CN112980981A - 皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针、实现方法、检测系统 - Google Patents

皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针、实现方法、检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针、实现方法、检测系统，所述方法包括：对已获取的皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到分枝杆菌的多个保守基因；利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。利用本发明的引物和探针，可以提高皮肤感染性肉芽肿病原菌检测的灵敏度和特异度低、且检测菌种多、特别是皮肤组织样本中的病原菌检出率高。

Description

皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针、实现方法、检测系统
技术领域
本发明涉及一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统。
背景技术
皮肤感染性肉芽肿是一种由多病原感染引起的临床难以诊断、严重危及患者健康的慢性感染性疾病。临床表现为丘疹，结节，斑块，或者脓肿，破溃等多样性损害，多与外伤、旅居史和接触性感染有关。临床表现不具特异性，常造成误诊和漏诊，与肿瘤和其他炎症性皮肤病难以鉴别。目前没有一套标准化的治疗方案，治疗方法的选择依赖于病原体的确立。因此，若无法实现病原体的早期诊断，随着感染加重常会危及患者生命；而且诊断错误也会延误治疗。近年来皮肤感染性肉芽肿呈快速增多的趋势，以分枝杆菌居多，如由注射器污染和美容手术等引起的分枝杆菌感染的爆发，使得皮肤感染性肉芽肿成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。因此，目前国内外对感染性肉芽肿病原学诊断依然面临困境，迫切需要开发更加快速、精确的诊断方法。
已有的实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR，qPCR)方法诊断结核及非结核分枝杆菌的研究中，多采用多重real-time PCR、传统PCR方法，靶基因设立在分枝杆菌16S rRNA保守区、IS(转座酶基因)及rpoB基因(rpoB基因是结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位的编码基因，在结核分枝杆菌基因组中只有一个拷贝，含3534个核苷酸)，且多为通用引物，针对常见病原菌的特异性引物及探针使用较少。因此，检测的病原菌种类及准确性较为有限,特别是用于组织样本的病原菌检出率较低。而已上市的试剂盒，检测菌种及检测临床样本有限，且灵敏度有待提高。
发明内容
本发明实施例提供一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统，解决已有皮肤感染性肉芽肿病原菌检测的灵敏度和特异度低、检测菌种有限、皮肤组织样本中的病原菌检出率低等问题。
本发明实施例提供一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针，所述引物和探针包括用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌的通用引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCGAAGGCGGGTCTCT-3’；反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTAC-3’；探针：FAM-CAGTAACTGACGCTGAGGA-MGB。
进一步地，所述引物和探针还包括用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括以下至少一个：
结核分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TGCGCGATGGCGAACT-3’；反向引物：5’-GGTTCAGGGTTAGCCACACTTT-3’；探针：FAM-CAACTACGGTGTTTACGG-MGB；
海分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GACCATGAACCCTGAATGCAT-3’；反向引物：5’-CTCGACCGCAACCCTTTTC-3’；探针：FAM-CGGAGCACAACAAC-MGB；
溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CGGACTAACGGCGACAGAAC-3’；反向引物：5’-AACGGATGCGGCTTGATC-3’；探针：VIC-CGTGCAGTCACCC-MGB；
鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CAGTCTGTTGGGCAGCATGT-3’；反向引物：5’-TTCCTCAACTGTCCAGCACAAG-3’；探针：FAM-CAGCGGAAACTCGA-MGB；
嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GATTTCTGCGGCGATTCAAT-3’；反向引物：5’-GAGAAGTAGGGCAGCAGTTTGG-3’；探针：VIC-CGGTTGGCCAGTGCA-MGB；
堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCAACACTCGGGCTCTGT-3’；反向引物：5’-TGCTCGCAACCACTATCCAA-3’；探针：FAM-CGAGAGTTGTCCCACCAT-MGB；
胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CATCGCCTCGTGGAATGG-3’；反向引物：5’-GCGTGCCCGATTTTCTTTC-3’；探针：VIC-CGTTTGACCGTAACCG-MGB；
龟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TAACCCAGCGATGGACTTCAG-3’；反向引物：5’-TTTCGACGCATCGGGAAA-3’；探针：VIC-ATCGTCGGAGAGACGG-MGB；
偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CCTCGCCGACTAGCTGAATT-3’；反向引物：5’-CTCGCATCAACGTCGATCAC-3’；探针：VIC-AAGGCCACGCGTGC-MGB；
马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GCAGTCTGAGCTAAGGCTGAGAA-3’；反向引物：5’-GCGATCAACGTCACTTTGCA-3’；探针：FAM-CCATATCGTTACATGGGTTAC-MGB；
苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GACGGGCTCGATCACGAA-3’；反向引物：5’-TTGCTTGTTTTTGCCCGATT-3’；探针：FAM-CTGACCGAAAACCGG-MGB；
耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GATGATCGGCTGGGTCAATT-3’；反向引物：5’-ACATTGCCGCTGTGAGATTTCA-3’；探针：FAM-AGGCCCCGGCCAT-MGB；
戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TTGGGTCCTGAGGCAACAC-3’；反向引物：5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’；探针：FAM-CTCGGGTGCTGTCC-MGB；
脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCAAAACGTCGGACTGTCATA-3’；反向引物：5’-ACACCCCACCACCAAGCA-3’；探针：FAM-CGCTGGCACACTGT-MGB。
本发明实施例还提供一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针的实现方法，所述方法包括：对已获取的皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到分枝杆菌的多个保守基因；利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
进一步地，所述利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针包括：对于每个保守基因，通过在分枝杆菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定分枝杆菌的保守片段以及每种分枝杆菌的种特异性片段；利用从所述保守基因中得到的分枝杆菌的保守片段，设计用于检测分枝杆菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种分枝杆菌的种特异性片段，设计用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针；对已设计的用于检测分枝杆菌的通用引物和探针和用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
其中，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、鸟分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌中的两个或以上。
其中，所述特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针是前述的通用引物和探针。
其中，所述特异性满足要求的分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针包括前述的结核分枝杆菌的种特异性引物和探针、海分枝杆菌的种特异性引物和探针、溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针、鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针、嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针、堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针、胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针、龟分枝杆菌的种特异性引物和探针、偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针、马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针、苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针、耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针、戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针、脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针中的至少一个。
本发明实施例还提供一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的检测系统，所述系统包括：第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的如上述的用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如上述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物；检测装置，用于对所述待测样本DNA与如上述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌。
进一步地，所述系统还包括：
第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的如上述的用于皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针中的种进行混合，得到所述待测样本DNA与如上述的种特异性引物和探针的第二混合物；相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与如上述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌的相应菌种。
本发明实施例具有如下有益效果：
1、本发明实施例提供的特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针，可以用于准确鉴定是否存在皮肤感染性肉芽肿病原菌中的分枝杆菌，且皮肤感染性肉芽肿病原菌检测的灵敏度和特异度较高；
2、本发明实施例提供的分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针，可以用于准确鉴定分枝杆菌的种类，分枝杆菌各菌种检测的灵敏度和特异度较高，且检测菌种多，可检测的菌种包括结核分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、鸟分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌；
3、本发明实施例的检测系统采用分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针进行双重验证，提高皮肤感染性肉芽肿病原菌检测的敏感性及特异性，特别地，对于皮肤组织，可以快速准确地鉴定皮肤组织中的微量病原菌，检出率更高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针的实现方法的示意性流程框图；
图2是本发明实施例提供的皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针的设计和验证的示意性流程框图；
图3a至图3l分别是结核分枝杆菌TB6110-引物及探针、堪萨斯分枝杆菌Kan3-引物及探针、偶发分枝杆菌For1-引物及探针、龟分枝杆菌Chel1-引物及探针、胞内分枝杆菌Int1-引物及探针、戈登分枝杆菌Gor3-引物及探针、马尔摩分枝杆菌Mal1-引物及探针、耻垢分枝杆菌Smel-引物及探针、苏尔加分枝杆菌Szu3-引物及探针、海分枝杆菌Mar2-引物及探针、鸟分枝杆菌Avi3-引物及探针、脓肿分枝杆菌Abs3-引物及探针的灵敏度和特异性的示意图；
图4a是本发明的种特异性引物和探针TB6110与已有文献的种特异性引物和探针TB-P1检测结核分枝杆菌的比较结果图；
图4b是本发明的种特异性引物和探针TB6110与已有文献的种特异性引物和探针TB-P1的交叉反应的比较结果图；
图5a是本发明的种特异性引物和探针Abs3与已有文献的种特异性引物和探针MAbs检测脓肿分枝杆菌的比较结果图；
图5b是本发明的种特异性引物和探针Abs3与已有文献的种特异性引物和探针MAbs的交叉反应的比较结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明，应当理解，以下所说明的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
为便于说明，现对本发明涉及的常用术语进行说明。引物指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。通用引物是可与多种病原菌的DNA模板链结合的引物。种特异性引物：即该引物对某种病原菌特异，只能与该种病原菌的DNA链模板特异结合，不结合其他病原菌的DNA。探针是一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。保守片段指在进化过程中基本保持不变的DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核酸序列(如RNA或DNA序列)，蛋白质序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。靶基因即目的基因(gene ofinterest)，也称靶标基因，是从保守基因中选取的最有代表性的基因，是在实验中研究或操纵的特定基因。
图1是本发明实施例提供的一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针的实现方法的示意性流程框图，如图1所示，上述方法可以包括：
步骤1：对已获取的皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到分枝杆菌的多个保守基因。
步骤2：利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
已有研究中利用既往文献报道的某个DNA片段(长度大约是几百bp)，设计引物和探针，随着基因组数据逐渐健全，本发明利用全基因组数据(长度大约是30-50Mb)，设计引物和探针，数据庞大，得到的结果更加可靠。
所述步骤2的利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针包括：
步骤21：对于每个保守基因，通过在分枝杆菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定分枝杆菌属水平的保守片段以及每种分枝杆菌的种特异性片段。
步骤22：利用从所述保守基因中得到的分枝杆菌的保守片段，设计用于检测分枝杆菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种分枝杆菌的种特异性片段，设计用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针。
步骤23：对已设计的用于检测分枝杆菌的通用引物和探针和用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
其中，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、鸟分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌中的两个或以上。
以所述分枝杆菌包括上述14个菌种为例。
通过比对14个分枝杆菌菌种的全基因组数据，找到保守片段，再设计通用引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCGAAGGCGGGTCTCT-3’；反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTAC-3’；探针：FAM-CAGTAACTGACGCTGAGGA-MGB。
通过在分枝杆菌不同菌种之间进行比较，找到每种分枝杆菌与其他种类分枝杆菌之间的碱基不同的片段，然后再设计种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括：结核分枝杆菌的种特异性引物和探针、海分枝杆菌的种特异性引物和探针、溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针、鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针、嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针、堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针、胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针、龟分枝杆菌的种特异性引物和探针、偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针、马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针、苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针、耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针、戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针、脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针中的至少一个。其中：
结核分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TGCGCGATGGCGAACT-3’；反向引物：5’-GGTTCAGGGTTAGCCACACTTT-3’；探针：FAM-CAACTACGGTGTTTACGG-MGB；
海分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GACCATGAACCCTGAATGCAT-3’；反向引物：5’-CTCGACCGCAACCCTTTTC-3’；探针：FAM-CGGAGCACAACAAC-MGB；
溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CGGACTAACGGCGACAGAAC-3’；反向引物：5’-AACGGATGCGGCTTGATC-3’；探针：VIC-CGTGCAGTCACCC-MGB；
鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CAGTCTGTTGGGCAGCATGT-3’；反向引物：5’-TTCCTCAACTGTCCAGCACAAG-3’；探针：FAM-CAGCGGAAACTCGA-MGB；
嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GATTTCTGCGGCGATTCAAT-3’；反向引物：5’-GAGAAGTAGGGCAGCAGTTTGG-3’；探针：VIC-CGGTTGGCCAGTGCA-MGB；
堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCAACACTCGGGCTCTGT-3’；反向引物：5’-TGCTCGCAACCACTATCCAA-3’；探针：FAM-CGAGAGTTGTCCCACCAT-MGB；
胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CATCGCCTCGTGGAATGG-3’；反向引物：5’-GCGTGCCCGATTTTCTTTC-3’；探针：VIC-CGTTTGACCGTAACCG-MGB；
龟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TAACCCAGCGATGGACTTCAG-3’；反向引物：5’-TTTCGACGCATCGGGAAA-3’；探针：VIC-ATCGTCGGAGAGACGG-MGB；
偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-CCTCGCCGACTAGCTGAATT-3’；反向引物：5’-CTCGCATCAACGTCGATCAC-3’；探针：VIC-AAGGCCACGCGTGC-MGB；
马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GCAGTCTGAGCTAAGGCTGAGAA-3’；反向引物：5’-GCGATCAACGTCACTTTGCA-3’；探针：FAM-CCATATCGTTACATGGGTTAC-MGB；
苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GACGGGCTCGATCACGAA-3’；反向引物：5’-TTGCTTGTTTTTGCCCGATT-3’；探针：FAM-CTGACCGAAAACCGG-MGB；
耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GATGATCGGCTGGGTCAATT-3’；反向引物：5’-ACATTGCCGCTGTGAGATTTCA-3’；探针：FAM-AGGCCCCGGCCAT-MGB；
戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-TTGGGTCCTGAGGCAACAC-3’；反向引物：5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’；探针：FAM-CTCGGGTGCTGTCC-MGB；
脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：正向引物：5’-GGCAAAACGTCGGACTGTCATA-3’；反向引物：5’-ACACCCCACCACCAAGCA-3’；探针：FAM-CGCTGGCACACTGT-MGB。
在保守基因(或靶基因)中找到属水平的保守片段和种水平的种特异性片段，进而设计相应的引物及探针。进一步地，本发明的通用引物可以在16S rRNA区域设计，分枝杆菌各菌种均可在此区域找到保守序列，因此可以检测多种分枝杆菌，本发明的种特异性引物为某种分枝杆菌(比如结核分枝杆菌)特有的，其他分枝杆菌(如非结核分枝杆菌等)不能扩增出来，采用同样方法也可以设计基于23S rRNA、meth基因的种水平特异性引物。相应引物的探针都有其对应的靶基因位点。
通过本发明实施例提供的特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针，可以准确确定是否存在分枝杆菌，通过本发明实施例提供的分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针，可以准确确定分枝杆菌的种类，另外，同时采用分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针，可以进行双重验证，提高分枝杆菌的诊断准确性，利于早诊早治。
下面对分枝杆菌的引物和探针的实现方法进行详细说明。
第一步、对北京大学第一医院皮肤科的感染性肉芽肿病例进行回顾性分析，得到病原感染分布，结合Ensemble及NCBI数据库查找相应分枝杆菌各菌种的全基因组序列。
第二步、对分枝杆菌各菌种的全基因组序列进行数次自动比对，同时人工逐个碱基比对，查找相应菌种的保守基因(或从多个保守基因中选取靶基因)，例如靶基因16SrRNA、23S rRNA、meth基因。
第三步、选取上述所得保守基因(靶基因)，在种间及种内序列中逐个碱基进行比对，查找分枝杆菌的保守片段和种特异性片段以用于扩增；
第四步、在所筛选靶基因中设计引物及探针，具体地说，利用所述保守片段设计通用引物及探针，利用所筛选的种特异性片段设计种特异性引物及探针。
分枝杆菌引物及探针设计如下：选择Ensemble及NCBI数据库，查找分枝杆菌多个菌种的全基因组序列。逐个碱基比对，查找包含结核分枝杆菌、海分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、嗜血分枝杆菌在内的菌株间的保守片段，在16S rRNA区域找到靶基因，设计引物及探针。引物扩增片段在NCBI数据库中Blast(Basic Local Alignment Search Tool，是美国NCBI网站上的一个基本局部比对搜索工具，用于比较序列间的碱基差异)，均为分枝杆菌菌种。同样地，还可基于23rRNA、meth基因设计引物及探针，例如种水平特异性引物及探针。
第五步、在NCBI和Ensemble fungi数据库中比对引物所扩增DNA序列，确保引物特异性。
结果显示本发明所设计引物及探针的特异性均达到100％，即分枝杆菌通用引物仅可检测到不同种分枝杆菌，种水平引物及探针未检测到其他病原菌。
第六步、通过菌株水平验证，来进一步验证引物及探针的灵敏度及特异度，最终确定引物及探针如表1所示。
表1.引物及探针的序列信息表.
Figure BDA0003039418080000091
Figure BDA0003039418080000101
如图2所示，在设计引物及探针后，对已设计的引物和探针进行菌株水平验证，具体如下：
菌株水平验证：选择结核分枝杆菌、海分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌进行验证，如图3a至图3l所示。调整浊度为0.8，考虑提取效率为100％，倍比稀释检测引物及探针可检测最低DNA浓度及稳定性。其他菌株最高浓度检测菌株间有无交叉反应，结果如表2所示。
表2.菌株水平验证结果表.
引物名称 检测低限 分枝杆菌菌种间有无交叉反应
TB6110 0.8×10<sup>-1</sup>pg 无
Kan3 7.0×10<sup>2</sup>pg 无
For1 7.2×10<sup>-1</sup>pg 无
Chel1 2.03×100pg 无
Int1 4.1×10<sup>-2</sup>pg 无
Gor3 4.0×10<sup>-1</sup>pg 无
Mal1 8.7×10<sup>-1</sup>pg 无
Sme1 13.4×10<sup>-1</sup>pg 无
Szu3 12.6×10<sup>1</sup>pg 无
Mar2 8.5×10<sup>-1</sup>pg 无
Avi3 2.35×10<sup>2</sup>pg 无
Abs3 11.1×10<sup>1</sup>pg 无
需要说明的是，由于溃疡分枝杆菌及嗜血分枝杆菌标准菌株在国际上均难以获得，因此既往国内外文献中均缺乏上述两种病原菌的验证，本发明亦无法验证溃疡分枝杆菌和嗜血分枝杆菌的检测低限和交叉反应情况。
下面将本发明的分枝杆菌的通用引物和探针16S与已有文献(Bach HJ,TomanovaJ,Schloter M,et al.Enumeration of total bacteria and bacteria with genes forproteolytic activity in pure cultures and in environmental samples byquantitative PCR mediated amplification.J Microbiol Methods.2002May；49(3):235-45.)中的分枝杆菌的通用引物和探针fp-16S进行比较，比较结果参见表3，其中，+表示可检测到；-表示未检测到。
表3. 16S与fp-16S的菌株水平比较表.
Figure BDA0003039418080000111
Figure BDA0003039418080000121
从表3可以看出，本发明实施例的分枝杆菌的通用引物和探针16S，能够检测分枝杆菌的菌种更全面，且检测上述分枝杆菌的多个菌种的CT值更低，敏感性更低。
将本发明的结核分枝杆菌的种特异性引物和探针TB6110与已有文献(BarlettaF,Vandelannoote K,Collantes J,et al.Standardization of a TaqMan-based real-time PCR for the detection of Mycobacterium tuberculosis-complex in humansputum.Am J Trop Med Hyg.2014；91(4):709-714)中结核分枝杆菌的种特异性引物和探针TB-P1进行比较，两者在特异性上未见明显差异，如图4b所示，然而在灵敏度上，如图4a所示,本发明所设计的种特异性引物和探针TB6110可检测更低浓度DNA，检测相同浓度菌株DNA时，CT值更低，说明敏感性更强。
将本发明的脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针Abs3与已有文献(Sharma MK,LaY,Janella D,et al.A real-time PCR assay for rapid identification of inducibleand acquired clarithromycin resistance in Mycobacterium abscessus.BMC InfectDis.2020；20(1):944.)中的脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针MAbs进行比较，如图5a所示，本发明所设计的种特异性引物和探针Abs3在检测相同浓度菌株DNA时，CT值更低，说明敏感性更强，稳定性更好。将本发明的种特异性引物和探针Abs3与已有文献的种特异性引物和探针MAbs的交叉反应进行比较，如图5b所示，本发明的种特异性引物和探针Abs3与其它分枝杆菌不存在交叉反应，特异性较好，而已有文献的种特异性引物和探针MAbs与结核分枝杆菌存在交叉反应，特异性较差。
本发明基于基因组水平设计了上述分枝杆菌的引物和探针，实现分枝杆菌检测可鉴定至种水平，有利于为临床治疗选择方向。
综上，本发明基于基因组水平设计的引物和探针，更加精准，且经过菌株水平验证，具有较高稳定性，可检测低至41fg(fg即飞克；重量单位。千克、克、毫克、微克、纳克、皮克、飞克，依次相差103梯度)水平的DNA浓度。另外，本发明所设计的引物及探针包含属水平及种水平的引物及探针，可进行双重验证，提高诊断的准确性，可用于不同临床样本，例如皮肤组织样本、脓液样本、体液样本等，灵敏度较高，可提示临床完善相关病原学诊断，利于早期诊断治疗。
如图2所示，在进行菌株水平验证后，进行临床样本检测，具体如下：
对2019年1月至2020年12月就诊于北京大学第一医院皮肤科的经组织病理学检测确诊为感染性肉芽肿，且病原体不明确的患者组织样本(包括皮肤组织样本、脓液样本、体液样本等)，利用本发明进行病原学检测，共检出结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的总检出率为63.4(116/183)，其中非结核分枝杆菌92例，阳性率达50.3(92/183)；非结核分枝杆菌属水平样本54例，种水平样本38例，包含海分枝杆菌16.3％(15/92)、鸟分枝杆菌5.4％(5/92)、嗜血分枝杆菌4.3％(4/92)、脓肿分枝杆菌及溃疡分枝杆菌均为7.6％(7/92)；而组织培养检测阳性率仅为6.0％(11/183)，且培养结果较为单一，均为海鱼分枝杆菌。对于结核分枝杆菌，本发明的检出率为6.0％(11/183)，而组织培养检测阳性率为1.1％(2/183)。因此，本发明显著提高了结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌的检出率。
另外，本发明不需要进行病原菌培养，而是从患者皮肤组织样本和/脓液样本中提取患者皮肤组织DNA和/或脓液DNA(即待测样本DNA)以用于检测，因此本发明能够在6小时内完成分子检测，大大缩短了检测时间。已有技术中，采用样本培养的方式，具体地说，分枝杆菌的培养尤其是慢生长分枝杆菌的培养需要1月～3月不等，耗时长，不利于早期诊断。因此，本发明不仅提高了病原体检出率，可检出皮肤组织中微量病原体，且能在短期内完成病原检测，优于传统病原检测方法，为临床感染性肉芽肿的对因治疗提供了更为可靠的依据，可促进该类疾病早期诊断和精准治疗的开展。
本发明在已报道的靶基因外，获取新的靶基因，设计针对14种分枝杆菌的种水平特异性引物及探针。菌株水平灵敏度较好，可检测DNA浓度为fg水平的样本；菌株间无交叉反应。临床病原检出率可达60％。可适用于皮肤组织样本、脓液样本、体液样本等不同临床样本。
如上所述，既往基于qPCR的检测方法多是基于临床样本进行培养，对培养的菌株进行检测。分枝杆菌的生长缓慢，临床样本培养阳性率较低，而且耗时较长，需培养1月～3月方能进行鉴定。此外，针对分枝杆菌培养还需要严格的实验条件，需在具备一定生物安全防护级别的实验室进行培养，所以仅靠培养方法无法实现该类疾病的早诊早治的目标。皮肤感染性肉芽肿表现为浸润性结节和斑块，很少有脓液，所检测样本主要是皮肤组织，病原菌含量较低，培养方法和PCR-反向点杂交方法的检测率较低，在20％左右，亟需开发新的便于推广的检测系统。本发明提供的检测系统采用探针法对分枝杆菌进行检测，所用设备基于qPCR体系。具体如下：
本发明实施例提供的一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的检测系统可以包括：
第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的如上述的用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如上述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物；
检测装置，用于对所述待测样本DNA与如上述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌。
先通过人工方式生成通用引物及探针，在生成的探针上标记可指示是否有分枝杆菌的特定荧光；然后将待测样本DNA与已进行荧光标记的通用引物及探针混合后，将得到的第一混合物提供给检测装置，从而检测出待测样本中是否存在分枝杆菌。
进一步地，所述系统还可以包括：
第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的如上述的用于皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针中的种进行混合，得到所述待测样本DNA与如上述的种特异性引物和探针的第二混合物；
相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与如上述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌的相应菌种。
在检测出待测样本中存在分枝杆菌的情况下，以结核分枝杆菌为例，先通过人工方式生成结核分枝杆菌的引物及探针，在生成的探针上标记可指示是否有结核分枝杆菌的特定荧光；然后将待测样本DAN与已进行荧光标记的结核分枝杆菌的引物及探针混合后提供给检测装置。这样可以检测出待测样本中的分枝杆菌的种类。
其中，所述待测样本DNA可以是从患者皮肤组织样本中提取的患者皮肤组织DNA，也可以是从患者皮肤脓液样本、体液样本中提取的患者脓液DNA、体液DNA。
需要说明的是，属水平检测可以和种水平检测同时进行，也可以分开进行，同样地，多种分枝杆菌的种水平检测可以同时进行，也可以分开进行。
上述检测装置可以是qPCR检测装置，该PCR检测装置对输入的由待测样本DNA和本发明的引物及探针组成的混合物进行检测，可快速、准确检测不同临床样本中是否具有分枝杆菌以及分枝杆菌的种类，指导临床治疗，利于早期皮肤感染性肉芽肿病的精准治疗，改善预后。
具体实施过程如下：
首先，对本发明设计的通用引物及探针，种特异性引物及探针进行人工合成，并在探针的两端标记上特定的荧光，不同种的探针其标记的荧光不同，合成后将引物和探针，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量其浓度后备用；
其次，临床样本取材后进行总DNA提取，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量样本的核酸浓度，定量备用；
最后，将上述合成的引物、探针与临床样本DNA进行等比例加样混合后，上机，通过PCR仪器检测。该仪器为实时荧光定量PCR仪(qPCR)，其可以通过可视化的信号改变来实时检测样本反应情况。
结果判读：如果临床样本含有分枝杆菌，会和设计的引物及探针结合，产生不同颜色的荧光信号，该信号在qPCR仪上的显示是不同颜色的指数扩增曲线及相应的Ct值，并通过阴性对照和阳性对照品的曲线和Ct值来质控每次的检测准确度，再通过待测样品的曲线颜色和Ct值来判定待测样本中的病原菌种类。
所述Ct值是指每个PCR反应管内荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数(cycle)。
本发明提供的皮肤感染性肉芽肿病原菌的检测系统，通过标记不同荧光，进行多通道检测，节省样本。同时临床样本检测也说明该方法具有较高的检测效率，对2019年1月至2020年12月就诊于我科的经组织病理学检测确诊为感染性肉芽肿，且病原体不明确的患者组织样本利用该检测系统进行病原学检测，发现该检测系统共检出结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的总检出率为63.4(116/183)，其中非结核分枝杆菌92例，阳性率达50.3(92/183)；非结核分枝杆菌属水平样本54例，种水平样本38例，包含海分枝杆菌16.3％(15/92)、鸟分枝杆菌5.4％(5/92)、嗜血分枝杆菌4.3％(4/92)、脓肿分枝杆菌及溃疡分枝杆菌均为7.6％(7/92)；而组织培养检测阳性率仅为6.0％(11/183)，且培养结果较为单一，均为海鱼分枝杆菌。对于结核分枝杆菌，分子检测系统较培养仍具有明显优势，检出率为6.0％(11/183)，而组织培养检测阳性率为1.1％(2/183)。因此，该分子检测系统显著提高了结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌的检出率。另外，本发明提供的皮肤感染性肉芽肿病原菌的检测系统的分子检测能在6小时内完成，大大缩短了检测时间，而分枝杆菌的培养尤其是慢生长分枝杆菌培养需要1月～3月不等。因此，该分子检测系统不仅提高了病原体检出率，可检出皮肤组织中微量病原体，且能在短期内完成病原检测，优于传统病原检测方法，为临床感染性肉芽肿的对因治疗提供了更为可靠的依据，可促进该类疾病早期诊断和精准治疗的开展。
尽管上文对本发明进行了详细说明，但是本发明不限于此，本技术领域技术人员可以根据本发明的原理进行各种修改。因此，凡按照本发明原理所作的修改，都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌的通用引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCGAAGGCGGGTCTCT-3’；
反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTAC-3’；
探针：FAM-CAGTAACTGACGCTGAGGA-MGB。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针还包括用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针，所述种特异性引物和探针包括以下至少一个：
结核分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TGCGCGATGGCGAACT-3’；
反向引物：5’-GGTTCAGGGTTAGCCACACTTT-3’；
探针：FAM-CAACTACGGTGTTTACGG-MGB；
海分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GACCATGAACCCTGAATGCAT-3’；
反向引物：5’-CTCGACCGCAACCCTTTTC-3’；
探针：FAM-CGGAGCACAACAAC-MGB；
溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CGGACTAACGGCGACAGAAC-3’；
反向引物：5’-AACGGATGCGGCTTGATC-3’；
探针：VIC-CGTGCAGTCACCC-MGB；
鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CAGTCTGTTGGGCAGCATGT-3’；
反向引物：5’-TTCCTCAACTGTCCAGCACAAG-3’；
探针：FAM-CAGCGGAAACTCGA-MGB；
嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GATTTCTGCGGCGATTCAAT-3’；
反向引物：5’-GAGAAGTAGGGCAGCAGTTTGG-3’；
探针：VIC-CGGTTGGCCAGTGCA-MGB；
堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCAACACTCGGGCTCTGT-3’；
反向引物：5’-TGCTCGCAACCACTATCCAA-3’；
探针：FAM-CGAGAGTTGTCCCACCAT-MGB；
胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CATCGCCTCGTGGAATGG-3’；
反向引物：5’-GCGTGCCCGATTTTCTTTC-3’；
探针：VIC-CGTTTGACCGTAACCG-MGB；
龟分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TAACCCAGCGATGGACTTCAG-3’；
反向引物：5’-TTTCGACGCATCGGGAAA-3’；
探针：VIC-ATCGTCGGAGAGACGG-MGB；
偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-CCTCGCCGACTAGCTGAATT-3’；
反向引物：5’-CTCGCATCAACGTCGATCAC-3’；
探针：VIC-AAGGCCACGCGTGC-MGB；
马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GCAGTCTGAGCTAAGGCTGAGAA-3’；
反向引物：5’-GCGATCAACGTCACTTTGCA-3’；
探针：FAM-CCATATCGTTACATGGGTTAC-MGB；
苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GACGGGCTCGATCACGAA-3’；
反向引物：5’-TTGCTTGTTTTTGCCCGATT-3’；
探针：FAM-CTGACCGAAAACCGG-MGB；
耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GATGATCGGCTGGGTCAATT-3’；
反向引物：5’-ACATTGCCGCTGTGAGATTTCA-3’；
探针：FAM-AGGCCCCGGCCAT-MGB；
戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TTGGGTCCTGAGGCAACAC-3’；
反向引物：5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’；
探针：FAM-CTCGGGTGCTGTCC-MGB；
脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGCAAAACGTCGGACTGTCATA-3’；
反向引物：5’-ACACCCCACCACCAAGCA-3’；
探针：FAM-CGCTGGCACACTGT-MGB。
3.一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的引物和探针的实现方法，其特征在于，所述方法包括：
对已获取的皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的全基因组数据进行比对，得到分枝杆菌的多个保守基因；
利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用通过全基因组数据比对得到的分枝杆菌的多个保守基因，设计特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针包括：
对于每个保守基因，通过在分枝杆菌的种间及种内进行碱基比对，从所述保守基因中确定分枝杆菌的保守片段以及每种分枝杆菌的种特异性片段；
利用从所述保守基因中得到的分枝杆菌的保守片段，设计用于检测分枝杆菌的通用引物和探针，并利用从所述保守基因中得到的每种分枝杆菌的种特异性片段，设计用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针；
对已设计的用于检测分枝杆菌的通用引物和探针和用于检测每种分枝杆菌的种特异性引物和探针分别进行特异性检测，得到特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针以及分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、鸟分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌中的两个或以上。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述特异性满足要求的分枝杆菌的通用引物和探针是权利要求1所述的通用引物和探针。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述特异性满足要求的分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针包括权利要求2所述的结核分枝杆菌的种特异性引物和探针、海分枝杆菌的种特异性引物和探针、溃疡分枝杆菌的种特异性引物和探针、鸟分枝杆菌的种特异性引物和探针、嗜血分枝杆菌的种特异性引物和探针、堪萨斯分枝杆菌的种特异性引物和探针、胞内分枝杆菌的种特异性引物和探针、龟分枝杆菌的种特异性引物和探针、偶发分枝杆菌的种特异性引物和探针、马尔摩分枝杆菌的种特异性引物和探针、苏尔加分枝杆菌的种特异性引物和探针、耻垢分枝杆菌的种特异性引物和探针、戈登分枝杆菌的种特异性引物和探针、脓肿分枝杆菌的种特异性引物和探针中的至少一个。
8.一种皮肤感染性肉芽肿病原菌的检测系统，其特征在于，所述系统包括：
第一混合装置，用于将待测样本DNA与人工合成的如权利要求1所述的用于检测皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌的通用引物和探针进行混合，得到所述待测样本DNA与如权利要求1所述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物；
检测装置，用于对所述待测样本DNA与如权利要求1所述的分枝杆菌的通用引物和探针的第一混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述系统还包括：
第二混合装置，用于将所述待测样本DNA与人工合成的如权利要求2所述的用于皮肤感染性肉芽肿病原菌中分枝杆菌各菌种的种特异性引物和探针中的种进行混合，得到所述待测样本DNA与如权利要求2所述的种特异性引物和探针的第二混合物；
相应地，所述检测装置，还用于对所述待测样本DNA与如权利要求2所述的种特异性引物和探针的第二混合物进行检测，确定待测样本中是否存在分枝杆菌的相应菌种。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030134293A1 (en) * 1999-11-16 2003-07-17 Zhiping Liu Method for rapid and accurate identification of microorganisms
WO2009049007A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Magellan Biosciences, Inc. Compositions, methods and systems for rapid identification of pathogenic nucleic acids
CN103409502A (zh) * 2013-05-21 2013-11-27 王洪生 用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针与试剂盒
CN106755502A (zh) * 2017-01-26 2017-05-31 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 暗色丝孢霉病病原菌rt‑pcr检测引物和探针组合及试剂盒
CN106868114A (zh) * 2017-01-26 2017-06-20 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 镰刀菌病病原菌rt‑pcr检测引物和探针组合及试剂盒
CN107190087A (zh) * 2017-07-18 2017-09-22 武汉大学 基于TaqMan‑MGB探针检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030134293A1 (en) * 1999-11-16 2003-07-17 Zhiping Liu Method for rapid and accurate identification of microorganisms
WO2009049007A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Magellan Biosciences, Inc. Compositions, methods and systems for rapid identification of pathogenic nucleic acids
CN103409502A (zh) * 2013-05-21 2013-11-27 王洪生 用于皮肤感染性肉芽肿常见病原体检测的探针与试剂盒
CN106755502A (zh) * 2017-01-26 2017-05-31 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 暗色丝孢霉病病原菌rt‑pcr检测引物和探针组合及试剂盒
CN106868114A (zh) * 2017-01-26 2017-06-20 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 镰刀菌病病原菌rt‑pcr检测引物和探针组合及试剂盒
CN107190087A (zh) * 2017-07-18 2017-09-22 武汉大学 基于TaqMan‑MGB探针检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUNICE C. CHERN 等: "Evaluation of quantitative polymerase chain reaction assays targeting Mycobacterium avium, M. intracellulare, and M. avium subspecies paratuberculosis in drinking water biofilms", 《JOURNAL OF WATER&HEALTH》 *
MAURA J DONOHUE 等: "Impact of Chlorine and Chloramine on the Detection and Quantification of Legionella pneumophila and Mycobacterium Species", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
V J TEVERE 等: "Detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR amplification with pan-Mycobacterium primers and hybridization to an M. tuberculosis-specific probe", 《J CLIN MICROBIOL》 *
谢思露等: "实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染", 《现代预防医学》 *

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