CN103409502A - 用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针与试剂盒。所述探针包括：分枝杆菌探针、结核分枝杆菌探针、麻风分枝杆菌探针、鸟分枝杆菌探针、细胞内分枝杆菌探针、堪萨斯分枝杆菌探针和偶遇分枝杆菌探针；白色念珠菌探针、申克孢子丝菌探针、卡氏枝孢霉菌探针、裴氏着色菌探针、Fonsecaea monophora探针；奴卡菌探针、放线菌探针、利什曼原虫探针；上述各探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示；所述试剂盒包括上述各探针、相应的通用引物。本发明通过设计及优化针对常见皮肤感染性肉芽肿病原体筛查、检测的试剂盒，有利于提高临床诊断及治疗效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针与试剂盒。
背景技术
皮肤感染性肉芽肿病是一组主要由真菌、分枝杆菌、放线菌、奴卡菌和利什曼原虫等病原体所致的、组织病理呈肉芽肿样改变的疾病。在我国，真菌和分枝杆菌为首要致病菌，不仅可致皮肤及皮下组织感染，也可通过血行播散或直接浸润扩散导致危及生命的系统感染。各种真菌所致的着色芽生菌病、暗色丝孢霉病、孢子丝菌病等双相真菌感染在皮肤科临床日益多见；结核病在人类致死性感染性疾病中居首位，寻常狼疮等皮肤结核可致毁容，麻风病使人致畸、致残、丧失劳动能力，近年来国内外报道的非结核分枝杆菌感染也明显上升，有时尚出现爆发流行。
随着恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病、自身免疫病等导致机体抵抗力严重低下疾病的不断增多，器官移植、导管介入等技术的推广应用、广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛使用甚至滥用等，真菌和分枝杆菌的机会感染率和危害性也大大增加，据统计在HIV感染病程中发生结核、非结核分枝杆菌或真菌感染的可能性为70-90％，是其主要的死亡原因之一，尤其是当艾滋病等免疫力低下的患者继发真菌或分枝杆菌感染时，其皮损和肉芽肿改变常为首先被发现的临床和病理征象，如不及时地确诊和正确处置，可造成严重局部组织破坏或全身播散感染。再者，临床上免疫正常者发生皮肤感染性肉芽肿类疾患的病例快速增加，且大多为皮肤外伤所致。我国体力劳动者群十分庞大，皮肤外伤感染所致的皮肤感染性肉芽肿患者为数众多。该类疾病临床表现的多形性和缺乏特异性，以及其组织病理的呈感染性肉芽肿改变的非鉴别性，导致临床诊断极为困难。
在中国，对1980年以来报道的皮肤感染性肉芽肿病例分析总结，分枝杆菌中结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌(鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶遇分枝杆菌)；真菌中申克孢子丝菌、卡氏枝孢霉菌、 裴氏着色菌、Fonsecaea monophora为最常见的病原体；此外，白色念珠菌为最常见的深部真菌感染菌株，亦可致念珠菌性肉芽肿；细菌中星形奴卡菌、以色列放线菌及利什曼原虫有散发报道。
目前国内对真菌、分枝杆菌等微生物所致皮肤感染的诊断主要通过镜检、培养和组织病理等传统技术，同时结合分子生物学技术一定程度可提高其敏感性、特异性。但上述检测过程繁琐分散。因此，研究和开发适用于早期、快速和简便、一式多元化的皮肤感染性肉芽肿致病菌对于实验室筛查、检测技术有重要临床价值和意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的试剂盒。
对于用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针，本发明采用的技术方案是：包括分枝杆菌16SrRNA DNA探针、真菌18SrRNA DNA至28SrRNA DNA间隔序列DNA探针、奴卡菌、放线菌、利什曼原虫DNA探针；
分枝杆菌16SrRNA DNA探针包括分枝杆菌探针、结核分枝杆菌探针、麻风分枝杆菌探针、鸟分枝杆菌探针、细胞内分枝杆菌探针、堪萨斯分枝杆菌探针和偶遇分枝杆菌探针；分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，结核分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，麻风分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，鸟分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示，细胞内分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示，堪萨斯分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，偶遇分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7所示；
真菌18S rRNA至28s rRNA间隔序列DNA探针包括白色念珠菌探针、申克孢子丝菌探针、卡氏枝孢霉菌探针、裴氏着色菌探针、Fonsecaea monophora探针；白色念珠菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.8所示，申克孢子丝 菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.9所示，卡氏枝孢霉菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，裴氏着色菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.11所示，Fonsecaea monophora探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；
奴卡菌DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；
放线菌DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；
利什曼原虫DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.15所示。
对于用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的试剂盒，本发明采用的技术方案是：包括如上所述的分枝杆菌16SrRNA DNA探针、真菌18SrRNA DNA至28SrRNA DNA间隔序列DNA探针、奴卡菌、放线菌、利什曼原虫DNA探针；
还包括分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用引物、利什曼原虫通用引物；上述分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用引物、利什曼原虫通用引物的5’端生物素修饰。
作为优选，分枝杆菌通用引物：其中上游引物5’-ACCAACGATGGTGTG TCCAT-3’，下游引物5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’；真菌通用引物：其中上游引物5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；奴卡菌通用引物：其中上游引物5’-CTCCCATATGGTCGACCT-3’，下游引物5’-TCACGACGTTGTAAAACGAC-3’；放线菌通用引物：其中上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；利什曼原虫通用引物：其中上游引物5’-TGATACCACTTATCGCACTT-3’，下游引物5’-CTGGATCATTTTCCGATG-3’；上述分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用引物、利什曼原虫通用引物的5’端生物素修饰。
作为优选，还包括稀释液50ml、洗涤液50ml、封闭液20ml、杂交液20ml、显色液A 10ml、显色液B 10ml、终止液10ml；
稀释液的组成：Na2HPO4500mM、EDTA 1mM、溶剂为水；洗涤液的组成：Tris 10mM、NaCl 50mM、0.05％ Tween-20、溶剂为水；封闭液的组成：1％ BSA、溶剂为洗涤液；杂交液的组成：柠檬酸钠0.0015M、NaCL 0.015M、0.1％ SDS、溶剂为水；显色液A是稀释液稀释亲和素标记的辣根过氧化氢酶；显色液B是由OPD 1M、柠檬酸钠0.0015M、H2O215ul、水10ml组成；终止液的组成：H2SO41M、EDTA 500mM、溶剂为水。
作为优选，还包括已包被羧基基团的96孔酶标板。
作为优选，还包括阳性对照为通用探针。
本发明的有益效果是：
通过设计及优化针对常见皮肤感染性肉芽肿病原体筛查、检测的试剂盒，有利于提高临床诊断及治疗效率。通过对不同浓度模拟标本及120例临床标本的检测，结果显示该试剂盒在经过前处理后菌液浓度为1×102个菌细胞/mL时阳性检出率为60％，培养阳性检出率为100％；临床标本前处理后PCR检测阳性结果与培养阳性率的比较没有显著性差别(p＞0.05)。
随着国内免疫抑制剂的普遍使用及艾滋病等其他免疫缺陷患者的增多，分枝杆菌、真菌等局部、系统性感染性疾病发病率逐渐上升。皮肤感染性肉芽肿为此类疾病累及皮肤时最为直观的临床表现，及时准确的诊断、治疗可有效改善预后。然而，皮肤感染性肉芽肿病皮损表现和组织病理的非特异性、病原菌种类繁多及培养周期长的限制性，使诊断该类疾病的方向、方法难以统一，费时且造成人力、资源、经费的重复消耗。本发明致力于开发的快速、简便、一式多元化筛查、检测病原菌的试剂盒，有望在全国范围内实现对皮肤感染性肉芽肿疾病快速诊断。
具体实施方式
一、试剂盒的组成
1、96孔酶标板
所述酶标板购自已包被羧基基团Costar 96孔板。
2、设计各菌株通用引物
培养常见致皮肤感染性肉芽肿病原菌：6种分枝杆菌(结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶遇分枝杆菌)，5种真菌(白色念珠菌、申克孢子丝菌、卡氏枝孢霉菌、裴氏着色菌、Fonsecaea monophora)，奴卡菌，放线菌及利什曼原虫。
选取5对引物：分枝杆菌通用引物(上游引物5’-ACCAACGATGGTGTG TCCAT-3’，下游引物5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’)，真菌通用引物(上游引物5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，奴卡菌(上游引物5’-CTCCCATATGGTCGACCT-3’，下游引物5’-TCACGACGTTGTAAAACGAC-3’)，放线菌(上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，利什曼原虫(上游引物5’-TGATACCACTTATCGCACTT-3’，下游引物5’-CTGGATCATTTTCCGATG-3’)。5’端生物素修饰。
3、设计目标菌株探针
如表1所示，根据分枝杆菌16SrRNA DNA的保守序列区设计探针，其中分枝杆菌探针作为通用探针，另在探针的5’端进行化学修饰，由上海生物工程有限公司合成并修饰。
表1分枝杆菌16SrRNA DNA探针
如表2所示，根据真菌18SrRNA DNA和28SrRNA DNA间隔序列(含5.8SrRNADNA)设计探针，其中在探针的5’端进行化学修饰，由上海生物工程有限公 司合成并修饰。
表2真菌18SrRNA DNA至28SrRNA DNA间隔序列DNA探针
如表3所示，根据星型奴卡菌，以色列放线菌，利什曼原虫保守序列设计探针，其中在探针的5’端进行化学修饰，由上海生物工程有限公司合成并修饰。
表3奴卡菌、放线菌、利什曼原虫DNA探针
4、各种溶液
探针稀释液的组成：Na2HPO4500Mm、EDTA 1mM、溶剂为水。
洗涤液的组成：Tris 10mM、NaCl 50mM、0.05％ Tween-20、溶剂为水。
封闭液的组成：1％ BSA、溶剂为洗涤液。
杂交液的组成：柠檬酸钠0.0015M、NaCL 0.015M、0.1％ SDS、溶剂为水。
显色液由A和B组成：显色液A是稀释液稀释亲和素标记的辣根过氧化氢酶；显色液B是由OPD 1M、柠檬酸钠0.0015M、H2O215ul、水10ml组成。
终止液的组成：H2SO41M；EDTA 500mM；容积为水。
二、试剂盒检测步骤
实验步骤如下：
1、试剂盒分区如表4所示：
表4皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测试剂盒
2、PCR扩增各菌特异性片段；
3、包被探针：将不同浓度的探针液稀释100倍(探针的包被浓度为100pmol/uL)，每孔100μL加于96孔酶标板中，将酶标板放置37℃下1h；，
4、加样：样本在95℃加热变性5分钟后立即放到冰水浴中10分钟处理后，分别在相应孔中加入样本液50ul；
5、温育：用封口膜封板后置于37℃温育1h。
6、洗涤：用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
7、显色：每孔加显色液A100ul，37℃反应30min；再想每孔中加显色液B100ul，37℃反应30min。
8、测定：每孔加终止液100ul，轻轻混匀，在设定酶标仪波长为450nm处，测定各孔OD值。
三、模拟及临床组织标本试剂盒检测
1、临床标本
2010年-2013年我院门诊收集疑诊皮肤感染性肉芽肿患者病例共120例。其临床表现可为皮肤斑块、丘疹、结节、疣状增生、肉芽肿、皮下脓肿、瘘管、溃疡等，组织病理检查为肉芽肿样改变。所有患者均签署知情同意书。
2、模拟及临床样本试剂盒检测
(1)取菌液终浓度分别为1×105、1×104…1×101个菌细胞/mL的模拟常见的皮肤分枝杆菌6种、真菌5种、细菌2种及原虫1种感染组织标本各一份，各取适量用于培养，另取部分应用前处理措施后，用于冻融法提取DNA。
(2)取120例疑诊皮肤感染性肉芽肿临床标本，分别制备组织匀浆，各取适量用于培养，另取部分应用前处理措施，冻融法提取组织DNA。
(3)应用实验一中PCR反应体系，模拟皮肤细菌、真菌、原虫感染组织标本每个反应体系重复20次，疑似临床皮肤感染性肉芽肿标本反应体系重复3次。各产物均进行凝胶电泳检测。
(4)试剂盒进行探针包被后，将临床标本PCR扩增的靶基因片段产物各50ul热变性点样到相应孔中，进行分子杂交，并显色反应，通过酶标仪检测，获得结果。同时，将所得结果与通过直接测序的方法进行比较。
四、结果
1、培养纯菌液各浓度PCR体系敏感性、特异性：结果发现随着菌悬液浓度的降低，电泳条带的强度逐渐减弱，其敏感性为1×102个菌细胞/mL；培养方法敏感性也为1×102个菌细胞/mL。
2、试剂盒所含14种探针PCR-微孔板反向分子杂交-ELISA方法检测其敏感性结果显示，该方法对于结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌、白色念珠菌和申克孢子丝菌检测的敏感性比PCR-琼脂糖凝胶电泳敏感性高10倍，对其余菌株两种方法敏感性一致。结果如表5所示。
表5皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测试剂盒敏感性检测
3、对14种菌株探针进行特异性检测：分三板进行，一板每条DNA杂交板上(8个孔)固定包被六种分枝杆菌探针和阳性探针(分枝杆菌共探针)及阴性对照，选择六种分枝杆菌标准株PCR扩增产物与之杂交；第二板每条DNA杂交板上(8个孔)固定包被五种分枝杆菌探针和阳性探针(真菌共探针)及阴性对照，选择五种真菌标准株PCR扩增产物与之杂交；第三板每条DNA杂交板上(8个孔)固定包被两种细菌、一种原虫探针和阳性探针(细菌及原虫探针共反应)及阴性对照，选择两种细菌、一种原虫标准株PCR扩增产物与之杂交结果显示若某菌株与之相对应的探针杂交则吸光度大于0.102，为阳性；非对应的探针杂交则吸光度小于0.102，为阴性。(注：各菌株浓度均为1×103菌细胞/mL)，将结果汇总如表6所示。
表6皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测试剂盒特异性检测
4、模拟组织标本中PCR体系敏感性、特异性：模拟临床标本在经过前处理后在浓度为1×102个菌细胞/mL的数量级上PCR检测方法阳性检出率为60％，而未经过前处理的模拟临床标本在此数量级上PCR检测方法阳性检出率为0，但培养方法的阳性检出率为100％。
5、临床组织标本经培养及试剂盒检测结果：120例疑诊皮肤感染性肉芽肿临床标本，经培养后，有31个标本培养出阳性菌落，阳性率为26％；以培养的结果为金标准，标本前处理后的PCR检测28个标本为阳性结果，阳性检出率78％；经卡方检验表明：标本前处理后PCR检测阳性结果与培养出阳性菌落的率的比较没有显著性差别(p＞0.05)
我们前期对皮肤分枝杆菌感染常见病原体的检测和鉴定实验应用的微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”方法，经济快捷一式多 元化的实现目的菌种的初步鉴定。在此基础上，密切结合临床工作需要研究设计了本试剂盒。通过对不同浓度模拟标本及120例临床标本的检测，结果显示该试剂盒在经过前处理后菌液浓度为1×102个菌细胞/mL时阳性检出率为60％，培养阳性检出率为100％；临床标本前处理后PCR检测阳性结果与培养阳性的率的比较没有显著性差别(p＞0.05)。该数据枝持本试剂盒在临床工作中应用的可行性和有效性。
总之，一式多元元化检测皮肤感染性肉芽肿病原菌试剂盒的普及应用，有助于临床医师早期诊断并及时提供相应治疗，改善预后及提高患者生存质量。同时为研究此类疾病的传播模式和发病机制、探讨其致残和致死的相关因素和开展分子流行病学研究等有重要意义。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (6)
1.用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针，其特征在于，包括分枝杆菌16SrRNADNA探针、真菌18SrRNADNA至28SrRNADNA间隔序列DNA探针、奴卡菌、放线菌、利什曼原虫DNA探针；
所述分枝杆菌16SrRNA DNA探针包括分枝杆菌探针、结核分枝杆菌探针、麻风分枝杆菌探针、鸟分枝杆菌探针、细胞内分枝杆菌探针、堪萨斯分枝杆菌探针和偶遇分枝杆菌探针；所述分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述结核分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述麻风分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，所述鸟分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示，所述细胞内分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，所述堪萨斯分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述偶遇分枝杆菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7所示；
所述真菌18S rRNA至28s rRNA间隔序列DNA探针包括白色念珠菌探针、申克孢子丝菌探针、卡氏枝孢霉菌探针、裴氏着色菌探针、Fonsecaea monophora探针；所述白色念珠菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.8所示，所述申克孢子丝菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.9所示，所述卡氏枝孢霉菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述裴氏着色菌探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.11所示，所述Fonsecaea monophora探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；
所述奴卡菌DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；
所述的放线菌DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；
所述的利什曼原虫DNA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.15所示。
2.用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的分枝杆菌16SrRNA DNA探针、真菌18SrRNA DNA至28SrRNADNA间隔序列DNA探针、奴卡菌、放线菌、利什曼原虫DNA探针；
还包括分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用 引物、利什曼原虫通用引物；上述分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用引物、利什曼原虫通用引物的5’端生物素修饰。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述分枝杆菌通用引物：其中上游引物5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’，下游引物5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’；所述真菌通用引物：其中上游引物5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；所述奴卡菌通用引物：其中上游引物5’-CTCCCATATGGTCGACCT-3’，下游引物5’-TCACGACGTTGTAAAACGAC-3’；所述放线菌通用引物：其中上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；所述利什曼原虫通用引物：其中上游引物5’-TGATACCACTTATCGCACTT-3’，下游引物5’-CTGGATCATTTTCCGATG-3’；上述分枝杆菌通用引物、真菌通用引物、奴卡菌通用引物、放线菌通用引物、利什曼原虫通用引物的5’端生物素修饰。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括稀释液50ml、洗涤液50ml、封闭液20ml、杂交液20ml、显色液A10ml、显色液B10ml、终止液10ml；
所述稀释液的组成：Na2HPO4500mM、EDTA1mM、溶剂为水；所述洗涤液的组成：Tris 10mM、NaCl50mM、0.05％Tween-20、溶剂为水；所述封闭液的组成：1％BSA、溶剂为洗涤液；所述杂交液的组成：柠檬酸钠0.0015M、NaCL0.015M、0.1％SDS、溶剂为水；所述显色液A是稀释液稀释亲和素标记的辣根过氧化氢酶；所述显色液B是由OPD1M、柠檬酸钠0.0015M、H2O215ul、水10ml组成；所述终止液的组成：H2SO41M、EDTA500mM、溶剂为水。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括已包被羧基基团的96孔酶标板。
6.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照为通用探针。
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2013
- 2013-05-21 CN CN2013101913101A patent/CN103409502A/zh active Pending
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Application publication date: 20131127 |