CN103937897A - 检测化妆品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测化妆品中致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中上述寡聚核苷酸探针包含从藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因、白色念珠菌和新生隐球菌的18S-28SrDNA间区中选取的DNA片段或其互补的DNA或RNA序列。本发明还提供利用上述基因芯片检测化妆品中致病菌的试剂盒。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测化妆品中致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测化妆品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒。
背景技术
最近几年以来，为了满足消费者的需求，化妆品生产商在提高功效和回归大自然的同时，在化妆品中加入了来自植物、动物中的营养成分，另外化妆品中还含有氨基酸、蛋白质、脂肪、维生素、无机盐和胎盘液等营养成分，为细菌、真菌等各种致病菌的生长、繁殖提供了足够的营养成分，因此化妆品特别容易受到微生物的污染。除此之外、pH 4-7也是微生物生长最适宜的条件，另外，化妆品在生产、储存和日常使用过程中都是室温放置，室温也是微生滋生和繁殖的适宜温度。微生物的生长需要水分，它是决定微生物能否生长和生长快慢的重要因素。微生物细胞的主要成分就是碳源，微生物细胞内的核酸和蛋白质的重要位置是氮源，另外微生物的生长还需要矿物元素，包括钾、磷、钠、镁、铁等成分，另外微生物所需的生长因子都是维生素类，在化妆品中含量丰富。因此化妆品里含的营养为微生物生长提供了一切条件，就是微生物生长的摇床。
妆品中受到污染以后，会发生各种变质现象，影响化妆品的质量。微生物新陈代谢后分泌色素，比如霉菌代谢产生的色素，可以是化妆品变成黑色、黄色产生霉斑等各种颜色。另外微生物代谢有时产生的硫物质，胺物质等会发出酸臭味，使原本芬芳的气味发出难闻的气味。另外，微生物污染化妆品生长过程中，分解蛋白质、氨基酸、酶类等，是化妆品的理化结构发生变化，腐败变质不能使用。如果污染的微生物是致病菌，在使用的过程中，还会感染消费者，严重危害身体健康。致病菌生长过程中会产生代谢产物和各种毒素，这些产物在人体免疫系统的识别下，可以变成刺激源和变应原，使使用者产生过敏或者受到感染，引起各种各样的皮肤病，比如肤色异常、接触性和光感性皮炎，掉头发，头发粗糙，痤疮等皮肤病。
根据文献参考以及调查，我们选取了12种化妆品中常见的致病菌，包括白色念珠菌（Candida albicans），新生隐球菌（Cryptococcus neoformans），志贺氏菌（Shigella），藤黄微球菌（Micrococcus luteus），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），化脓链球菌（Streptococcus pyogenes），沙门氏菌（Salmonella），奇异变形杆菌（Proteus mirabilis），弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuarti）。
化妆品经过一次污染和二次污染，致病菌就会进入到化妆品中，而且化妆品为微生物的生长提供了足够的营养和水分，是微生物生长的温床。污染化妆品的微生物主要包括真菌和细菌，一般霉菌不致病，细菌主要是大肠杆菌群，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌等。被污染的化妆品就会引起消费者面部器官、皮肤的感染，更严重的引起全身感染，致病菌通过皮肤的破损处或者口腔进入到人体内。传统的病原菌鉴定主要是生化鉴定和血清型分型，这些方法可以很准确的鉴定微生物，但是操作时间太长，操作也比较复杂，需要耗费大量的人力和物力。随着技术的发展，也有一些新的技术涌现，包括实时定量聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性分析、荧光原位杂交、质谱技术、免疫技术等，这些方法与传统方法比，操作更简单，更快速。
（1）实时定量聚合酶链反应
实时荧光定量PCR ( real-time fluorescentquantitative polymerase chain reaction)，就是在简单的PCR反应过程中加入荧光染料或者荧光探针，利用PCR过程中荧光的变化量，用机器实时监测PCR中产物的扩增量，实现定量的目的。Richardson等人就利用荧光定量PCR技术了鉴定了314株分枝杆菌菌株，灵敏度可以高达95%以上，这位临床治疗结核病奠定了基础。与传统方法比较发现，实时荧光定量PCR的重复性比较好，灵敏度比较高，特异性也比较高。而且PCR扩增过程中就可以完成分析，避免了外界的污染。整个过程比较快，从提取模板到结果分析，只需要8个小时左右。但是它也有缺点，检测比较单一，实际样品中致病菌的种类繁多，所以实时荧光定量PCR还有局限性。
（2）限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性分析（restriction fragmentlength polymorphism，RFLP）的原理是根据不同种群细菌基因组DNA的多态性来鉴定病原菌。不同细菌基因组的酶切类型和位点不同，就可以在限制性内切酶的作用下，被切成不同长度片段的DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳技术分离，从而分析不同种群基因组的酶切类型，来鉴定病原菌。Christensen就利用RFLP技术，在八小时的情况下，就将血培养瓶中的乳酸菌鉴定到种。De Baere等利用本方法对95个临床样品进行检测，发现了有33个临床样品为皮肤藓菌，正确率100%。PCR-RFLP技术标记比较灵敏，速度也比较快，但是不足的是，基因很容易发生点突变、插入、缺失等情况，导致酶切位点发生变化，因此RFLP电泳图谱也会改变，实验不能重复。
（3）单链构象多态性分析
单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）的原理是不同碱基顺序的DNA序列具有不同的空间构象，不同空间构象在非变性凝胶电泳中的速度不一样，根据电泳的图谱就可以达到鉴定的目的。DNA单链在自身碱基顺序的影响下，可以折叠成多种多样的DNA单链构象。SSCP的实验步骤一般为对特定的目的片段进行PCR扩增，通过高温变性成单链，然后在非变性的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，得到SSCP电泳图谱。Shin等对12种临床比较常见的病原菌进行PCR扩增，变性，然后凝胶电泳得到12种常见病原菌的电泳图谱，能很好地区分。Turenne根据将培养分离的25种致病菌构建特异性电泳图谱，然后检测临床272例病原菌，将其中251种鉴定到种的水平。另外21例临床菌株在所构建的电泳图谱之外。SSCP技术虽然操作方便，灵敏度高，但是在亲缘关系特别相近的种属内，SSCP电泳图谱可以一模一样，说明SSCP技术的特异性不高。
（4）荧光原位杂交
荧光原位杂交技术( fluorescence in situ hybridization， FISH)是一种非放射性的杂交技术，它的原理就是，细胞或组织切片上核酸与RNA或者DNA探针可以碱基配对，是互补的，二者就可以形成稳定的杂交体，DNA或者RNA探针上面有报告分子比如生物素等，可以利用本生物素和带有荧光染料的亲和素结合，然后根据荧光染料来对所鉴定病原微生物进行定性，定量。Shepard等就根据带有荧光标记的探针，在3个小时就将197株临床病例鉴定为白色念珠菌和光滑念珠菌。本技术实验者比较安全，而且分辨率也比较好，简单。但是唯一的缺陷是不能高通量。
（5）质谱技术
质谱技术( mass spectrometry，MS)的对象是蛋白质，它的原理就是将待检多肽与基质结合，根据质荷比对多肽进行分析，达到蛋白质鉴定，蛋白质修饰，蛋白质分子相互作用的目的。首先在激光的作用下，使待测样本与基质分子结合成结晶薄膜，同时激光释放出能量给基质，基质再传递给待测样本，是待测样本变成带正电的、质荷比不同的分子。然后在质谱仪中电场和磁场的作用下分开，就得到质谱图。但是本技术不适用于病原微生物的快速鉴定，因为蛋白质提取比较复杂，而且蛋白质的纯度对质谱图影响很大。虽然成本低，检测快，但是质谱仪在一般的实验室很难实现。
（6）免疫技术
免疫学技术主要包括乳胶凝集反应、酶联免疫法、免疫磁性分离法。这三种技术的共同原理都是通过抗原抗体反应，然后级联放大，达到检测的目的。乳胶凝集反应就是把抗体标记上人工大分子乳胶，然后与抗体反应。酶联免疫法就是将酶连接到抗原抗体上，然后加入底物与酶反应，产生有颜色的物质，通过颜色的变化来定性病原菌。免疫磁性分离法就是将抗原抗体反应与磁场联系到一块，首先抗体与磁性微球连接，然后抗体与被检测抗原连接，通过磁场的变换，将微生物分离出来，达到鉴定的目的。但是此种技术不是高通量的，不能应对样品比较多的情况。
这些检测技术手段都各有自己的优点和缺点，化妆品中致病菌对人的危害也很严重，因此找到一种快速、灵敏、高通量的方法至关重要。
RNA的内转录间隔区( Internal Transcribed Spacer，ITS)，在细菌中是16S rRNA-23S rRNA之间的基因序列，在真菌中是18S rRNA-28S rRNA之间的基因序列。本实验中白色念珠菌、新生隐球菌的特异探针是跟据18S rRNA-28S rRNA之间的基因序列确定的，藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌是根据16S rRNA-23S rRNA之间的基因序列确定的。由于志贺氏菌的ITS与沙门氏菌的ITS同源性接近，很难区分，所以志贺氏菌根据ipaH特异基因设计探针。
发明内容
本发明提供一种检测化妆品中致病菌的基因芯片，以弥补传统检测化妆品中常见致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
为实现上述目的文发明公开了如下的技术内容：
一种检测化妆品中常见致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：
（1）从藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23S rDNA间区、白色念珠菌、新生隐球菌18S-28S rDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因
（2） 上述（1）中选取的DNA序列的互补DNA序列；
（3） 上述（1）或（2）中选取的DNA序列的互补RNA序列
其中，上述的从藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23S rDNA间区、白色念珠菌、新生隐球菌18S-28S rDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO:5–SEQ ID NO:35所示的DNA序列中的一种或多种DNA序列；从细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段具有SEQ ID NO:3所示的DNA序列。从真菌18s rDNA保守区中选取的DNA片段具有SEQ ID NO:2所示的DNA序列。
其中，上述的寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。上述的阳性对照探针优选为从细菌16s rDNA保守区和真菌18S rDNA中选取的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列，本发明的较佳实施例中上述的阳性对照探针具有SEQ ID NO:2- SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
本发明的另一目的是提供上述的基因芯片的应用，其可用于藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、白色念珠菌、新生隐球菌、志贺氏菌的至少一种的检测。其中，所应用的检测探针包括SEQ ID NO: 36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列中的至少一种。
本发明所涉及的SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 41序列如下：
表2 实验所用到的探针序列
| NO.01 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT _Cy3d |
| NO.02 | ATTATGCGACCGCCCGGCTAAT |
| NO.03 | GTACACACCGCCCGTCACACCATb |
| NO.04 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTc |
| NO.05 | ATCAACTTGTCACACCAGATTATTACT |
| NO.06 | AGGCGGGATCGCTTTGACAATG |
| NO.07 | ACTTGCGGCGGTAACGTC |
| NO.08 | CCTGTGAACTGTTTATGTTGCTTCGG |
| NO.09 | GGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGATT |
| NO.10 | AGTCTTCGGCAAGCTGATAACAACCA |
| NO.11 | GACACACTGTTTCATTTCTCCGTAATAA |
| NO.12 | TAATAAGAAATGAAAAATGGTGTGTTGCA |
| NO.13 | GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC |
| NO.14 | AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCA |
| NO.15 | AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG |
| NO.16 | GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT |
| NO.17 | TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA |
| NO.18 | ATGTTAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG |
| NO.19 | GGCTCCATCAGGATACAATCCTACTAAACTT |
| NO.20 | CACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGA |
| NO.21 | GCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTA |
| NO.22 | GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT |
| NO.23 | AAAAGGAGTGGTTATACGGGTATTAAAACATTA |
| NO.24 | GAATAACTAAGCTAATTCAAATGAGTTATCTTACT |
| NO.25 | CCACCCAGATAGTCTTTGAAAGAGACACTTT |
| NO.26 | CGCGCAGCCTTTCGATTGTACACCAAAGATTGGCG |
| NO.27 | AACGCACATTGTTTATCGCTTAAACAATGTGAG |
| NO.28 | GCTCCCACACGAATTGCTTGATTCACT |
| NO.29 | ACCAATTGTTGGTGTGCTGCGTGATC |
| NO.30 | GGCTGCGTATTATGCGTGGTCACTCGTATC |
| NO.31 | GCTCATGGGTGGAATATCAGCAAGCGGACA |
| NO.32 | CTGGTGGTGGTGTTGGGGTGGCGGCGTGGTG |
| NO.33 | CGCGACACGTGGGTGTTTTACGAA |
| NO.34 | AGGTTAAAAGAGATTCATTCGAT |
| NO.35 | AACGCACATTGTTTATCGCTTAAACAATGTGAG |
表3 芯片中所用的引物的序列
| NO.36 | P1 | TGTACACACCGCCCGTC |
| NO.37 | P2 | GGTACTTAGATGTTTCAGTTC |
| NO.38 | P3 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG |
| NO.39 | P4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
| NO.40 | P5 | TGACCGCCTTTCCGATA |
| NO.41 | P6 | TCTCCAGCATCTCATAYTTC |
本发明的再一目的是提供一种利用上述基因芯片检测化妆品中致病菌的试剂盒，该试剂盒包括本发明上述的基因芯片，该试剂盒还包括检测探针SEQ ID NO: 36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种。
本发明的试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。
本发明的再一目的是提供上述的试剂盒的应用，其可用于藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、白色念珠菌、新生隐球菌、志贺氏菌的至少一种的检测。
由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入化妆品中常见致病菌检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的化妆品中常见致病菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测化妆品中常见的致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，无论对于如出入境检验检疫部门对化妆品的检验检疫还是环境监测局对化妆品中致病菌的安全检验都有重要的应用价值。
附图说明
图1 为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；
图2A为利用本发明的基因芯片检测化妆品中白色念珠菌时的杂交结果；
图2B为利用本发明的基因芯片检测化妆品中新生隐球菌时的杂交结果；
图2C为利用本发明的基因芯片检测化妆品中志贺菌时的杂交结果；
图2D为利用本发明的基因芯片检测化妆品中藤黄微球菌时的杂交结果；
图2E为利用本发明的基因芯片检测化妆品中金黄色葡萄球菌时的杂交结果；
图2F为利用本发明的基因芯片检测化妆品中化脓链球菌时的杂交结果；
图2G为利用本发明的基因芯片检测化妆品中沙门氏菌时的杂交结果；
图2H为利用本发明的基因芯片检测化妆品中奇异变形杆菌时的杂交结果。；
图2I为利用本发明的基因芯片检测化妆品中弗氏柠檬酸杆菌时的杂交结果；
图2J为利用本发明的基因芯片检测化妆品中铜绿假单胞菌时的杂交结果；
图2K为利用本发明的基因芯片检测化妆品中产气肠杆菌时的杂交结果；
图2L为利用本发明的基因芯片检测化妆品中斯氏普罗维登斯菌时的杂交结果；
图3化妆品实际检测流程图。
具体实施方式
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
本实验用到的致病菌菌株如下
表4 本实验用到的12种致病菌
实施例1
探针的设计和制备
1. 序列获得
（1）16S-23S rDNA间区序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、志贺氏菌及他们的近缘菌的所有16S-23S rDNA间区序列。
（2）藤黄微球菌的间区序列公共数据库中没有，我们我们对它的ITS进行了测序，用细菌ITS的通用引物扩增出藤黄微球菌的ITS，PCR产物纯化后连接到T载体上，后电转进DH5α感受态中，挑取含500bp-1kbp的质粒测序，测序仪ABI 3700。测得的序列用Staden Package软件拼接，从而得到藤黄微球菌的间区序列。
（3）18S-28S rDNA间区序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到白色念珠菌、新生隐球菌的18S-28S rDNA间区序列。
（4）ipaH基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌四个种的全部ipaH基因序列。
2. 探针设计
（1）间区探针：分别将藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、志贺氏菌及他们的近缘菌的所有16S-23S rDNA间区序列，白色念珠菌、新生隐球菌的18S-28S rDNA间区序列，导入Glustal X软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。对照Glustal X比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度27bp±2bp，Tm值68℃±3℃。
（2）ipaH基因探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的志贺氏菌四个种的ipaH基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp±2bp，Tm值68℃±3℃的探针。
3. 探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10个T（表1所示的是荧光探针序列）并氨基化后委托探针合成公司（北京奥科公司）合成，备用
4. 探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。
在本发明的优选实施例中，选择了35条长度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探针，并通过多次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO. 2（SEQ ID NO:1）的探针序列选自所有真菌的18s rDNA，编号为NO. 3（SEQ ID NO:1）的探针序列选自所有细菌的16s rDNA，作为阳性对照用来检测是否有真菌、细菌，编号为NO. 1的探针作为荧光探针，编号为NO. 4的探针为多聚T片段，用作阴性对照，50%的DMSO，用作空白对照，编号NO. 5–NO. 10的6条探针序列（SEQ ID NO:5–SEQ ID NO:10）选自真菌（白色念珠菌、新生隐球菌）的18S-28S rDNA间区，编号NO. 11–NO. 13（SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:13）的3条探针序列选自志贺氏菌的ipaH基因，编号NO. 14–NO. 35（SEQ ID NO:14–SEQ ID NO:35）的22条探针序列选自藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23S rDNA间区基因。
表2 本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
| NO.01 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT _Cy3d |
| NO.02 | ATTATGCGACCGCCCGGCTAAT |
| NO.03 | GTACACACCGCCCGTCACACCATb |
| NO.04 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTc |
| NO.05 | ATCAACTTGTCACACCAGATTATTACT |
| NO.06 | AGGCGGGATCGCTTTGACAATG |
| NO.07 | ACTTGCGGCGGTAACGTC |
| NO.08 | CCTGTGAACTGTTTATGTTGCTTCGG |
| NO.09 | GGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGATT |
| NO.10 | AGTCTTCGGCAAGCTGATAACAACCA |
| NO.11 | GACACACTGTTTCATTTCTCCGTAATAA |
| NO.12 | TAATAAGAAATGAAAAATGGTGTGTTGCA |
| NO.13 | GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC |
| NO.14 | AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCA |
| NO.15 | AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG |
| NO.16 | GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT |
| NO.17 | TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA |
| NO.18 | ATGTTAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG |
| NO.19 | GGCTCCATCAGGATACAATCCTACTAAACTT |
| NO.20 | CACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGA |
| NO.21 | GCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTA |
| NO.22 | GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT |
| NO.23 | AAAAGGAGTGGTTATACGGGTATTAAAACATTA |
| NO.24 | GAATAACTAAGCTAATTCAAATGAGTTATCTTACT |
| NO.25 | CCACCCAGATAGTCTTTGAAAGAGACACTTT |
| NO.26 | CGCGCAGCCTTTCGATTGTACACCAAAGATTGGCG |
| NO.27 | AACGCACATTGTTTATCGCTTAAACAATGTGAG |
| NO.28 | GCTCCCACACGAATTGCTTGATTCACT |
| NO.29 | ACCAATTGTTGGTGTGCTGCGTGATC |
| NO.30 | GGCTGCGTATTATGCGTGGTCACTCGTATC |
| NO.31 | GCTCATGGGTGGAATATCAGCAAGCGGACA |
| NO.32 | CTGGTGGTGGTGTTGGGGTGGCGGCGTGGTG |
| NO.33 | CGCGACACGTGGGTGTTTTACGAA |
| NO.34 | AGGTTAAAAGAGATTCATTCGAT |
| NO.35 | AACGCACATTGTTTATCGCTTAAACAATGTGAG |
表3 芯片中所用的引物的序列
| NO.36 | P1 | TGTACACACCGCCCGTC |
| NO.37 | P2 | GGTACTTAGATGTTTCAGTTC |
| NO.38 | P3 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG |
| NO.39 | P4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
| NO.40 | P5 | TGACCGCCTTTCCGATA |
| NO.41 | P6 | TCTCCAGCATCTCATAYTTC |
实施例2
基因芯片制备：芯片点样
1. 溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。
2. 加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。
3. 点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm（长×宽×高）的洁净的醛基化玻片（CEL Associates, Inc.）放到芯片点样仪（Spotarray 72）的载物台上, 使用SpotArray的控制软件（Tele chem smp3 stealty pin），运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mm×2.25mm，该点阵内点间距250 μm，矩阵：12×9，12×250μm=3mm，9×250μm=2.25mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。
4. 干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。
5. 交联：用交联仪（uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker）600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。
由表1可见，每个点样区内为12（行）×9（列）个探针点。NO.2和NO.3框区示意的位置为检测细菌的正对照探针，NO.1框区示意的位置为荧光探针，NO.4框区示意的位置为负对照探针，其它为各致病菌的特异探针（对应于表2中的相应探针编号）。
实施例3
利用基因芯片快速检测化妆品中常见致病菌
1.样品处理：
（1）水溶性的液体样品：用灭过菌量筒在超净台中量取10mL液体样品，加到90mL事先准备好并灭菌的培养基中，制成1:10的稀释液，如果化妆品整个不足10mL，可适当的减少用量，将所有的样品加入到相应的培养基中。
（2）不溶性的油状液体样品：量取样品10mL，先加入也已经灭菌的矿物油中混均匀，然后再加入10mL吐温-80，在42水浴中使其混匀大概10分钟，加入灭菌的前增菌培养基75mL，然后在42水浴中乳化，制成1:10的稀释液。
（3）亲水的半固体样品：在无菌的环境下称取10g样品，加到90mL已灭菌的前增菌培养基中，涡旋震荡混匀，常温放置20分钟左右，吸取上清制成1:10的稀释液。
（4）疏水的半固体样品：在无菌环境下称取10g样品，加到事先已经灭过菌的研钵中，然后加入10mL灭过菌的矿物油，研磨使其变成黏稠状，然后加入10mL灭过菌的吐温-80，研磨溶解之后，加入70mL灭过菌的前增菌培养基，制成1:10的稀释液。
（5）固体样品：在无菌环境中称取10g样品，加到90mL已经灭过菌的前增菌培养基中，涡旋震荡混匀，然后放在常温20分钟，吸取上清液10mL，加到90mL前增菌培养基中，制成1:10的稀释液。疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称取10g样品，加入10mL灭过菌的矿物油，再加入10ml吐温-80，放置一段时间，吸取上清，制成1:10稀释液。如果化妆品样品量太少，也可以减少使用量。
2.前增菌
取10mL 1：10的化妆品样品稀释液分别加到90mL的前增菌培养基YPD、BHI、SCDLP中，分别放在合适的条件下培养24小时。
3.提取基因组
（1）吸取1000 ml 2YT培养基到1.5ml离心管中，12000 rpm 离心3min，吸取上清丢弃，留下沉淀。
（2）用移液枪吸取500 μL 50mM Tris-Hcl(PH=8.0)到1.5 ml离心管中，吹打重悬沉淀，涡旋震荡，洗涤菌体，12000 rpm离心3min，弃上清。
（3）然后再加500 μL 50mM Tris-Hcl(PH=8.0) 到1.5 ml离心管中，吹打重悬沉淀，再加入20 μL 0.5mM EDTA，涡旋震荡混匀，37℃水浴20min。
（4）加50μL 20mg/ml 溶菌酶，37℃水浴20min（因为是革兰氏阳性菌，需要破细胞壁，开水浴锅100℃），水浴过后，反复冻融5-6次（在液氮与100℃水浴锅中交替）。
（5）加6μL 20mg/ml 蛋白酶K，混匀后，加入30μL 10% SDS，50℃水浴至澄清（一般需要2个小时）。
（6）澄清后，加入等体积的P:C:I（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1），涡旋混匀，12000rpm离心10min，吸上清（尽量避免吸中间层）。
（7）在上清中加入10μL（10mg/ml）RnaseA，混匀后，37℃水浴10min。
（8）再加入等体积的P:C:I（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1），混匀后，12000rpm离心10min，吸取上清。
（9）重复步骤（9）一次。
（10）加入等体积C：I（24:1），混匀后，12000rpm离心10min，吸上清。
（11）加入2.5倍体积预冷无水乙醇（-80℃或-40℃预冷），混匀后，-80℃沉淀30min以上，然后12000rpm（预冷4℃离心机）离心15min，弃上清。
（12）加入1ml 70% 乙醇清洗一次，12000rpm（4℃）离心10min，弃上清。
（13）干燥至乙醇挥发完全，加入适量（50-80μL）MQ回溶，用NanoDrop 2000 OD仪测OD值，以及1%凝胶电泳检测，放在-20℃保存。
4. 扩增靶序列：
取上述基因组提取方法提取基因组作为模板加入 PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表4所示。（注：以下表4，表5中的PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 混合物，Taq酶均购自Sangon公司）
表4 Multiplex PCR反应混合液配方
| 成分 | 浓度 | 加样量（μl） |
| ddH2O | - | 36 |
| 10×PCR 缓冲液 | 10× | 5 |
| MgCl2 | 25mM | 5 |
| dNTP 混合物 | 10mM | 0.5 |
| P-1至P-2 | 10μM | 各1 |
| P-3和P-4 | 10μM | 各0.6 |
| P-5和P-6 | 10μM | 各0.1 |
| Taq酶 | 5U/μl | 0.5 |
注：表中P-1至P-6为表3中所列的引物。
将反应管放入PCR仪（Biometra）中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 30秒
72℃ 1分钟 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
4℃ 20分钟
5. 纯化：将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱（MILIPORE公司）纯化，具体步骤如下：
（1）将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。
（2）25℃、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。
（3）将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25μl的超纯水（MilliQ），37℃放置5分钟。
（4）将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。
6. 标记靶序列：取12μl 纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表5所示。
表5 标记混合液配方
| 成分 | 浓度 | 加样量（μl） |
| ddH2O | - | 9.3 |
| 10×PCR缓冲液 | 10× | 3 |
| MgCl2 | 25mM | 3 |
| dNTP 混合物 | 10mM | 0.3 |
| P-2，P-4和P-6 | 10μM | 各0.6 |
| Cy3-dUTP | 25nM | 0.3 |
| Taq酶 | 5U/μl | 0.3 |
注：表中P-2、 P-4 、P-6为表3中所列的引物。
将反应管放入PCR仪（Biometra）中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 30秒
72℃ 1分钟 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
4℃ 20分钟
7. 烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。
8. 杂交：向杂交盒（博奥公司）内预加入70μl ddH2O以保持湿度。12μl杂交液（配方如下所示）回溶烘干产物并加在实施例三中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片（博奥公司）（注意盖片和载玻片之间不能有气泡），盖紧杂交盒，40℃水浴锅中杂交16小时。
9. 洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
杂交液配方：10%硫酸葡聚糖（dextran Sulfate）；25%甲酰胺（formamide）；0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）； 6×SSPE
洗液A： 1×SSC（氯化钠-柠檬酸钠溶液）；0.1% SDS
洗液B： 0.05×SSC
洗液C： 95%乙醇
10. 扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪（AXON instrument）扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name: 575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测常见的化妆品中常见致病菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、白色念珠菌、新生隐球菌、志贺氏菌）时的杂交扫描结果如图2A-2L所示。
实施例4
对基因芯片进行性能评价
对实施例2中制备的化妆品中常见致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：
评价芯片的好坏，不止芯片能验证检测范围内的12种致病菌，在芯片检测范围外的致病菌，必须没有杂交信号。本实验随机选择了检测范围外近缘以及远缘的常见20种致病菌用于特异性评价，验证本实验芯片的特异性是否良好。
对实施例2中制备的化妆品中常见致病菌检测基因芯片的灵敏度进行鉴定如下：
我们将12种致病菌基因组进行一系列稀释，包括100ng/μL，10ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，分别进行PCR，然后杂交试验，对比实验结果，确定本实验能够检测出致病菌的最低模板浓度为1 ng/μL。
对实施例2中制备化妆品中常见致病菌检测基因芯片的多种菌进行鉴定如下：
检测化妆品中常见的致病菌，在实际情况中，一种化妆品中可能存在不止一种检测范围内的致病菌，可能二种，或者三种，所以为了证明本芯片能同时检测不止一种致病菌，我们将致病菌的基因组两个或者三个混合，做多重PCR，然后杂交芯片，查看结果，证明了本芯片可以同时检测多种致病菌。
对实施例2中制备的化妆品中常见致病菌检测基因芯片的双盲实验进行鉴定如下：
在实际化妆品检测中，往往不知道致病菌的类型，在研发芯片的过程中，由于人的主观意识的存在，实验结果不客观，所以在实验室别人的帮助下完成盲测实验。首先，在实验者不知情的情况下，帮助者将基因组的标记去掉，顺序打乱，然后实验者做多重PCR，杂交芯片，查看实验结果，保证实验结果的客观性。
对实施例2中制备的化妆品中常见致病菌检测基因芯片的模拟实验进行鉴定如下：
根据国内外大量文献，以及出入境检验检疫局，我们确定了检测化妆品中致病菌的模拟实验方案，并一一验证了12株菌，试验方法如下：
1. 首先，从保存菌种的甘油管中用移液枪吸取10uL菌液，加到
相应的液体培养基中，活化菌种。
2. 将活化后的菌种进行一系列梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8、10-9这四个梯度做模拟实验，用移液枪吸取各个梯度的菌液100uL，分别加到相应的液体及固体平板上，培养12-24H，查看平板的菌落数，以及相对应的液体培养基菌种的富集情况。模拟实验所用的液体培养基均模拟化妆品的环境，首先将化妆品原样弄成1：10的稀释液，然后再按照1:10加到增菌培养基中。
3. 本实验由于菌种培养基的情况不同，分为三组做模拟实验，白色念珠菌和新生隐球菌为一组，前增菌及选择培养基均为YPD，固体培养基也是沙氏琼脂培养基。化脓链球菌的前增菌以及选择培养基为BHI，固体培养基为血琼脂平板。其他的细菌前增菌为SCDLP培养基，选择培养基分别为，固体平板为2YT琼脂培养基。
4. 富集出的菌液提取基因组，杂交芯片，查看扫描结果。
对实施例2中制备的化妆品品中常见致病菌检测基因芯片的实际样品实验进行鉴定如下：
本文选取了18种平时生活中使用的化妆品作为实际样品检测，18种化妆品信息如表6所示，实验步骤按下图3所示，发现4种化妆品有污染(见表6，编号为10,13,18的实际样品)，其中样品10检测出藤黄微球菌、铜绿假单胞菌两种致病菌，13、18检测出铜绿假单胞菌。实际样品步骤
表6 化妆品实际样品
| 编号 | 样品名称 | 规格 | 取样量 |
| 1 | 柔婷海洋爽肤水 | 50ml | 10ml |
| 2 | 珀莱超越美白活肤水 | 100ml | 10ml |
| 3 | FIRMtmPETERTHOMASROTH | 30ml | 10ml |
| 4 | Water drop Cream | 45g | 10g |
| 5 | 美宝莲净柔两用粉饼 | 10g | 10g |
| 6 | 什果乐水水润唇膏 | 10g | 10g |
| 7 | PRINCESSA | 100g | 10g |
| 8 | 李医生润唇膏 | 15g | 10g |
| 9 | 隆力奇蛇油护手霜 | 50g | 10g |
| 10 | 卡丝娜医学针灸羊胎素 | 500ml | 10ml |
| 11 | 衫亚牌太湖珍珠粉 | 150g | 10g |
| 12 | 水密码润肤乳 | 120ml | 10ml |
| 13 | 曼秀雷敦新碧水感防晒露 | 100ml | 10ml |
| 14 | 郁美净浴后乳液 | 220g | 10g |
| 15 | 温碧泉丝滑身体乳 | 180g | 10g |
| 16 | 温碧泉水精灵洁面乳 | 20g | 10g |
| 17 | 温碧泉水精灵水分乳液 | 20ml | 10ml |
| 18 | 兰蔻早晚眼霜 | 15ml | 10ml |
根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 检测化妆品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 41
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Claims (10)
1.一种检测化妆品中常见致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：
（1）从藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23S rDNA间区、白色念珠菌、新生隐球菌18S-28S rDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因中选取的DNA序列；
（2）所述（1）中选取的DNA序列的互补DNA序列；
（3）所述（1）或（2）中选取的DNA序列的互补RNA序列。
2.权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的从藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌的16S-23S rDNA间区、白色念珠菌、新生隐球菌18S-28S rDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO:5–SEQ ID NO:35所示的DNA序列中的一种或者多种DNA序列。
3.权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。
4.权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针选自细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。
5.权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针具有SEQ ID NO:2- SEQ ID NO:3所示的DNA序列，阴性对照为SEQ ID NO:4。
6.权利要求1-5任一项所述的基因芯片在用于检测藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、白色念珠菌、新生隐球菌、志贺氏菌方面的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于所应用的检测探针包括SEQ ID NO: 36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列中的至少一种。
8.一种检测化妆品品中常见致病菌的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括权利要求1-5任一项所述的基因芯片。
9.权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括检测探针SEQ ID NO: 36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种；还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。
10.权利要求8所述试剂盒在制备用于检测藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、斯氏普罗威登斯菌、白色念珠菌、新生隐球菌、志贺氏菌方面的应用。
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