CN113444805B - 检测组织中tRF表达引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒的应用 - Google Patents

检测组织中tRF表达引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测组织中tRF表达引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒的应用，其特征在于：该tRF‑33‑Q1Q89P9L842205的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF‑33‑Q1Q89P9L842205在喉癌患者组织中的特异性表达下调：所述引物为：F1：5’ATAAGCGCCGCTGGTGTAGTG 3'；R1：5’TATGGTTGTTGACGACTGGTTGAC 3’，与现有技术相比，本发明的优点在于喉癌组织中的特异性表达下调tRF‑33‑Q1Q89P9L842205可作为喉癌诊断的新型分子标记物。

Description

检测组织中tRF表达引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及一种喉癌组织中tRNA衍生片段的检测方法，尤其涉及一种荧光染料法实时定量逆转录-聚合酶链式反应检测喉癌组织中tiRNA的方法及其应用。
背景技术
喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，发病人群以40岁以上男性为主，且有年轻化趋势。近年虽有CO2激光显微、机器人、放化疗联合等新技术应用于喉癌治疗，但其死亡率并未明显降低。主要由于这些技术大都只能使早期喉癌患者获益，而中晚期喉癌患者仍需喉全切或半切手术，术后常伴随喉功能丧失、频繁复发及转移等问题，严重危害人类健康【潘新良,林云.正确选择喉癌治疗方式、提高患者的生存率及生活质量[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2020,55(12):1111-1115.】。故早诊早治是降低喉癌死亡率、提高患者生存率及生活质量的最有效办法，早期喉癌如能及时治疗，不仅可保喉，其5年生存率可高达95％以上，但由于喉癌起病隐匿且缺乏早期特异性症状，多数患者就诊时往往处于中晚期【MengY,Bian L,Zhang M,Bo F,Lu X,Li D.Liquid biopsy and their application progressin head and neck cancer:Focus on biomarkers CTCs,cfDNA,ctDNA and EVs[J].Biomark Med.2020,14,1393-1404.】，与肝癌、前列腺癌等不同的是，喉癌尚缺乏如甲胎蛋白、前列腺特异抗原等特异性标志物作为辅助诊断，目前喉癌诊断的金标准为喉镜下组织活检，但存在创伤性大、取材困难、滞后性和部分患者不适合等缺点，无法实现广泛高效诊断。因此，寻找理想的喉癌标志物是实现其早诊早治的重要途经之一。
随着分子诊断研究的不断深入，科学家逐渐将目光转向tiRNA，因其有多种核苷酸(nucleotide，nt)修饰而结构稳定，且在肿瘤发生发展过程有重要功能而成为肿瘤标志物研究的新热点。它们是由血管生成素从成熟tRNA的反密码环处特异性切割产生的具有5'的羟基的小RNA，约为29～50nt，是一类广泛存在于真核生物细胞中的非编码小RNA分子。tiRNA可以分为5'tiRNA和3'tiRNA两个亚类，分别来自成熟tRNA的5'末端开始到反密码子环的末端、从反密码子环开始到成熟tRNA的3'末端【Zhu L,Ge J,Li T,Shen YJ,GuoJM.tRNA-derived fragments and tRNA halves:The new players in cancers[J].Cancer Lett.2019,452:31-37.】。tiRNA具有多种生物学功能，既可以在应激反应中作为信号分子，又可以作为基因表达的调节者，这些特点使得tiRNA在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种检测组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205表达的引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该检测组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205表达的引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：该tRF-33-Q1Q89P9L842205的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌患者组织中的特异性表达下调：
所述引物为：
F1：5’ATAAGCGCCGCTGGTGTAGTG 3'；
R1：5’TATGGTTGTTGACGACTGGTTGAC 3’。
进一步地，所述试剂盒还包括有外参基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物：
F2：5’CAGCACATATACTAAAATTGGAACG 3’
R2：5’ACGAATTTGCGTGTCATCC 3’。
其中，该用于喉癌检测的tiRNA分子标记物为tRF-33-Q1Q89P9L842205，其基因在基因组上的定位为：chr2-70476123-70476193和chr16-686736-686806，对应的tRNA分别为chr2.trna27-GLYCCC和chr16.trna34-GLYCCC，即这两个tRNA都能产生该tiRNA，该tiRNA的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，为GCGCCGCTGGTGTAGTGGTATCATGCAAGATTC。
本发明还提供一种检测tiRNA分子标记物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：
(1)采集喉癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；
(2)将总RNA特异性逆转录成cDNA；
(3)将cDNA进行荧光染料法qRT-PCR检测，反应结束后检测样品中tRF-33-Q1Q89P9L842205和外参基因RNU6-2的Cq值；
(4)根据Cq值，通过外参基因RNU6-2的表达水平来均一化tiRNA的水平，并使用ΔCq公式来计算tRF-33-Q1Q89P9L842205的PCR相对定量值，式中ΔCq＝Cq(tRF-33-Q1Q89P9L842205)-Cq(RNU6-2)；
当样本中的tRF-33-Q1Q89P9L842205生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于-4.09时，则认为是非喉癌样本；大于-4.09时，则认为是喉癌样本。
其中，上述步骤(1)中提取喉癌组织中总RNA的过程如下：
步骤a、收集喉癌组织样本：取10～20mg的喉癌组织，浸泡在含1～2mL的RNA保存液的无核酸酶离心管中；若不立即使用则应存放在-80℃超低温冰箱中保存；
步骤b、裂解组织：把步骤a中的组织从-80℃冰箱中取出置于室温下解冻，滤纸吸干RNA保存液后，多位点剪取约15mg左右的组织于事先加入1mL Trizol试剂的2mL无核酸酶的离心管中。用电动匀浆器将喉癌组织充分研磨成匀浆液，15～30℃孵育10分钟，使核酸蛋白复合体完全解离；
步骤c、三氯甲烷提取：加入200μL三氯甲烷，在漩涡振荡器上震荡15秒，15～30℃孵育5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，离心后混合液将分为下层的红色酚氯仿相，RNA在上层水相中富集，小心吸取上层水相约400μL～600μL至无核酸酶离心管中；
步骤d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，4℃静置15分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，得RNA沉淀；
步骤e、乙醇洗涤并沉淀：弃上清，并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温放置10分钟晾干后，加入15μL无核酸酶的水来溶解沉淀，即为组织中的总RNA提取液，于-80℃保存备用。
上述步骤(2)中将总RNA特异性逆转录成cDNA的过程如下：将2μL上述RNA提取液与1.2μL的特异性逆转录引物混匀，70℃加热5分钟后，置于冰上。按表1逆转录反应体系，进行上机操作，反应条件为：先26℃杂交40分钟，然后42℃杂交40分钟，再85℃杂交10分钟，最后保存于-20℃备用；
而步骤(3)中实时定量PCR反应条件如下：先95℃预变性3分钟；然后95℃变性12秒，60℃退火40秒，72℃延伸30秒，40个循环；最后95℃酶变性5分钟，4℃保温。
本发明还提供一种tiRNA分子标记物在制备喉癌辅助诊断试剂盒中的应用。该试剂盒包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、荧光试剂、PCR缓冲液、焦碳酸二乙酯(DEPC)水。
与现有技术相比，本发明的优点在于在喉癌患者组织中的特异性表达下调的tRF-33-Q1Q89P9L842205可作为喉癌诊断的新型分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行喉癌诊断，通过使用TRIzol、异丙醇等试剂，采用混匀离心等方法，能提取出浓度、纯度较好的RNA，仅需收集15mg左右的喉癌组织即可检测tiRNA，成为喉癌诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景，而采取的实时定量PCR仪器是一种常见仪器，SYBR Green荧光染料法并不需要另行设计探针即可同时检测目的tiRNA和外参基因，具有经济、方便等特点，本发明提供的方法，对进一步研究喉癌相关tiRNA的生物学功能具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例一中喉癌组织tiRNA下一代测序结果图；
图2为本发明实施例二中正常组织和喉癌组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205和RNU6-2的扩增曲线图；
图3为本发明实施例三中tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌组织中显著低表达；
图4为本发明实施例三中tRF-33-Q1Q89P9L842205的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一
检测tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌组织和正常喉组织中的表达情况：
测序检测：采用美国Arraystar公司的tiRNA测序试剂采用下一代测序方法检测喉癌组织和正常组织中tiRNA的水平。
结果分析：结果如图1所示，通过分析喉癌组织和癌旁组织获得表达显著下调的tRNA衍生片段的分子标记物，tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌组织和正常组织中差异达2.94倍，如图1箭头所示，提示tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌中可能作为一个抑癌基因发挥作用。
实施例二
采集正常喉组织作为正常对照组，按照如下步骤进行tiRNA的检测，包括以下步骤：
步骤a、收集喉癌组织样本：取10～20mg的喉癌组织，浸泡在含1～2mL的RNA保存液的无核酸酶离心管中；若不立即使用则应存放在-80℃超低温冰箱中保存；
步骤b、裂解组织：把步骤a中的组织从-80℃冰箱中取出置于室温下解冻，滤纸吸干RNA保存液后，多位点剪取约15mg左右的组织于事先加入1mL Trizol试剂的2mL无核酸酶的离心管中，用电动匀浆器将喉癌组织充分研磨成匀浆液，15～30℃孵育10分钟，使核酸蛋白复合体完全解离；
步骤c、三氯甲烷提取：加入200μL三氯甲烷，在漩涡振荡器上震荡15秒，15～30℃孵育5分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，离心后混合液将分为下层的红色酚氯仿相，RNA在上层水相中富集，小心吸取上层水相约400μL～600μL至无核酸酶离心管中；
步骤d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，4℃静置15分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，得RNA沉淀；
步骤e、乙醇洗涤并沉淀：弃上清，并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温放置10分钟晾干后，加入15μL无核酸酶的水来溶解沉淀，即为组织中的总RNA提取液，于-80℃保存备用。
步骤f、将上述步骤e提取的总RNA特异性逆转录：将2μL上述RNA提取液与1.2μL的特异性逆转录引物混匀，70℃加热5分钟后，置于冰上，按表1逆转录反应体系，进行上机操作，反应条件为：先26℃杂交40分钟，然后42℃杂交40分钟，再85℃杂交10分钟，最后保存于-20℃备用；
步骤g、荧光染料法qRT-PCR检测：将上述步骤f获得的逆转录产物按照表2的配比加入反应体系中，并按照表3的程序设定进行PCR参数；
所用的tRF-33-Q1Q89P9L842205的特异性扩增上下游引物为：
F1:5’ATAAGCGCCGCTGGTGTAGTG 3'
R1:5’TATGGTTGTTGACGACTGGTTGAC 3’
所用的外参基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物为：
F2:5’CAGCACATATACTAAAATTGGAACG 3’
R2:5’ACGAATTTGCGTGTCATCC 3’
表1.特异性逆转录反应体系
Figure BDA0003171215480000051
表2.荧光染料法定量PCR反应体系
Figure BDA0003171215480000052
表3.PCR参数
Figure BDA0003171215480000053
Figure BDA0003171215480000061
从图2可以看出，正常组织和喉癌组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205和RNU6-2均得到有效扩增，并可以得到组织样本中RNU6-2和tRF-33-Q1Q89P9L842205表达水平的扩增曲线，其中，从RNU6-2的扩增曲线可以得到所检测的喉癌组织和正常喉组织标本的Cq值分别为16.15和16.4，tRF-33-Q1Q89P9L842205的扩增曲线可以得到所检测的喉癌组织和正常喉组织标本的Cq值分别为12.26和11.06，可以得出正常组织与喉癌组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205表达量的对比，与实施例一中的基因测序的结果是一致的。
同时利用同一标本中RNU6-2和tRF-33-Q1Q89P9L842205的Cq值，根据计算公式ΔCq＝Cq(tRF-33-Q1Q89P9L842205)-Cq(RNU6-2)计算出该tRF-33-Q1Q89P9L842205的ΔCq值，根据ΔCq值的大小就可以判断该tRF-33-Q1Q89P9L842205的相对表达水平；ΔCq值越小，其对应tRF-33-Q1Q89P9L842205的表达水平越高，而ΔCq值越大，其对应tRF-33-Q1Q89P9L842205的表达水平越低；
从图2可得出正常组织的ΔCq＝-5.34；喉癌组织的ΔCq＝-3.89，明显大于正常组织的ΔCq值，说明tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌组织中是低表达的。
实施例三
应用tRF-33-Q1Q89P9L842205生物标志物进行喉癌检测的方法
步骤包括：
1、收集组织样本；
2、喉癌组织中RNA的提取(提取方法如同实施例二)；
3、特异性逆转录和荧光染料法qRT-PCR检测如同按照实施例二中的“特异性逆转录和荧光染料法qRT-PCR检测”进行操作；
4、以tRF-33-Q1Q89P9L842205作为喉癌检测的生物标志物，分析45例喉癌患者癌组织与其癌旁组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205的表达水平。喉癌患者组tRF-33-Q1Q89P9L842205的ΔCq明显高于正常组，P<0.0001，证明其tRF-33-Q1Q89P9L842205的表达水平明显低于正常组，如图3所示。tRF-33-Q1Q89P9L842205作为喉癌标志物的截断值为-4.09，当样本中的tRF-33-Q1Q89P9L842205生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于-4.09时，则认为是非喉癌样本；大于-4.09时，则认为是喉癌样本。
5、检测45例喉癌患者喉癌组织及其癌旁组织tRF-33-Q1Q89P9L842205水平，制作ROC曲线，如图4所示，AUC值为0.661，P＝0.008。表4为tRF-33-Q1Q89P9L842205为生物标志物进行喉癌诊断的结果，可得出tRF-33-Q1Q89P9L842205作为喉癌标记物的灵敏度为0.733，特异度为0.578。
表4.tRF-33-Q1Q89P9L842205为生物标志物进行喉癌诊断的结果
Figure BDA0003171215480000071
实施例四检测试剂盒及应用
本实施例中的用于喉癌检测的tRF-33-Q1Q89P9L842205生物标志物检测试剂盒，除含有常规实时定量PCR试剂之外，还包括外参的检测引物和tRF-33-Q1Q89P9L842205的检测引物。其中，常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水(RNase free water)。
利用上述检测试剂盒进行检测时，其具体的操作方法可参照实施例二的操作方法
进行样本的检测和喉癌的判断。
应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、快速、便利地进行tRF-33-Q1Q89P9L842205生物标志物的检测，以判断喉癌情况，便于治疗。
序列表
<110> 宁波市医疗中心李惠利医院
<120> 检测组织中tRF表达引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
GCGCCGCTGG TGTAGTGGTA TCATGCAAGA TTC 33

Claims (2)

1.一种检测组织中tRF-33-Q1Q89P9L842205表达的引物在制备喉癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：该tRF-33-Q1Q89P9L842205的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF-33-Q1Q89P9L842205在喉癌患者组织中的特异性表达下调：
所述引物为：
F1：5’ATAAGCGCCGCTGGTGTAGTG 3'
R1：5’TATGGTTGTTGACGACTGGTTGAC 3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括有外参基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物：
F2：5’CAGCACATATACTAAAATTGGAACG 3’
R2：5’ACGAATTTGCGTGTCATCC 3’。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105385760A (zh) * 2015-11-30 2016-03-09 宁波市医疗中心李惠利医院 可用于检测与喉癌相关的shisa3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

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ZEB2 在喉癌中的表达及侵袭、转移机制研究;宁波市医疗中心李惠利医院;《科学技术成果鉴定证书》;20200224;第1-4页 *
间质蛋白Periostin 与喉癌诊断、治疗及预后关系的研究;宁波市医疗中心李惠利医院;《科学技术成果鉴定证书》;20180806;第1-4页 *

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