CN106868114A

CN106868114A - 镰刀菌病病原菌rt‑pcr检测引物和探针组合及试剂盒

Info

Publication number: CN106868114A
Application number: CN201710061639.4A
Authority: CN
Inventors: 龚杰; 张雯; 吴伟伟; 陈见友; 陆捷洁; 韩娜; 张婷婷; 黎青山
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-01-26
Also published as: CN106868114B

Abstract

本发明提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒。所述引物和探针组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑12所示。本发明的试剂盒能够快速、特异、灵敏、稳定对角膜镰刀菌病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的镰刀菌病病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明提供的试剂盒包含改良的DNA提取体系，能快速有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

Description

镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

背景技术

真菌性角膜炎是一种世界范围内常见的致盲性眼病，多见于包括中国在内的农业人口为主的发展中国家。其中，又以镰刀菌属真菌引起的角膜镰刀菌病最为常见。统计资料表明，同仁医院眼科研究所报告的775例真菌性角膜炎中，角膜镰刀菌占58.7％，其病原菌以茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌为主。

近年来，随着广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛应用，角膜镰刀菌病的发病率有较明显的上升趋势。角膜镰刀菌病起病缓慢，外用抗生素无效，早期主要症状包括疼痛、畏光、红肿、视力模糊，如治疗不及时，可以引起角膜穿孔，导致失明。因此，真菌性角膜炎的早期诊断对防盲、治盲意义重大，只有早期及时确诊，才能合理治疗。

目前，临床上常用的诊断方法包括镜检、培养、共聚焦显微镜检查、组织病理检查等。但除培养外，都不能达到真菌鉴定到种水平。而真菌培养，耗时过长，一般需1-2周，不适用于临床早期诊断。因此，开发精准的分子诊断技术，用于对角膜镰刀菌病的诊疗，有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种改良的真菌DNA提取液。

为了实现本发明目的，本发明的镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，该组合包括：

(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌(SEQ ID NO:1-3)

Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′

Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′

Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′

(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针(SEQ ID NO:4-6)

Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′

Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′

Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；

其中，[T]表示锁核酸；

(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针(SEQ ID NO:7-9)

Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′

Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′

Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及

(IV)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物和探针(SEQ ID NO:10-12)

Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′

Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′

Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。

本发明还提供与上述引物和探针组合配套使用的竞争性内参模板(SEQ ID NO:13-15)和内参探针(SEQ ID NO:17)。

本发明还提供含有所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测镰刀菌病病原菌的试剂盒。

所述试剂盒还包括竞争性内参模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和内参探针Fu-IACP，其序列信息如下：

Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′(SEQ ID NO:13)

Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′(SEQ ID NO:14)

Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′(SEQID NO:15)

Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGATCTTGAGCCTGGTACCATG-3′(SEQ ID NO:16)

Fu-IACP：5′-TAMRA-ACTGAGCACGTCTATCCGA-BHQ1-3′(SEQ ID NO:17)。

所述试剂盒进一步包括真菌DNA提取液和/或玻璃珠等；

所述真菌DNA提取液的配方如下：

800mM Tris-HCl pH 9.5

200mM EDTApH 8.0

100mM NaHCO₃

300mM KCl

所述玻璃珠优选为直径710-1180μm的酸洗玻璃珠。

本发明还提供一种用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)以上述提取的DNA为模板，利用本发明的试剂盒，分别进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

实时荧光定量PCR扩增反应体系的配制如下：

(1)依次配制如下试剂

①PCR mixture A，配方如下：

②PCR mixture B，配方如下：

③PCR mixture C，配方如下：

④PCR mixture D，配方如下：

⑤PCR mixture E，配方如下：

(2)镰刀菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture B混合，加入2μl DNA模板，即得；

(3)串珠镰刀菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture C混合，加入2μl DNA模板，即得；

(4)茄病镰刀菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture D混合，加入2μl DNA模板，即得；

(5)尖孢镰刀菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture E混合，加入2μl DNA模板，即得。

实时荧光定量PCR扩增反应程序如下：95℃10min；95℃15s，54℃20s，72℃30s(采集数据)，共40个循环。

前述方法中，步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析待测样品中是否含有相应的镰刀菌病病原菌；含有病原菌的待测样品会出现对应的扩增曲线，表现为阳性结果；不含有病原菌的待测样品不出现扩增曲线或扩增曲线在检测阈值之下，表现为阴性结果。

本发明提供一种能快速、稳定地组织标本中提取核酸的方法，具体如下：

S1、采集待测样本100-500mg加入2ml离心管中，向离心管中加入600μl真菌DNA提取液和0.5g玻璃珠，在TissueLyser II(Qiagen公司)上30Hz震荡10min，或涡旋震荡10min；

S2、95℃温育10min，14000rpm离心5min，取上清，作为DNA模板。

可将上述提取核酸的方法用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌方法的步骤1)。

本发明提供的镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒，能够快速、特异、灵敏、稳定对镰刀菌病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的镰刀菌病病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。本发明提供的试剂盒包含改良的DNA提取体系，能快速有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

附图说明

图1为本发明实施例1中镰刀菌病病原菌的LSU rDNA序列保守区和beta-tubulin特异性序列的比对图。

图2为本发明实施例3中四个检测体系的标准曲线。

图3为本发明实施例3中Fpan检测体系扩增曲线。

图4为本发明实施例3中特异性检测体系的扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1引物、探针的设计

目前为止，尚未发现用于角膜镰刀菌病病原菌的real time PCR检测方法。因此，结合NCBI数据库信息和发明人前期对致病性镰刀菌的序列信息，通过seqman软件比对，在large-subunit(LSU)rDNA和beta-tubulin上，找到了适应用于检测镰刀菌属通用引物探针及其下属各种的特异性引物探针(图1)。主要物种包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌。同时，充分考虑到镰刀菌属序列与其他常见真菌序列的区别。

利用primer select软件进行引物初筛，并辅以经验性的人工校正，选定不存在碱基变异的区域作为扩增引物。初步选定引物后，通过采用浓度依赖的近似法(nearest-neighbor)的Tm估算公式，结合体系的离子进行计算。

具体公式如下：

上述公式中，△H为反应热；△S为熵变；R为气体常数；C为引物的起始浓度；M为单价阳离子的总浓度。

通过调整引物长度和5'端碱基，使引物和探针体系趋于合理，所得引物信息如下：

用于检测镰刀菌属的通用引物探针：

Fpan-F：GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG(SEQ ID NO:1)Tm值为51.88℃

Fpan-R：AACCAGACGGGGCTCTCAC(SEQ ID NO:2)Tm值为54.85℃

Fpan-P：GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG(SEQ ID NO:3)Tm值为60.23℃

其中，Fpan-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

用于检测串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的特异性引物探针：

Fmon-F：CGCATGAGTGTTTACTTCAACG(SEQ ID NO:4)Tm值为53.04℃

Fmon-R：AGGTCGACGAGGACGGCT(SEQ ID NO:5)Tm值为55.99℃

Fmon-P：AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA(SEQ ID NO:6)Tm值为66℃

其中，[]内的锁核酸碱基(locked nucleic acid)，Fmon-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

用于检测茄病镰刀菌(Fusarium solani)的特异性引物探针：

Fsol-F：GCATGAGCGTCTACTTCAAC(SEQ ID NO:7)Tm值为51.57℃

Fsol-R：AAGGGACCAGCACGAACG(SEQ ID NO:8)Tm值为53.05℃

Fsol-P：AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA(SEQ ID NO:9)Tm值为58.60℃

其中，Fsol-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

用于检测尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的特异性引物探针：

Foxy-F：TGTCTACTTCAACGAGGTATGC(SEQ ID NO:10)Tm值为52.75℃

Foxy-R：CATGGTACCAGGCTCAAGAT(SEQ ID NO:11)Tm值为52.18℃

Foxy-P：AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG(SEQ ID NO:12)Tm值为58.76℃

其中，Foxy-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

设定竞争性内参(即内参引物与目标基因的引物相同)，以确保阴性结果的可靠性，内参模板信息如下：

Fpan-IAC(SEQ ID NO:13)：

GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGctagaTGACTGAGCACGTCTATCCGATGAtcatgGTGAGAGCCCCGTCTGGTT

Fmon-IAC(SEQ ID NO:14)：

CGCATGAGTGTTTACTTCAACGctagaTGACTGAGCACGTCTATCCGATGAtcatgAGCCGTCCTCGTCGACCT

Fsol-IAC(SEQ ID NO:15)：

GCATGAGCGTCTACTTCAACctagaTGACTGAGCACGTCTATCCGATGAtcatgCGTTCGTGCTGGTCCCTT

Foxy-IAC(SEQ ID NO:16)：

TGTCTACTTCAACGAGGTATGCctagaTGACTGAGCACGTCTATCCGATGAtcatgATCTTGAGCCTGGTACCATG

内参探针为：

Fu-IACP：ACTGAGCACGTCTATCCGA(SEQ ID NO:17)，探针5’用TAMRA修饰，3’用BHQ1修饰。

此处所设计的内参体系，为竞争性内参，内参体系和检测体系的引物完全相同，但探针不同。由于内参体系和检测体系使用了相同的引物，所以不存在引物的优势扩增(这就避免了由于内参引物的扩增能力与检测引物存在较大差别，从而抑制其中扩增能力较弱的体系)。同时，通过加入高浓度的内参明确这内参模板的加入不会影响检测体系。

实施例2用于实时荧光定量PCR检测镰刀菌病病原菌的试剂盒

试剂盒(20人份)包含：

1)DNA提取管(20个)

提取管为2ml离心管，每管含600μl的DNA提取液和0.5g酸洗玻璃珠(直径710-1180μm，sigma，货号G1152)。真菌DNA提取液配方如下：

2)PCR mixture A(2×预混液，300μl)，配方如下：

3)PCR mixture B(260μl)，配方如下：

4)PCR mixture C(260μl)，配方如下：

5)PCR mixture D(260μl)，配方如下：

6)PCR mixture E(260μl)，配方如下：

7)positive control(40μl)3管，分别为1ng/μl的皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉和疣状瓶霉基因组DNA。

试剂盒的使用方法如下：

1)DNA提取：

①将待检测的样品200mg加入2ml离心管中，向离心管中加入600μl真菌DNA提取液和0.5g玻璃珠，在TissueLyser II(Qiagen公司)上30hz震荡10min，或涡旋震荡10min。

②短暂离心使样品收集到离心管底部，95℃水浴10min。

③14000rpm离心5min，取上清留用。

2)镰刀菌属通用检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture B混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

3)串珠镰刀菌检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture C混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

3)茄病镰刀菌检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture D混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

4)尖孢镰刀菌检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture E混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

5)PCR程序为：

95℃10min；{95℃15sec，54℃20sec，72℃30sec(采集数据)}40个循环。

本试剂盒适用于ABI 7500/7500Fast/Vii7，Stratagene Mx3000P，Mx3005P，Mx4000，MJ Research Chromo4，Opticon(II)，Corbett Rotor Gene 3000等仪器。

实施例3试剂盒效果检测

1)标准曲线制作和灵敏度检测

①构建质粒标准品

a、分别以Fpan-F和Fpan-R、Fmon-F和Fmon-R、Fsol-F和Fsol-R、Foxy-F和Foxy-R四对引物，扩增出单一片段(以TAKARA的PremixTaqTM完成，货号：R004A)后，连入pUC18DNA质粒载体(TAKARA，货号：3218)，转入E.coli DH5α(TAKARA，货号：9057)。通过PCR检测筛选出阳性克隆，在摇菌培养后以碱裂解法提取纯化质粒。

b、以Qubit 3.0Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)检测质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，计算公式如下：

c、稀释为每微升含如下拷贝数的不同溶液，拷贝数为：10⁵、10⁴、10³、10²、10、1。

②构建质粒标准曲线

以上一步所得的质粒标准品，分别以四个检测体系进行扩增，其扩增数值和扩增曲线分别如表1所示，而据此构建标准曲线如图2所示。

表1扩增的质粒标准品Ct数值表

③灵敏度确定

从上述的数据可以看出，四个检测体系的检测下限10拷贝的质粒数。因此，从理论上说，当存在10个拷贝的模板时，就可以被有效地检测到。

2)稳定性检测

以确定的临床标本，同一份标本重复96次检测，结果如表2所示。

表2稳定性检测

由表2可知，在96次检测中，四个检测体系表现得非常稳定。

3)特异性检测：

以下列物种的高浓度基因组(5-10ng/μl)，用于特异性检测，除人类基因组外，还包括(10个属29个种)：镰刀菌属(茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌)、着色霉属(Fonsecaea monophora、Fonsecaea pedrosoi)、枝孢霉属(卡氏枝孢霉)、毛癣菌属(红色毛癣菌、趾间毛癣菌、断发毛癣菌、紫色毛癣菌、疣状毛癣菌)、小孢子菌属(犬小孢子菌、石膏小孢子菌、猪小孢子菌、铁锈色小孢子菌、桃色小孢子菌)、表皮癣菌属(絮状表皮癣菌)、念珠菌属(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平光滑念珠菌)、曲霉属(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)、马尔尼菲青霉、新型隐球菌。其中，所用的菌株均已经过形态学和分子方法的鉴定。

结果如下：

①Fpan检测体系，能有效检测到茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌，但不能检测其他真菌物种；

②Fmon检测体系、Fsol检测体系、Foxy检测体系，有效检测到各自的目标物种，而其他无关物种都扩增不出产物。

4)内参体系验证

加入高浓度的内参模板后，检测内参是否对就目标检测有影响。取1-3份明确已知的阳性临床标本，加入高浓度内参(10⁵拷贝/体系)，结果见表3：

表3内参加入对检测体系的影响

从表3可见，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得较好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出明显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

5)临床标本验证

在临床上共收集到9份培养阳性的临床标本，检测结果见表4和图3、图4)：

表4培养阳性临床标本的检测结果

其中，Foxy为尖孢镰刀菌，Fsol为茄病镰刀菌，Fmon为串珠镰刀菌。以上结果表明，本发明能够有效检测到阳性的临床标本，因此，适用于角膜镰刀菌病的临床分子检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

<130> KHP171110607.4TQ

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcccgagttg taatttgtag ag 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaccagacgg ggctctcac 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgccttcc gagttccctg g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcatgagtg tttacttcaa cg 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtcgacga ggacggct 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcagtcaa[t] g[t]caagagtt ca 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcatgagcgt ctacttcaac 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagggaccag cacgaacg 18

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agctgacatc tgtaggcttc tggtaa 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtctacttc aacgaggtat gc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catggtacca ggctcaagat 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattcccaag ctcacacaac tagg 24

<210> 13

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcccgagttg taatttgtag agctagatga ctgagcacgt ctatccgatg atcatggtga 60

gagccccgtc tggtt 75

<210> 14

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcatgagtg tttacttcaa cgctagatga ctgagcacgt ctatccgatg atcatgagcc 60

gtcctcgtcg acct 74

<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcatgagcgt ctacttcaac ctagatgact gagcacgtct atccgatgat catgcgttcg 60

tgctggtccc tt 72

<210> 16

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgtctacttc aacgaggtat gcctagatga ctgagcacgt ctatccgatg atcatgatct 60

tgagcctggt accatg 76

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actgagcacg tctatccga 19

Claims

1.镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合，其特征在于，该组合包括：

(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌

Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′

Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′

Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′

(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针

Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′

Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′

Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；

其中，[T]表示锁核酸；

(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针

Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′

Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′

Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及

(IV)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物和探针

Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′

Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′

Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。

2.含有权利要求1所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测镰刀菌病病原菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括竞争性内参模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和内参探针Fu-IACP，其序列信息如下：

Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′

Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′

Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′

Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGATCTTGAGCCTGGTACCATG-3′

Fu-IACP：5′-TAMRA-ACTGAGCACGTCTATCCGA-BHQ1-3′。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括真菌DNA提取液和/或玻璃珠；

所述真菌DNA提取液的配方如下：

所述玻璃珠优选为直径710-1180μm的酸洗玻璃珠。

5.用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)以上述提取的DNA为模板，利用权利要求2-4任一项所述试剂盒，分别进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR扩增反应体系的配制如下：

(1)依次配制如下试剂

①PCR mixture A，配方如下：

②PCR mixture B，配方如下：

③PCR mixture C，配方如下：

④PCR mixture D，配方如下：

⑤PCR mixture E，配方如下：

(2)镰刀菌检测体系的配制

(3)串珠镰刀菌检测体系的配制

(4)茄病镰刀菌检测体系的配制

(5)尖孢镰刀菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture E混合，加入2μlDNA模板，即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR扩增反应程序如下：95℃10min；95℃15s，54℃20s，72℃30s采集数据，共40个循环。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析待测样品中是否含有相应的镰刀菌病病原菌；含有病原菌的待测样品会出现对应的扩增曲线，表现为阳性结果；不含有病原菌的待测样品不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值，表现为阴性结果。

9.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)具体操作如下：

S1、采集待测样本100-500mg加入2ml离心管中，向离心管中加入600μl真菌DNA提取液和0.5g玻璃珠，30Hz震荡10min，或涡旋震荡10min；

S2、95℃温育10min，14000rpm离心5min，取上清，作为DNA模板。