠李糖乳桿菌〇〇〇1的抗 感染性質 當前的研究目標在於 1 ·評枯乳酸雙歧桿菌HN 0 1 9與鼠李糖乳桿菌ην ο 〇 1對抗胃 腸這病原g鼠傷寒沙門.氏菌（Saimonel la typhimurium)之 保護效果。 2 ·決定由乳酸雙歧桿g HN0 1 9與鼠李糖乳桿菌.Ο 0 1所誘 發的免疫刺激效杲在保護小白鼠對抗鼠傷寒沙門氏菌感染 方面所扮演的角色。 測定對細g轉移至肝臟與脾藏的現象來評估抗感染性 質。測定吞噬細胞功能（周邊血液白血球/與腹膜巨噬細 胞）及對一種T細胞有絲分裂原（ρ η A)所產生之棘巴細胞增 生反應來評估免疫增.進效果。 使用如下實驗步驟： 1·使兩6至7週齡大，重20至30克之BALB/c小白鼠3 2 ·小白鼠係隨機分佈至4個處理條件不同之實驗組中，並 隔離飼養。 3 ·所有小白鼠在實驗全程中接受以脫脂乳粉為主之飼料3
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第28頁 587098 I五、發明說明（26) 4·試驗組小白氣在接受感染前7天，每天分別餵食乳酸雙 歧桿gHN019或氧李糖乳桿_ΗΝ〇〇ι “ο9 Cfu/天）並在試 驗期間連續餵食。 5·餵食乳酸雙歧桿菌HN019或鼠李糖乳桿菌HN001的小白鼠 與對照組小白氣（不給予LAB)自第7天開始，口腔接受8 X 10° cfu/天鼠傷寒沙門氏菌（ATCC1 772 )感染，連續5天。 6 ·未受感染之對照組小白鼠，則不接受鼠傷寒沙門氏菌 (ATCC1772)感染。 7 ·感染後第6天，測定小白鼠體内細菌轉移至肝臟與脾臟 的情形及評估免疫功能。 實驗結杲 補充乳酸雙歧桿菌HN019與補充鼠李糖乳桿gHN〇(n之軔 料的小隐菌轉移至肝臟與脾臟的情形均 傷寒沙門氏菌的小白鼠在程度上明顯的較輕（圖3 )。 感染後顯著抑制吞噬細胞功能（圖4);感染鼠傷寒沙門 氏菌的對照組小白鼠之吞噬細胞活性明顯的低於未受感染 的小白鼠。然而，感染鼠傷寒沙門氏菌對接受乳酸雙歧f 菌HN019或鼠李糖乳桿菌HN001的小白鼠之周邊血液白血^ 丨之吞噬細胞活性並不影響。此點可由補充乳酸雙歧桿菌 I HN019或鼠李糖乳桿gHNOOi並感染鼠傷寒沙門氏義的小白 I鼠之吞噬細胞活性與正常且未受感染的對照組小白氛在穿 丨度上類似得知。 I 補充乳酸雙歧桿S ΗΜΟ 1 9與補充鼠李糖乳桿g HN〇 〇工的小 白鼠對因Ρ Η A所產生的淋巴細胞增生反應高於成染鼠傷震
C:\DATA\DATA30\54466.ptd 第 29 頁 587098 五、發明說明（27) 沙門氏菌之對照組小白鼠（圖5 )。接受 HN019與鼠李糖乳桿菌HN001的小白氣 組小白鼠之反應程度則沒有明顯差異 綜合這些結果可以顯示，補充乳酸1 李糖乳桿菌HN0 0.1能夠對因腸道細菌鼠 起的感染提供保護。對感染所增加的； 疫力提升。 乳酸雙歧桿S 丨 與未受感染的對照 Ε歧桿菌ΗΝ019或鼠 | 傷寒沙門氏菌所引 ^抗力並伴隨出現免 ；

Claims (1)

  1. 587碍\〇2曰修正補充 氧 六、申請專利範圍 月 修正 、夕一種&品組合物，其包含刺激免疫性濃度之下列任一 或夕種生=性純培養物：鼠李糖乳桿菌η N 〇 〇丨c C R C 9^0 107，.鼠李糖乳桿菌hN〇67 ccRC 910108 ;乳酸雙歧桿 曰lfjdobacterium lactis) HN019 CCRC 910110 或嗜 酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) HN017 CCRC 9 10 10 9’及生理上可接受的賦形劑或稀釋劑。 · 2 ·如申請專利範圍第1項之食品組合物，其含有該等菌 · 株中任意二種或二種以上。 3 ·如申請專利範圍第丨或2項之食品組合物，其中該生理 上可接受的賦形劑或稀釋劑為一種食品。 4 ·如申請專利範圍第3項之食品組合物，其中該食品係f 指醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品或乳粉任一種。 5 · —種用於增進免疫力之醫藥組合物，其包含刺激免疫 性濃度之下列任一或多種生物性純培養物：鼠李糖乳桿菌 HN001 CCRC 910107 ;鼠李糖乳桿菌 HN 0 6 7 CCRC910108 ; 乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis) HN019 CCRC 910110 或嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) HN017 CCRC 910109，及醫藥上可接受的賦形劑或稀釋 劑。 6 ·如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其含有該等菌 株中任意二種或二種以上。 7 · —種生物性純培養物，其係指鼠李糖乳桿菌η N 〇 〇 1 - CCRC 910107 ° 8· —種生物性純培養物，其係指鼠李糖乳桿菌H N 〇 6 7
    O:\54\54466-930302.ptc 第32頁 587098 案號 87117136 月 日_修正 六、申請專利範圍CCRC 9 1 0 1 08 ° O:\54\54466-930302.ptc 第33頁
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