KR20010023117A - 면역을 향상시키는 젖산균 - Google Patents

면역을 향상시키는 젖산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세균 락토바실루스 람노수스 HN001 및 HN 067, 락토바실루스 아시도필루스 HN017 및 비피도박테리움 락티스 HN019에 관한 것으로서,
각 균주는 섭식시 면역향상효과를 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

면역을 향상시키는 젖산균{IMMUNITY ENHANCING LACTIC ACID BACTERIA}
젖산균(LAB)을 함유하는 제품의 소비는 면역 향상을 포함한 건강이익의 범위와 연관되어 있다. 수천개의 젖산균이 있지만, 이중 일부의 균주만 건강-증진 특성을 나타낸다. 산 및 담즙염에 대해 내성을 갖고, 점막상피세포에 부착하고, 위장관을 통과해도 살아있는 상기 세균의 능력은 건강-증진 균주를 선택하기 위한 중요한 기준으로 간주된다. 건강증진이 입증된 소수의 젖산균 균주만이 확인되었다.
소장의 점막상피세포에 대해 양호한 부착을 나타냄으로써 치료용도에 제공하는 LAB 균주는 뉴질랜드 특허 제248057호에 공지되어 있다. 상기 특허에 기술된 미생물은 선천성 면역(식균기능) 및 후천성 면역(항체반응 및 임파구 증식반응)을 모두 향상시킨다.
식균작용을 포함하는 면역반응의 넓은 분포범위를 향상시키는 기타 LAB 세균을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적은 상기 소망하는 것을 이루기 위한 몇가지 방법을 진행시키거나, 또는 면역을 향상시키는 젖산균을 대중적으로 유용하게 선택할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명은 젖산균의 균주 및 면역을 향상시키는 그들의 용도에 관한 것이다.
도 1은 실시예 5에 기술된 바와 같이, 락토바실루스 람노수스 HN001로 발효된 생성물 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 비발효 생성물을 마우스에 공급하는 것이 말초혈액 백혈구의 식균작용에 미치는 효과를 도시한 것이다. BALB/c 마우스에 14일동안 발효된 생성물 또는 비발효 생성물내에 109cfu/일 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 우유에 기초한 식사를 공급하였다. 말초혈액 백혈구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인(fluoroscein) 이소티오시아네이트-표지된 대장균(Escherichia coli.)을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(ANOVA, SAS 프로그램):**P＜0.0001.
도 2는 실시예 7에서와 같이, 생 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 열사 락토바실루스 람노수스 HN001을 마우스에 공급하는 것이 말초혈액 백혈구의 식균작용에 미치는 효과를 도시한 것이다. BALB/c 마우스에 14일동안 우유에 기초한 식사를 공급하고, 생 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 열사 락토바실루스 람노수스 HN001 109cfu/일을 경구투여하였다. 말초혈액 백혈구 및 복막 대식구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(ANOVA, SAS 프로그램):**P＜0.0001.
도 3은 실시예 8에서와 같이, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 마우스에 공급하는 것이 쥐티푸스에 감염된 마우스내 세균자리옮김에 미치는 효과를 도시한 것이다. 공급하지 않은 대조군, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001이 공급되는 BALB/c 마우스를 쥐티푸스로 경구감염시키고, 그후에 매일 계속해서 상기를 공급하였다. 감염후 6일후 마우스를 자비롭게 죽이고, 세균자리옮김을 측정하기 위해 그의 간과 비장을 채취하였다. 그후 계산하기 전에 채취된 기관으로부터의 조직 현탁액을 MacConkey 한천 플레이트에서 24-48시간동안 배양하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(ANOVA, SAS 프로그램):*P＜0.05.
도 4는 실시예 8에 기술된 바와 같이, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 마우스에 공급하는 것이 쥐티푸스에 감염된 마우스의 말초혈액 백혈구의 식균작용에 미치는 효과를 도시한 것이다. 공급하지 않은 대조군, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001이 공급되는 BALB/c 마우스를 쥐티푸스로 경구감염시키고, 그후에 매일 계속해서 상기를 공급하였다. 감염후 6일후 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 말초혈액 백혈구의 식균작용을 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 값(평균±표준오차)은 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(ANOVA, SAS 프로그램): P＜0.01.
도 5는 실시예 8에 기술된 바와 같이, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 마우스에 공급하는 것이 쥐티푸스에 감염된 마우스의 비장 임파구의 증식반응에 미치는 효과를 도시한 것이다. 공급하지 않은 대조군, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001이 공급되는 BALB/c 마우스를 쥐티푸스로 경구감염시키고, 그후에 매일 계속해서 상기를 공급하였다. 감염후 6일후 비장 임파구의 증식반응을 비색법으로 측정한후, 96시간 배양중 마지막 16시간동안 5-브로모-2'-데옥시우리딘을 첨가하였다. 값(평균±표준오차)은 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(ANOVA, SAS 프로그램): P＜0.01.
본 발명의 실시방법
4개의 세균 균주의 동결건조된 배양물을 오스트레일리아 NSW 2073 핌블 1 수아킨 스트리트 뉴 사우쓰 왈스 레져널 래보래토리의 Australian Government Analytical Laboratories(AGAL)에 기탁했다. 상세한 기탁사항은 다음과 같다:
균주 기탁번호 기탁일자
락토바실루스 아시도필루스 HN017 NM97/09515 1997. 8. 18.
락토바실루스 람노수스 HN001 NM97/09514 1997. 8. 18.
비피도박테리움 락티스 HN019 NM97/09513 1997. 8. 18.
락토바실루스 람노수스 HN067 NM98/01925 1998. 2. 11.
상기 4개의 균주는 선천성 및 후천성 면역반응 모두를 포함한 면역반응의 넓은 분포범위를 향상시키는 것을 알았다.
실시예 1-형태적 및 유전적 특성
RAPD 분석, 16S rRNA 서열화 및 SDS-PAGE 분석은 균주의 분류학적 특성을 확인하는데 사용하였다. 또한, 락토바실루스 아시도필루스 HN017은 뉴질랜드특허 248057의 락토바실루스 아시도필루스(LC1)와 유전적으로 다르다는 것을 알았다.
RAPD 분석, 16S rRNA 서열화 및 SDS-PAGE 분석은 락토바실루스 람노수스 HN067의 분류학적 특성을 확인하는데 사용하였으며; 분자수준에서 락토바실루스 람노수스 HN067의 특성을 위해 사용된 종-특이 프라이머는 Pr I(앞방향) 5-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3 및 Pha II(역방향) 5-GCGATGCGAATTTCTATTATT-3을 포함했다.
상기 균주의 형태 및 당발효 특성은 표 1 및 표 2에 상술되어 있다.
형태 및 기타 특성
락토바실루스아시도필루스 HN017 락토바실루스람노수스 HN001 비피도박테리움락티스 HN019 락토바실루스람노수스 HN067
끝이 둥근장단형 간균,일반적으로 단일 또는쌍으로 발생.또는 MRS 브로쓰에서자랄경우, 단쇄임.그람양성,포자 형성하지 않음,카탈라아제 음성,37±1℃의 최적 배양온도 및 6.0-6.5의최적 pH를 갖는 임의혐기성 간균.절대 동종발효세균이며, 글루코스로부터기체가 발생하지않음. 사슬내에 끝이 사각인장단형 간균,MRS 브로쓰에서 자랄경우, 보통 0.7×1.1×2.0-4.0㎛.그람양성,비운동성,포자 형성하지 않음,카탈라아제 음성,37±1℃의 최적 배양온도 및 6.0-6.5의최적 pH를 갖는 임의혐기성 간균.임의 이종발효세균이며, 글로코스로부터기체가 발생하지않음. 중간크기의 세포와같이 특정 형태의미세호기성 내지혐기성 간균,TPY 한천 조각상에서배양시, 세포의 'V'또는 울타리배열.0.05% 시스테인 히드로클로리드가 있는MR5 브로쓰에서, 이들은 중간-확대세포 및 클럽형(끝이 주걱형)세포를 형성.그람양성,비운동성,포자 형성하지 않음,카탈라아제 음성,37±1℃의 최적 배양온도 및 6.0-7.0의최적 pH를 갖는 간균.프룩토스-6-포스페이트 포스포-케톨라아제 양성. 사슬내에 끝이 사각인장단형 간균,MRS 브로쓰에서 자랄경우, 보통 0.7×1.1×2.0-4.0㎛.그람양성,카탈라아제 음성,비운동성,포자 형성하지 않음,37±1℃의 최적 배양온도 및 6.0-6.5의최적 pH를 갖는 임의혐기성 간균.임의 이종발효세균이며, 글로코스로부터기체가 발생하지않음.
선택된 락토바실루스 및 비피도박테리움 균주의 탄수화물 발효형태
S1 번호 세균명 스코어*
1 락토바실루스 아시도필루스 HN017 5755546
2 락토바실루스 람노수스 HN001 5757177
3 비피도박테리움 락티스 HN019 1051622
4 락토바실루스 람노수스 HN067 5757175
API 50 CH 당발효 킷은 당발효 형태를 측정하기 위해 사용하였다.
*스코어는 22개의 중요한 당의 스코어에 기초한다(Bergey's 매뉴얼).
실시예 2-장세포에 대한 부착력
사람 장 상피세포(HT-29 및 CaCo-2)에 대한 선생물균주의 부착력은 분화형 주세포를 사용하여 생체외에서 평가하였다. HT-29 및 CaCo-2 세포의 단층은 커버슬립위에서 자랐으며, 다중벽 접시안에 넣었다. 그후, 다 쓴 배양액의 상층액 1㎖중 LAB 108cfu/㎖를 DMEM 배지 1㎖와 함께 세포층에 첨가하고, 37℃의 10% CO2-90% 공기중에서 1시간동안 배양했다. 단일층을 PBS로 4회 세척하고, 메탄올로 고정하고, 그람염색하여 상피세포에 부착한 세균수를 현미경으로 측정했다. 평균하여, 20개의 필드를 세고, 그 결과를 표 3에 요약한다.
HT-29 및 CaCo-2 주세포에 대한 부착력*
균주 HT-29 CaCo-2
락토바실루스 아시도필루스 HN017 98±17 171±16
락토바실루스 람노수스 HN001 161±18 218±35
비피도박테리움 락티스 HN019 188±27 194±25
*세균수(평균±SEM)/100개의 상피세포
실시예 3-선천성 및 후천성 면역향상
세개의 균주 락토바실루스 람노수스 HN001, 락토바실루스 아시도필루스 HN017 및 비피도박테리움 락티스 HN019의 면역향상효과는 식균세포(혈중 백혈구 및 복막 대식구) 기능을 측정하고, 마우스내 백신에 대한 반응을 모방하기 위해 사용되는 단백질 항원에 대한 특이 항체의 농도를 정량함으로써 시험하였다.
하기의 실험 프로토콜을 사용하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다.
2. 마우스를 다른 처리군으로 무작위배치하였다(표 4).
3. 10일동안 50㎕ 탈지우유내 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019(109cfu/일)를 마우스에 공급하였다. 대조군 마우스에는 탈지분유 50㎕만 공급하였다.
4. 모든 마우스에게는 실험내내 탈지분유에 기초한 식사를 제공하였다.
락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 수용한 마우스로부터 혈중 백혈구 및 대식구는 대조군 마우스의 세포에 비해 상당히 높은 식균능력을 보여주었다(표 4). 선생물 공급 마우스의 백혈구에 의한 산소라디칼의 생성(산화적 방출)은 또한 대조군 마우스보다 높았다(데이터는 나타내지 않음).
락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 및 비피도박테리움 락티스 HN019가 마우스내 식균작용에 미치는 효과
처리군 식균작용을 갖는혈중 백혈구(%) 식균작용을 갖는복막 대식구(%)
대조군 14.33±0.87 66.1±3.5
락토바실루스 아시도필루스 HN017 22.7±1.21** 79.0±1.0**
락토바실루스 람노수스 HN001 24.84±0.93** 80.5±1.8**
비피도박테리움 락티스 HN019 23.19±0.95** 77.4±2.6*
BALB/c 마우스에 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019 109cfu/일을 10일동안 경구투여하였다. 혈중 백혈구 및 복막 대식구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(학생용 t 시험):*P＜0.05,**P＜0.01.
락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 수용한 마우스의 혈청 및 장세척물내 특이 IgG 항체의 농도는 또한, 대조군 마우스의 농도보다 높았다(표 5).
식이 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 및 비피도박테리움 락티스 HN019가 혈청 및 점막 항체반응에 미치는 효과
처리군 혈청 항체반응(단위/㎖) 점막 항체반응(단위/㎖)
대조군 80.2±6.0 1350±96.0
락토바실루스 아시도필루스 HN017 134.6±25.2* 1548±270.0
락토바실루스 람노수스 HN001 118.5±12.5** 1512±198.0
비피도박테리움 락티스 HN019 158.1±51.6*** 1548±234.0
BALB/c 마우스에 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019 109cfu/일을 10일동안 경구투여하였다. 0일 및 7일에 마우스를 콜레라 독소(모의 장감염에 사용된 항원)로 면역화하였다. 혈청 및 장 분비물내 특이 항체의 농도는 10일에 ELISA를 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준오차를 나타낸다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(학생용 t시험):*P=0.08;**P＜0.05;***P＜0.01.
실시예 4-4주간 LAB 공급후 면역촉진효과
락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 및 비피도박테리움 락티스 HN019의 마우스내 면역촉진효과는 하기 실험프로토콜을 사용하여 평가하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다.
2. 마우스를 다른 처리군으로 무작위배치하였다(18마리/군).
3. 순응(7일동안)후, 마우스에 50㎕ 탈지우유내 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019 109cfu/일을 28일동안 공급하였다(0일 내지 28일). 대조군 마우스에는 50㎕ 탈지우유(미생물없이)만 공급하였다.
4. 실험내내 식사로 탈지분유를, 그리고 마음대로 물을 공급하였다.
5. 면역촉진효과는 혈중 백혈구 및 복막 대식구의 식균작용, 비장 임파구의 NK-세포 작용, T-세포 미토겐에 대한 임파구 증식(비장세포)반응, ConA(세포-매개 면역의 지표) 및 파상풍 백신에 대한 항체반응을 측정함으로써 평가하였다.
표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 수용한 마우스의 백혈구(호중구, 단핵구 및 대식구)는 대조군 마우스의 백혈구보다 상당히 높은 식균작용(선천성 면역의 지표)을 나타냈다.
마우스내 식이 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 및 비피도박테리움 락티스 HN019의 효과
처리군 식균작용을 갖는혈액 백혈구(%) 식균작용을 갖는복막 대식구(%)
대조군 15.5 72.67
락토바실루스 아시도필루스 HN017 29.4** 82.2*
락토바실루스 람노수스 HN001 24.2** 82.8**
비피도박테리움 락티스 HN019 31.1** 83.0**
마우스(18마리/군)에 50㎕ 탈지우유내 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019 109cfu/일을 28일동안 공급하였다. 혈중 백혈구/복막 대식구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 28일에 측정하였다. 값은 최소이승평균이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(SAS 분석):*P＜0.002,**P＜0.0005.
락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 28일동안 소비한 결과, NK-세포 작용, ConA에 대한 임파구 증식반응 및 파상풍 백신에 대한 항체반응을 증가시켰다. 면역능력의 상기 모든 지표를 위해, 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 수용한 마우스들은 대조군 마우스보다 높은 반응들을 가졌다(표 7).
상기 결과와 함께, 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019를 연장된 기간동안 공급하면 선천성 면역 및 후천성 면역의 여러 관점에서 지속적인 향상을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
식이 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 및 비피도박테리움 락티스 HN019가 NK 세포작용, ConA에 대한 임파구 증식반응 및 파상풍 백신에 대한 항체반응에 미치는 효과
ConA 처리군 NK 세포작용(%) ConA에 대한임파구증식(흡수) 파상풍 백신에 대한항체반응(단위/㎖)
대조군 8.8 1.4±0.125 402.5±41.4
락토바실루스 아시도필루스 HN017 9.9 1.6±0.44 923.9±116.0*
락토바실루스 람노수스 HN001 11.5 1.8±0.1* 711.5±127.2*
비피도박테리움 락티스 HN019 10.5 1.7±0.5* 844.6±134.7*
마우스(18마리/군)에 50㎕ 탈지우유내 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 비피도박테리움 락티스 HN019 109cfu/일을 28일동안(즉, 0 내지 28일) 공급하였다. 비장 임파구의 NK-세포 작용은 흘림세포계측법 및 D275-표지된 Yac-1 세포를 사용하여 28일에 측정하였다. ConA에 대한 비장 임파구의 임파구 증식반응은 상업용 세포증식킷(독일의 보에링거 만하임제)을 사용하여 28일에 평가하였다. 항체반응을 위해, 마우스를 파상풍 백신(호주, CSL, 50㎕/1회투여)으로 7일 및 21일에 면역화하였다. 특이 항체의 농도는 ELISA를 사용하여 측정하고; 백신 제조사에 의해 공급된 항원(호주, CSL)은 코팅판에 사용하였다. 값은 마우스 18마리의 최소이승평균이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(SAS 분석):*P＜0.05.
실시예 5-발효 대 비발효 생성물을 사용한 선천성 및 후천성 면역의 향상
락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 비발효 생성물에 비해 선생물균주 락토바실루스 람노수스 HN001을 사용하여 제조된(발효된) 요구르트의 면역향상효과를 평가하는것을 목적으로 한다. 면역향상효과는 식균작용(말초혈액 백혈구 및 복막 대식구) 및 B-세포 미토겐에 대한 임파구증식반응(LPS)을 측정하여 시험하였다.
하기 실험 프로토콜을 사용하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다.
2. 마우스를 다른 처리군으로 무작위배치하였다.
3. 대조군 마우스에는 실험동안 전유를 식사로 제공하였다.
4. 14일동안 전유에 기초한 식사 뿐만 아니라, 하루에 락토바실루스 람노수스 HN001(109cfu/일)을 사용하여 제조한 요구르트 2.5g 또는 락토바실루스 람노수스 HN001(109cfu/일)을 함유하는 전유 2.5g을 마우스에 공급하였다.
결과
락토바실루스 람노수스 HN001로 제조한 요구르트 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 전유를 공급한 마우스는 대조군 식사를 공급한 마우스에서 관찰된 것보다 상당히 높은 수준의 말초혈액 백혈구 식균작용을 나타냈다(도 1). 이 증가는 락토바실루스 람노수스 HN001이 (락토바실루스 람노수스 HN001로 발효된) 요구르트 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 비발효 생성물내에 전달되었는지와는 무관한 것으로 보였다. 락토바실루스 람노수스(HN001)을 함유하는 비발효 WMP 생성물에 비해 락토바실루스 람노수스(HN001)을 사용하여 제조된 발효 요구르트를 수용한 마우스사이에 식균작용의 수준에는 차이가 없었다.
비발효 생성물 및 락토바실루스 람노수스 HN001 발효 생성물이 공급된 마우스 둘다 대조군 마우스보다 높은 LPS에 대한 임파구 증식반응을 나타냈다(표 8). 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 비발효 생성물을 수용한 마우스와 락토바실루스 람노수스 HN001로 발효된 생성물을 수용한 마우스사이에서 상기 반응은 상당한 차이가 없었다.
발효 및 비발효 락토바실루스 람노수스 HN001이 마우스내 임파구 증식반응에 미치는 효과
처리군 LPS에 대한 임파구 증식(흡수)
대조군(WMP) 0.4699±0.028
락토바실루스 람노수스 HN001로 발효된 WMP 0.5361±0.028
락토바실루스 람노수스 HN001로 발효되지 않은 WMP 0.5518±0.028*
비발효 생성물 또는 락토바실루스 람노수스 HN001로 제조한 요구르트(발효 생성물)내에 109cfu/일 락토바실루스 람노수스 HN001을 함유하는 우유에 기초한 식사를 BALB/c 마우스에 14일동안 제공하였다. 대조군 마우스에는 LAB없이 우유에 기초한 식사를 제공하였다. 증식반응은 96시간 배양중 최종 16시간동안 5-브로모-2'-데옥시우리딘을 혼입하여 비색법으로 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과 상당한 차이를 나타냈다(학생용 t 시험):*P=0.05.
락토바실루스 람노수스 HN001을 공급하면 식균작용 및 임파구 세포 증식을 포함하는 면역기능의 범위를 향상시킨다는 것을 상기 결과로부터 알 수 있다. 발효 또는 비발효 생성물내에 존재하는 락토바실루스 람노수스 HN001은 일부 기능에 대한 반응을 높이는 발효 생성물 및 다른것보다 우수한 비발효 생성물과 함께 면역기능을 향상시키는데 효과적이다.
실시예 6-락토바실루스 람노수스 HN067에 의한 선천성 및 후천성 면역향상
실험예 1.
락토바실루스 람노수스 HN067의 면역향상효과는 말초혈액 백혈구 및 복막 대식구의 식균능력(비특이 면역의 지표)을 측정하고, 마우스내 면역화 항원인 (파상풍 백신에 대한 모의반응을 위해 사용되는)콜레라 독소에 대한 특이 항체의 농도를 정량화함으로써 시험하였다.
하기 실험프로토콜을 사용하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다. 실험내내 상기 마우스에게 탈지우유에 기초한 식사를 제공하였다.
2. 시험군(n=6)의 마우스들에게 10일동안 50㎕ 탈지우유내 락토바실루스 람노수스 HN067(109cfu/일)을 경구투여하였다. 대조군 마우스(n=6)에는 탈지분유(LAB없음)만 50㎕ 공급하였다.
결과
락토바실루스 람노수스 HN067을 수용한 마우스의 혈중 임파구 및 복막 대식구는 대조군 마우스의 세포보다 상당히 높은 식균작용(식균기능 향상됨)을 나타냈다. 상기 결과는 하기 표 9에 기술되어 있다.
식이 락토바실루스 람노수스 HN067이 식균기능에 미치는 효과
처리군 식균작용을 갖는혈액 임파구(%) 식균작용을 갖는복막 대식구(%)
대조군 13.1±1.5 76.4±1.9
락토바실루스 람노수스 HN067 23.7±1.5** 87.2±1.9*
BALB/c 마우스(6마리/군)에는 10일동안 락토바실루스 람노수스 HN067(109cfu/일)을 경구투여하면서 또는 투여없이 우유에 기초한 식사를 제공하였다. 혈액 임파구 및 복막 대식구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 측정하였다. 값은 최소이승평균±표준오차 LSM이다. 대조군과는 상당히 차이를 나타냈다(SAS 프로그램):*P=0.0005,**P=0.0001.
락토바실루스 람노수스 HN067을 수용한 마우스의 혈청 및 장 세척물내 경구면역화에 사용되는 항원인 콜레라 독소에 대한 특이 항체의 농도는 또한 대조군 마우스보다 상당히 높았다(표 10).
락토바실루스 람노수스 HN067로 식사공급하는 것이 콜레라 독소에 대한 혈청 및 점막 항체반응에 미치는 효과
처리군 혈청 항체반응(단위/㎖) 점막 항체반응(단위/㎖)
대조군 63.1±43.2 1969.7±279.5
락토바실루스 람노수스 HN067 246.5±43.2** 2995.5±465.2*
BALB/c 마우스에 락토바실루스 람노수스 HN067(109cfu/일)과 함께 또는 없이 10일동안 우유에 기초한 식사를 제공하였다. 마우스를 0 및 7일에 모의 장감염에 사용되는 항원인 콜레라 독소(10㎍/1회투여)로 경구면역화하였다. 혈청 및 장 분비물내 항체수준은 10일에 ELISA를 사용하여 측정하였다. 값은 최소이승평균±표준오차 LSM을 나타낸다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(SAS 프로그램):*P=0.02;**P=0.0039.
실험예 2.
락토바실루스 람노수스 HN067의 면역촉진효과는 하기 실험프로토콜을 사용하여 마우스내에서 평가하였다.
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다. 실험내내 상기 마우스에게 탈지분유에 기초한 식사 및 물을 임의로 제공하였다.
2. 7일동안 순응후, 1군(n=20)의 마우스에게 14일동안 50㎕ 탈지우유(1군, n=20)내 109cfu/일 락토바실루스 람노수스(HN067)를 경구투여하였다. 대조군 마우스(2군, n=20)에는 미생물없는 탈지우유를 공급하였다.
3. 면역촉진효과는 혈중 백혈구 및 복막 대식구의 식균작용 및 식물성 혈구응집소(PHA) 및 리포다당체(LPS)(각각 T 및 B-세포 미토겐)에 대한 비장 임파구 증식반응을 측정함으로써 평가하였다.
결과
락토바실루스 람노수스 HN067을 수용한 마우스의 혈중 백혈구 및 복막 대식구는 대조군 마우스의 백혈구 및 임파구보다 상당히 높은 식균작용(선천성 면역의 지표)을 나타냈다(표 11).
식이 락토바실루스 람노수스 HN067이 마우스의 식균기능에 미치는 효과
처리군 식균작용을 갖는혈액 백혈구(%) 식균작용을 갖는복막 대식구(%)
대조군 13.7±0.07 64.6±2.1
락토바실루스 람노수스 HN067 22.5±0.07** 75.8±1.7*
BALB/c 마우스에 14일동안 락토바실루스 람노수스 HN067(109cfu/일)을 경구투여하면서 또는 경구투여하지 않고 우유에 기초한 식사를 공급하였다. 혈중 백혈구/복막 대식구의 식균작용은 흘림세포계측법 및 플루오로세인 이소티오시아네이트-표지된 대장균을 사용하여 측정하였다. 값은 최소이승평균±표준오차 LSM이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(SAS 프로그램):*P=0.002,**P=0.0001.
14일동안 락토바실루스 람노수스 HN067을 수용한 마우스는 대조군 마우스에 비해 높은, PHA 및 LPS에 대한 임파구 증식반응을 나타냈다(표 12).
락토바실루스 람노수스 HN067 보충이 PHA 및 LPS에 대한 임파구 증식반응에 미치는 효과
ConA 처리군 PHA에 대한 임파구 증식 LPS에 대한 임파구 증식
대조군 1.18±0.08 0.99±0.07
락토바실루스 람노수스 HN067 1.37±0.07* 1.24±0.06**
BALB/c 마우스에 14일동안 락토바실루스 람노수스 HN067(109cfu/일)을 경구투여하면서 또는 투여하지 않고 우유에 기초한 식사를 제공하였다. PHA 및 LPS에 대한 비장세포의 임파구 증식반응은 상업용 세포증식킷(독일의 보에링거 만하임제)을 사용하여 14일에 평가하였다. 값은 최소이승평균±표준오차 LSM을 나타낸다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(SAS 프로그램):*P＜0.08,**P＜0.01.
요컨대, 락토바실루스 람노수스 HN067을 수용한 마우스는 백혈구 식균기능, 경구면역화에 대한 항체반응 및 T 및 B-세포 미토겐에 대한 임파구 증식반응을 포함한 숙주면역반응의 범위을 상당히 향상시킴을 보여주었다. 혈중 백혈구(호중구 및 단핵구) 및 대식구는 선천성 면역의 주요 효과기이며, 미생물 감염에 대한 보호에 중요한 역할을 한다. 미토겐(T- 및 B-세포 미토겐)에 대한 생체외 임파구 증식반응 및 각각의 면역성사이의 상관관계는 또한 잘 입증되어 있다. 그러므로, 상기 결과는 락토바실루스 람노수스 HN067을 공급함으로써 선천성 및 후천성 면역의 여러 면들을 향상시킬 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 7-생 락토바실루스 람노수스 HN001 및 열사 락토바실루스 람노수스 HN001을 사용한 선천성 및 후천성 면역향상
본 연구의 목적은 살아있거나 또는 열사 형태로 존재하는 경우 선생물균주 락토바실루스 람노수스 HN001의 면역향상효과를 조사하는 것이었다. 면역기능에 미치는 효과는 말초혈액 백혈구의 식균작용을 측정함으로써 평가하였다. 생 또는 열사 락토바실루스 람노수스 HN001이 체액성 면역에 미치는 효과는 콜레라 독소로 마우스를 면역화하고, 생성된 특이항체의 농도를 측정함으로써 조사하였다.
하기 실험프로토콜을 사용하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다.
2. 마우스를 다른 처리군으로 무작위배치하였다.
3. 실험내내 대조군 마우스에게는 탈지분유에 기초한 식사를 제공하였다.
4. 실험 마우스에게는 14일동안 탈지분유에 기초한 식사 뿐만 아니라 하루에 109cfu/일 생 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 109cfu/일 열사 락토바실루스 람노수스 HN001을 제공하였다.
5. 마우스를 공급 0일 및 7일에 콜레라 독소로 경구면역화하였다.
결과
락토바실루스 람노수스 HN001 공급은 대조군 식사를 섭취한 마우스에 비해 말초혈액 백혈구의 식균작용 수준을 상당히 향상시켰다(도 2). 상기 증가는 락토바실루스 람노수스 HN001이 살아있는 형태 또는 열사된 형태로 전달되는지와는 무관한 것으로 보였다. 열사 락토바실루스 람노수스 HN001에 비해 생 락토바실루스 람노수스 HN001을 수용한 마우스의 식균작용 수준에는 차이가 없었다.
살아있는 락토바실루스 람노수스 HN001 및 죽은 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급하면 대조군 마우스에 비해 혈청 및 점막 항체반응을 모두 증가시켰다. 그러나, 반응수준은 생 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급한 마우스에서보다 상당히 높았다(표 13).
생 락토바실루스 람노수스 HN001 및 열사 락토바실루스 람노수스 HN001이 마우스내 콜레라 독소에 대한 혈청 및 점막 항체반응에 미치는 효과
처리군 혈청 항체반응(단위/㎖) 점막 항체반응(단위/㎖)
대조군 88.69±18.52 708.6±146.9
생 락토바실루스 람노수스 HN001 214.89±62.33* 2054.5±285.8***
열사 락토바실루스 람노수스 HN001 174.89±44.78 1533.6±319.3
BALB/c 마우스에 14일동안 우유에 기초한 식사를 공급하고, 살아있는 형태 또는 열사된 형태의 109cfu/일 락토바실루스 람노수스 HN001을 경구투여하였다. 대조군 마우스에는 LAB을 공급하지 않았다. 마우스를 0일 및 7일에 콜레라 독소로 경구면역화하였다. 항체반응(혈청 및 장 분비물)은 14일에 ELISA를 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준오차이다. 대조군과는 상당한 차이를 나타냈다(학생용 t 시험):*P=0.05,***P=0.0005.
상기 결과는 생 및 열사 락토바실루스 람노수스 HN001이 모두 마우스내 선천성 및 후천성 면역을 향상시킬 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 8-비피도박테리움 락티스 HN019 및 락토바실루스 람노수스 HN001의 항감염 특성
본 연구의 목적은:
1. 위장 병원체 쥐티푸스(Salmonella typhimurium)에 대한 비피도박테리움 락티스 HN019 및 락토바실루스 람노수스 HN001의 보호효과를 평가하고,
2. 마우스내 쥐티푸스 감염에 대한 보호에 있어서 비피도박테리움 락티스 HN019 및 락토바실루스 람노수스 HN001에 의해 유도된 면역촉진의 역할을 측정하는 것이다.
항감염 특성은 간 및 비장으로의 세균 자리옮김을 측정함으로써 평가하였다. 면역향상효과는 식균기능(말초혈액 백혈구 및 복막 대식구) 및 T-세포 미토겐(PHA)에 대한 임파구 증식반응을 측정함으로써 시험하였다.
하기 실험프로토콜을 사용하였다:
1. 체중 20-30g의 6주 내지 7주된 BALB/c 마우스를 사용하였다.
2. 마우스를 4개의 다른 처리군으로 무작위배치하고, 개별적으로 수용하였다.
3. 실험내내 모든 마우스에게 탈지분유에 기초한 식사를 제공하였다.
4. 감염시키기 7일전에 마우스에게 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001(109cfu/일)을 매일 공급하기 시작하고, 시험을 지속시키는 동안 계속하였다.
5. 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 마우스에게 투여하고, 대조군(LAB 없음)은 7일에 출발하여 5일동안 쥐티푸스(ATCC 1772) 8×105cfu/일로 경구감염시켰다.
6. 비감염 대조군에게는 쥐티푸스 감염을 제공하지 않았다.
7. 감염후 6일에 마우스는 간 및 비장으로의 세균 자리옮김을 측정하고, 면역기능평가를 위해 사용되었다.
결과
비피도박테리움 락티스 HN019 및 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급한 마우스는 모두 쥐티푸스만 공급된 마우스보다 간 및 비장으로의 세균 자리옮김 수준이 상당히 저하되었음을 보였다(도 3).
감염으로 인해 식균기능이 상당히 억제되었으며(도 4); 쥐티푸스로 감염된 대조군 마우스의 식균작용은 감염되지 않은 마우스보다 상당히 낮았다. 그러나, 쥐티푸스 감염은 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급한 마우스의 말초혈액 백혈구의 식균작용에 영향을 미치지 않았다. 이는 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001이 공급되고, 쥐티푸스로 감염된 마우스 및 정상 비감염 대조군 마우스내 식균작용의 유사한 수준에 의해 나타났다.
비피도박테리움 락티스 HN019 및 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급한 마우스 모두 쥐티푸스 감염 대조군보다 높은, PHA에 대한 임파구 증식반응을 나타냈다(도 5). 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 수용한 마우스와 비감염 대조군 마우스 사이의 반응에 있어서 상당한 차이가 나타나지 않았다.
상기 결과와 함께, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 람노수스 HN001을 공급하면 쥐티푸스와 같은 장 병원체에 대한 보호를 제공할 수 있다. 감염에 대한 향상된 내성은 면역수행력을 향상시킴으로써 이루어진다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 AGAL 기탁번호 NM97/09514(1997.8.18)의 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) HN001의 생물학적 순배양물로 구성된다.
다른 측면에서 본 발명은 AGAL 기탁번호 NM98/01925(1998.2.17)의 락토바실루스 람노수스 HN067의 생물학적 순배양물로 구성된다.
다른 측면에서 본 발명은 AGAL 기탁번호 NM97/09515(1997.8.18)의 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophillus) HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001, 락토바실루스 람노수스 HN067 또는 AGAL 기탁번호 NM97/09513(1997.8.18)의 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HN019중 어느 하나의 생물학적 순배양물의 조성물을 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제와 함께 면역촉진농도로 포함한다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 둘 또는 그 이상의 상기 균주들을 함유한다.
상기 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제는 식품인 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 식품은 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유 중 어느 하나이다.
선택적으로, 상기 조성물은 약학적 조성물이고, 상기 부형제 또는 희석제는 약물학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제이다.
면역을 향상시키고, 생리학적으로 허용할 수 있고, 생물학적으로 순수한 균주는 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 아시도필루스 HN067 중 어느 하나의 동족체 또는 변이체이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기 생물학적 순배양물 중 어느 하나를 면역촉진 투여비율로 포유동물에 투여하는 것으로 구성된 선천성 및 후천성 면역을 향상시키는 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 균주중 둘 또는 셋의 실질적으로 생물학적 순배양물이 존재한다.
상기 배양물은 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제를 갖는 조성물의 형태로 투여되는 것이 바람직하다.
상기 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제는 식품인 것이 바람직하다.
상기 식품은 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상세한 설명에 인용되거나 또는 지시된 성분, 요소 및 특징으로 각각 또는 함께 구성되며, 상기 성분, 요소 또는 특징중 둘 또는 그 이상의 조합물에 관한 것이며, 여기에서 본 발명과 관련된 분야에 공지된 당량을 갖는 특정의 정수가 언급되며, 상기 공지된 당량은 각각 설명된다.

Claims (14)

  1. AGAL 기탁번호 NM97/09514(1997.8.18)의 락토바실루스 람노수스 HN001 또는 AGAL 기탁번호 NM98/01925(1998.2.11)의 락토바실루스 람노수스 HN067의 생물학적 순배양물.
  2. AGAL 기탁번호 NM97/09514(1997.8.18)의 락토바실루스 람노수스 HN001의 생물학적 순배양물.
  3. AGAL 기탁번호 NM98/01925의 락토바실루스 람노수스 HN067의 생물학적 순배양물.
  4. 면역촉진농도의, 제 2 항의 락토바실루스 람노수스 HN001, 제 3 항의 락토바실루스 람노수스 HN067, AGAL 기탁번호 NM97/09513(1997.8.18)의 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 AGAL 기탁번호 NM97/09515(1997.8.18)의 락토바실루스 아시도필루스 HN017의 생물학적 순배양물과 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제의 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 조성물은 둘 또는 그 이상의 상기 균주들을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제는 식품인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 식품은 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물이며, 상기 부형제 또는 희석제는 약물학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 락토바실루스 아시도필루스 HN017, 락토바실루스 람노수스 HN001, 비피도박테리움 락티스 HN019 또는 락토바실루스 아시도필루스 HN067 균주 중 어느 하나의 동족체 또는 변이체의, 면역을 향상시키는 생리학적으로 허용할 수 있는 생물학적 순수균주.
  10. 면역촉진투여속도로 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 9 항 중 어느 한 항의 생물학적 순배양물을 포유동물에 투여하는 것으로 구성된 선천성 및 후천성 면역을 향상시키는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 둘 또는 세 균주의 생물학적 순배양물이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에 투여하는 것으로 구성된 선천성 및 후천성 면역을 향상시키는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제는 식품인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 식품은 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유인 것을 특징으로 하는 방법.
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