CN112063745A - 尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针及其应用 - Google Patents

尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针及其应用。本发明的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物，所述引物的核苷酸序列为FOV A‑F：5＇‑GCTCTAGTCAACCAAGCCGA‑3＇；FOV A‑R2：5＇‑CCAGCCTTGAACAAACAGATC‑3＇。本发明的尖孢镰刀菌萎蔫专化型具有特异性强、灵敏度高的特点，适用于棉花枯萎病菌数量的确定以及预测预报工作。

Description

尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针及其应用。
背景技术
棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)引起的棉花系统性土传病害。棉花枯萎病在世界各地普遍发生，对棉花的品质和产量造成严重的损失。由于土传病害受气候等外界环境因子的影响相对较小，土壤中病原菌数量往往是病害流行的主要决定因素。因此构建可特异性检测尖孢镰刀菌萎蔫专化型的引物及探针，定量检测土壤中病原菌数量对此类病害预测预报及有效防治具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物、探针。
本发明的再一目的在于提供尖孢镰刀菌萎蔫专化型的检测方法。
本发明的再一目的在于提供尖孢镰刀菌萎蔫专化型的检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物的应用。
本发明的再一目的在于提供尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及其探针的应用。
根据本发明具体实施方式的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物，其引物序列为
FOV A-F：5＇-GCTCTAGTCAACCAAGCCGA-3＇；
FOV A-R2：5＇-CCAGCCTTGAACAAACAGATC-3＇。
本发明还设计了与尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物配合使用的探针，探针序列为
FOV probe2：5＇-AGACCCTGCACTACGGAACCCGTTCCA-3＇。
上述FOV probe2探针的5＇端标记有荧光染料，3＇端标记有荧光淬灭基团，其中，荧光基团可选FAM、HEX、TET等，本发明的优选方案为FAM；淬灭基团可选TAMRA、BHQ等，本发明的优选方案为BHQ1。
根据本发明具体实施方式的尖孢镰刀菌萎蔫专化型的检测方法，包括使用上述尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物进行PCR扩增的步骤；或者，包括使用上述尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针进行PCR扩增的步骤。
根据本发明具体实施方式的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物的应用，其可以为棉花枯萎病的发生提供预测预报的作用，并可准确确定棉花枯萎病菌数量。
根据本发明具体实施方式的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及其探针的应用，其可以为棉花枯萎病的发生提供预测预报的作用，并可准确确定棉花枯萎病菌的数量。
本发明的有益效果：
本发明的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物具有良好的特异性，能够特异性的检测尖孢镰刀菌萎蔫专化型，对其近缘种、属无扩增产物。本发明的灵敏度高，准确度高，在10～1×106拷贝/μL范围内均可以准确检出。因此，本发明的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及其配合使用的探针可以用于棉花枯萎病菌数量的确定，并为棉花枯萎病的发生提供预测预报。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性检测结果，其中，M：marker DL1000；1.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；2.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；3.尖孢镰刀菌西瓜专化型；4.尖孢镰刀菌冬瓜专化型；5.尖孢镰刀菌黄瓜专化型；6.尖孢镰刀菌甜瓜专化型；7.尖孢镰刀菌烟草专化型；8.尖孢镰刀菌辣椒专化型；9.尖孢镰刀菌向日葵专化型；10.禾谷镰刀菌；11.假禾谷镰刀菌；12.立枯丝核菌；13.大丽轮枝菌；14.黄色镰刀菌；15.三线镰刀菌；16.层出镰刀菌；17.木贼镰刀菌；18.胶孢镰刀菌；19.茄镰孢菌；20.腐皮镰刀菌；21.柔毛镰刀菌；22.锐顶镰刀菌；23.离蠕孢菌；24.平脐蠕孢菌；25.弯孢菌；26.黑斑病菌；27.黑白轮枝菌；28.灰霉菌；
图2是质粒拷贝数与Ct值的标准曲线；
图3显示棉花枯萎菌数量与病害发生关系；
图4显示软件提供引物对尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性的检测结果，(a)为利用Fov F1和Fov R1引物进行PCR扩增结果；(b)为利用Fov F2和Fov R2引物进行PCR扩增结果；(c)利用Fov F3和Fov R3引物进行PCR扩增结果，其中：M：marker DL1000；1.尖孢镰刀菌萎蔫专化型；2.尖孢镰刀菌西瓜专化型；3.尖孢镰刀菌冬瓜专化型；4.尖孢镰刀菌黄瓜专化型；5.尖孢镰刀菌甜瓜专化型；6.尖孢镰刀菌烟草专化型；7.尖孢镰刀菌辣椒专化型；8.尖孢镰刀菌向日葵专化型；9.禾谷镰刀菌；10.假禾谷镰刀菌；11.立枯丝核菌；12.大丽轮枝菌；13.黄色镰刀菌；14.三线镰刀菌；15.层出镰刀菌；16.木贼镰刀菌；17.胶孢镰刀菌；18.茄镰孢菌；19.腐皮镰刀菌；20.柔毛镰刀菌；21.锐顶镰刀菌；22.离蠕孢菌；23.平脐蠕孢菌；24.弯孢菌。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1制备尖孢镰刀菌萎蔫专化型的特异性引物
以尖孢镰刀菌萎蔫专化型在PHO基因中插入转录因子Tfo1的片段为目标序列，设计尖孢镰刀菌萎蔫专化型的特异性引物FOV A-F和FOV A-R2，
FOV A-F：5＇-GCTCTAGTCAACCAAGCCGA-3＇；
FOV A-R2：5＇-CCAGCCTTGAACAAACAGATC-3＇。
同时，本发明设计了尖孢镰刀菌萎蔫专化型的探针：
FOV probe2：FAM5＇-AGACCCTGCACTACGGAACCCGTTCCA-3＇BHQ1。
实施例2验证引物的特异性扩增效果
2.1引物的特异性
以FOV A-F和FOV A-R2为引物，以27种不同的病原菌DNA为模板(尖孢镰刀菌萎蔫专化型、尖孢镰刀菌西瓜专化型、尖孢镰刀菌冬瓜专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌甜瓜专化型、尖孢镰刀菌烟草专化型、尖孢镰刀菌辣椒专化型、尖孢镰刀菌向日葵专化型、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌、黄色镰刀菌、三线镰刀菌、层出镰刀菌、木贼镰刀菌、胶孢镰刀菌、茄镰孢菌、腐皮镰刀菌、柔毛镰刀菌、锐顶镰刀菌、离蠕孢菌、平脐蠕孢菌、弯孢菌、黑斑病菌、黑白轮枝菌、灰霉菌)，进行PCR扩增，PCR扩增体系为20μL体系，体系如下：rTaq酶0.5μL，10×Buffer 2.0μL，dNTP 2.0μL，特异性引物各1.0μL，NDA模板1μL，ddH2O 12.5μL。PCR扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min共35个循环；72℃延伸10min。在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳检测。
结果如图1所示，引物FOV A-F和FOV A-R2具有很好的特异性，仅能扩增出尖孢镰刀菌萎蔫专化型，其余菌株均没有条带。
2.2构建标准曲线
以尖孢镰刀菌萎蔫专化型基因组为模板，以上述筛选得到的引物FOV A-F/FOV A-R2进行扩增，将扩增产物纯化后克隆到载体pMD18-T上，通过热激转化的方法转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行繁殖。
在带有氨苄抗生素的LB培养皿上筛选含有重组质粒的菌落，并进行PCR验证，获得含有特异性序列的重组质粒。
利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将提取的重组质粒用内切酶EcoRⅠ进行酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，利用Promega Gel Extaction Kit进行片段回收，利用分光光度计测定重组质粒的DNA浓度，并根据公式计算重组质粒DNA的拷贝数。
用ddH2O将上述质粒载体稀释成1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL稀释液。以上述拷贝数梯度稀释的DNA为模板，以FOV A-F和FOV A-R2为引物，以FOV probe2为探针，采用TaqMan荧光探针的方法进行实时荧光定量PCR反应。建立质粒拷贝数与Ct值的标准曲线。
结果如图2所示，标准曲线为y＝-3.30x+38.06，R2＝1.00，因此，本发明引物在重组质粒1×10～1×106拷贝数范围内线性关系良好，可以准确预报棉花枯萎菌的数量。
此外，当重组质粒为2拷贝数时，可测得Ct值为37.11，因此，本发明的引物能够检出尖孢镰刀菌萎蔫专化型的最低拷贝数为2，本发明的引物对尖孢镰刀菌萎蔫专化型具有较高的灵敏度。
实施例3引物FOV A-F/FOV A-R2在预测棉花枯萎病中的应用
在温室条件下，将棉花枯萎菌孢子悬浮液均匀的拌入灭菌并晾干的土壤基质中，保证土壤中各处的菌量一致，制成带菌量为106CFU/g，105CFU/g，104CFU/g，103CFU/g，102CFU/g土壤，不含菌的土壤为空白对照。催芽后的棉花种子置于含有不同菌量的土壤的育苗盒中。每个梯度留存100g菌土晾干后提取DNA。温室培养条件为白天25℃，晚上18℃。50d后调查病情。同时每个梯度留存100g菌土晾干后提取DNA，qPCR检测病原菌数量。分析病原菌数量与棉花枯萎病病害发生严重程度的拟合关系。
结果如图3所示，棉花枯萎病病情指数随土壤中孢子含量的增加而上升。在土壤中孢子含量高于105CFU/g时，棉花开始发病。因此，根据实验结果，土壤中孢子浓度为105CFU/g为病害发生的临界值，本发明的引物可以为棉花枯萎病的发生测预报的作用。
实施例4引物FOV A-F/FOV A-R2与其他引物的特异性比较
将软件设计提供的3个引物与本发明的引物FOV A-F/FOV A-R2进行比较，软件提供引物序列如表1所示：
表1软件提供引物序列
Fov F1 CGCATCAAACTCACCTCTG
Fov R1 GGCAACTGAACAAGTCAAAGG
Fov F2 AGGGCGAATAAGGCTGATG
Fov R2 GGGCAACTGAACAAGTCAAAG
Fov F3 GGCGAATAAGGCTGATGTG
Fov R3 CGCTACGGTATCTGACTTGAG
分别以软件提供的3个序列为引物，以24种不同的病原菌DNA为模板(尖孢镰刀菌萎蔫专化型、尖孢镰刀菌西瓜专化型、尖孢镰刀菌冬瓜专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌甜瓜专化型、尖孢镰刀菌烟草专化型、尖孢镰刀菌辣椒专化型、尖孢镰刀菌向日葵专化型、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌、黄色镰刀菌、三线镰刀菌、层出镰刀菌、木贼镰刀菌、胶孢镰刀菌、茄镰孢菌、腐皮镰刀菌、柔毛镰刀菌、锐顶镰刀菌、离蠕孢菌、平脐蠕孢菌、弯孢菌)，进行PCR扩增。在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳检测。
结果如图4中(a)所示，2、4、6、13、14、16泳道与1泳道尖孢镰刀菌萎蔫专化型的扩增片段重叠，Fov F1/Fov R1引物对尖孢镰刀菌萎蔫专化型的特异性较差。
如图4中(b)所示，2、4、6、13、14、16、18泳道与1泳道尖孢镰刀菌萎蔫专化型的扩增片段重叠，Fov F2/Fov R2引物对尖孢镰刀菌萎蔫专化型的特异性较差。
如图4中(c)所示，尖孢镰刀菌萎蔫专化型的条带不清晰，且2、4、6、7、13、14、17、18泳道与1泳道尖孢镰刀菌萎蔫专化型的扩增片段重叠，Fov F3/Fov R3引物对尖孢镰刀菌萎蔫专化型的特异性较差。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为
FOV A-F：5＇-GCTCTAGTCAACCAAGCCGA-3＇；
FOV A-R2：5＇-CCAGCCTTGAACAAACAGATC-3＇。
2.尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为
FOV A-F：5＇-GCTCTAGTCAACCAAGCCGA-3＇；
FOV A-R2：5＇-CCAGCCTTGAACAAACAGATC-3＇；
所述探针的核苷酸的序列为：
FOV probe2：5＇-AGACCCTGCACTACGGAACCCGTTCCA-3＇。
3.根据权利要求2所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针，其特征在于，所述探针的5＇端标记有FAM荧光染料，3＇端标记有淬灭基团BHQ1。
4.棉花枯萎病的检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物进行PCR扩增的步骤。
5.棉花枯萎病的检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针进行PCR扩增的步骤。
6.棉花枯萎病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物。
7.棉花枯萎病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针。
8.权利要求1所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物的应用。
9.权利要求1所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物在预测棉花枯萎病方面的应用。
10.权利要求2所述的尖孢镰刀菌萎蔫专化型特异性引物及探针在预测棉花枯萎病方面的应用。
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