CN111206069B

CN111206069B - 一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法

Info

Publication number: CN111206069B
Application number: CN201911024140.1A
Authority: CN
Inventors: 林吉恒
Original assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Current assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN111206069A

Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，为解决现有化妆品中致病菌的检测操作复杂、检测周期长、容易出现误检和漏检的问题，提供了一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法，包括以下步骤：(1)将待检测化妆品加入到灭菌生理盐水中，振荡混匀，静置，取上清液作为检测液；(2)将检测液加入到培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，培养得菌液；(3)在菌液中加入纳米免疫磁珠，进行免疫反应；(4)将纳米免疫磁珠从菌液中进行免疫磁分离，统计捕获到的细菌数，计算捕获率。本发明的三种免疫磁珠的灵敏度较高，捕获相应致病菌的特异性较强，且在化妆品基质和纯培养物中的捕获率均无显著性差异(P＞0.05)。

Description

一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展，化妆品已逐渐成为人们日常生活中的必需品，但其基质富含营养容易受到微生物污染，这不仅影响化妆品的色、香、味及剂型，如果消费者使用了含有致病菌的化妆品，还会引发皮肤发痒、发炎，皮肤化脓感染，伤口病情恶化等。其中，耐热大肠菌群超标，消化道就可能被感染，而大肠埃希氏菌作为耐热大肠菌群中与人类生活密切相关的仅有的一个种，被视为粪便污染的最佳指示菌；铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌污染的化妆品，则易通过皮肤进入体内，引起化脓甚至引发败血症。中国卫生部在《化妆品安全技术规范》2015年版中对这些致病菌进行了规定：每克或每毫升产品中不得检出耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

当前化妆品中上述3种致病菌的检测方法主要是传统的平板培养法，但这种方法存在着操作复杂、检测周期长、容易出现误检和漏检等不足，如需要配置大量的固体和液体培养基，样品需培养48或者72小时才能观察结果，最终结果还需结合生化试验等方法进行综合判断。此外，化妆品中防腐剂的存在也使一部分化妆品的抑菌作用无法清除，影响化妆品微生物的检验结果。目前，传统的微生物检测方法已不能很好地满足化妆品中致病菌检测的需要，迫切需要建立一种灵敏度更高、特异性更强、快速、简便的检测方法，以满足化妆品中致病微生物快速检测的需要。

中国专利文献上公开了“一种同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片”，申请公布号为CN106636434A，该发明建立了一种可以同时检测5中致病菌的基因芯片，可以达到检测化妆品中常见的致病菌的目的，基因芯片的灵敏度为0.085ng/μL，同时检测5种致病菌；其基于致病菌的基因组2个或者多个混合，做多重PCR，然后杂交芯片，得到检测结果，存在着检测成本高、特异性差的问题，难以满足化妆品中致病微生物快速检测的需要。

发明内容

本发明为了克服现有化妆品中致病菌的检测方法操作复杂、检测周期长、容易出现误检和漏检的问题，提供了一种灵敏度更高、特异性更强、快速、简便的利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中3种致病菌的方法，包括以下步骤：

(1)将待检测化妆品加入到灭菌生理盐水中，振荡混匀，静置，取上清液作为检测液；

(2)将步骤(1)得到的检测液加入到培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，培养得菌液；

(3)在步骤(2)得到的菌液中加入纳米免疫磁珠，进行免疫反应；所述纳米免疫磁珠包括大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)、金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)和铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)；

(4)将经过步骤(3)处理的纳米免疫磁珠从菌液中进行免疫磁分离，统计各免疫磁珠捕获到的细菌数，按照以下公式计算捕获率：

捕获率＝N_c/N₀×100％，

其中，N_c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；

N₀是空白对照中的细菌数，单位为CFU/100μL；所述空白对照为不加样品的细菌纯培养物。

本发明利用纳米免疫磁珠可分别实现对大肠埃希菌Escherichia coli(Ec)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu(Sa)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(Pa)这3种致病菌的特异性筛选和富集，具有较高的检测灵敏度和准确度，为快速、准确检测化妆品中3种致病菌奠定基础。

免疫磁珠由磁性微球表面固化抗原或抗体等免疫活性分子构成，本发明所述纳米免疫磁珠的比表面积较微米免疫磁珠大，表面偶联的抗体多，捕获致病菌的能力也更强。本发明的免疫磁珠捕获法捕获化妆品中3种致病菌的原理如下：利用特异性抗体包被在磁珠表面来捕获检样(或增菌液)中的目标微生物，在磁场的作用下被吸附沉淀，使菌株与干扰检测灵敏度的检样残渣及其他杂菌分离，起到浓缩和富集的作用。由于免疫磁珠上的抗体与细菌抗原的结合是通过非共价键结合，因此不会影响目标菌的生理和生化特性可为下一步试验提供优良的条件。

作为优选，步骤(1)中，所述待检测化妆品在灭菌生理盐水中的加入量为0.1～0.12g/mL。

作为优选，步骤(2)中，所述培养基为胰酪大豆胨液体培养基(TSB)；培养温度为35～37℃，培养时间为18～24h。

作为优选，步骤(3)中，以菌液总体积为基准，

所述大肠埃希菌免疫磁珠的加入量为60～80μL/mL；

所述金黄色葡萄球菌免疫磁珠的加入量为60～100μL/mL；

所述铜绿假单胞菌免疫磁珠的加入量为80～100μL/mL。

本发明研究发现纳米免疫磁珠的加入量在20～80μL时，用量与捕获率呈正相关，在80μL时达到最大，捕获率为90.3％，而免疫磁珠量为100μL时捕获率则略有下降为81.8％，这可能由于过量的免疫磁珠会导致非特异性反应的增加，而影响对目标细菌的特异吸附；IMB-Sa的捕获率和免疫磁珠量呈正比，免疫磁珠量为20μL时，捕获率只有65.9％，100μL时最高达到95.7％；IMB-Pa的捕获率和免疫磁珠量呈正比，免疫磁珠在量为80μL时达到92.1％，100μL时最高达到98.9％。

作为优选，步骤(3)中，所述菌液的浓度为10²～10³CFU/mL。

IMB-Ec在菌液浓度为10²-10³CFU/mL时捕获率最高，为91％、93.3％，之后，随着浓度的增加捕获率逐渐降低；IMB-Sa在菌液浓度为10¹CFU/mL时捕获率最高，为91.3％，在10²-10³CFU/mL时捕获率也较高，在84％以上；而IMB-Pa则在浓度为10³CFU/mL时捕获率最高，达到94.7％。

作为优选，步骤(3)中，免疫反应的时间控制在20～40min。

免疫磁珠对目标菌的富集是基于抗原抗体的结合，需要一段时间的充分接触和反应，免疫反应时间过短会造成磁珠与菌体结合不充分；免疫反应时间过长则可能由于整个过程都在轻摇振荡而造成菌体与磁珠的脱离。当免疫反应时间在5-30min内，IMB-Ec和IMB-Pa的捕获率随着免疫反应时间的增加而逐渐增加，在30min时达到最高，捕获率分别为84.4％、96.3％，之后随着反应时间的延长，捕获率反而有所降低；IMB-Sa的捕获率在免疫反应时间为40min时达到最高，捕获率为87.8％。

作为优选，步骤(4)中，免疫磁分离的时间为1～5min。

免疫分离时间对捕获率的影响很大，免疫分离时间过短会导致磁珠分离不彻底，免疫分离时间过长，会导致捕获率降低。IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa的捕获率分别在免疫磁分离的时间为5，5，1min时达到最高，分别为91.1％、91.7％、95.5％。之后，磁分离时间再延长，捕获率反而有所降低。

作为优选，步骤(3)中，所述纳米免疫磁珠的制备方法为：

(a)将纳米级羧基磁珠加入到活化缓冲液中，磁力架分离，弃上清，重复操作，得第一活化纳米级羧基磁珠；

(b)在步骤(a)得到的活化纳米级羧基磁珠中加入活化缓冲液，涡旋混匀，再加入活化剂，放于混匀器室温反应，得第二活化纳米级羧基磁珠；

(c)在步骤(b)得到的第二活化纳米级羧基磁珠中加入多克隆抗体，室温反应，得多克隆抗体纳米级羧基磁珠；所述多克隆抗体为大肠埃希菌多克隆抗体或金黄色葡萄球菌多克隆抗体或铜绿假单胞菌多克隆抗体；

(d)在步骤(c)得到的多克隆抗体纳米级羧基磁珠中加入封闭剂，室温反应；

(e)用清洗经步骤(d)处理后的多克隆抗体纳米级羧基磁珠，磁力架分离，弃上清，重复操作，所得磁珠，即为纳米免疫磁珠。

作为优选，步骤(a)和(b)中，所述活化缓冲液为0.5M无水吗啉乙磺酸(MESbuffer)，所述活化缓冲液的pH值为5.0～6.0。

作为优选，其特征在于，步骤(b)中，所述活化剂为浓度为8～15mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

作为优选，步骤(e)中，所述清洗液为含0.05wt％叠氮钠的PBS溶液。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用三种纳米免疫磁珠可分别实现对大肠埃希菌Escherichia coli(Ec)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu(Sa)、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(Pa)这3种致病菌的特异性筛选和富集，具有较高的检测灵敏度和准确度，为快速、准确检测化妆品中3种致病菌奠定基础；

(2)三种免疫磁珠的灵敏度较高，捕获相应致病菌的特异性较强，且在化妆品基质和纯培养物中的捕获率均无显著性差异(P＞0.05)。

附图说明

图1是纳米级羧基磁珠的SEM图。

图2是大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)与大肠埃希菌的结合形态图。

图3是金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)与金黄色葡萄球菌的结合形态图。

图4是铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)与铜绿假单胞菌的结合形态图。

图5是三种纳米免疫磁珠捕获的灵敏度实验结果图。

图6是三种纳米免疫磁珠在洗面奶基质中及纯培养物中的捕获效果对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明以下实施例中所用试剂来源为：

大肠埃希菌Escherichia coli(Ec)(CMCC(44102))、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(Sa)(CMCC(26003))、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(Pa)(CMCC(10104))均购于中国食品药品检定研究院；

大肠埃希菌多克隆抗体、金黄色葡萄球菌多克隆抗体和铜绿假单胞菌多克隆抗体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

纳米级羧基磁珠购于无锡百迈格生物科技有限公司，生产批号为20180118；

封闭液购于无锡百迈格生物科技有限公司，批号为80110；

胰酪大豆胨液体培养基(TSB)购于青岛海博生物技术有限公司。

实施例1

(1)制备大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)：

取纳米级羧基磁珠10mg于1.5mL离心管中，加入0.5mL活化缓冲液(0.5M MESbuffer)(pH＝5.0)，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5mL活化缓冲液，涡旋混匀；加入0.5mL活化剂EDC(10mg/mL)，放于混匀器室温反应40min。加入100μg大肠埃希菌多克隆抗体，室温反应12h；最后，加入封闭剂0.5mL，室温反应4h；用含0.05％叠氮钠的PBS溶液0.5mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4℃保存备用，此为大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)；

(2)制备金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)：

取纳米级羧基磁珠10mg于1.5mL离心管中，加入0.5mL活化缓冲液(0.5M MESbuffer)(pH＝6.0)，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5mL活化缓冲液，涡旋混匀。加入0.5mL活化剂EDC(8mg/mL)，放于混匀器室温反应40min。加入100μg金黄色葡萄球菌多克隆抗体，室温反应18h；最后，加入封闭剂0.5mL，室温反应4h；用含0.05％叠氮钠的PBS溶液0.5mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4℃保存备用，此为金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)；

(3)制备铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)：

取纳米级羧基磁珠10mg于1.5mL离心管中，加入0.5mL活化缓冲液(0.5M MESbuffer)(pH＝5.5)，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5mL活化缓冲液，涡旋混匀。加入0.5mL活化剂EDC(15mg/mL)，放于混匀器室温反应40min。加入100μg铜绿假单胞菌多克隆抗体，室温反应18h；最后，加入封闭剂0.5mL，室温反应4h；用含0.05％叠氮钠的PBS溶液0.5mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4℃保存备用，此为铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Sa)；

(4)称取化妆品样品(洗面奶基质)10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角烧瓶中，充分振荡混匀，静置15min，取1:10的上清液作为检测液；

(5)将10mL检测液加入到90mLTSB培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，36℃培养20h，得到浓度为10³CFU/mL的菌液；同时，与不加样品的细菌纯培养物作对照；

(6)取1mL菌液，加入80μL大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)、100μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)和100μL铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)，免疫反应30min；

(7)将纳米免疫磁珠在磁场的作用下从菌液中免疫磁分离5min，统计各免疫磁珠捕获到的细菌数，按照以下公式计算捕获率，结果如表1所示：

捕获率＝N_c/N₀×100％，

其中，N_c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；

实施例2

(1)制备大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)：同实施例1；

(2)制备金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)：同实施例1；

(3)制备铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)：同实施例1；

(4)称取化妆品样品(洗面奶基质)10g，加到装有玻璃珠及100mL灭菌生理盐水的三角烧瓶中，充分振荡混匀，静置15min，取上清液作为检测液；

(5)将10mL检测液加入到90mLTSB培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，37℃培养18h，得到浓度为10²CFU/mL的菌液；同时，与不加样品的细菌纯培养物作对照；

(6)取1mL菌液，加入70μL大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)、60μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)和80μL铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)，免疫反应40min；

(7)将纳米免疫磁珠在磁场的作用下从菌液中免疫磁分离1min，统计各免疫磁珠捕获到的细菌数，按照以下公式计算捕获率，结果如表1所示：

捕获率＝N_c/N₀×100％，

其中，N_c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；

实施例3

(1)制备大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)：同实施例1；

(2)制备金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)：同实施例1；

(3)制备铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)：同实施例1；

(5)将10mL检测液加入到90mLTSB培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，35℃培养24h，得到浓度为10²CFU/mL的菌液；同时，与不加样品的细菌纯培养物作对照；

(6)取1mL菌液，加入60μL大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)、70μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)和90μL铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)，免疫反应20min；

(7)将纳米免疫磁珠在磁场的作用下从菌液中免疫磁分离3min，统计各免疫磁珠捕获到的细菌数，按照以下公式计算捕获率，结果如表1所示：

捕获率＝N_c/N₀×100％，

其中，N_c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，步骤(6)中，大肠埃希菌免疫磁珠(IMB-Ec)在菌液中的加入量为100μL/mL，其余完全相同。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，步骤(6)中，金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB-Sa)在菌液中的加入量为20μL/mL，其余完全相同。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，步骤(6)中，铜绿假单胞菌免疫磁珠(IMB-Pa)在菌液中的加入量为60μL/mL，其余完全相同。

对比例4

对比例1与实施例1的区别在于，步骤(6)中，免疫反应时间为5min，其余完全相同。

表1.实施例1-3和对比例1-4的反应参数及捕获率

由表1可以看出，本发明利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中3种致病菌的方法只有在各个参数处于较佳的选择时，才能同时实现3种致病菌的较高捕获率，如对比例1所示，IMB-Ec免疫磁珠量过高为100μL时，大肠埃希菌的捕获率则略有下降为81.8％，这是因为过量的免疫磁珠会导致非特异性反应的增加，会影响对目标细菌的特异吸附。任一参数的超出，均会导致捕获率的降低。

免疫磁珠与致病菌结合的超微结构观察

取1mL浓度为10³CFU/mL的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌悬液分别与80μL免疫磁珠在37℃反应30min，2.5％戊二醛洗1次，磁分离去上清；2.5％戊二醛处理样品，室温下静置2h，磁分离弃上清，PBST洗3次；磁分离弃上清，PBST洗3次；30％，50％，70％，85％，95％和100％乙醇脱水各2次；乙酸异戊酯置换2次；临界点干燥器处理对样品进行CO₂临界点干燥；干燥后的样品经喷金后置于扫描电镜下观察，结果如图1-4所示。

图1可以看出与菌体未结合的免疫磁珠呈现圆形，大小相对均匀。图2-4为IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa免疫磁珠分别与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在PBS溶液中结合，经过戊二醛固定及乙醇脱水后，在扫描电子显微镜(SEM)下观察到的结合形态图；由图可知IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa与各致病菌菌体表面的抗原表位结合，形成复合物，说明制备的免疫磁珠能成功捕获对应的致病菌。

三种纳米免疫磁珠的灵敏度和特异性检测

分别取1mL菌浓度为10¹-10⁷CFU/mL的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌悬液，按照各免疫磁珠的最佳捕获条件，检测免疫磁珠IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa的灵敏度；同时，在3种免疫磁珠的最佳捕获条件下，分别考察免疫磁珠IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa的特异性。

3种免疫磁珠灵敏度实验结果如图5所示，IMB-Ec在菌液浓度为10²-10³CFU/mL时捕获率最高，为91％、93.3％，之后，随着浓度的增加捕获率逐渐降低；IMB-Sa在菌液浓度为10¹CFU/mL时捕获率最高，为91.3％，在10²-10³CFU/mL时捕获率也较高，在84％以上；而IMB-Pa则在浓度为10³CFU/mL时捕获率最高，达到94.7％。

特异性检测结果如表2所示：

表2.三种纳米免疫磁珠特异性实验结果

注：N_c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；N₀是空白对照中的细菌数，单位为CFU/100μL。

如表2所示，IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa 3种免疫磁珠对3株致病菌分别进行捕获。IMB-Ec免疫磁珠对Ec的平均捕获率为91.3％，对Sa的捕获率较低，为11.3％、9.1％、11.2％，对Pa的捕获率则低于17％；IMB-Sa免疫磁珠对Sa的捕获率为94.0％、88.2％、91.5％，对Sa、Pa的捕获率均小于15％；IMB-Pa免疫磁珠对Pa的捕获率分别为95.2％、95.0％和89.8％，对Ec的捕获率小于7％，对Sa的捕获率则小于17％。3种免疫磁珠对其相应致病菌的捕获率均在88％以上，而对非相应致病菌的捕获率较低，说明此次制备的3种免疫磁珠特异性好，抗干扰能力较强。

化妆品基质的干扰性检测

三种纳米免疫磁珠在洗面奶基质中及纯培养物中的捕获效果如图6所示，IMB-Ec、IMB-Sa和IMB-Pa在纯培养中的捕获效率分别为83.3％、76.3％、57.3％，在洗面奶基质中捕获效率则分别为75.6％、70.3％、55.3％，三种免疫磁珠在洗面奶基质和纯培养物中的捕获率均无显著性差异(P＞0.05)，说明该基质对捕获目的菌的干扰较小。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将待检测化妆品加入到灭菌生理盐水中，振荡混匀，静置，取上清液作为检测液；

（2）将步骤（1）得到的检测液加入到培养基中，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，培养得菌液；

（3）在步骤（2）得到的菌液中加入纳米免疫磁珠，进行免疫反应；所述纳米免疫磁珠包括大肠埃希菌免疫磁珠、金黄色葡萄球菌免疫磁珠和铜绿假单胞菌免疫磁珠；

（4）将经过步骤（3）处理的纳米免疫磁珠从菌液中进行免疫磁分离，统计各免疫磁珠捕获到的细菌数，按照以下公式计算捕获率：

捕获率=N _c /N ₀×100%，

其中，N _c是免疫磁珠捕获到的细菌数，单位为CFU/100μL；

N ₀是空白对照中的细菌数，单位为CFU/100μL；

大肠埃希菌免疫磁珠由如下步骤制备得到：

取纳米级羧基磁珠10 mg于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL 0.5 M pH=5.0无水吗啉乙磺酸缓冲液，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5 mL活化缓冲液，涡旋混匀；加入0.5 mL10 mg/mL活化剂EDC，放于混匀器室温反应40 min，加入100 μg大肠埃希菌多克隆抗体，室温反应12 h；最后，加入封闭剂0.5 mL，室温反应4 h；用含0.05%叠氮钠的PBS溶液0.5 mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4 ℃保存备用；

金黄色葡萄球菌免疫磁珠由如下步骤制备得到：

取纳米级羧基磁珠10 mg于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL 0.5 M pH=6.0无水吗啉乙磺酸缓冲液，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5 mL活化缓冲液，涡旋混匀，加入0.5 mL8 mg/mL活化剂EDC，放于混匀器室温反应40 min，加入100 μg金黄色葡萄球菌多克隆抗体，室温反应18 h；最后，加入封闭剂0.5 mL，室温反应4 h；用含0.05%叠氮钠的PBS溶液0.5 mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4 ℃保存备用；

铜绿假单胞菌免疫磁珠由如下步骤制备得到：

取纳米级羧基磁珠10 mg于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL 0.5 M pH=5.5无水吗啉乙磺酸缓冲液，磁力架分离，弃上清，重复三次；加入0.5 mL活化缓冲液，涡旋混匀，加入0.5 mL15 mg/mL活化剂EDC，放于混匀器室温反应40 min，加入100 μg铜绿假单胞菌多克隆抗体，室温反应18 h；最后，加入封闭剂0.5 mL，室温反应4 h；用含0.05%叠氮钠的PBS溶液0.5 mL清洗磁珠，磁力架分离，弃上清，重复三次，4 ℃保存备用；

步骤（3）中，所述菌液的浓度为10²~10³ CFU/mL；

步骤（3）中，大肠埃希菌免疫磁珠的加入量为80 μL /mL，免疫反应的时间为30 min，免疫磁分离的时间为5min；

步骤（3）中，金黄色葡萄球菌免疫磁珠的加入量为100 μL/mL，免疫反应的时间为30min，免疫磁分离的时间为5min；

步骤（3）中，铜绿假单胞菌免疫磁珠的加入量为100 μL/mL，免疫反应的时间为30 min，免疫磁分离的时间为5min。

2.根据权利要求1所述的一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述待检测化妆品在灭菌生理盐水中的加入量为0.1~0.12g/mL。

3.根据权利要求1所述的一种利用纳米免疫磁珠快速捕获化妆品中三种致病菌的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养基为胰酪大豆胨液体培养基；培养温度为35~37℃，培养时间为18~24h。